Instituto Conmemorativo Gorgas de Estudio de la Salud Laboratorio Central de Referencia en Salud Pblica. Panam.

Diagnstico de Leptospirosis mediante la Prueba de Microaglutinacin (MAT) en muestras de pacientes con Sndrome Febril. Enero Junio 2009

Preparado por: Licda. Amarielsy Batista I. T.M. Licdo. Juan C. Domnguez G T.M.

Asesora: Dra. Markela de Quinzada, PhD.

Consultores: Lic. Carlos Justo. T.M. Licda. Dianik Moreno. T.M.

Diciembre, 2009

INDICE GENERALINTRODUCCION PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA OBJETIVOS CAPITULO I 1.1. Historia 1.2. Generalidades de la Leptospirosis 1.3. Etiologa de la Leptospirosis 1.4. Reservorio de la Leptospira 1.5. Epidemiologa de la Leptospirosis 1.6. Fisiopatologa de la Leptospirosis 1.7. Aspectos clnicos de la Leptospirosis 1.7.1. Leptospirosis Anictrica 1.7.2. Leptospirosis Ictrica 1.8. Vas de transmisin de la Leptospirosis 1.9. Diagnstico diferencial 1.10. Diagnstico de Leptospirosis 1.10.1. Diagnstico de Laboratorio Tcnicas Indirectas a. Naturaleza de la respuesta de anticuerpos b. Tcnica de Microaglutinacin (MAT) c. Tcnica Inmunoenzimtica tipo ELISA d. Tcnica de Inmunofluorescencia e. Prueba de Tamizaje Tcnicas Directas

a. Observacin al Microscopio de Campo oscuro. b. Cultivo de Leptospira c. Tinciones d. Tcnica de Reaccin en Cadena de la Polimerasa 1.11. Tratamiento CAPITULO II 2.1. METODOLOGIA 2.1.1. rea de estudio 2.1.2. Tipo de estudio 2.1.3. Universo 2.1.4. Muestra 2.1.5. Variable 2.1.6. Recoleccin de datos 2.1.7. Materiales 2.1.8. Reactivos 2.2. PREPARACION DE REACTIVOS Y MEDIOS a. Soluciones tampn y medios para aislamientos de Leptospira b. Preparacin del cultivo de Leptospira para la prueba de MAT c. Preparacin de antgenos para la prueba de MAT PRUEBA DE MAT d. Fase 1: Tamizaje preliminar e. Fase 2: Titulacin de muestras positivas por MAT f. Lectura g. Interpretacin CAPITULO III

3.1. RESULTADOS 3.2. DISCUSION DE LOS RESULTADOS CONCLUSIONES RECOMENDACONES BIBLIOGRAFIA ANEXOS

INTRODUCCION

En Amrica Central cmo en Amrica de Sur, la Leptospirosis est asociada con el aumento de la pobreza, modificaciones en las urbanizaciones (asentamientos, invasiones de tierras, viviendas precarias en terrenos

inundables) y con las condiciones climticas y la falta de agua potable. El propsito de este estudio es dar a conocer la incidencia que ha tenido la Leptospirosis en la poblacin panamea, as como tambin conocer todos aquellos factores asociados a la presencia de casos positivos en nuestro pas. En este estudio se utilizar una tcnica indirecta, como es la Tcnica de Microaglutinacin (MAT), para el diagnstico de la seropositividad a la Leptospirosis en muestras de sueros de pacientes que han presentado los primeros sntomas de la infeccin. El MAT es el mtodo serolgico de referencia en donde el suero de los pacientes reaccionan con antgenos vivos de Leptospiras de 7 a 10 das de crecimiento en medio lquido de EMJH; despus de incubados, se observa la aglutinacin del suero con cada uno de los distintos serovares al microscopio de campo oscuro Leptospira. El diagnstico de Leptospirosis debe ser investigado en todo paciente con fiebre y mialgias, toda vez que las manifestaciones clnicas son para estudiar la presencia de anticuerpos contra la

superponibles con otras enfermedades. La mayora de los errores de diagnstico puede evitarse con la realizacin de una historia y examen fsico detallados.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En los ltimos aos, la Leptospirosis ha reemergido como una importante enfermedad infecciosa de distribucin universal, en la que se han reportado varias especies de Leptospira entre patgenas y saprfitas en los ltimos aos.

