libro de fermentacion

8/7/2019 libro de fermentacion

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A los lectores

El programa de monografas cientficas es una faceta de la vasta labor de laOrganizacin de los Estados Americanos, a cargo del Departamento de AsuntosCientficos y Tecnolgicos de la Secretara General de dicha organizacin, a cuyo

financiamiento contribuye en forma importante el Programa Regional de Desa-rrollo Cientfico y Tecnolgico.

Concebido por los Jefes de Estado Americanos en su Reunin celebrada en

Punta del Este, Uruguay, en 1967, y cristalizado en las deliberaciones y manda-tos de la Quinta Reunin del Consejo Interamericano Cultural, llevada a cabo en

Maracay, Venezuela, en 1968, el Programa Regional de Desarrollo Cientfico yTecnolgico es la expresin de las aspiraciones preconizadas por los Jefes de Es-

tado Americanos en el sentido de poner la ciencia y la tecnologa al servicio de los

pueblos latinoamericanos.

Demostrando gran visin, dichos dignatarios reconocieron que la ciencia y latecnologa estn transformando la estructura econmica y social de muchas na-

ciones y que, en esta hora, por ser instrumento indispensable de progreso enAmrica Latina, necesitan un impulso sin precedentes.

El Programa Regional de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico es un comple-

mento de los esfuerzos nacionales de los pases latinoamericanos y se orienta ha-cia la adopcin de medidas que permitan el fomento de la investigacin, la ense-anza y la difusin de la ciencia y la tecnologa; la formacin y perfeccionamiento

de personal cientfico; el intercambio de informaciones, y la transferencia y adap-

tacin a los pases latinoamericanos del conocimiento y las tecnologas generadas

en otras regiones.

En el cumplimiento de estas premisas fundamentales, el programa de mono-grafas representa una contribucin directa a la enseanza de las ciencias en ni-

veles educativos que abarcan importantsimos sectores de la poblacin y, al mis-mo tiempo, propugna la difusin del saber cientfico.

La coleccin de monografas cientficas consta de cuatro series, en espaol y

en portugus, sobre temas de fsica, qumica, biologa y matemtica. Desde suscomienzos, estas obras se destinaron a profesores y alumnos de ciencias de los

primeros aos de la universidad; de stos se tiene testimonio de su buena acogi-da.El Programa Regional de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico de la Secretara

General de la Organizacin de los Estados Americanos agradece a los doctores

Rodolfo Ertola, Osvaldo Yantorno y Carlos Mignone, autores de esta monografa,

y a quienes tengan el inters y buena voluntad de contribuir a su divulgacin.

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INDICE

Prlogo ............................................................................................................. iv

INTRODUCCION ............................................................ ............................... 1

CAPITULO 1Definiciones y reas de aplicacin .......................................................... 4Definiciones .............................................................................................. 4Areas de Aplicacin .................................................................................. 6Smbolos y unidades ................................................................................ 6

CAPITULO 2Aspectos generales de los procesos de fermentacin .............................. 8

Efectores internos y externos .................................................................. 8Esquema de un proceso industrial .......................................................... 10

CAPITULO 3

Seleccin, mantenimiento y mejoramiento de microorganismos deinters industrial ..................................................................................... 13Seleccin ................................................................................................... 13Mantenimiento o conservacin de los cultivos ....................................... 15Mejoramiento de microorganismos industriales .................................... 18

Obtencin de nuevas cepas por ingeniera gentica ............................... 25

CAPITULO 4Medios de fermentacin ........................................................................... 31Requerimientos nutricionales ................................................................. 31

Disponibilidad de los componentes ......................................................... 33Materias primas fundamentales ............................................................. 34Formulacin ............................................................................................. 35Optimizacin ............................................................................................ 37Esterilizacin ............................................................................................ 37

CAPITULO 5

Crecimiento microbiano ........................................................................... 43Estequiometra de crecimiento ................................................................ 43Cintica de crecimiento ........................................................................... 49Consumo de sustrato ............................................................................... 50Mantenimiento celular ............................................................................ 51Requerimiento de oxgeno ....................................................................... 51Efecto de pH y la temperatura sobre el crecimiento ............................... 53


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CAPITULO 6

Formacin de producto ............................................................................ 55

CAPITULO 7Sistemas de cultivo y aspectos generales de bioreactores ..................... 60Sistemas de cultivo ................................................................................... 60Cultivo continuo ....................................................................................... 61Batch alimentado ..................................................................................... 64Batch ......................................................................................................... 67Bioreactores .............................................................................................. 70

CAPITULO 8Produccin de levadura de purificacin .................................................. 73Introduccin ............................................................................................. 73Cepas y medios de mantenimiento empleados ....................................... 73

Requerimientos nutricionales ................................................................. 74Cintica de crecimiento y rendimientos .................................................. 75Produccin comercial ............................................................................... 76

CAPITULO 9

Produccin de Penicilina ......................................................................... 82Introduccin ............................................................................................. 82Cepas, medios de mantenimiento e inculos .......................................... 82Requerimientos nutricionales y especficos ............................................ 84Parmetros de produccin ....................................................................... 85Tecnologa del proceso ............................................................................. 87Economa del proceso ............................................................................... 90

CAPITULO 10Tratamiento de efluentes ........................................................................ 92Aspectos fundamentales .......................................................................... 93Diferencias entre tratamientos biolgicos de efluentes y procesos defermentacin.............................................................................................. 97Mtodos de tratamiento ........................................................................... 99Metodologa para la determinacin de la calidad de un efluente .......... 100Estrategia general para encarar el problema de los efluentes .............. 1 01

CAPITULO 11

Posibilidades futuras ............................................................................... 102


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PROLOGO

El ttulo Microbiologa Industrial" puede tener connotaciones un poco ambi-

guas, especialmente en medios acadmicos. Hay, lamentablemente, en todo elmundo universitario, una tendencia a separar dicotmicamente entre "ciencia pu

ra" y "aplicaciones". De esto resulta por un lado la Ciencia, y por el otro las apli-

caciones, sobre todo las industriales, presentadas como una serie de "recetas" ba-

sadas en empirismos.

Esta estructura conceptual es errnea, y ms an, nociva. Nada ms errneo

que ignorar que las aplicaciones industriales requieren, para ser competitivas en

el mundo actual, estar basadas en slidos conocimientos. La solucin de los pro

blemas reales que generan el diseo y operacin ptima de una moderna planta

industrial basada en un proceso biolgico, requiere lo ms moderno del genio

cientfico.

En ese sentido, esta monografa puede ser considerada una reivindicacin de

lo que debe ser la Microbiologa Industrial. Tras ese ttulo, que ha sido en el pasa-

do mal interpretado y a veces despreciado, se esconde el desarrollo de una serie de

temas que bien podran ubicarse bajo ttulos ms de moda y de ms "apeal", comobiotecnologa, ingeniera. bioqumica, etc. Se trata de las bases de la tecnologa

que en todo el mundo se est. desarrollando y traduciendo en logros industriales.

Lasecuencia. de los captulos indica., en realidad, el camino a seguir para el dise-

o de un proceso industrial biolgico: desde la seleccin y mantenimiento de mi-

croorganismos, incluyendo referencias a. microorganismos recombinantes y a los

principios bsicos de los medios de fermentacin. Se tratan luego los principios de

estequiometra y cintica. microbiana, y se analiza los tipos de biorreactores dispo-

nibles. El trabajo termina con la presentacin de tres ejemplos detallados de pro-

cesos microbiolgicos: levadura, penicilina y tratamiento de efluentes.

Todo esto est presentado en una forma accesible, a pesar de reflejar enmu-

chos aspectos los ltimos avances en el conocimiento de los sistemas de produc-

cin bio-industriales.

El Dr. R. Ertola es, sin lugar a dudas, la persona que ms impacto ha tenido

en el desarrollo de la. ingeniera bioqumica en la Argentina, y los Dres. Mignone

conocimiento en el tenia, y una. reivindicacin de lo que debe ser entendido por Mi-

crobiologa Industrial.

