UNIVERSIDAD DEL MAGDALENAFACULTAD DE INGIENERÍAASIGNATURA DE GENÉTICA

Profesor: Juan Carlos Narváez BarandicaLaboratorio No. 1: Extracción de ADN (ácido desoxirribonucleico)Lugar: Laboratorio de Genética, Hangar de Acuicultura del programa de Ingeniería Pesquera

PRESENTACIÓN

La molécula de ADN es encargada de contener toda la información genética de los organismos vivos y de algunos virus, la cual es transmitida de generación en generación, sustentando la base de la herencia. Su estructura es utilizada para saber qué sectores de la molécula son responsables de la codificación de proteínas, las cuales cada una es responsable del desarrollo y funcionamiento del individuo. Desde el punto de vista químico, el ADN es un polímero de nucleótidos, donde cada nucleótido está constituido por un azúcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada y un grupo fosfato. Cada base

nitrogenada puede ser una purina (adenina=A y guanina=G) o una pirimidina (timina=T y citosina=C). Estructuralmente, el ADN es una doble hilera de nucleótidos, los cuales se unen entre sí a través de puentes de hidrógenos. Cada base nitrogenada de una hilera tiene una base complementaria en la otra. Por ejemplo, para adenida es timina y para citosina es guanina (Figura 1).

Figura 1. Estructura de ADN.

Lo que distingue a un nucleótido de otro es la base nitrogenada, y por lo tanto la secuencia del ADN se especifica nombrando sólo la secuencia de sus bases. La disposición secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena es la que codifica la información genética. Por ejemplo, una secuencia de ADN puede ser AATCGTC y su secuencia complementaria es TTAGCAG.

La molécula de ADN está ubicada en los núcleos de las células (Figura 2) y su extracción se convierte en la principal herramienta para el estudio genético de las especies. El proceso de extracción implica una serie de pasos, que dependiendo del método empleado pueden variar los reactivos utilizados en cada uno.

Figura 2. Ubicación de la molécula de ADN

En general se han propuesto diferentes métodos, que dependiendo del tipo de tejido fuente se aplican o no. Para el tejido muscular se tienen el de formol-

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Núcleo

Cromosoma

Cromatina condensada

Solenoide

Nucleosomas

Cromatina descondensada

cloroformo, el de sales y los kits comerciales de extracción. Cada uno tiene su ventaja sobre el otro, pero lo importante es tener en cuenta los factores económicos y el tiempo. El procedimiento a implementarse en este laboratorio está basado en un kit comercial y los estudiantes interesados en utilizar los otros dos métodos pueden contactar directamente al profesor para que le adjudique un espacio en el laboratorio e implementarlos.

OBJETIVO DEL LABORATORIO

El propósito de este laboratorio es inducir a los estudiantes de Ingeniería Pesquera en los procesos de extracción de ADN nuclear libre de ARN y de proteínas.

MANEJO DE MUESTRAS Y REACTIVOS

1- El estudiante deberá usar guantes, mientras se encuentre trabajando con ADN.2- Todo el material de trabajo debe estar estéril, a fin de evitar contaminación.3- El material biológico debe ser conservado a bajas temperaturas.

PROCEDIMIENTO

Reactivos y equipamiento

1. Micropipetas2. Material fungible (Puntas, gradillas de plástico, tubos de 1.5 ml.)3. Pinzas y bisturí 4. Mechero 5. Vortex6. Microcentrifuga7. Baño de María8. Refrigerador 9. Solución lisis10. Proteinasa K11. Homogenizadores 12. RNAsa13. Cloruro de sodio (NaCl) [5M]14. Alcohol etílico absoluto y al 75%15. Buffer TE16. Agua bidestilada y autoclavada17. Papel absorbente

PROTOCOLO PARA LA EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE TEJIDO NO INVASIVO: MUCOSA BRANQUIAL

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1. Agitar el hisopo fuertemente contra las paredes del tubo ependorf, con el propósito de liberar la mayor cantidad de células.

2. Retirar el hisopo del tubo original y ponerlo en un tubo nuevo (ependorf 1.5ml), el cual debe contener una abertura en la parte inferior y debe haberse esterilizado previamente.