Las condiciones ambientales y los efectos del cambio climtico prevalentes en la mayora de pases tropicales y subtropicales de Amrica favorecen la transmisin. En zonas de alta endemicidad de Amrica Latina, el riesgo de contraer Leptospirosis es de cuatro de cada diez personas.

La Leptospira despus de penetrar la piel o las mucosas erosionada o con abrasiones hace una bacteremia que inicialmente alcanza todas las partes del cuerpo, incluyendo el lquido cefalorraqudeo (LCR) y los ojos, y genera la produccin de anticuerpos aglutinantes y el fenmeno de opsonizacin. Si esta respuesta no es suficiente para detener su progreso, la Leptospira avanza en los tejidos. All se multiplica en forma acelerada.

Por esta razn es importante la realizacin de un diagnstico para tratar al paciente de forma oportuna y eficaz, ya que muchas veces la sintomatologa cursa igual a otras enfermedades.

OBJETIVOS Objetivo General:

Determinar la seropositividad de la infeccin por Leptospira mediante la prueba de Microaglutinacin (MAT) en muestras de sueros de pacientes con Sndrome febril enviadas al Laboratorio Central de Referencia en Salud Pblica del Instituto Conmemorativo Gorgas de Estudio de la Salud

Objetivos Especficos:

Evaluar la seropositividad a la Leptospira en Panam.

Identificar los diferentes serotipos existentes de Leptospira a que han estado expuestos los pacientes con reactividad positiva.

Comparar la relacin que existe entre las actividades ocupacionales de los pacientes y la reactividad a la Leptospira.

Marco Terico

LEPTOSPIROSIS: ZOONOSIS DE IMPORTANCIA MUNDIAL

1.1. HISTORIA

Probablemente Lacereaux (Leons de la piti) hizo en 1802, la primera descripcin clnica de Leptospirosis; mientras que en 1883, Landarouzi describi un caso tpico con ictericia y hemorragias

denominndolo tifus heptico. Tres aos despus, en 1886, Mathieu en Francia y Adolf Weil (Farrar ,1995) en Alemania describen cuadros agudos febriles con ictericia y

manifestaciones de agresin renal. nombre de Enfermedad de Weil.

Goldschimidt en 1887,

propuso el

Es en 1914 que los japoneses Inada e Ido

(1916)

encuentran una

espiroqueta en el hgado de cobayos infectados con sangre de enfermos mineros febriles. En el cobayo aparecieron fenmenos hemorrgicos y es por esta razn, que los investigadores japoneses llamaron al agente encontrado Spirochaeta icterohaemorrhagiae. El mismo equipo japons encontr la relacin de este microorganismo con las ratas de desage y al estudiarlas encontraron que el 40% de esas ratas eran portadoras de la Spirochaeta icterohaemorrhagiae. En 1917 y 1918, Noguchi estudi varias muestras aisladas en diferentes lugares y propuso la creacin del genero Leptospira. Y en 1922, Eodsworth inform el primer caso en seres humanos adecuadamente documentado con aislamiento del agente. Desde entonces, con el correr de las investigaciones, se han venido identificando nuevos serotipos de

Leptospiras patgenos para animales y el hombre, que comprometen no slo la salud sino la economa de las regiones afectadas.

