Lección 3 1

LECCIÓN 3. Caracterización mediante marcadores moleculares - ADN.

Lección 3 2

• Analizan directamente la molécula de ADN.• Detectan ciertas variaciones en la secuencia de ADN.

Base púrica

Base pirimidínica

Desoxirribosa

Grupo fosfato

Puentes de hidrógeno

Nociones generales sobre Marcadores Moleculares -ADN

Lección 3 3

ORIGEN DEL POLIMORFISMO.• Cambios en la secuencia primaria de ADN.• Cambios en la secuencia de reconocimiento de un enzima de

restricción, o de anclaje de un cebador.• Inserciones o deleciones entre las secuencias de reconocimiento de

los enzimas de restricción, o de anclaje del cebador.

Nociones generales sobre Marcadores Moleculares –ADN (2)

Lección 3 4

PCR (Polymerase Chain Reaction): Replicación “exponencial”, en condiciones in vitro, de un fragmento de ADN flanqueado por dos secuencias concretas de bases (iguales o diferentes), situadas en

cadenas opuestas.

La replicación del ADN

Dirección de Síntesis

El despegue de los MM-ADN: PCR

Lección 3 5

1 ciclo

2 ciclo

1. Desnaturalización

2. Unión del cebador

21 copias3. Elongación

n ciclos 2n copias22 copias

PCR: Fundamento de la técnica.

Lección 3 6

1. Amplificación de fragmentos.2. Separación por electroforesis de los fragmentos

amplificados.3. Tinción y visualización.

PCR (2): Metodología

Lección 3 7

1.Amplificación de fragmentos.

Ingredientes Equipamiento

•ADN molde•ADN polimerasa•Cebadores •dNTPS

PCR (3): Metodología (2)

Lección 3 8

2. Separación por electroforesis de los fragmentos amplificados.

Mezclado con tampón de

carga

Cargado del gel Separación por electroforesis

PCR (4): Metodología (3)

Lección 3 9

3. Tinción y visualización.Visualización con luz UV

PCR (5): Metodología (4)

Lección 3 10

–[ADN molde]

–[ADN polimerasa]

–[Cl2Mg]

–Condiciones de la amplificación

PCR (6): Factores que influyen

Lección 3 11

Clasificación Marcadores Moleculares -ADN

• Métodos no basados en la P.C.R.– R.F.L.P.

• Métodos basados en la P.C.R.– Utilizando cebadores arbitrarios o semiarbitarios

• M.A.A.P.• Intermicrosatélites o I.S.S.R.• A.F.L.P.

– Utilizando cebadores diseñados específicamente• Microsatélites• C.A.P.S.• S.C.A.R.

• Métodos basados en la secuenciación– Secuenciación del ADN.

• Microarrays o Matrices• Single Nucleotide Polymorphisms (SNP)

Lección 3 12

6,9

a

c

d

b

8,0 2,5

10,5

1,5

2,51,1

8,0 2,5

e

f

1,5 9

9,0 Kb

12,0 Kbaa bb ddcc

8,0 Kb6,9 Kb

10,5 Kb

1,5 Kb

e

b

cd

a

e

ee ff

R.F.L.P. (Botstein et al., 1980)Fundamento de la técnica

Lección 3 13

R.F.L.P. (2): Resultados

Lección 3 14

Cortar, desnaturalizar e hibridar

3m

3p

3p

3m

Sitios de restricción

Cromosomas paternos

Cromosomas maternos

Descendiente

Los RFLP tienen una herencia codominante

R.F.L.P. (3): Resultados (2)

Lección 3 15

1. Corte mediante enzimas de restricción.2. Separación por electroforesis.3. Transferencia a filtro.4. Hibridación con sonda “marcada”.5. Visualización de los fragmentos donde se ha producido

hibridación.

