LABORATORIO No.5 DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE ALGUNOS

COMPONENTES DEL PROTOPLASMA CÉLULAR INTRODUCCIÓN Las biomoléculas son compuestos de carbono con una variedad de grupos funcionales y se encuentran jerárquicamente organizados en las células. La versatilidad de los átomos de carbono para formar enlaces covalentes sencillos y dobles principalmente, es de gran significancia biológica porque a partir de ellos se establecen unidades monoméricas como los monosacáridos, aminoácidos y nucleótidos. La polimerización de estas unidades monoméricas primarias permite la aparición de un segundo nivel de complejidad al que pertenecen macromoléculas como los polisacáridos (almidón y glucogéno), proteínas (albúmina e histonas) y ácidos nucleicos (DNA y RNA). Las interacciones de macromoléculas a través de diferentes tipos de fuerzas intermoleculares y mecanismos complejos de empaquetamiento, permiten la conformación de las diferentes organelas (membranas plasmáticas) y estructuras supramoleculares, como los cromosomas. Finalmente la interacción conjunta de las biomoléculas en sus diferentes niveles de organización permite la conservación de la estructura y funcionamiento de las células (Ver Figura No. 5.1).

En esta práctica se estudiarán los dos ¡primeros niveles de complejidad estructural de algunas biomoléculas, para lo cuál el estudiante deberá consultar acerca de sus características y propiedades físico- químicas, de forma tal que pueda comprender los resultados de los ensayos que aquí se realicen. 5.1 OBJETIVOS 5.1.1 OBJETIVO GENERAL: ♦ Identificar en forma cualitativa la presencia de algunos componentes que se encuentran en el protoplasma cellular. 5.1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ♦ Determinar mediante métodos cualitativos la presencia de carbohidratos, lípidos, proteínas, enzimas y ácidos nucleicos en muestras de materia viva. ♦ Reconocer la composición química de los reactivos que se utilizan en la identificación de los compuestos protoplasmáticos. ♦ Investigar las reacciones que se producen en la identificación de los compuestos protoplasmáticos.

Figura No. 5.1. Biomoléculas

5.2 MATERIALES: ♦ Tubos de ensayos ♦ Pipetas ♦ Goteros ♦ Gradillas para tubos de ensayos ♦ Mechero de alcohol ♦ Pinzas ♦ Reactivo de Benedict ♦ Solución de glucosa al 3% ♦ Fruta madura ♦ Levadura activa ♦ Almidón ♦ Macerado de pan ♦ Lugol ♦ Solución de clara de huevo ♦ Solución de gelatina sin sabor ♦ Suero fisiológico ♦ Hidróxido de sodio al 10% ♦ Sulfato de cobre al 0.5% ♦ Aceite vegetal ♦ Grasa animal ♦ Sudan III o IV ♦ Baño de maría ♦ Agua destilada ♦ Solución sanguínea ♦ Suspensión de levadura activa ♦ Reactivo de difenilamina ♦ Papel filtro ♦ Anhídrido acético ♦ Cloroformo ♦ Ácido Sulfúrico concentrado ♦ Solución reactivo de almidón al 1% 5.3 PROCEDIMIENTO: 5.3.1. Determinación de carbohidratos: 5.3.1.1 Monosacáridos: a. En un tubo de ensayo se vierten 5ml del reactivo de Benedict, y se calienta hasta ebullición. No debe cambiar de color. b. Se añade al mismo tubo de ensayo 1ml de una solución de glucosa y se calienta hasta ebullición. ¿Qué color aparece? Una turbidez verde indica de 0.1 a 0.3% de azúcar reductor, y un precipitado rojo naranja o rojo ladrillo, indica que la concentración de azúcar supera el 1.5%. Ver figura No. 5.2 c. Macere un pedacito de fruta madura y adiciónela a un tubo de ensayo que

contiene 5 ml de reactivo de Benedict. Caliente hasta ebullición. ¿Nota algún cambio? Analice sus resultados y saque conclusiones.

Figura No. 5.2 Prueba de Benedict. 5.3.1.2 Polisacárido: a. Haga una suspensión acuosa de almidón y vierta en un tubo de ensayo 2ml de ella. b. Agréguele a la anterior solución dos gotas de solución de lugol. ¿Qué cambio se experimenta? Anote los resultados. Caliente hasta ebullición esta solución por dos minutos, ¿Se experimenta algún cambio? Deje el tubo de ensayo en reposo hasta que se enfríe. ¿Qué sucede? Ver figura No. 5.3 c. Deposite dos gotas de lugol en una solución acuosa de un macerado de pan, ¿Qué sucede? Saque conclusiones

Figura No. 5.3. Determinación de almidón

5.3.2 Proteínas: a. Diluya la clara de huevo en 50ml de suero fisiológico o en agua. b. A 1ml de la solución anterior se añaden dos gotas de sulfato de cobre al 0.5% y 1ml de hidróxido de sodio al 10%, ¿Se produce algún cambio? c. En un tubo de ensayo, coloque 2ml de solución de gelatina sin sabor, y proceda como en el caso anterior. Agregue dos gotas de sulfato de cobre y 1ml de hidróxido de sodio agite y anote los resultados.

