Las plaquetas median la destrucción de parásitos de malaria intraeritrocíticos y median la supervivencia a la infección.

Brendan J. McMorranTansania, Australia.

SCIENCE VOL 323 6 FEBRERO 2009

PRESENTA:

Edgar L. Martínez Salazar. Estudiante de Medicina IX semestre Universidad de Antioquia.

CONTENIDO

• Introducción• Artículo• Objetivo• Metodología• Resultados• Conclusiones

• Preguntas y discusión.

OBJETIVO• Explorar el papel plaquetario en el curso de la infección por

malaria en un modelo murino, P. chabaudi e Invitro usando el cultivo de P. falciparum humano.

• HIPÓTESIS• La primera infección por malaria mostraría una trombocitopenia

asociada a una respuesta inmune adaptativa mediada por plaquetas, mientras que la inmunidad por malaria que se adquiere en sitios endémicos podría estar explicada por el secuestro plaquetario a la vasculatura y estaría asociada más a complicaciones.

INTRODUCCIÓN• La inmunidad adaptativa • Respuesta inmune innata Limita el crecimiento del parasito

en el GR supervivencia• Primeros años de vida parasitemia/gravedad clínica.

http://www.immunopaedia.org.za/fileadmin/gallery/Malaria/malaria4.jpg

INTRODUCCIÓN• Primera barrera: GR• Trombocitopenia P. falciparum, P. vivax y P. chabaudi.• Trombocitopenia Gravedad y Parasitemia • Adhesión plaquetaria GRP• Plaquetas Enfermedades Infecciosas.

http://3.bp.blogspot.com/_8bm6OtHuayY/SpiBNNE06bI/AAAAAAAAANM/QqW-D3ZjaF8/s1600-h/plaquetas_www.arauto.uminho.pt.jpg

INTRODUCCIÓN

METODOLOGÍA

C57BL/6 fueron infectados con 150 ul P. chaubadi

Al alcanzar 5-15% Parasitemia., fueron cultivadas por punción retroorbital y diluidas en HEM precalentado.

Inocularon 100ul IV de GRP en ratones para experimento.

Recogen sangre de punción cardíaca y analizan

A las cohortes se les suministró ASA (25 mg/kg V.O.) o vehículo (salino) desde el día antes de la infección hasta 10 días después.

Infección experimental con P. chabaudi en los ratones.

METODOLOGÍACultivo de P. falciparum

Cepa de P. falciparum 3D7 Se mantuvo parasitemia entre 1 y 10% en eritrocitos AB+ humanos en atmosfera de 1% O2/5% CO2

Suplementó con: -1X glutamax, 0.2%- Albumax 4% combinada con suero

humano AB+- 10 mM D-glucose, 25 μg/mg- Gentamicina- 6 mM HEPES- Hipoxantina0.2 mM

METODOLOGÍAPreparación de plaquetas humanas lavadas.

Sangre humana

Centrifugación e Incubación 37 C°

Plasma rico en plaquetas es separado de otros componentes sanguíneos por centrifugación.

Las plaquetas se sedimentaron (1700g centrifugación, 7 min) y se resuspendieron en buffer de lavado

Nuevamente se sedimentaron (1500g 7 min) y resuspendieron en buffer.

Análisis plaquetario

Se confirmó la integridad y funcionalidad plaquetaria

Incubado por 15 minutos

Incubado por 15 minutos

METODOLOGÍAPlatelet incubation with P. falciparum cultures

Las plaquetas fueron pre-tratadas con componentes inhibitorios, antes de adicionarla a los parasitos.

Sincronización de parásitos en el estadio de trofozoito. Y diluido en sangre no infectada parasitemia de 0,5%

Las plaquetas fueron adicionadas al parasito en 1/5 del volumen de cultivo final

Un volumen equivalente de Buffer fue adicionado en cultivos de control,

METODOLOGÍATinción TUNEL en extendido de sangre periferica

Extendido de sangre

Se incubaron las laminas con mezcla enzimática etiquetada dUTP

4 h a 37°C

Marca con anticuerpos anti-BrdU

Lavado

Se incuban las laminas por 30 minutos en la oscuridad con biotina anti CD41 humano o anti CD41 raton

Evaluación microscópica x1000

Al menos se contaron 100 parasitos por extendido. Y fueron identificados como fragmentos de DNA si se teñian para TUNEL.

