Laboratorio de Genética Molecular de Eucariotas 2010-22012.igem.org/wiki/images/6/60/Transf.pdf ·...
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Transformación
Laboratorio de Genética Molecular de Eucariotas
2010-2
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!Vamos a meter el plásmido en la bacteria!
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Transformación
Se refiere al proceso de alterar una célula de forma que adquiera
y exprese material genético del ambiente que la rodea
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Transformación
• Esferoplástos
– Células desprovistas de pared por digestión enzimática – Permeabilización exceso Ca++
– Organismos que no pueden inducir competencia
• Electroporación
• Acetato de Litio (LiAc) – Cloruro de Calcio (CaCl2) – Simple – Altamente Reproducible – Plásmidos autoreplicativos – Plásmidos integrativos
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Electroporación
• Pulso electrico crea poros acuosos por donde entra el ADN
– Porceso reversible
– Estabilidad a <10ºC
– http://gmcrops.yolasite.com/resources/IMG_electroporation.gif
– Difusión
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Electroporación
• Pulso electrico crea poros acuosos por donde entra el ADN
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Electroporación
• La eficiencia de transformación aumenta con valores grandes de E tau ½ – 2,2-4,6 ms
• Pulso depende del organismo y de la longitis de la cuveta – 1,25V
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Electrocompetencia
• Fase óptima de crecimiento – OD600=0,3
• Log temprana
– OD600=0,7-0,8 • Log media
• Lavados – Retirar exceso de sales
• Prevenir “arcing” • Disminuir conductividad
– Aumentar resistencia
• Glicerol – Conservar a -80
ON DH5a
OD600=0,8
Detener crecimiento
Concentrar
Lavar
Resuspender buffer con baja fuerza iónica
Almacenar
x3
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Transformación Química
• Utiliza CaCl2 para facilitar la unión del ADN a las paredes de las células
• Heat-shock (42ºC)
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• Löfblom et al, 2007
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Electroporación
• Electroporador
• Fácil y rápido
• Cantidad de ADN directamente proporcional a eficiencia de trasnformación
• 1x109-10 UFC/ug ADN
Transformación Química
• Conocimiento previo
• Más largo
• Saturación a altas concentraciónes de ADN
• 1x104-6UFC/ug ADN
Quimiocompetencia
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¿Cómo selecciono las bacterias que adquirieron el plásmido
(transformantes)?
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• Resistencia a antibiótico
– Topo: Kan-Amp
• Presencia de un marcador de selección
• Suceptiblidad a sucrosa
– SacB
• Blue/White screening
– Topo: LacZ interrumpido
¿How to make your own plasmid? Seleccionar
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¿How to make your own plasmid? Confirmar
• PCR
• Mapa de restricción
• Secuenciación!
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¡Vamos a sacar el plásmido de la bacteria!
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Miniprep
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Miniprep
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• ¿Qué es miniprep?
• ¿Soluciones?
• ¿SDS?
• ¿NaOH?
Entonces…
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Plásmido en gel
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Plásmido en gel