LABORATORIO 7: AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS.

Jessica Beltrán 1124564, jeka-beltran@hotmail.comChristian Andrés Zapata 1210315, cazs13@hotmail.com

Santiago de Cali, Colombia

Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad del Valle

Diciembre 14/2013

ABSTRACT

En la práctica se tomó el PH al acido amino acético con papel tornasol, y se hizo reaccionar con oxido de cobre; después se separó una solución de albumina de huevo en diferentes tubos de ensayo y se adicionó a cada uno etanol, acido clorhídrico, acido nítrico la cual luego se calentó, hidróxido de sodio al cual se le agregó formaldehido, sulfato de cobre y formol; se comprobó el carácter acido de los aminoácidos y se observo la formación de aminoácidos y proteínas a partir de las distintas reacciones.

KEY WORDS: clot, protein, reaction, filtration, amino acid.

INTRODUCIÓN:

Las proteínas son biopolímeros compuestos de muchos aminoácidos conectados unos con otros a través de enlaces amida (peptídicos). Presentan diferentes papeles en los sistemas biológicos. Algunas proteínas son los componentes principales de las estructuras de los tejidos (musculo cabello, piel, uñas). Otras transportan moléculas de una parte a otra en un sistema vivo. Otras incluso actúan como catalizadores para la gran cantidad de reacciones biológicas que son necesarias para mantener la vida. [1]

Fig. 1. Estructura de una proteína.

Las proteínas fueron nombradas y descritas por primera vez por el químico sueco Jöns Jakob Berzelius en 1838. Sin embargo, el papel central de las proteínas en los organismos vivos no se aprecia plenamente hasta 1926, cuando James B. Sumner mostró que la enzima ureasa es una proteína. La primera secuencia de proteínas que se descubrió fue la de insulina por Frederick Sanger. Las primeras estructuras de proteínas resueltas son la hemoglobina y la mioglobina, por Max Perutz y Sir John Cowdery Kendrew, respectivamente, en 1958. Las estructuras tridimensionales de ambas proteínas fueron determinadas por análisis de difracción de rayos-x. [2].

Los aminoácidos son las unidades químicas o “elementos constitutivos” de las proteínas; contiene aproximadamente 16% de nitrógeno. Los aminoácidos se combinan para formar proteínas del organismo. Todos los aminoácidos componentes de las

proteínas son L-alfa-aminoácidos. Por lo tanto, están formados por un carbono alfa unido a un grupo carboxilo (-COOH), a un grupo amino (-NH2), a un hidrógeno y a una cadena (habitualmente denominada cadena lateral o radical R) de estructura variable, que determina la identidad y las propiedades de cada uno de los diferentes aminoácidos. [3].

Fig. 2. Estructura general de un aminoácido.

Aproximadamente el 66% de los aminoácidos producidos se utilizan en la industria de alimentos, el 30% como aditivos de piensos y el 4% restante en medicina y cosmética así como material de partida en la industria química. Algunas aplicaciones de las proteínas en la industria: película, papel fotográfico, pinturas, colas, calzados, alimentos, detergentes, fibras, medicinas; entre otras.

PROCEDIMIENTO:

Para estudiar las propiedades de los aminoácidos y proteínas se realizaron diversas reacciones basadas en la albúmina. A continuación se describe brevemente en que consistió cada reacción:

En la primera reacción se mezcló 0.1 mL de solución al 2% de ácido

aminoácetico con 2 gotas de solución acuosa de fenolftaleína y no con tornasol como lo indicó la guía, en un tubo de ensayo.

En la segunda reacción se mezclaron 0.3 g de ácido aminoácetico con 5 mL de agua en un tubo de ensayo, adicionalmente se añadió 1 g de óxido de cobre (II) y se hirvió la mezcla para luego proceder a filtrar los residuos obtenidos y evaporarlos en baño maría.

En la tercera reacción se vertió 1 mL de clara de huevo en 4 tubos de ensayo y se realizaron las siguientes pruebas:

Tabla 1. Pruebas en 5 tubos de ensayo.