3. Ubicar el tubo perforado con el hisopo dentro del tubo original, adicionar 200µl de solución lisis y agitar vigorosamente contra las paredes.

4. Centrifugar durante 2 minutos a 10.000 rpm. Eliminar el tubo perforado y conservar el original conteniendo la solución de células en suspensión.

5. Resuspender las células en un vortex durante unos segundos.6. Adicionar 1µl de proteínasa K e incubar a 56°C por lo menos durante 1 hora.7. Adicionar 400µl de NaCl 5M y agitar vigorosamente con el vortex durante 10 segundos.8. Centrifugar a 10.000 rpm. durante 5-10 minutos con el propósito de separar el ADN de las

proteínas y otros residuos.9. Transferir 450µl del sobrenadante obtenido a un tubo nuevo previamente esterilizado.

Esta solución contendrá el ADN extraído, el otro tubo con los residuos de proteínas será descartado.

10. Adicionar 800µl de alcohol etílico absoluto y agitar por inversión 30-40 veces.11. Incubar toda la noche a -20°C.12. Centrifugar a 10.000 rpm. durante 15 minutos para la precipitación del ADN.13. Retirar el alcohol etílico absoluto cuidadosamente sin agitar el tubo. Este paso puede

hacerse por decantación o con la ayuda de una micropipeta. 14. Adicionar 500µl de alcohol etílico al 70% para limpiar el ADN precipitado y centrifugar a

10.000 rpm. durante 2 minutos para ayudar a limpiar bien el tubo.15. Retirar el alcohol etílico al 70% cuidadosamente. Este paso puede hacerse por decantación

o con la ayuda de una micropipeta.16. Dejar secar el tubo completamente.17. Agregar 45µl de solución TE buffer para resuspender el ADN.18. Almacenar el ADN extraído a una temperatura de -20°C.

PROTOCOLO PARA LA EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE TEJIDO NO INVASIVO: ALETA CAUDAL

1. En un tubo ependorf de 1.5µl previamente esterilizado adicionar aproximadamente 0.1-0.5cm2 de aleta caudal.

2. Adicionar 300µl de solución lisis y 1µl de proteínasa K.3. Incubar a 65°C por lo menos durante 1 hora.4. Agitar el tubo con vortex durante 5 minutos.5. Adicionar 300µl de NaCl [5M] y agitar vigorosamente con el vortex durante 10 segundos.

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6. Centrifugar a 15.000 rpm. durante 15 minutos con el propósito de separar el ADN de las proteínas y otros residuos.

7. Transferir 450µl del sobrenadante obtenido a un tubo nuevo previamente esterilizado. Esta solución contendrá el ADN extraído, el otro tubo con los residuos de proteínas será descartado.

8. Adicionar 600µl de alcohol etílico absoluto y agitar por inversión 30-40 veces.9. Incubar por lo menos durante 1 hora a -20°C.10. Centrifugar a 14.000 rpm. durante 10 minutos para la precipitación del ADN.11. Retirar el alcohol etílico absoluto cuidadosamente sin agitar el tubo. Este paso puede

hacerse por decantación o con la ayuda de una micropipeta. 12. Adicionar 500µl de alcohol etílico al 70% para limpiar el ADN precipitado y centrifugar a

10.000 rpm. durante 2 minutos para ayudar a limpiar bien el tubo.13. Retirar el alcohol etílico al 70% cuidadosamente. Este paso puede hacerse por decantación

o con la ayuda de una micropipeta.14. Dejar secar el tubo completamente.15. Agregar 45µl de solución TE buffer para resuspender el ADN.16. Adicionar 1µl de RNAsa e incubar a 37°C durante 30 minutos.17. Almacenar el ADN extraído a una temperatura de -20°C.

PROTOCOLO PARA LA EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE TEJIDO MUSCULAR

1. Tomar aproximadamente 1-5mg de tejido muscular, fragmentarlo cuidadosamente con la ayuda de un bisturí en un tubo ependorf de 1.5µl previamente esterilizado.

