La tecnología de ADN recombinante se desarrolla en tres pasos: el aislamiento del gen de interés, la p g ,clonación y expresión de dicho gen, y la producción a gran escala de la proteína codificada por el gen.

El aislamiento de un gen

í íSe aísla la proteína de la que se quiere obtener el gen e intentar determinar por medios químicos la secuencia de aminoácidos qque la componían. Este proceso se denomina secuenciación de proteínas y a diferencia de la secuenciación de ADN es técnicamente muy secuenciación de ADN es técnicamente muy complicado. Si la proteína es suficientemente pequeña puede ser secuenciada en su

lid d i f ió i l óditotalidad y esta información, gracias al código genético, era utilizada para sintetizar químicamente el gen. q g

Para proteínas de tamaño medio o grande lo que se hacía era secuenciar solamente una pequeña parte de la proteína y, utilizando también el código genético,

ó ófabricar una cadena de ADN de 15 ó 20 nucleótidos que era complementaria a una de las cadenas del gen o al ARNm correspondiente. Esta corta cadena de nucleótidos se marcaba radiactivamente o por nucleótidos se marcaba radiactivamente o por fluorescencia y se utilizaba como sonda para identificar el gen completo o el ARNm completo que llevan la información para sintetizar la proteína de interés En el información para sintetizar la proteína de interés. En el caso de que hayamos localizado el ARNm tenemos que convertirlo en ADN. Este proceso se hace mediante la enzima llamada transcriptasa inversa. La cadena de enzima llamada transcriptasa inversa. La cadena de ADN obtenida utilizando la información de un ARNm se llama ADN complementario o abreviadamente ADNc.

Las enzimas de restricción(conocidas también como endonucleasas) tienen como función cortar las hebras de ADN Se podría decir que sonlas hebras de ADN. Se podría decir que son “tijeras moleculares” que cortan ADN. Lo hacen en forma específica. Es decir, que reconoce una p qsecuencia particular de nucleótidos.

Existen 3 tipos de enzimas de restricción:Tipo I y Tipo III:° Tienen actividad de restricción y modificación.° Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento. Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que reconocen. ° Necesitan ATP para moverse desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.

Tipo II:

° Sólo tienen actividad de restricción.

° Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que predecible dentro de la secuencia que reconocen.

° No necesitan ATP.

L d l b ti d l b t iLas endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima La primera letra representa elprimera vez esta enzima. La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa

Ejcepa. Ej:

Eco RI E = género Escherichiaco = especie coliR = cepa RV 13I = primera endonucleasa aislada de esta cepap p

Acorde a como realizan el corte, las enzimas se pueden clasificar en:pueden clasificar en:

Enzimas que generan “extremos romos” (No--Enzimas que generan extremos romos (No tienen bases desapareadas)

--Enzimas que generan “extremos cohesivos” (Contienen bases desapareadas)

ROMPER LAS CELULASSEPARAR EL ADNCONCENTRAR Y FRAGMENTAR EL ADNAISLAR EL ADN AISLAR EL ADN AÑADIR REGULADORES DE LA EXPRESION GENICA SI SE VA A EXPRESAR EL ADNGENICA, SI SE VA A EXPRESAR EL ADN

Un vector es una molécula Un vector es una molécula d ADN d t ñ d ADN d t ñ de ADN de tamaño de ADN de tamaño

pequeño fácil de aislar y pequeño fácil de aislar y caracterizar, de fácil caracterizar, de fácil

introducción en la célula introducción en la célula oducc ó e a cé u a oducc ó e a cé u a anfitriona y una vez allí con anfitriona y una vez allí con capacidad de replicación capacidad de replicación capacidad de replicación capacidad de replicación

autónomaautónoma

Pueden clasificarse según varios criterios como:Pueden clasificarse según varios criterios como:Pueden clasificarse según varios criterios como:Pueden clasificarse según varios criterios como:**Su procedencia procariótica o eucariótica.Su procedencia procariótica o eucariótica.**El tipo de molécula a partir de la que se preparan:El tipo de molécula a partir de la que se preparan:--Plásmidos: bacterianos, levaduras o de plantas.Plásmidos: bacterianos, levaduras o de plantas.Vi i f t b t i (b t ióf l Vi i f t b t i (b t ióf l --Virus: que infectan bacterias (bacteriófagos o solo Virus: que infectan bacterias (bacteriófagos o solo

fagos), plantas, invertebrados o vertebrados.fagos), plantas, invertebrados o vertebrados.--Cromosomas artificiales: derivados de elementos Cromosomas artificiales: derivados de elementos cromosómicos de fagos (pACs), de bacterias (BACs) cromosómicos de fagos (pACs), de bacterias (BACs) o de levaduras (YACs)o de levaduras (YACs)o de levaduras (YACs).o de levaduras (YACs).--Quimeras, es decir, moléculas formadas Quimeras, es decir, moléculas formadas combinando partes de otras cuyo origen es combinando partes de otras cuyo origen es diferente. Normalmente quimeras de plasmados y diferente. Normalmente quimeras de plasmados y fago.fago.gg**El tipo de célula anfitriona en la que el DNA El tipo de célula anfitriona en la que el DNA recombinante resultante, se puede incorporar.recombinante resultante, se puede incorporar.**El gen de resistencia que contiene el vector para su El gen de resistencia que contiene el vector para su posterior detección o selección.posterior detección o selección.**El t ñ d l DNA d it i tEl t ñ d l DNA d it i t**El tamaño del DNA que admiten como inserto.El tamaño del DNA que admiten como inserto.

Existen varios métodos Existen varios métodos que dependerán del que dependerán del

tipo de célula tipo de célula tipo de célula tipo de célula fundamentalmente. fundamentalmente.