R.F.L.P. (4): Metodología

Lección 3 16

1. Corte mediante enzimas de restricción

5’3’

3’5’C T T A A G

G A A T T C

Corte

Enzima de restricción EcoRI

3’ 5’5’ 3’G

C T T A AA A T T C

Extremos cohesivos

G

R.F.L.P. (5): Metodología (2)

Lección 3 17

2. Separación por electroforesis

4. Hibridación con sonda

marcada con isótopo radiactivo (32P) o

digoxigenina5. Visualización de los fragmentos hibridados:

autorradiografía (32P) o quimioluminescencia (digoxigenina)

3. Transferencia a filtro (Southern)

esponjasolución tampón

gel de agarosa

bloque papel absorbentefiltro de nitrocelulosa

gel

filtro con ADN

R.F.L.P. (6): Metodología (3)

Lección 3 18

• Utilizan 1 cebador arbitrario de entre 5 y 20 pares de bases• Se amplifican secuencias al azar• Si el cebador hibrida en dos secuencias diana en cadenas opuestas y a una distancia

adecuada para que en cada ciclo de elongación se llegue de uno a otro, se amplificará el fragmento entre las 2 dianas

D

D

MAAP (Caetano-Anollés, 1994): Fundamento de la técnica.

Lección 3 19

M 1 2 3 4 5 6 7 8

800 pb

Cebador de 10 bases de longitud

MAAP: RAPD (Williams et al., 1990): Resultados

Lección 3 20

Cebador de 5-10 bases de longitud

MAAP: DAF (Caetano-Anollés et al., 1991)Resultados

Lección 3 21

SRAP (Sequence-Related Amplified Polymorphism)Primers: 13 a 15 bases• Forward: 5’ Núcleo de 14 bases + 3 nt. selectivos 3’ Núcleo: 5’ 10 bases aleatóreas + CCGG 3’ Nucleótidos selectivos: Variándolos se obtiene una “familia de

primers”• Reverse: Estructura similar con variaciones: Núcleo: 5’ 10 bases aleatóreas diferentes a las del Forward +

AATT 3’• Reglas para la construcción de los primer Que no formen horquillas u otras estructuras secundarias Que contengan 40–50% de GC

MAAP: SRAP (Li and Quirós, 2001)

Lección 3 22

Resultados:Dianthus chinensis, Dianthus barbatus and Dianthus superbus(Caryophyllaceae) planta ornamentales

MAAP: SRAP (Li and Quirós, 2001)

Lección 3 23

Esta metodología está optimizada para estudios en los que cada U.B.C. está formada por varios individuos que en principio sean idénticos.Ej: U.B.C. = variedad comercial

• PASO 1: Ensayar un elevado número de cebadores y seleccionar los que proporcionen buena amplificación.

• PASO 2: Realizar una nueva extracción de ADN y realizar una nueva amplificación con los mismos cebadores.

La metodología propuesta analiza la reproducibilidad global en un estudio de caracterización con MAAP.

RAPD: Propuesta de metodologia para estudiar reproducibilidad (Vidal et al. 1999)

Lección 3 24

• PASO 3: Para cada amplificación, realizar un conteo de bandas.Para que una banda sea considerada presente, debe estar al menos en 4 de los 5 individuos ( por eso el interés de contar con varios individuos idénticos por U.B.C.)

• PASO 4: De las dos repeticiones, elegir una como “referencia” y otra como “comparada”La repetición que presente mayor número de bandas será considerada como la “referencia”.La otra será la “comparada”.

RAPD: Propuesta de metodologia para estudiar reproducibilidad (2)

Lección 3 25

• PASO 5: Determinar los siguientes parámetros.Se recomienda hacer los cálculos para cada U.B.C., y luego hallar

el valor medio.– Falsos Negativos (FN) %: Bandas NO visibles en la repetición

“comparada” y SI en la “referencia” con respecto al número total de bandas.

– Falsos Positivos (FP) %: Bandas NO visibles en la repetición “referencia” y SI en la “comparada” con respecto al número total de bandas.

– Reproducibilidad: R = 100 – FN – FP.• También se puede hacer el estudio para diferentes tipos de

bandas:– Por tamaño: Grandes/Intermedias/Pequeñas.– Por intensidad: Bien definidas/Débiles.

RAPD: Propuesta de metodologia para estudiar reproducibilidad (3)

Lección 3 26

• Ej variedades de vid

RAPD: Propuesta de metodologia para estudiar reproducibilidad (4)

Lección 3 27

CACACACACACACACA TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG

GTGTGTGTGTGTGTGT ACACACACACACACACACACACAC

CACACACACACACACA TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG

GTGTGTGTGTGTGTGT ACACACACACACACACACACACAC

producto PCRcebador con anclaje en 5’

NNN(CA)n

(AC)nNNN

(CA)nNN

NN(AC)n

producto PCRcebador con anclaje en 3’