Prof. Jos Merchuk

Ben Gurion UniversityBeer Sheva, Israel

y Yantorno que fueron sus alumnos, son sus dignos sucesores: su esfuerzo manco-
http://secuencia.de/http://secuencia.de/http://secuencia.de/


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INTRODUCCION

Los microorganismos pueden ser considerados en trminos generales con dos

criterios que son antagnicos. Uno corresponde a las actividades tiles que tie-

nen algunos para obtener bienes o servicios y otro completamente distinto corres-ponde a los efectos perjudiciales que ocasionan que estn generalmente asociados

a la produccin de enfermedades, tanto en el hombre como en los animales, y quetambin se pueden extender al deterioro producido sobre alimentos y materialesdiversos.

La Microbiologa Industrial se ocupa fundamentalmente de las actividadestiles de los microorganismos.

El trmino microorganismo se aplica en esta monografa, con el mismo crite-rio que el utilizado por Palleroni, o sea a organismos tales como bacterias, hongos

y levaduras, es decir procariotes y eucariotes con inclusin de algas microscpi-cas, pero que no comprende a los virus. Aunque existen aplicaciones industriales

de los virus como es el caso de la produccin de algunas vacunas esos procesos

quedan excludos de esta monografa.

Las aplicaciones de los microorganismos datan de tiempo inmemorial. Elhombre hizo uso de ellos sin saber que stos existan desde que invent o descu-bri al azar la manera de hacer cerveza, vinagre, vino o pan. La cerveza era cono-

cida antes del 6000 a.C. por sumerios y babilonios, y en el antiguo Egipto existaya verdadera produccin en 1700 a.C.; el vinagre se produca desde antes de esa

fecha y el vino es tambin muy antiguo, ya que existe evidencia de su produccin

antes del 2000 a.C. en Egipto y China, y finalmente el pan se conoce desde 4000

a.C. aproximadamente.

Se puede afirmar que hasta comienzos del siglo XX existe muy poco o ningn

control de los procedimientos utilizados para la elaboracin de esos productos oalimentos. En un anlisis cronolgico se pueden fijar 4 grandes etapas en el de-

sarrollo de la Microbiologa Industrial: 1) hasta 1900; 2) 1900-1945; 3) 1945-1979y 4) 1979 hasta el presente, y considerar el comienzo del siglo como el inicio de

cierto control en los procesos de utilizacin de cultivos puros.

A partir de 1900 comienza la etapa de produccin de una serie de productosnuevos que se suman a los conocidos desde la ms remota antigedad, y que son

la levadura de cerveza, glicerol, cido lctico, acetona butanol y etanol.

Hasta el 1945 poco se esperaba del futuro de la Microbiologa Industrial, ya

que solamente unos pocos productos eran fabricados con microorganismos, y ade-ms varios de esos productos podan obtenerse por otras vas, ya ms convenien-

tes por razones econmicas, como etanol, cido lctico o acetona butanol.

Con el advenimiento de la penicilina en 1945 y la necesidad de su produc-cin, se produce un impacto formidable sobre los procedimientos microbiolgicos,ya que se plantea el desafo de la produccin en gran escala en condiciones de

mucho mayor control y con necesidad de operaciones ms complejas para la sepa-

racin y purificacin de los productos. Como consecuencia de los avances logrados

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en esos desarrollos se produce en pocos aos la aparicin de un gran nmero denuevos productos, como otros antibiticos, aminocidos, esteroides, enzimas, bio-masa aplicada a la alimentacin animal y humana (protenas unicelulares), nu-cletidos, etc.

A partir de 1979 la Microbiologa Industrial recibe un nuevo y notable impul-so que se suma al anterior cuando se concretan a nivel de procedimientos prcti-cos las posibilidades que ofrece la ingeniera gentica, disciplina surgida comoconsecuencia del avance de la Biologa Molecular. Este nuevo impulso posibilitala produccin industrial, basada en la utilizacin de microorganismos recombi-nantes, de sustancias nuevas nunca producidas antes por esa va como la insuli-na, hormona de crecimiento, interfern y otras de muy reciente aparicin en elmercado de productos relacionados con el rea de la salud.

Con la evolucin cronolgica comentada se fue tambin produciendo una evo-lucin en los conceptos involucrados, ya que con el avance de los conocimientos y

sobre todo con la necesidad de resolver problemas de produccin vinculados aprocesos cada vez ms complejos, se fue haciendo necesaria la participacin deingenieros y bioqumicos adems de los microbilogos, y se fue produciendo tam-bin la integracin de conocimientos provenientes de varias disciplinas. Se fueprofundizando, por ejemplo, el estudio de los microorganismos de inters indus-trial, no slo en sus aspectos microbiolgicos, sino tambin en relacin a los re-querimientos surgidos de las aplicaciones industriales de los mismos. Se fue asdiferenciando la metodologa general empleada en la seleccin, mantenimiento ymejoramiento de los microorganismos, ya que estos aspectos deban orientarse alos productos de inters y al aumento de la productividad de las cepas emplea-

das. Lo mismo sucedi con los requerimientos :de los medios de produccin quedeben incluir consideraciones econmicas adems de las microbiolgicas. En losaspectos tecnolgicos se produjeron tambin evoluciones necesarias, ya que delas cubas clsicas de fermentacin construdas de materiales diversos y con pocainstrumentacin se pas a biorreactores de acero inoxidable muy instrumenta-dos.

El desarrollo de los procesos en los reactores y la interaccin microorganis-mo-medio que en los mismos requiri aportes fundamentales de la Bioqumica yFisiologa Microbiana, como el conocimiento de las rutas metablicas, cinticaenzimtica, mecanismos de regulacin y estudios acerca de la influencia del me-dio ambiente sobre la productividad del proceso. Con respecto a la Tecnologa seincorporaron conocimientos fundamentales de fenmenos de transporte comotransferencia de materia, calor y cantidad de movimiento y criterios de cambiode escala.

Por otra parte, y como consecuencia de la contribucin de otras disciplinasbsicas como la Qumica, se fueron incorporando tambin conceptos de termodi-nmica y estequiometra que se integraron con los de la cintica enzimtica paraser aplicados al crecimiento microbiano y a la formacin de productos. Con todosesos conceptos emanados de la Microbiologa, Qumica, Bioqumica y Tecnologa,se constituyeron las bases de la Microbiologa Industrial actual.

La presente monografa considera esencialmente las bases de la Microbiolo-ga Industrial sin entrar en los aspectos ingenieriles, es decir trata de aquellostemas que corresponden al microorganismo como su seleccin, mantenimiento ymejoramiento, el diseo y formulacin de los medios, estequiometra y cinticadel crecimiento microbiano y de formacin de producto y modos de operacin delos reactores. Finalmente y como ejemplo de aplicacin se consideran dos indus-trias tpicas y el tratamiento de efluentes.

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La Microbiologa Industrial abarca, como ya dijimos, todos aquellos procesos

que se realizan con microorganismos, y aunque conceptualmente pueden conside-

rarse tambin procesos de fermentacin a los que se realizan con microorganis-

mos sin crecimiento, ya sea en suspensin o inmovilizados, esta monografa est

limitada nicamente a los procesos con clulas en crecimiento, que son por otra

parte los ms importantes.

En Microbiologa Industrial se utilizan los trminos fermentacin y fermen-

taciones industriales, para caracterizar a los procesos o tecnologas basados en el

uso de microorganismos. El trmino "fermentacin", que deriva del latn fermen-

tar(hervir), inicialmente reservado a la actividad microbiana anaerobia, se fue

aplicando asimismo a procesos aerobios y finalmente tambin a aqullos que uti-

lizan clulas animales y vegetales. En la actualidad se est haciendo muy gene-

ral y se corre el peligro de no poder aplicarlo con precisin a un determinado tipo

de proceso biolgico. Nosotros preferimos conservar el trmino ya que est am-

pliamente divulgado, y por otra parte muy arraigado en todo el mundo. Es por

ello que los procesos de la Microbiologa Industrial o las fermentaciones indus-

triales, o los procesos de fermentacin, son o pueden considerarse como sinni-

mos, y es en ese sentido que sern empleados en esta monografa.