1.2. GENERALIDADES DE LA LEPTOSPIROSIS La Leptospirosis es una enfermedad febril aguda producida por una bacteria del Orden: Spirochaetales, Familia: Treponemataceae, Genero: Leptospira, del cual existen varios tipos. Se trata de una zoonosis, es decir, una enfermedad propia de los animales que el hombre contrae en forma accidental. La bacteria responsable para esta patologa se encuentra en el sistema urinario (riones) de una gran cantidad de animales, como: perros, cerdos, vacas, caballos, ratas, conejos, entre otros; y se transmite a los humanos al estar en contacto con agua o alimentos contaminados directa o indirectamente con la orina de estos animales infectados. Es importante mencionar que la transmisin de la Leptospirosis es favorecida por un ambiente permanentemente hmedo. Tambin es posible que infecte al

hombre al penetrar pequeas heridas en la piel o por las conjuntivas. El padecimiento se ha presentado posterior a baarse en aguas contaminadas(Vlez, 2006)

.

La enfermedad es un peligro profesional entre trabajadores de rastros, granjeros, trabajadores de alcantarillas, plantadores de arroz y otros.

Leptospirosis es una enfermedad que ocurre espordicamente y que puede presentarse como epidemia, es decir, con mayor nmero de casos en un momento dado, y con relacin importante con periodos de lluvias e inundaciones.

1.3. ETIOLOGIA DE LA LEPTOSPIROSIS La enfermedad es producida por muchos serotipos de espiroquetas del gnero Leptospira. Las Leptospiras se clasifican entre las bacterias de la siguiente manera:

ORDEN: Spirochaetales FAMILIA: Treponemataceae GENERO: Leptospira.

Las Leptospiras son microorganismos helicoidales de 5-18 m de longitud y 0.1-0.2 m de ancho, que estn constituidos por un cuerpo citoplasmtico y un axstilo que se disponen en forma espiral. (Correa, 1987) Una membrana envolvente recubre ambas estructuras. El axstilo consiste en dos filamentos axiales que se insertan en la extremidad del cuerpo citoplasmtico, por medio de botones terminales. Esta

organela es la encargada de la motilidad de la Leptospira.(Correa, 1987)

Tiene

un

activo

movimiento de rotacin pero no se le conocen flagelos.(Jawetz, 1983)

. La pared es similar a la de

otros Gram negativos, con una fina capa de peptidoglican y una membrana externa con lipopolisacrido de poca actividad endotxica. Las Leptospiras son microorganismos aerobios obligados, oxidasa positivos y catalasa positivos. Para su cultivo necesitan medios enriquecidos con suero de conejo o albmina bovina, como el Stuart, EMJH o Korthoff.

Todas son muy sensibles a la desecacin, al calor y fro excesivo, as como a las variaciones del pH no tolerando el medio cido, el pH ptimo para su multiplicacin es 7,2- 7,4. En el agua salada no sobreviven, al contrario de los largos perodos que pueden permanecer en el agua dulce, principalmente si se encuentra almacenada (hasta 180 das). animales infectados, las Leptospiras(CENEPI, 1997)

En la leche de

no sobreviven, salvo que sta est

diluida en agua a la razn de 1:20 o ms. (Correa, 1987)

En el fro puede sobrevivir hasta 100 das a 20 C. Es importante mencionar que la pasteurizacin no destruye a las Leptospiras, lo que indica que es necesaria la ebullicin para cumplir con su destruccin. A los diez segundos muere con 100 y solo a los 10 minutos si la temperatura es de C 56 C. La orina cida es letal para las Leptospiras y por eso, es necesario alcalinizarla si se pretende aislarla de la orina de un enfermo. En el medio cido pierde su motilidad tan rpido como en 15 minutos.

Este gnero contiene especies patgenas, para los seres humanos (por ejemplo: L. interrogans) y no patgenos (por ejemplo: L. biflexia). El complejo interrogans, con base en las propiedades antignicas, se subdivide a su vez en varios serotipos. Estos serotipos, por su comportamiento inmunolgico, se han dividido en otros subgrupos. Entre los ms comunes se encuentran: L. icterohaemorrhagiae, L. autumnalis, L. canicola, L. pomona, L.australis, L. grippotyphosa. No hay especificidad de husped ni de cuadro clnico como se crea antes.