Prueba Tubo de ensayo

Calentar y medir temperatura

3

Agregar 4 mL de etanol

4

Añadir 5 gotas de HCl concentrado

5

Añadir 5 gotas de ácido nítrico concentrado

6

Añadir 5 gotas de solución concentrada de NaOH

7

Para la tercera reacción se vertió 1 mL de clara de huevo en 3 tubos de ensayo con los siguientes reactivos: al primer tubo se le añadieron 5 gotas de sulfato de cobre (II). Al segundo tubo de ensayo se le añadieron 5 gotas de solución al 5% de acetato de plomo (II) y para el tercer tubo de ensayo no se realizó prueba ya que el reactivo (cloruro de mercurio) es altamente peligroso y cancerígeno.

Para la cuarta reacción se añadió 1 mL de clara de huevo y 0.6 mL de ácido nítrico concentrado en un tubo de ensayo, se calentó y seguidamente se le añadieron 10 gotas de NaOH.

Para la quinta reacción se mezcló 1 mL de solución de clara de huevo con 1 mL de solución al 10% de hidróxido de sodio y 5 gotas de sulfato de cobre (II) en un tubo de ensayo y posteriormente se calentó.

Para la sexta reacción se mezcló 0.2 mL d solución de clara de huevo con 1 gota de solución diluida de formaldehído y 2 gotas de ácido sulfúrico concentrado.

RESULTADOS:

I. Ácidez de los aminoácidos:

Se encontró que la mezcla inicialmente era de color transparente y mantuvo su color luego de añadir la fenolftaleína.

II. Formación de una sal compleja de ácido aminoácetico:

En un principio la solución presentó coloración transparente, luego de añadir el óxido de cobre pasó a color marrón-negro. Al hervir se formaron dos fases, una líquida y una sólida; para obtener el precipitado (cristales azules, ver Imagen 1) en su forma más pura se realizó una filtración, los datos se muestran en la siguiente tabla:

Imagen 1. Cristales obtenidos al filtrar el exceso de óxido de cobre.

Tabla 2. Datos de filtración de cristales formados en la reacción.

Elemento Masa± 0 ,0001 gPapel filtro 2,182

Papel filtro con precipitado

2,270

Precipitado 0,088

Después de obtener el precipitado, se calculó su % de rendimiento:

g expermientalesg te ó ricos

·100 %

0,088 g0,554 g

· 100 %=15 %

III. Coagulación de la albúmina:

Para el primer tubo se observó una coloración blanco-lechoso. Luego de calentar la solución, la temperatura marcada por el termómetro fue de 76º C y ésta presentó coagulación de color blanco. Para el segundo tubo se observaron 2 fases en la que una estaba la coagulación de color blanco. Para el tercer tubo de ensayo se observaron 2 fases, una de color blanco-lechoso y otra en la que se formó un coagulo de color blanco. Para el cuarto tubo de ensayo se observaron 2 fases, una de color blanco-lechoso y otra en la que se presentó un coagulo de color amarillo. Para el quinto tubo de ensayo se observa que la solución toma una coloración transparente y no se formó coagulo.

IV. Precipitación de proteínas con metales pesados:

Para el primer tubo de ensayo se observó una coloración verde claro con formación de un coagulo de color turquesa. Para el segundo tubo de ensayo se observó un coagulo de color blanco en la solución.

V. Reacción Xantoproteica:

Para esta reacción se observó que cuando se añade ácido nítrico concentrado la solución toma un color amarillo, cuando se adicionó NaOH se observaron 2 fases; una amarilla y otra de color naranja en forma de coagulo.

VI. Reacción de biuret:

Para esta reacción se observó que inicialmente cuando se mezcló hidróxido de sodio con sulfato de cobre (II) la solución tomó una coloración morada y al calentar la coloración cambió a negro.

VII. Reacción coloreada del formaldehído para proteínas:

Inicialmente la solución era de color transparente, al adicionar el formaldehído no se observaron cambios de coloración. Al añadir las gotas de ácido sulfúrico concentrado se formó un precipitado blanco.