Con respecto a los smbolos y unidades empleados, que estn considerados

especialmente en el captulo 1, se decidi emplear aquellos que son los ms acep-

tados por la mayora de los especialistas.

Es importante destacar que para la comprensin de los temas tratados es ne-

cesario que el lector tenga conocimientos generales de Microbiologa, Qumica y

Bioqumica, adems de cierto nivel de conocimiento matemtico. Es muy conve-

niente, por ejemplo, que el lector haya ledo previamente las monografas de lasseries biolgicas, como as tambin algunas correspondencias a temas de Qumi-

ca y Matemticas ya publicados por la OEA. Finalmente y con objeto de facilitar

al lector la posibilidad de ampliar los conocimientos sobre los temas tratados, se

incluyen en cada captulo algunas lecturas recomendadas.

Lecturas recomendadas:

1. `Microorganismos". I.M. Gutirrez-Vzquez. Monografa N 6. Serie de Biologa. Pro-

grama Regional de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico. Departamento Asuntos Cient-ficos. Secretara General de la Organizacin de los Estados Americanos. 1968.

2. "Principios generales de Microbiologa". N.J. Palletoni. Monografa N 7. Serie de Bio-

loga. Programa Regional de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico Departamento de

Asuntos Cientficos. Secretara General de la Organizacin de los Estados Americanos.1970.

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Captulo 1

DEFINICIONES Y AREAS DE APLICACION

Definiciones

La Microbiologa Industrial puede definirse diciendo que es la parte de la Mi-

crobiologa que se ocupa de las aplicaciones industriales de los microorganismos.

Desde otro punto de vista puede decirse tambin que los procesos de la Microbio-

loga Industrial constituyen aquellos procesos industriales catalticos basados en

el uso de microorganismos.

Con el notable impulso de la Biotecnologa producido en los ltimos aos y lainclusin y difusin de otros trminos como biotecnologa de avanzada, biotecno-

loga moderna, biotecnologa de punta, biotecnologa recombinante o tecnologa

del DNA recombinante, biotecnologa e ingeniera gentica, biotecnologa y mi-crobiologa industrial, y hasta biotecnologa negativa, etc., se ha complicado lacomunicacin entre los distintos especialistas y la interpretacin adecuada de los

trminos empleados. Para poder clarificar esos trminos pensamos que es conve-

niente definir y delimitar los campos de la Biotecnologa y de algunas disciplinas

que la integran.

La Biotecnologa es una actividad multidisciplinaria que comprende la apli-cacin de los principios cientficos y de la Ingeniera al procesamiento de mate-

riales por agentes biolgicos para proveer bienes y servicios. Los agentes biolgi-cos pueden ser clulas microbianas, animales, vegetales y enzimas. Se entiende

por bienes a cualquier producto industrial relacionado con alimentos, bebidas,productos medicinales, etc., y por servicios a aquellos vinculados a la purificacinde aguas y tratamiento de efluentes. Esta definicin que es la ms conocida yaceptada por la mayor parte de los paises fue propuesta por la Organizacin para

la Cooperacin Econmica y el Desarrollo (OECD).

La Microbiologa Industrial se ocupa de produccin de bienes y servicios con

clulas microbianas. Por lo tanto la Microbiloga Industrial representa una parte,

seguramente la ms importante, de la Biotecnologa.

La Ingeniera gentica comprende una serie de tcnicas que permiten obte-ner un organismo recombinante, o sea portador de un gen extrao proveniente de

otras clulas, sean stas microbianas, vegetales o animales. Es una disciplina de

rivada de la Biologa molecular que est incluida en la Biotecnologa como herra-

mienta fundamental para la obtencin de microorganismos especficos a ser utili-zados en la produccin de bienes y servicios. El trmino tecnologa del DNA re-combinante puede considerarse sinnimo de Ingeniera gentica.

Consideramos que los trminos biotecnologa de avanzada, biotecnologa mo-derna, no son adecuados. Cualquier tecnologa o biotecnologa avanza y se mo-derniza. Si los trminos se aplican a procesos con cepas de Ingeniera genticanicamente o a transplante de embriones o a micropropagacin vegetal por culti-

vos de tejidos o a produccin de especies vegetales mejoradas por cultivos de teji-

dos o a produccin de especies vegetales mejoradas por cultivos de anteras, cte.,pueden confundirse mucho los conceptos cuando con toda justicia podemos in-cluir tambin en la biotecnologa de avanzada las nuevas tecnologas de produc-cin de alcohol, ya que son ms modernas o de avanzada con respecto a las ante-

riores. Si se desea hacer una diferencia, tal vez sera conveniente referirse a la

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Biotecnologa tradicional o convencional para denominar a los procesos conocidoscon anterioridad al advenimiento de la Ingeniera gentica, y no convencional a

los posteriores.

Areas de aplicacin

Las reas de aplicacin de la Microbiologa industrial son muy variadas y de

ellas surge ha i mportancia y el impacto que tiene esta disciplina en la actualidad.

Las reas principales son: salud, alimentos, produccin vegetal y animal, in-sumos industriales, minera y servicios.

En primer lugar se debe destacar la importancia de la Microbiologa Indus-

trial en el mantenimiento de la salud y tratamiento de enfermedades, fundamen-talmente por su aplicacin en la produccin de compuestos de actividad farmaco-

lgica y vacunas.

En la industria de alimentos es tambin significativa la aplicacin de la Mi-crobiologa Industrial en la produccin de bebidas, enzimas, saborizantes, pro-

ductos lcteos, etc.

La produccin agropecuaria se ve tambin favorecida en sus aspectos de pro-

duccin vegetal y animal por un conjunto variado de procesos microbiolgicos que

se han enriquecido notablemente en los ltimos aos (como ha sucedido con otras

reas) con la utilizacin de tcnicas de ingeniera gentica.

El rea de aplicacin en minera est relacionada con la biolixiviacin o sea

con la aplicacin de microorganismos en la extraccin de metales de minerales de

baja ley.

Finalmente el rea de servicios se refiere fundamentalmente a la aplicacinde microorganismos en la purificacin de efluentes, aspecto fundamental para el

mantenimiento de la calidad de vida.

Varios ejemplos de productos y microorganismos empleados en las distintasreas de aplicacin de la Microbiologa Industrial se pueden observar enla Tabla 1.

Smbolos y unidades

Es conveniente emplear smbolos y unidades correspondientes al sistema in-

ternacional, pero es importante que sean aquellos que son utilizados por la mayo-

ra de los investigadores y profesionales relacionados. La Seccin de Biotecnolo-

ga de la Unin Internacional de Qumica Pura y Aplicada estudi el problema yencomend a una serie de expertos de varios pases la confeccin de una lista de

smbolos y unidades utilizadas. La lista fue sometida a la crtica de numerososespecialistas y fue finalmente publicada en ingls como gua general sobre sm-

bolos y unidades en Biotecnologa. Una traduccin castellana adaptada a la no-menclatura en espaol fue tambin preparada y publicada posteriormente.

En la tabla 2 se dan algunos smbolos y unidades, expresados en el sistema

internacional (SI) y tambin en unidades comunes en Microbiologa Industrial, y

que son las que utilizamos en esta monografa. Corresponde ahora, despus deconsiderar los aspectos generales de los procesos fermentativos, tratar aquellos

esenciales que corresponden a los microorganismos de inters industrial.

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Tabla 2. Algunos smbolos y unidades empleadas en Microbiologa Industrial.

Descripcin y/o definicin Smbolo Unidad S.I * Unidades comunes


1 . Biotechnology. International Trends And Perspectives. A. Bull, G. Holt and M. Lilly.OECD. Par i s , 1982.

2. Lista de Stntbolos con Unidades recomendadas para su entpleo en Biotecnologta . Tra-duccin castellana, R. Ertola. Rev. Latinoam. Ing. Qu f m . Vol. 16, N 2, 5-12 (1986), deloriginal ing ls Pure and Appl . Chem. Vol . 54 N 9 , p . 1743 -1745 , (1982) .