Tabla n 1. Clasificacin de la Leptospiras

Especie Leptospiras patgenas

Serogrupo

Serovar

Cepa de referencia

L .interrogans

L .alexanderi L. fainei L. inadai L. kirshneri

L. meyeri

Australis Australis Bataviae Canicola Hebdomadis Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae Pomona Pyrogenes Sejroe Manhao Hurstbridge Lyme Autumnalis Cynopteri Grippotyphosa Pomona Semaranga Ballum Ballum Javanica Sejroe Tarassovi Celledoni Autumnalis Panama Bataviae Mini Ranarum Icterohaemorrhagiae Semaranga

Australis Bratislava Bataviae Canicola Hebdomadis Icterohaemorrhagiae Copenhageni Lai Pomona Pyrogenes Hardjo Manhao 3 Hurstbridge Lyme Bim Cynopteri Grippotyphosa Mozdok Semaranga Ballum Castellonis Javanica Sejroe Tarassovi Celledoni Fortbragg Panama Brasiliensis Georgia Pingchang Hualin Saopaulo

L. borgpetersenii

L. weillii L .noguchi L .santarosai

Ballico Jez Bratislava Van Tienen Hond Utrecht IV Hebdomadis RGA M 20 Lai Pomona Salinem Hardjoprajitno L 60 BUT 6 10 1051 3522 C Moskva V 5621 Velrad Semaranga 173 Mus 127 Castellon 3 Veldrat Bat 46 M 84 Perepicilin Celledoni Fort Bragg CZ 214 K An 776 LT 117 80-412 LT 11-33 Sao Paulo

Genomospecies 1 Genomospecies 4 Genomospecies 5

Leptospiras saprfitas Genomospecies 3 L. biflexa L. wolbachii Holland Semaranga Codice Holland Patoc Codice Was Holland Patoc I CDC

Fuente: Brihuega B. 2008. Leptospirosis: diagnstico y tipificacin de Leptospira. Buenos Aires. Argentina.

1.4. RESERVORIOS DE LA LEPTOSPIRA Animales. La Leptospirosis afecta una gran variedad de animales, tanto salvajes como domsticos, los ms importantes son las ratas y las vacas. Este hecho se explica porque el pH alcalino de la orina de estos animales favorece la sobrevivencia de la Leptospira. Como el hombre tiene una orina relativamente cida para la Leptospira, se considera un mal reservorio.

La excrecin de la Leptospira en la orina de los reservorios puede ocurrir por perodos prolongados y contaminar el ambiente (Gillespie, 1963)

Los tres reservorios ms comunes de la infeccin se encuentran en:

las ratas (Leptospira icterohaemorrhagiae), en los perros (Leptospira canicola) en ganado y cerdos (Leptospira pomona). otras variedades tambin pueden causar la enfermedad, pero la ms grave es la causada por la Leptospira icterohaemorrhagiae.

Agua dulce. Para que ocurra la infeccin en el medio, las Leptospiras necesitan una supervivencia en este medio primero, la cual tiene una vinculacin tremenda con la humedad relativa alta y la temperatura a su punto ptimo en el lugar de aparicin. La temperatura del agua tiene un efecto beneficioso, ya sea baja o alta. Las bajas temperaturas disminuyen la multiplicacin de los microorganismos, pero el tiempo de supervivencia aumenta y las altas temperaturas favorecen la multiplicacin, pero con menos tiempo de supervivencia. Esto permite que las Leptospiras puedan sobrevivir

y mantener sus capacidades infectantes en el agua durante 22 das y en el barro 5-6 das.(lvarez, 2007)

El agua contaminada con orina de animales

infectados, es el vehculo ms comn de transmisin de este organismo al ser humano, y es una fuente importante de epidemias en nadadores y campesinos. (Kaufmann, 1965-1974)

Las aguas estancadas con contaminacin alta son desfavorables para que sobreviva la Leptospira.(Nogushi, 1918)

Bajo condiciones favorables, el

microorganismo puede sobrevivir en el agua hasta 180 das. (Okazaki, 1975)