A continuación se muestran fotos de los resultados obtenidos durante este proceso:

Imagen 1. Reacciones de acidez de

aminoácidos y coagulación de la albúmina.

Imagen 2. Reacciones de precipitación de proteínas con metales pesados, reacción xantoproteica, reacción de biuret y reacción coloreada del formaldehido para proteínas.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS:

Ácidez de los aminoácidos:

En los resultados se encontró que el color de la solución no cambió, para explicar esto se hace necesario tener en cuenta el pKa de la glicina ya que con este se puede deducir si la fenolftaleína afectó o no la reacción.

pKa 1 = 2,3 pKa 2= 9,4

Debido a que existe más de un pKa, el compuesto posee carga neutra en su estructura, y por tanto el pI (punto isoeléctrico) es equivalente al pH.

pI= pKa 1+ pKa 22

pI=2,3+9,42

=5,85≅ 6

El resultado anterior sugiere que el pH de la glicina es ácido, esto es debido a que la fenolftaleína al disolverse en un medio ácido (glicina) permanece incoloro a su vez que es un ácido débil porque pierde cationes H+. Si se

encontrará en un medio básico cambiaría a un color rosa o violeta.

Fig. 1. Estructura de la glicina.

A continuación se muestra las ecuaciones de grupos carboxilo y amino disociado en sus respectivos iones:

R−COOH ↔ R−COO−¿+H +¿ ¿¿

R−N H3+¿ ↔ R−N H 2+H +¿ ¿¿

Ecuación 1. Disociación de iones de grupos carboxilo y amino.

El grupo carboxilo se disocia en agua para producir un anión carboxilato y un ion hidronio (ver Ecuación 2).

Ecuación 2. Iones del ácido carboxílico.

Lo que hace que tenga el comportamiento ácido se basa en dos razones: que el carbono carbonílico lleve una carga positiva significativa (δ+), esto hace que se distribuya la carga entre los enlaces porque se da el desplazamiento una carga negativa en el átomo de oxígeno adyacente, que es exactamente lo que ocurre cuando se ioniza un protón a partir del grupo hidroxilo. La carga negativa se dispersa de forma equivalente sobre los dos oxígenos, de manera que en el ion carboxilato cada oxigeno sobrelleva solamente la mitad de la carga negativa.

En cuanto al grupo amino, éste tiene un par de electrones no compartidos por parte del nitrógeno lo que hace que su comportamiento sea básico.

Fig. 2. Estructura de una amina.

Formación de una sal compleja de ácido aminoácetico:

En esta reacción se forma una sal llamada glicinato de cobre a partir de la glicina y el óxido de cobre (II). La mayoría de los iones metálicos reaccionan con donadores de electrones formando compuestos de coordinación o complejos. La especie donadora (ligando) debe tener por lo menos un par de electrones no compartidos para formar el enlace. Un ligando que sólo tiene un grupo donador disponible, como el amoniaco se denomina unidentado. Mientras que los que tienen dos grupos, como la glicina, se llaman bidentados. [3]

Fig. 2. Reacción de glicina y óxido de cobre (II).

Esta formación de complejo neutro dada por la glicina y el oxido de cobre (Cu ¿) explica el cambio de coloración de la solución luego de ser sometida al calor, el color negro del precipitado indica el exceso de óxido de cobre (II). La coloración de los cristales formados luego de la filtración.

Coagulación de la albúmina:

En la prueba 1 se formó el coagulo de la albúmina, esto es debido a un factor principal: al someter a una proteína a altas temperaturas como sucedió en la práctica, la proteína se desnaturaliza, es decir, pierde la forma de su estructura terciaria y pasa de una forma enroscada a una forma desplegada.

La hélice alfa se estira o despliega, por rompimiento de enlaces de hidrógeno. En la proteína desnaturalizada ocurren cambios estructurales que afectan sus propiedades biológicas, como la hormonal, enzimáticas y la actividad inmunológica. . Se produce una pérdida de solubilidad, ya que se exponen grupos hidrofóbicos que hacen insoluble la proteína. La desnaturalización es generalmente un proceso irreversible, fuertemente endotérmico, que produce un aumento de la entropía o desorden del sistema. [10]

Fig. 3. Proceso de desnaturalización de la estructura terciaria de una proteína.