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Captulo 2

ASPECTOS GENERALES

DE LOS PROCESOS DE FERMENTACION

Un proceso de fermentacin tpico es esencialmente un proceso que se lleva a

cabo en un recipiente llamado fermentador o en general, biorreactor, mediante elcual determinados sustratos que componen el medio de cultivo son transformados por accin microbiana en metabolitos y biomasa. El microorganismo va au-mentando en su concentracin en el transcurso del proceso al mismo tiempo que

el medio se va modificando y se forman productos nuevos como consecuencia de

las actividades catablicas y anablicas. Los dos fenmenos crecimiento y forma-

cin de producto, tienen lugar durante el desarrollo del proceso simultneamenteo no segn los casos.

Efectores internos y externosEl comportamiento de un microorganismo en crecimiento es el resultado de

la interaccin que se produce entre el microorganismo y el medio ambiente en el

reactor, y que en rigor es el resultado de los llamaos efectores intra y extra celu-lares.

Los efectores internos estn representados por la dotacin gentica intrnse-ca del organismo considerado y por sus mecanismos de regulacin metablica.

Estos ltimos pueden ser modificados por alteraciones del medio ambiente o ms

precisamente por los efectores externos mientras que la existencia de un gen de-pende de la especie del microorganismo considerado. Un gen est o no est, slo

su expresin puede modificarse. Con el fin de mejorarla productividad de un pro-

ceso de fermentacin las cepas empleadas pueden someterse a tratamiento fsico

o qumico de mutacin que al alterar algn sector del genoma logran aumentar

la produccin de un metabolito aunque tambin pueden disminuirla o incluso su-

primirla.

Tambin se puede dotar a un microorganismo de una capacidad genticanueva cuando se efecta la insercin de sectores del genoma de una especie enun microorganismo, hacindose ste capaz de producir metabolitos que desde elpunto de vista gentico de su especie no podra hacerlo. La obtencin de mutan-tes por el uso de agentes mutagnicos o por algn otro mecanismo bioqumico yla construccin de cepas nuevas por ingeniera gentica constituyen los recursosde la gentica microbiana, para mejorar la productividad de un microorganismodado o para dotarlo de una capacidad productiva nueva. Es decir que los efecto-res internos pueden modificarse para lograr la optimizacin de un proceso fer-mentativo. Todos estos aspectos sern considerados especialmente en el captulo

siguiente, que corresponde al mejoramiento de los microorganismos de inters in-

dustrial.

El comportamiento o expresin fenotpica, o sea lo que realmente se observa

como respuesta del microorganismo al medio ambiente en el reactor es, adems,

el resultado de la influencia de las variables de naturaleza fsica y qumica queconstituyen los efectores externos.

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Los efectores externos de naturaleza fsica estn vinculados con las condicio-

nes de operacin que se utilizan en los reactores y son por ejemplo la temperatu-

ra, la agitacin, aireacin, etc; es decir, estn constituidos por las variables demanipulacin fsica que se fijan o se programan en el curso del proceso de pro-duccin.

La modificacin de algunos de los efectores fsicos como por ejemplo la tem-

peratura, tiene un efecto notable sobre un proceso. Si el valor utilizado no es ade-

cuado puede disminuir o an impedir la formacin de un metabolito determina-do. Adems la temperatura puede modificar los requerimientos nutritivos de al-gunos microorganismos, lo que significa que al modificarse el valor de un efector

puede cambiar los requerimientos de otro.Los efectores externos de naturaleza qumica estn representados por la pre-

sencia de los componentes de los medios de fermentacin, adems del 0 2 quepuede considerarse un nutriente ms. Los componentes de los medios debencumplir con todos los requerimientos nutricionales y adems con los requeri-mientos especficos que son indispensables para la formacin de productos. Losaspectos fundamentales de los medios, como su diseo y formulacin, sern tra-tados en el captulo 4.

Los reactores estn tambin estrechamente vinculados al manejo o manipu-lacin de los efectores externos, ya que adems de la regulacin de las variablesfsicas permiten segn el modo de operarlos fijar o regular la alimentacin decomponentes de los medios que, como ya se dijo, constituyen los efectores qumi-cos. Tal es el caso cuando se operan los reactores en "batch" o en forma disconti-nua, (todos los componentes son colocados desde un comienzo en el medio de pro-

duccin) o cuando se opera el reactor en "batch alimentado" donde la alimenta-cin de los componentes se realiza en forma controlada durante el proceso. Final-

mente cuando se opera el reactor en continuo, se alimenta medio completo a una

determinada velocidad al mismo tiempo que se deja salir con la misma velocidad

medio fermentado, lo que permite tratar a la velocidad de crecimiento especficocomo variable independiente. Estos aspectos sern desarrollados especialmente

en el captulo 7.

La influencia de los efectores internos y externos sobre el comportamiento de

una clula microbiana se puede representar esquemticamente como lo muestralaFig. 1.

Figura 1. Influencia de los efectores internos y externos sobre la expresin celular.

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Para comprender con claridad estos conceptos es conveniente citar algunosejemplos demostrativos. Supongamos una cepa de un microorganismo (B. subti-

lis) que genticamente est en condiciones de efectuar la biosntesis de una enzi-

ma (a-amilasa) y que es colocada en un medio de cultivo adecuado y en condicio-

nes de operacin ptimas para la produccin de esa enzima. Por medio adecuado

se entiende una fuente de carbono como el almidn o dextrina, adems de fuente

orgnica de nitrgeno, y otras sales minerales. Por condiciones de operacin pti-mas se consideran la temperatura de 30-37 C, agitacin, pH inicial 6.5-7.0. Su-

pongamos tambin que el proceso es de tipo "batch". Si en la composicin del me-

dio utilizamos glucosa, por ejemplo, difcilmente tendremos un rendimiento nor-mal de a-amilasa mientras exista glucosa en el medio, debido a la influencia ne-

gativa de sta, ya que la misma acta como represor catablico de la biosntesisde la enzima. Este es un ejemplo negativo de un efector externo (glucosa) que nopermite la expresin del gen de la cepa. No solamente la glucosa tiene este efecto

sino en general cualquier otra fuente de carbono que sea de consumo rpido.

Si en cambio se opera el reactor como "batch" alimentado, con alimentacinprogramada de glucosa, la influencia negativa de ese efector externo desaparece,

porque su concentracin se mantiene en lmites muy bajos.

Otro efector externo de naturaleza qumica que inhibe la biosntesis de otros

productos como muchos antibiticos es el anin fosfato. Por eso la produccin in-

dustrial de esos compuestos debe hacerse de manera tal que existan concentra-ciones limitantes de fosfato inorgnico. Si ste esta en concentraciones de 0.3 a

300 mM generalmente se producen crecimientos celulares altos pero concentra-ciones superiores a 10 mM suprimen la sntesis de muchos antibiticos.

La presencia de azcares asimilables superiores a 0.16 g l-1

produce invaria-blemente formacin de alcohol en proceso de crecimiento de levadura de panifica-

cin (Saccharomyces cerevisiae) an en presencia de exceso de oxgeno. Es el de

nominado efecto Crabtree. Es por ello que la produccin de levadura se debe lle-

var a cabo con sistemas de "batch" alimentado con alimentacin programada deazcares para maximizar la formacin de biomasa e impedir la formacin de al-

cohol. Es otro ejemplo de la influencia de un efector externo o de naturaleza qu-

mica sobre la actividad metablica de un microorganismo.

Para investigar adecuadamente la influencia de los efectores externos qumi-

cos, es necesario el empleo de sistemas continuos, aspecto que ser tratado en el

captulo 7.