El suelo. Es tambin un vehculo importante de transmisin. Algunos trabajos han demostrado que el microorganismo sobrevive hasta 15 das en suelos con orina. (Nogushi, 1918)

Figura n 1. Fuente: Leptospirosis. Mdulos Tcnicos. Serie Documentos Monogrficos N Oficina General de Epidemiologa. Instituto Nacional de 2. Salud. Lima 2000

1.5. EPIDEMIOLOGIA DE LA LEPTOSPIROSIS

La mayora de los afectados son adultos jvenes entre 20-40 aos, con ms frecuencia en hombres. La mayor fuente de infeccin para las personas la constituye la exposicin directa a la orina de animales infectados o el contacto con agua y/o suelo contaminados con tales orinas, ya sea a travs de actividades ocupacionales o recreativas (INTA, 2005)

Por lo general, el hombre es un husped terminal, lo que significa que la transmisin de persona a persona es sumamente rara. La poblacin con riesgo de enfermar comprende la que habita zonas endmicas de los pases tropicales subdesarrollados. La exposicin ocupacional (veterinarios,

criadores de animales, agricultores, etc.) y la exposicin recreacional (excursionistas, exploradores, etc.) hacen ms probable la infeccin. (INTA, 2005)

Es una enfermedad ms frecuente en la poblacin rural que en la urbana. Las condiciones ambientales prevalentes en la mayora de pases tropicales y subtropicales de Amrica (lluvias abundantes, desborde de aguas residuales suelos no la durante cidos, las altas

inundaciones,

temperaturas) favorecen(INTA, 2005)

transmisin.

Frente a la notificacin de un caso sospechoso, se debe: Consideracin del sndrome clnico presentado por el paciente, prestando especial atencin a la evolucin del mismo en el tiempo. Bsqueda de exposicin a factores de riesgo para la adquisicin de la enfermedad. La investigacin del terreno que aproxima al conocimiento de la probable fuente de infeccin y al mecanismo de transmisin actuante. As mismo, permite verificar las condiciones del ecosistema (estados del suelo,

presencia de acmulos de agua dulce, proliferacin de roedores, etc.). La investigacin epidemiolgica debe aportar como conclusin la existencia o inexistencia de factores epidemiolgicos de riesgo para la adquisicin de la enfermedad.

En Panam es poco lo que se puede conocer acerca de la enfermedad, ya que es a inicio del ao 2000 que se vienen a reunir datos por parte del LCRSP/ICGES acerca de casos positivos de la enfermedad. Estos datos no muestran el 100% de casos positivos a nivel nacional, debido a que la enfermedad tiende a confundirse con otras enfermedades (dengue, malaria, hepatitis, entre otras) o no se tena conocimiento de esta enfermedad por parte de los mdico, por lo que muchas veces se pasaba por alto la Leptospirosis, y no se enviaba muestras para estudios o registros de casos sospechosos al LCRSP.

Casos de Leptospira Notificados por ao 2000-2008Preliminar35 30 25 20 15 10 5 0 2000 2001 2002 2003 2004 AoFuente: VIGEPI-MINSA-LCRSP/ICGES, 2008

Numero de casos

2005

2006

2007

2008

1.6. FISIOPATOLOGIA DE LA LEPTOSPIROSIS

La Leptospira penetra a travs de mucosas o de piel con lesiones y/o abrasiones. Entra a la sangre y rpidamente se distribuye por todo el organismo, incluyendo el lquido cefalorraqudeo. Las caractersticas morfolgicas de la Leptospira le confieren gran movilidad y la presencia de hialuronidasa, son los mecanismos que facilitan el ingreso a diferentes rganos. (INTA, 2005)(1968)