Figura No. 5. 4 Determinación de Proteínas 5.3.3 Lípidos: a. Coloque en un tubo de ensayo 3ml de agua. Agregue una pizca del reactivo Sudan III agite y observe, anote los resultados. b. En el mismo tubo de ensayo adicione 1ml de aceite vegetal, agite nuevamente y deje en reposo por unos minutos. Luego observe y anote los resultados. c. En otro tubo de ensayo coloque 2ml de grasa animal y agregue una pizca de Sudan III. Si la grasa está solidificada caliente un poco para derretirla. Agite y anote los resultados, comparándolos con los del tubo anterior. Saque conclusiones.

Figura No. 5.5. Determinación de Lípidos

5.3.3.1. Reacción de Lieberman Burchard para colesterol: a. Diluya una parte de la yema de huevo en 10 ml de cloroformo. b. Tome 1 ml de la solución clorofórmica y colóquelo en un tubo de ensayo limpio y seco. c. Adicione 1 ml de anhídrido acético. d. Adicione 3 a 4 gotas de ácido sulfúrico concentrado. e. Agite suavemente y observe los cambios de coloración. Si el resultado es azul-verdoso la prueba es positiva para colesterol puro y los demás resultados con menor intensidad de color rojo/café, son pruebas positivas para ergosterol, aunque con menor proporción de colesterol en su contenido. El ensayo con la yema de huevo será positivo cuando aparezca la coloración café pálida. 5.3.4 Enzimas: a. En un tubo de ensayo limpio y seco coloque un embudo pequeño con papel filtro. Enjuáguese la boca con suero fisiológico y descarte. b. Sí es necesario mastique un trocito de parafina (vela) y la saliva secretada viértala sobre el embudo, recogiendo la saliva filtrada en el tubo. c. Coloque, en una serie de 5 a 10 tubos de ensayo, dos gotas de lugol en cada uno. d. En otro tubo coloque 10mL de suspensión acuosa de almidón y añadale 1ml de saliva y agite. e. Cada 20 segundos pase 1mL de la mezcla almidón más saliva a cada uno de los tubos de la serie, hasta que no se produzca coloración. Observe la variación de los colores a lo largo de la serie. f. Caliente a ebullición otra muestra de saliva y repita todo el experimento.

Figura No. 5.6 Determinación de colesterol

Figura No. 5.7 Actividad enzimática 5.3.5 Ácidos Nucleicos: a. Numere tres tubos de ensayo bien limpios y en cada uno de ellos ponga las siguientes sustancias: Tubo No. 1 = 3 ml de agua destilada Tubo No. 2 = 3 ml de suspensión de levadura activa Tubo No. 3 = 3 ml. de solución sanguínea b. Agregue a cada tubo 5 ml del reactivo difenilamina y coloque luego todos los tubos en baño de maría durante 15 minutos. Observe y anote los resultados después de haberse enfriado todos los tubos.

Figura 5.8. Determinación de Ác. Nucleicos

5.3 CUESTIONARIO: • ¿Que es un azúcar reductor? • Cite ejemplos de azucares reductores y no reductores • ¿Cuales son los componentes del reactivo de Benedict? • ¿Que reacción se produce cuando se calienta el tubo de ensayo que contiene el reactivo de Benedict y glucosa? • ¿Cuál es la naturaleza del precipitado de color rojo ladrillo que se forma en la anterior reacción? • ¿Cual es la composición química del lugol? • ¿A que se debe la desaparición del color azul violáceo de la solución de almidón cuando se calienta hasta ebullición? • ¿Por qué aparece nuevamente el color cuando la anterior solución se enfría? • ¿En que consiste la reacción del biuret? • ¿En que consiste la reacción xantoproteica? • ¿Que es el Sudan III? • ¿Por qué es necesario incluir en el experimento de ácidos nucleicos un tubo con agua? • ¿Considera que las levaduras contienen más RNA que DNA? • ¿Que indica la reacción en el caso de la suspensión de células sanguíneas?

5.5 ENLACES: •http://ww w.ibiblio.org/virtualcell/index.htm: Página sobre una visita virtual a la célula, con muy buenos dibujos y animaciones. Incluye además un “libro virtual” sobre química orgánica y biología celular. Puede descargarse completa en un archivo comprimido e instalarla en el propio ordenador. • http://ww w.acdlabs.com/ Página para descargar programas que permiten elaborar estructuras tridimensionales de las moléculas y con múltiples enlaces a tutórales de biomoléculas. • http://ww w.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/q uery.fcgi?DB=pubmed Busca en esta página las bases de datos de proteínas y modela alguna de ellas. Retornar a tabla de contenido.