Esquema de un proceso industrial

En la Fig. 2 se presenta un esquema general de un proceso de fermentacin.Como puede verse existen 4 etapas bien diferenciadas, a saber: 1) Propagacin decultivos, lo que se realiza en el laboratorio y que comienza generalmente en untubo de ensayo que contiene un repique reciente del microorganismo o un tubo

liofilizado o congelado donde se conserva la cepa de inters o de una colonia del

microorganismo previamente seleccionada. Este material microbiolgico seleccio-

nado constituye el punto de partida con el cual se debe aumentar la cantidad delmismo mediante sucesivos pasajes en frascos de volmenes crecientes que son

generalmente operados en agitadores de vaivn o rotatorios en cmaras de culti-vo. 2) Fermentacin: con el material obtenido anteriormente, se siembra el tan-que de inoculo que puede tener un volumen de 50, 500 1000 1 segn la escalaindustrial posterior. Del tanque de inoculo se pasa posteriormente al fermenta-dor industrial cuyo volumen, que vara de acuerdo al producto a obtener y a su

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den dar buenos rendimientos de un producto pero que representan un inconve-

niente en la etapa de purificacin.

Adems, el reactor y las condicioines de operacin deben ser tales que asegu-

ren la productividad mxima del proceso y la calidad del producto, que en algu-

nos casos depende de las condiciones de operacin empleadas como sucede con al-

gunos preparados enzimticos cuya composicin es regulada segn como se opere

en la etapa de la fermentacin y en la correspondiente a la separacin y purifica-

cin.


1 . A. Fiechter -Physical and chemical Parameters of Microbial Growth. Advances in Bio-

chemical Engineering Vol. 30, 7-60. Springer-Verlag, 1984.

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Una vez efectuado el muestreo y seleccin (screening) para el aislamiento deuna cepa de inters, la misma deber ser caracterizada. En este procedimiento se

debe tener en cuenta que la composicin qumica del material a partir del cual se

va a realizar el aislamiento comienza a variar a partir del momento en que es to-mada la muestra, por lo tanto sta se debe procesar rpidamente, tratando deevitar alteraciones que afecten a la poblacin de inters.

a) Aislamiento directo: en este caso es deseable que el medio que se utilizapara el aislamiento permita la mxima expresin del material gentico del orga-nismo. Si se busca por ejemplo un organismo con accin antimicrobiana, se puede

crecer al potencial productor, en una caja de petri en presencia del o los organis-

mos contra los cuales se requiere la accin antimicrobiana, observndose la pro-

duccin del inhibidor por las zonas de inhibicin de crecimiento.Para la deteccin de productores de factores de crecimiento tales como ami-

nocidos y necletidos se utiliza la estimulacin del desarrollo de bacterias aux-

trofas por un lisado del organismo. Esto se puede llevar a cabo en medios slidos.En este caso se debe tener una "rplica" de la caja a ensayar. Una vez obtenido el

crecimiento en la primer caja, se replica a una segunda, antes de "matar" las co-lonias con luz. U.V., por ejemplo. Esta caja es luego cargada con agar contenien-do una suspensin del organismo auxtrofo al producto buscado. Despus de unperodo de incubacin se observa crecimiento en forma de halo alrededor de lascolonias productoras, lo que permite el aislamiento de este organismo de la placarplica.

b) Enriquecimiento del cultivo: esta tcnica consiste en incrementar en unapoblacin mixta el nmero de organismos de inters en relacin al resto. De estaforma se busca favorecer el crecimiento de un tipo dado de microorganismos me

diante condiciones de cultivo adecuadas al mismo, o de condiciones inapropiadaspara el desarrollo de los otros. Esto se logra mediante el empleo de sustratosespe-cficos o ciertos inhibidores. Para mantener la fuerza selectiva del medio, el

cual se modifica por el crecimiento del organismo buscado, se realizan subculti-vos peridicos en medio fresco. Esto lleva a que el organismo de inters sea el do-

minante de la poblacin, lo cual facilita su posterior aislamiento en medio slido.

Se debe considerar en este caso el efecto del medio sobre la velocidad especfica

de crecimiento (u).La seleccin de un organismo por este procedimiento depende de su valor de

u comparado con los de los otros organismos. Evidentemente el dominante de lapoblacin ser el que posea el mayor valor de u para las condiciones de cultivo

empleadas. Sin embargo no necesaria-mente sera mas til un organismo de ums alto; puede ser deseable uno con

mayor afinidad por el sustrato. El pro-blema de seleccin puede ser superadoempleando el sistema de cultivo conti-nuo, tema que se trata en el captulo 7,donde la fuerza de seleccin se mantiene

a un nivel constante y el organismo do-minante ser seleccionado por su afini-dad por el sustrato, ms que por su u

mxima

En la Fig. 3 se muestra un modelode competicin entre dos organismos ca-

paces de crecer en un cultivo continuoenriquecido.

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En cultivo continuo el valor de um est determinado por la concentracin de

sustrato y es igual en estado estacionario a la velocidad de dilucin (D). A valores

de u = D < uz se tiene que uA > uB y por lo tanto el organismo A podr ser selec-cionado a pesar de que umA < umB (uz = valor de u a partir del cual uB > uA).

Mantenimiento o conservacin de los cultivos

Los objetivos de la conservacin de los cultivos se podran resumir en los si-guientes aspectos: a) preservar la pureza gentica del cultivo sin prdida de nin-guna de sus propiedades bioqumicas; b) preservar los niveles de su productividad inicial; c) lograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con facili-

dad. Esto ltimo puede ser un factor esencial en la seleccin de un mtodo depreservacin.

En todo trabajo de Microbiologa se deben conocer las caractersticas de lapoblacin con la cual se va a trabajar (propiedades morfolgicas y bioqumicas).En este sentido, tanto en la conservacin como en el desarrollo del cultivo, ya sea

el que suministra o el que recibe la cepa, deberan usar las mismas tcnicas me-

todolgicas. Tanto para el mantenimiento, preparacin y propagacin de inculos

se deben usar mtodos reproducibles que no produzcan variaciones o prdidas delas caractersticas de la cepa empleada.

No hay mtodos de mantenimiento en procesos industriales que sean comu-nes a todas las industrias, emplendose en algunos casos mtodos especficos se-cretos.

El conocimiento de las caractersticas del cultivo es esencial en la eleccin de

un mtodo de preservacin. La identidad del cultivo puede conocerse en base asus caractersticas de crecimiento en uno o ms medios especficos, tomando en

consideracin propiedades macro y microscpicas exhibidas, o en base a una eva-

luacin ms exhaustiva empleando muchos ensayos bioqumicos, biolgicos, in-munolgicos y genticos.

En general los cultivos no son estudiados en detalle debido a la casi imposibi-

lidad de determinar en cada etapa si ha habido o no alteracin gentica. En la.mayora de las situaciones solamente se pueden notar cambios mensurables uobservables tales como pigmentacin, morfologa, reacciones fermentativas, pro-

piedades microscpicas, etc. El anlisis de estos parmetros junto con la determi-

nacin cuantitativa del recuento de colonias antes y despus del proceso de man-

tenimiento brindan la informacin necesaria para la correcta evaluacin de latcnica de conservacin a elegir.

Los mtodos de preservacin o mantenimiento ms importantes son los si-

guientes:

Subcultivos

Es un mtodo comn de conservacin, que consiste en el repique peridico

del cultivo en un medio nutritivo fresco. El intervalo de transferencia vara con el

microorganismo, debiendo considerarse el medio adecuado para cada especie.Una vez desarrollados los cultivos se mantienen a 4 C durante lapsos que osci-

lan entre 15 das y 2 meses. Los inconvenientes que presenta son varios: a) incre-

mento de la posibilidad de mutacin con cada transferencia, con prdida de lascaractersticas del organismo; b) riesgo de contaminacin; c) alteraciones en elmedio de cultivo, durante la estada en fro, en la cual se produce una desecacingradual del mismo.

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Se encuentra con frecuencia que el crecimiento despus de la rehidratacin

tiene una fase de retardo extendida. Se puede reducir esta fase si se emplea parael crecimiento un medio de igual composicin que el que da ptimo desarrollo pe-ro disminuyendo su concentracin original entre un 25 y un 50%.