ISSR (Zietkiewicz et al., 1994)Fundamento de la técnica

Lección 3 28

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

800 pb

ISSR (2): Resultados

Lección 3 29

Corte con 2 enzimas de restricción

AATAATTC

GT

GAATTCAATTCTTAAGTTAA

Unión de adaptadoresTTAA

TA

AATTCTGAATCTTAAATTCT

GAATTTAAGA

GAATTTAAGA

GAATCTTAAATTCT

AATTCT

Amplificación selectiva1er ciclo

TATAATTCAATGTTAA

Cebadores AATTCT GAAT

AFLP (Vos et al., 1995): Fundamento de la técnica

Lección 3 30

AFLP (2): Resultados

Lección 3 31

Electroforesis

186 pb182 pb

174 pb

Individuo C

Individuo A

A

Individuo B

CB

TGTGTGTGTGGTGTGTGTG

ACACACACACCACACACAC

GTGTGGTGTGTGTG

CACACCACACACAC

Microsatélites (SSR/STMS) (Tautz, 1989)Fundamento de la técnica

Lección 3 32

M ITA RUT ALV OHA SUP MAT

213 pb

192 pb184 pb

Electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida.

Microsatélites (2)Metodologías para la separación de fragmentos

Lección 3 33

Detección del tamaño de los fragmentos de ADN mediante un secuenciador automático de ADN.

Microsatélites (3)Metodologías para la separación de fragmentos (2)

Lección 3 34

Microsatélites (4)Resultados con secuenciador automático

Lección 3 35

Microsatélites (5)Resultados con secuenciador automático (2)

Lección 3 36

Microsatélites (6)Resultados con secuenciador automático (3)

Lección 3 37

• Base de datos del Instituto Agrario di San Michele all’Adige

http://meteo.iasma.it/genetica/gmc.html

Microsatélites (7)Bases de datos internacionales

Lección 3 38

• Swiss Vitis Microsatellite Database (SVMD)

http://www1.unine.ch/svmd/

Microsatélites (9)Bases de datos internacionales (3)

Lección 3 39

• Sistema de Identificación de Variedades de Vid Españolas mediante Microsatélites (SIVVEM)(Universidad Politécnica de Madrid)

http://www.sivvem.monbyte.com/sivvem.asp

Microsatélites (10)Bases de datos internacionales (4)

Lección 3 40

POSIBLE APLICACIÓN: Averiguar los parentales de un determinado clon.

No Cultivar identificatioLoc. 1 Loc. 1 Loc. 2 Loc. 2 Loc. 3 Loc. 3 Loc. 4 Loc. 4 Loc. 5 Loc. 5 Loc. 6 Loc. 64 Albarín Blanco 150 150 228 234 241 255 165 165 187 193 243 2491 Agudelo 130 150 224 228 237 255 151 165 187 193 245 249

41 Espadeiro 136 150 232 234 237 241 151 165 187 187 243 245

Para estimar la probalidad de que la hipótesis sea cierta, se aplica el procedimiento de la “máxima verosimilitud”.

Microsatélites (11)

Lección 3 41

• Se parte de un fragmento de ADN genómico o cloroplástico amplificado mediante PCR.

• Se somete a digestión mediante enzimas de restricción• Se revela el polimorfismo por electroforesis

Detección de híbridos.Análisis con ADN genómico

Análisis poblacionalADN cloroplástico

CAPS [PCR-RFLP] (Konieczny & Ausubel, 1993)

Lección 3 42

• Muy utilizado:– Identificación de variedades.– Análisis poblacionales.

• ADN cloroplástico muy conservado en el reino vegetal poca variación intraespecífica la combinación PCR-RFLP evita esta limitación.

• Razones de su éxito:– Primers para amplificación del ADN cloroplástico “universales”.– La técnica RFLP no requiere radiactividad.

PCR-RFLP de ADN cloroplástico

Lección 3 43

Combinación cebador – enzima: K1K2-TaqI

Patrones mayoritarios y variantes para diferentes combinaciones de

cebador y enzimaHaplotipos: Combinaciones de

patrones obtenidos en el estudio

PCR-RFLP de ADN cloroplástico (2)

Lección 3 44

Clonación

Secuenciación

También RFLP; AFLP

GTAGTTCCTGCATCAAGGAC GTAGTTCCTGRAPD

CATCAAGGACGTAGTTCCTGtcgaccaaCATCAAGGACagctggtt SCAR

Es un marcador muy específico a partir de otro que proporciona un elevado número de bandas

SCAR (Paran & Michelmore, 1993)

Lección 3 45

• Consiste en detectar la secuencia primaria del ADN.• Metodologías principales:

– Maxam-Gilbert (1977)– Sanger (1977). Es más fácilmente automatizable, y en la actualidad hay

secuenciadores totalmente automáticos.• Bases del proceso:

– Se parte de fragmentos de ADN obtenidos bien de una librería de genes o genoteca, o de una reacción de PCR.