T f ióT f ióTransformación.Transformación.Se consigue artificialmente Se consigue artificialmente sometiendo a la célula sometiendo a la célula sometiendo a la célula sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos bacteriana a tratamientos físicos y químicos. y químicos. La célula capta moléculas de La célula capta moléculas de ppADN que se encuentran en el ADN que se encuentran en el medio externo, las introduce en medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a su su interior y las incorpora a su y py pgenoma.genoma.

Consiste en introducir el ADN en Consiste en introducir el ADN en la célula hospedadora mediante la célula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector un virus, utilizando como vector

de clonación el genoma del de clonación el genoma del virus.virus.

Son moléculas de DNA de doble Son moléculas de DNA de doble hebra de pequeño tamaño y hebra de pequeño tamaño y hebra, de pequeño tamaño y hebra, de pequeño tamaño y

forma circular, presentes en forma circular, presentes en forma libre en el citosol de forma libre en el citosol de

muchas bacterias y de algunos muchas bacterias y de algunos muchas bacterias y de algunos muchas bacterias y de algunos eucariotas unicelulares. Son eucariotas unicelulares. Son

fáciles de purificar y a partir del fáciles de purificar y a partir del cultivo bacteriano Permiten la cultivo bacteriano Permiten la cultivo bacteriano. Permiten la cultivo bacteriano. Permiten la incorporación de insertos de incorporación de insertos de

DNA de un tamaño máximo de DNA de un tamaño máximo de unas 10kb unas 10kb unas 10kb unas 10kb

El DNA del bacteriófago El DNA del bacteriófago contiene en sus extremos contiene en sus extremos contiene en sus extremos contiene en sus extremos

secuencias de 12 nucleótidos secuencias de 12 nucleótidos complementarios entre si complementarios entre si pp

llamados sitios cos, responsables llamados sitios cos, responsables de su circulación y de su circulación y

id ió (id ió (P l encapcidación (encapcidación (Proceso por el que el ácido nucleico de un virus

queda recubierto en una cápsida) queda recubierto en una cápsida)

S t i téti S t i téti Son vectores sintéticos, Son vectores sintéticos, quimeras que combinan quimeras que combinan q qq q

características de características de plásmidos y fagos para plásmidos y fagos para plásmidos y fagos para plásmidos y fagos para combinar las ventajas combinar las ventajas

de ambos tipos de de ambos tipos de de ambos tipos de de ambos tipos de vectores vectores

Características ideales de un Características ideales de un ééhuésped: huésped:

-- rápido crecimientorápido crecimiento-- no dañino o patogénicono dañino o patogénico-- estable en cultivoestable en cultivo

Con frecuencia, las células Con frecuencia, las células anfitrionas son procarióticas, anfitrionas son procarióticas,

principalmente cepas de Eprincipalmente cepas de E--coli coli por ser fáciles de obtener, por ser fáciles de obtener,

i l lti li i l lti li manipular, multiplicar y conocer manipular, multiplicar y conocer su genética. su genética.

La membrana plasmática muestra La membrana plasmática muestra una permeabilidad selectiva y no una permeabilidad selectiva y no una permeabilidad selectiva y no una permeabilidad selectiva y no

admite grandes fragmentos de admite grandes fragmentos de rDNA, se acude a diversos métodos rDNA, se acude a diversos métodos rDNA, se acude a diversos métodos rDNA, se acude a diversos métodos

para facilitar su captación por para facilitar su captación por alteración transitoria de la alteración transitoria de la

permeabilidad celular o introducir el permeabilidad celular o introducir el rDNA directamente rDNA directamente

4- La localización celular de la proteína a expresar.

5- Cuando se pretende que el gen se exprese a alto nivel, se suele escoger un plásmido de control relajado, es decir, con gran número de copias, mientras que si plásmido de control relajado, es decir, con gran número de copias, mientras que si interesa un nivel bajo de expresión se escoge un plásmido de control estricto, con poco número de copias.

La construcción de un vector de expresión requiere la p qconsideración de varios elementos con el fin de asegurar mayores niveles de producción proteica.

El mismo debe poseer un promotor “fuerte”, ser fácilmente El mismo debe poseer un promotor fuerte , ser fácilmente transferible con el fin de evaluar la producción proteica.

Debe incluirse factores de terminación de la transcripción, pues éstos protegen el ARN mensajero (ARNm) de degradación éstos protegen el ARN mensajero (ARNm) de degradación exonucleotídica, extendiendo la vida media del mismo.

El sitio de unión al ribosoma. La secuencia Shine-Dalgano i t tú l t 3’ d l ARN ib ó i 16 S d t l interactúa con el extremo 3’ del ARN ribosómico 16 S durante el inicio de la traducción, siendo la distancia adecuada para lograr eficiencia de la traducción.

Número de copias del plásmido , determinado por el origen de replicación, debido a que en algunos casos.

plásmidos con elevado número de copia dan alta eficiencia de plásmidos con elevado número de copia dan alta eficiencia de proteína expresada.

Un vector de expresión incluye las secuencias apropiadas para la transcripción y la traducción en la célula huéspedt aducc ó e a cé u a uésped

Los vectores de expresión pueden convertir las células en fábricas de proteínas, como insulina, hormona del crecimiento, pigmentación en las plantas, etc

Un vector de expresión permite que se exprese un gen extraño en una célula huésped.

Vectores de expresión en plantasVectores de expresión en plantas

Combinaciones de elementos genéticos 5-3 e intrones que mejoran la expresión en plantas transgénicas. la expresión en plantas transgénicas. Los elementos están asociados con un gen defructosa 1,6-bisfosfatasa.un gen de proteína de unión de clorofila a/b.g p /un gen de ubiquitinaun gen de nopalina sintetasa.