En general no es posible determinar para cada grupo de organismos el mto-do de conservacin ideal, por lo que se trata de emplear el ms adecuado. De to-dos, la liofilizacin es el ms utilizado, aunque algunos organismos muestran altas tasas de mortandad. En este caso la alternativa es la congelacin, a pesar deque las cepas mantenidas de esta forma son difciles de transportar.

Mejoramiento de microorganismos industriales

En general los organismos aislados de la naturaleza productores de metaboli-tos de inters industrial producen a los mismos en niveles muy bajos, por lo tanto

se hace necesario incrementar estos rendimientos para lograr una mayor renta-bilidad de los procesos.

Una forma de mejorar el rendimiento es mediante la optimizacin del medio

de cultivo y de las condiciones de operacin, pero esto est limitado por la capaci-dad de sntesis mxima del producto deseado que tiene el organismo. La otra po-

sibilidad es el mejoramiento gentico de la cepa.

Como ya se dijo, la productividad potencial de un organismo es controlada

por su genoma, pudiendo el mismo ser modificado para incrementar los rendi-mientos. Con el organismo modificado, se reexaminan las condiciones del cultivo

para lograr nuevamente la mxima productividad. Por lo tanto los programas dedesarrollo involucran una continua modificacin gentica del microorganismo,seguida por una readaptacin del medio de cultivo a los nuevos requerimientos,

mejoras de las condiciones de operacin y tambin de los procesos de extraccin ypurificacin.

La obtencin de cepas modificadas genticamente se puede realizar por 1)

Seleccin natural de variantes, 2) Mutacin inducida, y 3) Recombinacin genti-ca.

1. Seleccin natural

Se debe tener en cuenta que en cada divisin celular hay una pequea proba-

bilidad de que ocurra un cambio gentico, por lo cual no es sorprendente que enuna gran masa celular la poblacin sea heterognea. Esta distribucin puede pre-sentar problemas de rendimientos debido a que en general las variantes tienenmenores niveles de produccin que la poblacin parental. Estos cambios definiti-vos (mutaciones) se deben distinguir de las variaciones fenotpicas que dependende las condiciones ambientales y que tienen lugar en todas las clulas de la po-

blacin que expresan la misma modificacin fisiolgica, dentro de las variacionespermitidas por su genotipo. En las mutaciones espontneas el elemento respon-

sable de la mutacin no es conocido, pero igual que las inducidas (el factor muta-

gnico se conoce) son estables y hereditarias y tienen una frecuencia estadstica-mente medible (tasa de mutacin).

La frecuencia de mutaciones espontneas vara entre 10-6 a 10

-9mutaciones

por genoma y por generacin. Por lo tanto si se considera un valor de 10 -7se de-bern estudiar un gran nmero de organismos (> 10 7 ) en la bsqueda del tipodeseado.

En la seleccin de variantes naturales, una prctica que todava es utilizada

se refiere a la observacin de las caractersticas morfolgicas de las colonias, lascuales, en manos de un operador avezado, se asocian con mayor o menor produc-

tividad, lo que permite seleccionar y posteriormente estudiar los clones aislados.

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Estos estudios involucran una etapa de crecimiento seguida por ensayos de eva-

luacin del producto. En estos casos es ms adecuado realizar las experiencias en

erlenmeyers de hasta 500 ml, ya que si bien demanda una considerable mano de

obra, los resultados de ensayos en tubos o pequeos frascos son menos confiables.A veces es posible el diseo de un procedimiento simple de "screening" selec-

tivo para un tipo particular de mutantes. Por ejemplo, clulas no mutadas quemueren en un plaqueo por seleccin de mutantes resistentes a drogas, metales,etc. En estas condiciones se aslan mutantes con un esfuerzo mnimo an de po-

blaciones donde la tasa de mutacin es menor a 1 x 106 .

Cuando se comparan los incrementos en los rendimientos de cepas obtenidas

por mutaciones naturales como las que resultan del empleo de un agente tal co-mo la luz ultravioleta se observa, en general, que con agentes como el menciona-do los incrementos en productividad son superiores y con una mayor tasa de mu-tacin.

2. Mutacin inducida.

El procedimiento de mutacin mediante el empleo de un agente determinado

implica dos etapas, el tratamiento de la poblacin con el mutgeno elegido y lue-

go el aislamiento de los mutantes para su posterior ensayo y seleccin.

Empricamente el empleo de diferentes agentes resulta en el aislamiento dedistintos "espectros" de mutantes.

La eleccin de un agente mutagnico depende en general de consideraciones

prcticas. En algunos de los casos es ms conveniente el empleo de ms de uno

en lugar del uso masivo de uno solo. La tcnica a emplear puede producir una al-ta tasa de mutacin o puede favorecer la separacin de un nmero reducido de ti-

pos deseables de un gran nmero de productores mediocres.

Hasta donde sea posible el aislamiento del mutante debera utilizar la carac-terstica mejorada del mismo como factor de seleccin. El incremento de su pro-

ductividad podra ser el resultado de una modificacin en los mecanismos de con-

trol que limitan el nivel de produccin y/o de una variacin en los precursoresque llevan al producto. En este sentido el conocimiento de las rutas y mecanis-

mos de control de la biosntesis de un producto facilitan la estrategia a seguir enel aislamiento.

Es importante en los programas de bsqueda y seleccin, tener una alta pro-porcin de mutantes entre la poblacin sobreviviente al tratamiento, debido aque slo estos individuos son los estudiados. Con el aumento de la dosis del mu-

tgeno en general se incrementa esta proporcin, aunque para cada mutgeno y

cada organismo hay una dosis ptima.

Los agentes mutagnicos pueden ser agrupados en:

1) Fsicos, como la luz ultravioleta, que es un mutgeno muy conveniente. La

longitud de onda puede variar de 200 a 300 nm y el tiempo de exposicin entre

0.5 y 20 minutos, dependiendo de la sensibilidad del organismo y tratando de lo

grar un porcentaje de muerte entre el 90 y 99.9%. Otros agentes como rayos X yrayos vson actualmente poco utilizados.

2) Qumicos: Estos agentes se emplean en concentraciones del orden de 0.05M con exposiciones de 0.5 a 12 horas. Como muchos de ellos son no txicos, elgrado de mortandad no es empleado como dato de eficiencia. El tratamiento se

realiza adicionando el mutgeno a una suspensin de clulas, la cual es incubada

a temperatura constante un determinado tiempo. Estas manipulaciones requie-

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ren personal con experiencia debido a las lesiones que pueden ocasionar. Entreestos agentes se destacan los siguientes: a) Acido nitroso. Este agente inducetransiciones A-T --- G-C y/o deleciones por uniones cruzadas en el interior de la

cadena. b) N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG). Es uno de los mutgenos

ms potentes, produciendo una alta tasa de mutacin con bajo porcentaje de mor-

tandad. Requiere de un manejo sumamente cuidadoso. c) Anlogos de base. Pro-

ducen transiciones, como el 5-bromuracilo y la 2-aminopurina, siendo otros an-

logos menos efectivos. Sus modos de accin dependen de sus incorporaciones al

nuevo ADN formado y del lugar que ocupen al sustituir a la base normal. d) Mu-

tgenos estructurales, como la proflavina o naranja acridina que no son incorpo-

rados covalentemente al ADN, sino que actuan como agentes de intercalado en la

estructura, promoviendo adiciones o deleciones simples durante la sntesis.

Mutantes con niveles mejorados de metabolitos primarios

Metabolitos primarios son aquellos esenciales para la vida de un microorga-nismo como por ejemplo, aminocidos, nucletidos, vitaminas, cidos orgnicos.

Antes de considerar la seleccin de este tipo de mutantes, es necesario cono-

cer los mecanismos de control involucrados en la biosntesis de estos metabolitos.Las concentraciones de los mismos estn reguladas por sistemas de control por

retroalimentacin ("feed back). Los dos principales sistemas involucrados son in-hibicin y represin "feed back".