– Cada uno de estos fragmentos se usa como una plantilla para generar un conjunto de sub-fragmentos que difieren entre si, en longitud, en una sola base.

– Los sub-fragmentos se separan mediante electroforesis.– Se identifica la base que queda al final de cada sub-fragmento porque

previamente se ha teñido con fluorocromos.– Para secuenciar determinadas partes del genoma es necesario ensamblar varios

fragmentos.

Secuenciación del ADN

Lección 3 46

3’CTGATCGCGTGGTACACTGTCATCTGTCT5’GACTAG5’GACTAGC5’GACTAGCGC5’GACTAGCGCAGC5’GACTAGCGCA5’GACTAGCGCAG5’GACTAGCGCAGCA5’GACTAGCG5’GACTAGCGCACCAT

5’GACTAG5’GACTAGC

5’GACTAGCGC

5’GACTAGCGCAGC

5’GACTAGCGCA5’GACTAGCGCAC

5’GACTAGCGCAGCA

5’GACTAGCG

5’GACTAGCGCAGCAT

http://www.genome.gov/19519278#al-3 (How to sequence a human genome)

Diagrama del metodo SANGER.Secuenciación del ADN (2).

Lección 3 47

¿Y que hacemos con los que nos da el secuenciador?

Lección 3 48

Alineamiento múltiple

Comparación con bases de datos

Datos de secuenciación Ensamblado secuenciasADN Traducción a proteína

Comparación con bases de datos

Alineamiento con Proteínas similares

Características proteínas.Deducción de conclusiones

Los fundamentos de la bioinformática

Reconstrucción filogenética …

¿Y que hacemos con los que nos da el secuenciador? (2)

Lección 3 49

• EST (Expressed Sequence Tags)• ITS (Internal Transcriber Spacer)• Genes que codifican para el RNA ribosómico

– La taxonomía de las bacterias está basada en el gen 16S DNA

¿Qué secuenciar?

Lección 3 50

• Secuencias obtenidas a partir de ADN complementarios de diversos organismos, que representan por tanto fragmentos de genes que se están expresando activamente.

• Los EST se obtienen a partir de genotecas de ADN complementario (ADNc) obtenidos a partir de un ARNm.

Transcriptasa inversa

Degradación de ARNmSíntesis de la segunda cadena de ADN

GUACU AGUAGU ARNm

CATGAGUACU AGUAGU

TCATCAARNmADNc

CATGA TCATCAGTACT AGTAGT ADN duplexo

E.S.T. (Craig Venter,1991)

Lección 3 51

• El ADNc se secuencia de manera total o parcial dando origen al EST.

– Puede secuenciarse el extremo 5’: Se secuencia la parte codificante del gen– Puede secuenciarse el extremo 3’: Con frecuencia esto conlleva secuenciar

regiones no codificantes, pero de mayor variabilidad• Son secuencias cortas (10-600 bp) y de poca calidad, ya que la

secuencia corresponde a una única lectura de una de las cadenas (los errores incluyen no solo cambios de bases, sino inserciones y deleciones).

E.S.T. (2)

Lección 3 52

Aplicaciones en caracterización de germoplasma vegetal– Estudios de diversidad genética.– Estudios de evolución genéticaSu mayor utilidad es que permite comparar una secuencia problema

para determinar:- Si es una región codificante- Si existe “splicing”* alternativo - Si existen posibles homólogos en otros organismos.

Las secuencias EST son fáciles de obtener, por lo que representan en la actualidad más de la mitad de las entradas del GenBank/EMBL,

*Es un proceso post-transcripcional de corte y empalme de ARN

E.S.T. (3)

Lección 3 53

• Es la región espaciadora interna del ADN ribosómico nuclear (18S-26S)• Existen 2 espaciadores en esta región: ITS-1 e ITS-2

18S rADN 5.8S rADN 26S rADNITS1 ITS2

El análisis conjunto de ambas regiones proporciona árboles filogenéticos con mejor resolución y más consistentes que cuando se utiliza una sola de las regiones ITS

I.T.S.