En la segunda prueba ocurre la esterificación del grupo carboxilo. Los ácidos carboxílicos pueden transformarse directamente en ésteres al calentarlos con alcoholes en presencia de una cantidad catalítica de ácido mineral (generalmente H 2 S O4). Esta reacción forma agua como subproducto

y es reversible [11]. A continuación se muestra su ecuación:

Fig. 4. Reacción de albúmina y etanol.

Para favorecer el equilibrio hacia la derecha suele usarse uno de los reactivos en exceso (generalmente el alcohol) [11]. Este tipo de reacción resulta de gran utilidad para modificar temporalmente, o proteger alguno de los grupos funciones, especialmente durante la unión controlada de los aminoácidos para formar péptidos o proteínas. [1]

En la tercera prueba se encuentra que al adicionar el ácido clorhídrico en la albúmina este se coagula debido a que se genera una reacción de formación de sal, donde se protege al grupo ácido (HCl) generando el aumento de los iones H+¿¿ en la solución, esto explica el color blanco del coagulo.

Fig. 5. Reacción de albúmina y HCl.

En la cuarta prueba la coagulación de la solución fue dada por la nitración electrofilia aromática en donde el nucleofilo (nitrógeno) ataca al anillo sustituyendo uno de sus hidrógenos por nitrógeno. A continuación se describe el mecanismo de reacción:

Fig. 6. Mecanismo de nitración electrófila a aromática.

El electrófilo es el ion nitronio, NO2+,

que se genera del ácido nítrico, por protonación y perdida de agua. Este ion genera un carbocatión intermediario, cuando este pierde un protón se genera el nitrobenceno como producto de sustitución [12]. Este tipo de reacción se caracteriza principalmente por el cambio de coloración, en donde parte de ser incolora a ser de color rojizo o amarillo, ya que estos compuestos poseen una oxidación muy tóxica.

Fig. 6. Reacción de albúmina y ácido nítrico.

En la última prueba de esta secuencia de reacciones se da lugar a la formación de sales a partir del componente ácido de la albúmina.

Fig. 7. Reacción de albúmina e hidróxido de sodio.

Precipitación de proteínas con metales pesados:

Reacción Xantoproteica:

Reacción de biuret:

Reacción coloreada del formaldehído para proteínas:

SOLUCIÓN A LAS PREGUNTAS DE LA GUÍA:

1. ¿En qué consiste la prueba de millón? ¿Cuales proteínas dan positiva esta prueba? ¿Cuál es la reacción química fundamental?

El reactivo de millón es una mezcla de nitrato mercuroso y mercurio en ácido nítrico; que sirve para saber si existe tirosina en la solución, si esto es así se genera un coagulo blanco que por calentamiento pasa al rojo carne. [4]. Es decir que esta prueba da positiva para las proteínas que contienen el aminoácido tirosina.

Fig.54. Reacción química fundamental de la prueba de millón.

2. ¿Por qué el acido nítrico colorea la piel de amarillo? ¿Qué sucede en esta reacción?

Esto se debe a que ocurre una "reacción xantoproteica". Ya que El ácido nítrico, un oxidante fuerte. Lo que ocasiona que reaccione con grupos S-H de la metionina y puente S-S entre cisteínas, formando nitro derivados lo cual se traduce en un color amarillento de la piel, que sólo se irá cuando la capa de piel mude.

3. Describa el ensayo de la reacción coloreada del formaldehido para proteínas.

Este ensayo constituye la formación de una imina, esto se da por que la reaccionar una proteína con el formol (formaldehido), se forma una proteína más compleja, ya que, el doble enlace del aldehído se va a romper por acción de los hidrógenos del grupo amidas, de la proteína (albumina), formando a si la imina correspondiente y agua, y esta proteína se va manifestar de color.

El procedimiento que describe esta reacción es el siguiente:

En un tubo de ensayo se ponen 0.2 mL de una solución de clara de huevo y se añade una gota de solución diluida de formaldehido. A continuación se agrega con cuidado acido sulfúrico concentrado, de tal forma que este forme una capa separada en el fondo del tubo. [5].