En la inhibicin, el producto final de una va metablica inhibe la actividadde una enzima (normalmente la primera) de su va de formacin, cundo se hasobrepasado un valor mximo de concentracin intracelular de dicho producto

(caso de biosntesis de aminocidos). La primera enzima de la va es de tipo "alos-trica", lo que significa que en este caso el producto final se une a ella en el cen-tro regulador (no compite con el sustrato por el centro activo, como en la llamada

inhibicin competitiva), afectando la unin de la enzima al sustrato. Es un con-trol fino y casi instantneo.

La represin es aquella donde el producto final de una va metablica previe-

ne la sntesis de una enzima o de todas las que catalizan la va mencionada. Estoocurre a nivel de cido desoxirribonucleico (ADN), impidiendo la transcripcindel gen a cido ribonucleico mensajero (ARNm). Este mecanismo es de accinms lenta que el anterior, ya que permite actuar a las enzimas preformadas.

Los mecanismos de regulacin son ms complejos en caso de vas biosintti-

cas ramificadas donde los productos de cada brazo son raramente requeridos porel organismo en igual proporcin. Los procesos de control de estos son los siguien-

tes: a) por isoenzimas; b) concertado o multivalente; c) cooperativo; d) acumulati-

vo; e) secuencial. Para un conocimiento detallado de estos mecanismos de controlse remite al lector a la bibliografa.

Como se ve, la concentracin de un metabolito microbiano es controlada por

una variedad de mecanismos. El conocimiento de la va metablica y su controlfacilita la construccin del mutante deseado. Estos pueden tener distintas modi-

ficaciones: a) el mutante no reconoce la presencia del inhibidor o represor; b) no

se produce producto final, que es el que controla la enzima clave de la va meta-blica; c) el producto final es eliminado de la clula debido a una modificacin en

la permeabilidad de la membrana celular.

Los mutantes que no producen inhibidores o represores por producto finalpueden ser empleados para la produccin de intermediarios en caminos no rami-ficados, o de intermediarios y productos finales en caminos ramificados.

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Al no producirse el producto final de la ruta, el control de la misma es elimi-

nado, pero como estos productos son esenciales para el crecimiento, los mismosse deben incorporar al medio en concentraciones tales que permitan el desarrollo,

pero que no ejerzan el control normal por inhibicin o represin. En este caso losmutantes son auxotrficos para uno o ms productos finales. El aislamiento destos mutantes puede resultar en la obtencin de un cepa altamente productora,si la mutacin ocurre en el sitio correcto.

La seleccin de auxtrofos se puede realizar empleando tcnicas de enrique-

cimiento o mediante la identificacin visual de mutantes. Por ejemplo, la separa-cin mecnica de esporos auxtrofos y prototrficos de organismos filamentosos

ha sido alcanzada por el mtodo de "enriquecimiento por filtracin". Se ha aplica-

do a Aspergillus, Neurospora, etc.. El procedimiento implica la incubacin de unasuspensin de esporos mutada, en un medio lquido mnimo; los prottrofos desa-

rrollan en tanto que los auxtrofos no. La suspensin es luego filtrada a travs de

un filtro adecuado, obtenindose un filtrado enriquecido en auxtrofos, debido aque los esporos germinados por su mayor tamao son retenidos en el filtro.

Si bien los mutantes auxotrficos se utilizan para producir grandes cantida-des de muchas sustancias de inters, los mismos no son adecuados para la obten-

cin de productos que controlan independientemente su sntesis. Un caso tpicoes el que figura a continuacin, donde se sintetiza un producto P.

Las letras minsculas indican las enzimas que intervienen en el proceso.

En este caso si P es el producto requerido, no es apropiado tener un auxtrofo.La solucin es modificar el organismo de tal forma que la primer enzima (a)

no reconozca la presencia de niveles inhibidores de P. El aislamiento de talesmutantes se puede alcanzar a partir de mutantes resistentes a metabolitos an-logos y/o de revertantes.

Los metabolitos anlogos (compuestos similares a otros en su estructura)han ampliado el rango de inhibidores para los cuales se obtienen mutantes resis-tentes.

En el ejemplo de la va metablica anteriormente presentado si P* es un an-

logo txico de P, un mutante puede ser aislado en presencia de P* si por ejemplo,la primera enzima de la va no es suceptible a la inhibicin por el anlogo. Estaenzima tambin podra ser resistente al efecto de control de P, por lo cual habrauna produccin no inhibida. Para el aislamiento de este tipo de mutantes se pue-de emplear la tcnica de gradiente en placa, en la cual existe una variacin en laconcentracin del anlogo en un sentido de la placa, presentando la misma, zo-nas de escaso crecimiento por altos niveles del anlogo txico desde donde es po-

sible aislar los mutantes resistentes. Estos debern ser posteriormente estudia-dos en relacin a la produccin de P.

Otra posibilidad de mejorar los rendimientos de este tipo de productos es elempleo de revertantes. En este caso un mutante auxotrfico para P (no producela enzima "a") es sometido a una segunda mutacin con el objeto de obtener re-

vertantes que elaboran el producto final en mayores niveles (la enzima "a" produ-cida no reconoce en control de P).

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Mutantes resistentes a anlogos de aminocidos han sido empleados en pro-

cesos de mejoramiento de cepas, para la obtencin de antibiticos.

El mejor ejemplo de mutantes modificados en la permeabilidad es el caso de

la fermentacin de cido glutmico. Se ha aislado un mutante de Corynebacte-rium glutamicum, cuya permeabilidad puede ser modificada por el nivel de bioti-na. O sea la permeabilidad celular es controlada por la composicin del medio de

cultivo; de esta forma el organismo puede excretar glutamato (50 g l -1) con bajasconcentraciones de biotina (5 ug l-1) . Esto sugiere la posibilidad de modificar ge-

nticamente la permeabilidad celular para incrementar la productividad.

Mutantes productores de enzimas de inters industrialSolamente se tendrn en cuenta las enzimas degradativas, cuya produccin

puede ser controlada por induccin, represin "feed back" y/o represin catabli-ca. Las tcnicas de mutacin en este caso pretenden alterar los mecanismos decontrol para obtener mutantes que puedan producir enzimas en ausencia de in-ductor y an en presencia de represores. Las mutaciones pueden tener lugar enun gen regulador, eliminando la produccin de un represor activo, o si se produ-cen en el operador, se podra evitar la unin del represor. Los mutantes que pro-ducen enzimas inducibles en ausencia de inductor se denominan mutantes cons-titutivos. Los mismos pueden ser aislados a partir de un cultivo continuo en elcual el sustrato inductor est en concentraciones limitantes, lo cual favorece el

desarrollo de los mutantes constitutivos sobre la poblacin inducible; empleando

inductores dbiles o utilizando ciclos con y sin inductor, tratando de favorecer elenriquecimiento en la poblacin del mutante constitutivo, ya que al transferir a

un medio con inductor el tipo inducible requiere un tiempo de induccin que no lorequiere el constitutivo.

Para la seleccin de mutantes resistentes a la represin catablica puedenaprovecharse las posibilidades del sistema continuo empleando un medio de cul-

tivo con el sustrato de la enzima y el represor catablico. En estas condiciones el

organismo capaz de emplear ambos sustratos tendra una ventaja competitiva y

podra ser seleccionado a una determinada velocidad de dilucin.

Mutantes con mejores rendimientos de metabolitos secundariosMetabolitos secundarios son sustancias no imprescindibles para las funcio-

nes vitales como por ejemplo alcaloides, toxinas, antibiticos, giberelinas, etc.

La relacin entre metabolito primario y secundario presenta todava numero-sos interrogantes con relacin a los mecanismos que controlan la sntesis de estos

ltimos. Se deben hacer algunas consideraciones, ya que en ciertas fermentacio-nes de antibiticos la velocidad de crecimiento regula la formacin de enzimasbiosintticas. En el caso de la gramicidina S ( GS), lasGS sintetasas se forman enla ltima parte de la fase de crecimiento exponencial. Las enzimas despus de al-

canzar un pico en sus actividades especficas desaparecen rpidamente al entrarla poblacin en fase estacionaria. Los estudios de este producto en cultivo conti-nuo permitieron establecer una relacin inversa entre la velocidad especfica de

crecimiento y la produccin de sintetasa. Si bien el mecanismo no es conocido, seestableci que los picos de actividad especfica en funcin de u varan de acuerdo

a la naturaleza del sustrato limitante de crecimiento (C, N, S y P).