Lección 3 54

Aplicaciones en caracterización de germoplasma vegetal– Estudios filogenéticos.– Han demostrado su utilidad para aclarar la filogenia en taxa de difícil

clasificación.– Se ha demostrado en algunos casos que tiene utilidad a niveles

taxonómicos infraespecíficos.

Aplicación en caracterización de recursos genéticos bacterianos.– Sirven para la identificación precisa de las cepas y para la descripción

de nuevas especies.Los genes que codifican para el ARN ribosómico se encuentran en todos

los organismos y están lo suficientemente conservados para tener validez en el estudio de relaciones evolutivas.

I.T.S. (2)

Lección 3 55

FUNDAMENTO DE LA TÉCNICA• Son pequeños soportes, generalmente portaobjetos de vidrio o

membranas de nylon donde se fijan de manera ordenada fragmentos de “ADN diana”.

• En las propias matrices se produce la hibridación de pequeñas sondas o trozos de ADN (generalmente ADNc), que están marcadas con fluorescencia.– La hibridación se produce donde haya complementariedad de

bases.

Microarrays, matrices, arreglos o “chips”

Lección 3 56

Aplicaciones en caracterización de germoplasma vegetal.– Identificación de secuencias génicas o de mutación génica (por

ejemplo un gen disfuncional frente a otro normal)– Determinación del nivel de expresión de los genes.– Abundancia de secuencias específicas en el ADN genómico– Detección de SNP– Primera caracterización rápida del germoplasma– Construcción de mapas genéticos– Marcadores en mejora

Microarrays, matrices, arreglos o “chips” (2)

Lección 3 57

Microarrays, matrices, arreglos o “chips” (3)

Ejemplo de visualización de un Microarray.– Verde: Representa los puntos donde se hibridó

el genotipo cuyo ADN “se tiñó de verde”– Rojo: Representa los puntos donde se hibridó el

genotipo cuyo ADN “se tiñó de rojo”– Amarillo: Representa los puntos donde se

hibridaron ambos genotipos.– Negro: Representa los puntos donde no hubo

ningún tipo de hibridación.

Lección 3 58

Se trata de sustituciones nucleotídicas, que ocurren con una frecuencia relativamente alta en el genoma.

Ej: Maíz

Utilidad: Detectan el nivel de polimorfismo más elemental que existe. De gran interés para:

• Marcadores de caracteres de interés agronómico.• Identificación de variedades.

SNPs

Lección 3 59

Características MM-ADN

Puntos fuertes Puntos débiles

RFLP•Codominante•Reproducibilidad alta

•Complejidad técnica

MAAP •Simplicidad•Reproducibilidad baja•Dominante

ISSR•Simplicidad•Mejor reproducibilidad

•Dominante

AFLP •Polimorfismo muy alto•Dominante•Complejidad

STMS•Codominante•Polimorfismo muy alto•Reproducibilidad alta

•Diseño de cebadores exige secuenciación

Lección 3 60

Características MM-ADN (2)

Puntos fuertes Puntos débiles

SNP•Codominante•Altamente discriminante

•Difícil de poner a punto para un taxon dado

Secuenciación de diversos fragmentos

•Reproducibilidad muy alta•Máxima información (interesante para estudios filogenéticos)

•Complejidad técnica (contratar el servicio)•Costos elevados

Microarrays•Alto rendimiento•Exploración del genoma entero

•Precisa información sobre secuencias génicas (ADNc)•Complejidad técnica

DArT

•No requiere información sobre secuencias génicas•Alto rendimiento•Detecta cambios en una sola base

•Marcador dominante•Complejidad técnica

Lección 3 61

A A A A A A A AB B B B B B B B

NNNN S S S S

S SN N

alta baja

Diagrama para la selección de la técnica molecular más adecuada (2).

RAPD RAPDRAPD RAPD

SC-PCRSC-PCR

PCR-RFLPPCR-RFLP

PCR-RFLPAFLP AFLPAFLP

AFLPAFLP

AFLPAFLP

STMSSTMS STMS

STMS

STMS STMS STMSSTMS STMS STMS

* recursosdisponibles

nivel de variabilidad

primers

t limit

*

RFLP

RFLP

Lección 3 62