Brito

y

colaboradores,

utilizando

tcnicas

de

inmunoelectromicroscopia, confirman la posible participacin de antgenos (Leptospira) en el proceso de lesin de la clula de hospedero, que se inicia por la interaccin de la bacteria con protenas de la superficie de la membrana celular, culminando con la penetracin y posterior agresin celular. La participacin directa del agente infeccioso parece, por lo tanto, desempear funcin destacada en la gnesis de la lesin celular, que

comienza con un fenmeno de adhesin especfica y que se complementa con la invasin celular. Para estos autores, aparte de la especificidad de la interaccin bacteria clula, hay una relacin significativa entre intensidad de adhesin y patogenicidad del microorganismo. Asociada a la agresin de las clulas parenquimatosas, el endotelio capilar es lesionado con intensidad, probablemente por la accin de las citotoxinas. De Brito y cols. , observaron en la clula endotelial de capilares del pulmn, rin y diafragma, alteraciones mitocondriales y del retculo

endoplasmtico, semejantes a las detectadas en los hepatocitos. Con la evolucin natural de estos fenmenos, se instala un cuadro de anoxia tisular que agrava y perpetua el proceso lesivo de las formas graves de Leptospirosis, considerado por De Brito(1968)

mas una vasculitis infecciosa

que enfermedad de un rgano o tejido especfico. Las lesiones endoteliales han sido comprobadas por la microscopa electrnica, principalmente en mitocondrias y retculo endoplasmtico. Las mitocondrias se encuentran dilatadas, mientras que el retculo

endoplasmtico est aumentado en su tamao. Todos estos fenmenos precederan a la lesin final: la necrosis celular. EL lipopolisacrido aislado de la Leptospira, llamado L-LPS, parece actuar intensamente en el desencadenamiento de graves fenmenos inflamatorios, que agreden a la clula endotelial y liberan citoquinas y potentes compuestos vasoactivos.

La Leptospirosis puede ser considerada como una enfermedad generalizada, sistmica, traducida fundamentalmente por una vasculitis

(inflamacin de los vasos sanguneos) infecciosa. La lesin vascular, predominantemente capilar, es un factor prominente de la Leptospirosis y responsable del edema y la ditesis hemorrgica. Afecta fundamentalmente a los capilares de hgado, pulmn y rin (Vlez, 2006).

1.7. ASPECTOS CLNICOS DE LA LEPTOSPIROSIS La Leptospirosis presenta cuadros clnicos diversos, conforme a: El tropismo del agente, intensidad de la infeccin y condiciones inmunitarias del hospedero.

La presencia de mialgias y fiebre puede ser los sntomas tempranos predominantes. Despus de un perodo de incubacin de 7 a 12 das, la enfermedad ofrece un curso bifsico. (INTA, 2005) Durante la primera semana de la enfermedad, se puede aislar la Leptospira de lquido cefalorraqudeo (LCR), pero no se manifiestan signos menngeos. A partir de la segunda semana, con la aparicin de anticuerpos se puede presentar meningitis, pero sin que se logre aislar la espiroqueta; esto sugiere que la meningitis se puede deber a la reaccin antgenoanticuerpo (INTA, 2005).

1.7.1. Leptospirosis Anictrica. En la Fase Sptica la enfermedad se caracteriza por ser de inicio sbito con fiebre remitente alta, cefalea persistente y mialgias intensas, dolor abdominal; adems, malestar general y astenia. Esta es la forma leve de la Leptospirosis. Estos signos y sntomas se mantienen por 4-7 das.(Farrar

Edmund, 1995)

De manera general, no hay muertes en esta fase, puede suceder

que no pase a la fase inmune. Los pacientes en esta fase estn agudamente enfermos, febriles y con bradicardia relativa; adems, de normotensos,(Sanford, 1987)

la cefalea es

intensa y su presencia y severidad puede anunciar que se inicia la meningitis.(Farrar Edmund, 1995)

Las mialgias comprometen a la regin paraespinal, el

abdomen y el cuello pero caractersticamente a los msculos gemelos de las pantorrillas. (Berman, 1973) La asociacin de vmitos, dolor abdominal y naseas ocurren hasta en el 95% de los pacientes (esto es muy inespecfico). La hepatomegalia (