4. ¿Qué es una proteína globular?

Son moléculas redondeadas y compactas generalmente solubles en agua. [6].

Figura 4. Estructura general de una proteína globular.

Estas proteínas realizan funciones biológicas dentro de las cuales están: catalizadores biológicos; mensajeros químicos que regulan los procesos biológicos, acarreadores de moléculas

pequeñas de una parte a otra del organismo, como la hemoglobina que transporta el oxigeno en la sangre; actúan como almacenes de alimentos; un ejemplo es la ovulina de la clara de huevo [1].

5. ¿Qué es el punto isoeléctrico de una proteína?

El punto isoeléctrico de una proteína.es un pH en el cual la molécula de proteína no lleva carga neta, ya que es ese pH en el que la proteína es electroforéticamente inmóvil. [7].

El cálculo de este está dado por:

pI= pKa 1+ pKa 22

6. Escriba formulas de los siguientes aminoácidos: alanina, leucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, cisteína, arginina histidina, tirosina.

Alanina:

Leucina:

Valina:

Prolina:

Fenilalanina:

Triptófano:

Cisteína:

Arginina:

Histidina:

Tirosina:

7. ¿Cómo se determina la presencia de azufre en las proteínas?

Se puede determinar mediante la reacción de aminoácidos azufrados, ya que se pone de manifiesto la presencia del azufre por la formación de un precipitado negruzco de sulfuro de plomo. Esta reacción da positiva, con aminoácidos que presentan azufre en su estructura. Cuando se pone a baño maría, con el hidróxido de sodio se forma una precipitación de tipo lechoso, cuando se agrega acetato de plomo se separa la fracción que contiene azufre de la fracción aminoácida para reaccionar con el acetato de plomo, de tal forma que forme un precipitado de color café oscuro-negruzco, esto indica la presencia de azufre en la proteína. [8].

8. Escriba las ecuaciones de las reacciones efectuadas durante el desarrollo de la práctica.

CONCLUSIONES:

BIBLIOGRAFÍA:

[1]. HART, H. “Química Orgánica”. 12 Editorial. Mc Graw Hill. 2007. Pág. 290, 490, 491, 492, 493, 469, 502, 515.

[2]. “Historia de las proteínas”. Alimentos y Proteínas. Consultado el: 11 de Diciembre 2013. Disponible en: http://alimentosproteinas.com/proteinas

[3]. Phyllips A. “Recetas nutritivas que curan” Editorial Elliot Glass. 1998. Pág. 36.

4. “Métodos cuantitativos para la identificación de aminoácidos y proteínas”. Prueba de Millón. Consultado el: 11 de Diciembre 2013. Disponible en: http://tuylaquimica.files.wordpress.com/2012/02/reactivos-y-proteinas.pdf

[5]. INSUASTY, B, RAMÍREZ, A. “Aminoácidos y proteínas”. Guía de Laboratorio de Química Orgánica. Universidad del Valle.

[6]. Diccionarios Oxford – Complutense. “Biología”. Ed. Complutense S.A. 2004. Pág. 85

[7]. J.G. Morris. “Fisicoquímica para biólogos”. Editorial Reverté S.A. 2001. Pág. 163.

[8]. “Reconocimiento De Proteínas”. Uniquíndio. Consultado el: martes 11 de diciembre de 2013. Disponible en: http://www.uniquindio.edu.co/uniquindio/ntic/trabajos/10/davidyoscar/paginas/recprot.htm

[3]. “Reacciones de formación de complejos”. Consultado el: 11 de Diciembre 2013. Disponible en: http://www.uia.mx/campus/publicaciones/quimanal/pdf/8formacioncomplejos.pdf

[10]. http://www.forest.ula.ve/~rubenhg/proteinas/

[11]. http://objetos.univalle.edu.co/files/Acidos_carboxilicos_y_sus_derivados.pdf

[12]. http://www.textoscientificos.com/quimica/aromaticos/sustitucion-aromatica