METODOLOGÍA

• Se indujo lisis con Fenilhuidrazina.• A los ratones se les injecto dos veces clorhidrato de fenilhidrazina

(PH) 0.06 mg/g • En dos días consecutivos con una diferecia de 24 h• Los animales fueron sacrificados en el día 7 despúes de la

primerea inyección y sus bazos fueron pesados.

Evaluación de cinética eritroidea

METODOLOGÍA• Immune status of Mpl-/- and C57BL/6 mice during P.

chabaudi infection.• Mice were infected with 1x104 infected RBC, cohorts

sacrificed at indicated days post infection and analysed for T-cells (CD3, CD3 and CD4, or CD4 and CD8 positive) and B-cells (B220 positive) by immunostaining and flow cytometry

METODOLOGÍACitometría de flujo de GR de ratón adheridos a plaquetas.

Citometría de flujo de GR humanos adheridos a plaquetas.

Análisis inmunológico de ratones infectados.

Análisis de citoquinas en plasma.

METODOLOGÍA

• % de crecimiento parasitario/función plaquetaria• Modelo de P. falciparum• Incubación de las plaquetas en antagonistas específicos• Agregamos diferentes componentes.• Para determinar los requirimientos de ADP un importante

regulador de la actividad plaquetaria, nosotros incubamos los cultivos de P. Falciparum+plaquetas con ADPasa, to remove estracellular ADP from culture medium.

RESULTADOS

(Mpl -/-)

10 veces menos plaquetas

C57BL/6

C57BL/6

MUERTE MUERTEP. chabaudi

P < 0.0001

RESULTADOS

• 5% C57BL/6• 50% Mpl −/−

• 20% C57BL/6• 100% de Mpl −/−

MUERTES

RESULTADOS• El número de plaquetas disminuyó concomitantemente con la

aparición de parásitos en la circulación periférica en ambos grupos.

(Mpl -/-) C57BL/6

RESULTADOSLa cinética eritropoyetica

RESULTADOS• Durante la inducción de lisis experimental tampoco se

observaron cambios en la cinetica eritrocitaria entre las cepas.

• Solución salina.• Clorhidrato de fenilhidrazina.

RESULTADOS

No hubo diferencias

RESULTADOS• ASA Inhibe Cicloxigenasa 1 y 2 Disminución de

tromboxano A2 Disminución de activación plaquetaria

• BAJA AGREGACIÓN

http://static.tantasalute.it/625X0/www/tantasalute/it/img/aspirina-compresse.jpg

RESULTADOS

RESULTADOS• Inhibición concentración dependiente.

Relación de cultivos P. falciparum/plaquetas

Reducción en esquizontes maduros en 5 horas y nuevos anillos en 21 a 29 horas

RESULTADOS• La activación plaquetaria mediada por ADP es mediada por

dos receptores metabothrophicpuronergic, P2Y1 y P2Y12. El antagonismo de P2Y1 abolio la actividad destructiva de la plaqueta sobre el parasito, pero no ocurrio al bloquear P2Y12.

RESULTADOS

1. Adenilciclasa activa PGE1Suprime actividad plaquetaria Suprime función inhibitora del crecimiento

2. La exposición a NO tuvo un efecto parecido.

3. Crecimiento parasitario normal plaquetas y ADPasa.

4. La activación plaquetaria mediada por ADP es mediada por dos receptores. El antagonismo de P2Y1 abolio la actividad destructiva de la plaqueta sobre el parasito, pero no ocurrio al bloquear P2Y12.

RESULTADOS• AspirinaP. chabaudi en los ratones Previno la inhibición del

crecimiento parasitario mediado por plaquetas• Aproximación clínica:• Voluntario donador de plaquetastomo aspirina oral 2 veces al dia

(4,2mg/kg) por una semana antes de donar la sangre para la purificación de plaquetas.