2. Adicionar 300µl de solución lisis y 1µl de proteínasa K, homogenizar cuidadosamente con la ayuda un embolo.

3. Incubar a 65°C por lo menos durante 1 hora.4. Agitar el tubo con vortex durante 5 minutos.5. Adicionar 300µl de NaCl [5M] y agitar vigorosamente con el vortex durante 10 segundos.6. Centrifugar a 15.000 rpm. durante 15 minutos con el propósito de separar el ADN de las

proteínas y otros residuos.7. Transferir 450µl del sobrenadante obtenido a un tubo nuevo previamente esterilizado.

Esta solución contendrá el ADN extraído, el otro tubo con los residuos de proteínas será descartado.

8. Adicionar 600µl de alcohol etílico absoluto y agitar por inversión 30-40 veces.9. Incubar por lo menos durante 1 hora a -20°C.10. Centrifugar a 14.000 rpm. durante 10 minutos para la precipitación del ADN.11. Retirar el alcohol etílico absoluto cuidadosamente sin agitar el tubo. Este paso puede

hacerse por decantación o con la ayuda de una micropipeta.

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12. Adicionar 500µl de alcohol etílico al 70% para limpiar el ADN precipitado y centrifugar a 10.000 rpm. durante 2 minutos para ayudar a limpiar bien el tubo.

13. Retirar el alcohol etílico al 70% cuidadosamente. Este paso puede hacerse por decantación o con la ayuda de una micropipeta.

14. Dejar secar el tubo completamente.15. Agregar 45µl de solución TE buffer para resuspender el ADN.16. Adicionar 1µl de RNAsa e incubar a 37°C durante 30 minutos.17. Almacenar el ADN extraído a una temperatura de -20°C.

CUESTIONARIO

1. Durante el protocolo se utilizó proteinasa K, proceso en el cual se incuba la solución de extracción a 65°C ¿Cuál cree usted que sería el fin de agregar esta enzima? ¿Qué consecuencias podría traer para el proceso la omisión de la fase de incubación?

2. ¿Cuál es el mecanismo químico mediante el cual el etanol produce la precipitación de DNA? ¿Qué pasaría si durante este proceso la solución de extracción no se refrigera?

3. ¿Cómo podría asegurarse que el material extraído realmente es DNA?4. ¿Cuál podría ser la diferencia entre protocolos usados para extraer ADN de bacterias,

levaduras y células de plantas?5. ¿Cómo podría cuantificar la concentración de ADN en la solución final?6. ¿Cómo podría saber si hay proteínas contaminando el ADN extraído?

PRESENTACIÓN DEL INFORME

Este se presenta a manera de artículo científico siguiendo la guía de autores de la revista Intrópica, siguiendo la estructura:

a. Titulo b. Autores con sus respectivas direcciones de correspondenciac. Resumen (no más de 9 renglones)d. Palabras claves (cinco)e. Introducción (no más de página y media)f. Materiales y métodos que incluya el área de estudio con un mapa con escala y en tonalidades de grises, fase de campo y análisis de informacióng. Resultados con tablas y figurash. Discusióni. Agradecimientosj. Bibliografía

Deberá entregarse a la semana siguiente de la práctica, en el laboratorio de genética molecular (Hangar de Acuicultura). Impreso y en pareja. Basado en una revisión bibliográfica, proponga modificaciones de los pasos de extracción suministrados en esta guía para optimizar y mejorar el proceso de extracción. Realice un análisis breve sobre qué método de extracción presenta mejor rendimiento de ADN en términos de cantidad. Mencione los pros y los contras.

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MATERIALES

5 muestras de tejido muscular de peces10 tubos de 1.5 ml esterilizadosAlcohol etílico al 70%Alcohol isopropílico BisturíUna aguja de disección5 cajas de Petri Papel absorbente Un baño de maría, un vortex, una microcentrifuga y micropipetas.

BIBLIOGRAFÍA

D. M. Hillis, C. Moritz y B. K. Mable (Ed), 1996. Molecular Systematics. Sinauer Associates, Inc. Publishers Sunderland, Massachusetts U.S.A. 655 pages

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