• Estas plaquetas fueron incapaces de inhibir el crecimiento de P. falciparum

RESULTADOS• Ratones infectados Plaquetas unidas a GRP

DOBLE

RESULTADOS• El CD41 (Ag plaquetario) en la superficie de GRP sirvio como

un marcador de la adhesión plaquetaria.• Los GRP se marcaron 3 veces más para CD41 comparado a los

GR no parasitados.

¿?

RESULTADOS• Humanos infectados: El numero de GRP unido a plaquetas

humanas fue dos veces y los GRP marcados con CD41 fueron el doble.

DOBLE

DOBLE

RESULTADOSEtapa tardía de infección:• Estadio de anillo: Flecha verde, teñidos solo con Hoechst.• Merozoitos extracelulares: Se tiñen con TUNEL Y Hoeschst Anticipa que el

merozoito morira.

RESULTADOS• En los ratones con bajas parasitemias (día 7), la coloración de

parasitos intraeritrociticos con TUNEL fue evidente, indicativo de la muerte de parasitos intraeritrociticos.

RESULTADOS• Se observaron 2 veces más muertes de parásitos

intraeritrociticos en ratones C57BL/6 que en Mpl -/-.

DOBLE

RESULTADOS• Diferencia entre las parasitemias de las dos cepas durante el

tiempo, mostrandose más altas en los días 9 y 10 para Mpl-/-.

RESULTADOS

• Parasitos intracelulares coloreados con TUNEL fueron tambien observados en cultivos de P. falciparum.

3 veces

marcado NO marcado

CONCLUSIONES• Las plaquetas median inihbición del crecimiento de cultivos de Plasmodium falciparum en GR• La mayoría de los parasitos observados durante la inhibición del crecimiento parasitario mediado por plaquetas

fueron trofozoitos y esquizontes maduros. La reducción en esquizontes maduros en 5 horas y nuevos anillos en 21 a 29 horas sugiere que las plaquetas estuvieron inibiendo el desarrollo de maduración de los parasitos.

• El crecimiento de P. falciparum es inhibido por plaquetas en una concentracion dependiente y mecanismo de activación-dependiente, que requiere ADP y activación a través del receptor P2Y1.

• La inhibición farmacológica de la función plaquetaria incrementa la suceptibilidad a la infección por malaria en los ratones aunque otros efectos indirectos de la aspirina no pueden ser excluidos.

• El mantenimiento de concentraciones altas intracelulares de ADM y GMP son mecanismos claves en suprimir la activación plaquetaria.

• La aspirina puede ser potencialmente peligrosa en infecciones por malaria.• Las plaquetas se unen selectivamente a los GRP.• La desstrucción del parasito mediada por plaquetas, tiene impacto en la parasitemia, lo que resulta en parasitemia

mayores para ratones Mpl -/- , lo que puede explicar su mayor suceptibilidad. • El mayor numero de parastios intraeritrociticos muertos en presencia de un numero normal de plaquetas in vitro e

invivo implica que las plaquetas destruyen directamente los parasitos de malaria.• La alta mortalidad en los ratones deficientes en plaquetas y la destrucción directa de P. falciparum por plaquetas

humanas indica que las plaquetas son importantes en el control de la infección por malaria. La trombocitopenia ocurre tempranamente en la infección en ambos humanos y ratones, antes de las formas graves de la enfermedad se desarrollen. Por lo tanto la principal efecto protector de las plaquetas podría ser en la fase temprana de la enfermedad. La modulación del crecimiento del parasito por plaquetas podría amortiguar la tasa de crecimiento del parasito y permitir el desarrollo de la respuesta inmune adaptativa. Este hallazgo es adicional al papel bien establecido de las plaquetas en la malaria cerebral. Nosotros hemos mostrado que la inhibición de la activación plaquetaria deroga el efecto protector, lo cual puede explicar el efecto deleterio de la aspirina puede tener en el desenlace de la malaria.