Otro factor del proceso de control es la regulacin "feed back" lo que significaque la acumulacin de metabolitos secundarios (penicilina, cloranfenicol, ciclohe-

ximida, cte.) es lo que limita su propia sntesis. En el caso de caminos ramifica-

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de un agente inductor (polietilenglicol 50%) y de dimetil sulfxido en algunos ca-

sos, luego de lo cual se los siembra rpidamente en un medio completo para rege-

nerar las clulas. La incubacin de protoplastos resulta en regeneracin de la pa-

red celular y reversin a una clula de morfologa normal, lo cual es una propie-

dad crtica, ya que despus de la fusin se desea recuperar un organismo, el cualpueda ser cultivado normalmente en pequea y gran escala. La fusin celular es

seguida por fusin nuclear. La tcnica de fusin celular se emplea en la obtencin

de hibridomas que son clulas que se obtienen por fusin de linfocitos con clulas

de mieloma (cncer de piel) de ratn u otro animal. Cada clula de hibridomasintetiza una sola especie molecular de anticuerpo. El cultivo de este tipo de clu-

las produce anticuerpos monoclonales, los cuales tienen una enorme importancia

en reactivos de diagnstico, en la purificacin de molculas por su alta afinidadespecfica y como vectores de drogas u otros reactivos para combatir tumores.

Obtencin de nuevas cepas por ingeniera genticaLa dcada de 1970 marca el comienzo de la unin entre las tcnicas bioqui-

micas para manipular el ADN in vitro con las tcnicas genticas para transferirel ADN de una clula a otra. La nueva metodologa resultante conocida con el

nombre de ingeniera gentica ha revolucionado el campo especfico de la Biotec-

nologa. A travs del procedimiento de clonado de ADN, genes de cualquier tipo

pueden ser tomados de su ambiente natural, analizados, alterados y reinsertadosen el mismo tipo de organismo o en otro diferente. Es as que la produccin desolventes, productos qumicos, hormonas, antgenos, enzimas y otras sustancias

de inters farmacolgico puede realizarse en grandes cantidades, a travs del clo-

nado de genes especficos en organismos que pueden ser desarrollados en escala

industrial. Gran parte del xito de una fermentacin, como incrementar el rendi-miento de un producto, aumentar su velocidad de formacin, eliminar productosindeseables o la inhibicin por un producto final, se puede alcanzar, al menos enprincipio, mediante el empleo de tcnicas genticas y estrategias que involucranmetodologa de ADN recombinante in vitro. Esta metodologa ha contribudo ade-ms al conocimiento de las funciones del ADN, a la organizacin de los genes, a

la regulacin de la expresin y a la estructura primaria de protenas.

El aspecto principal del clonado es la propagacin de un fragmento determi-

nado de ADN en una lnea celular en crecimiento. Este fragmento, para poderpropagarse debe ser unido a una molcula transportadora o vector el cual s es

capaz de multiplicarse en el husped.

El clonado de genes ha sido posible gracias a una serie de descubrimientosfundamentales. En primer lugar la puesta en evidencia de enzimas denominadas

endonucleasas de restriccin, las cuales reconocen y cortan el ADN en sitios bien

definidos, generando fragmentos de distintos tamaos, determinados por la dis-tancia que separa cada sitio de restriccin ubicado al azar sobre el genoma.

Existen distintos tipos de enzimas de restriccin. Las enzimas de restriccinde tipo II, catalizan la ruptura de dobles hebras en sitios donde reconocen se-cuencias de 4 o 6 bases de longitud. Se ha encontrado que los sitios de reconoci-

miento se leen igual en ambas hebras de ADN. En algunos casos la ruptura del

ADN se produce en sitios opuestos de las dos hebras rindiendo fragmentos romos( Hae III), mientras que en otras ocasiones la ruptura se produce en forma de es-calones, dejando extremos "cohesivos" (Eco RI) como se observa en la Fig. 5. Entodos los casos la enzima hidroliza enlaces fosfo-diester en el lado 3' dejando ex-

tremos libres 3' -OH y 5' -fosfatos. Los extremos romos resultantes de un corte

pueden transformarse en cohesivos aadiendo a los extremos 3', nucletidos (poliA a uno y poli T al otro) por accin de una transferasa terminal.

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Figura 6. Secuencias y cortes de enzimas de restricin.

A: Adenina. G: Guanina. T: Timina. C; Citosina.

Otro de los avances fundamentales en esta tecnologa fue el descubrimiento

de enzimas que pueden unir extremos libres de hebras de ADN. As molculas

separadas de ADN de doble hebra pueden ser ligadas ya sea por la ADN ligasa

del bacterifago T4 si los extremos son romos, o por la accin de la ligasa de E.

colio de T4 si son cohesivos.

Vectores de clonado

Para la transferencia y expresin de un ADN "extrao" en una clula hus-

ped, se requiere de un vector de expresin, el cual debe ser capaz de entrar y re-

plicarse dentro de ella. Un vector ideal debera ser pequeo, de fcil preparacin

y replicacin en la clula husped, no generar productos txicos para la misma,

poseer uno o ms marcadores (resistencia a drogas, etc.) para facilitar una

rpida y positiva seleccin y contener al menos un sitio donde se pueda integrar

el ADN extrao sin destruir una funcin esencial (replicacin).

Los plsmidos son muy empleados como vectores. Son molculas de ADN cir-

cular extracromosomal que se replican independientemente. Los que poseen ge-

nes para resistencia a antibiticos son de gran utilidad debido a que su adquisi-

cin por bacterias "competentes" es fcil de detectar. Uno de los ms conocidos, el

pBR322 posee sitios nicos de restriccin y lleva genes para resistencia a ampici-

lina y tetraciclina. Estos genes poseen sitios de restriccin para la insercin de

fragmentos de ADN, resultando luego de esta insercin en una inactivacin del

gen. En este caso la bacteria que reciba este plsmido, adquirir la resistencia

especificada por el otro gen intacto.

Los plsmidos que presentan un gran nmero de copias por clula, son losms empleados como vectores, debido a que al amplificar muchas veces el nme-

ro de segmentos del ADN de inters, permiten incrementar los rendimientos del

producto del o los genes que transportan.

En una clula la informacin gentica est presente en dos formas diferen-

tes, el ADN genmico y el cido ribonucleico mensajero (ARNm), que posee la

parte codante del gen sin el promotor. Estas dos formas pueden ser clonadas em-

pleando dos estrategias distintas. El primer caso es el mostrado en laFig. 6, don-

de el conjunto de colonias resultantes de la transformacin representa la "biblio-

teca genmica" o "genoteca", de la cual habr que extraer los clones de inters.

En el segundo caso a partir del ARNm se obtiene un ADN complementario

(ADNc), como se observa en la Fig. 7 para un ARN eucaritico. Este ADNc se

puede insertar posteriormente en un plsmido u otro vector.

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En la formacin de unagenoteca para la expresinde genes de un organismo

eucaritico, se debe tener encuenta que en este caso el

ADN genmico contiene se-cuencias que estn ausentesen el ARN correspondiente.Los genes eucariticos estn

constitudos por secuencias o

regiones que no aparecen en

el ARNm, denominadas "in-trones" o "secuencias intervi-nientes" y por regiones pre-sentes en el ARNm llamadas"exones". El nmero y tama-

o de los intrones vara deun gen a otro, pudiendo en-contrarse genes que carecen

de ellos. En el proceso de

transcripcin, se obtiene unARNm primario (localizado

en el ncleo) que contienetanto las secuencias de losexones como de los intrones,

por ste sufre luego un pro-ceso de "maduracin" o mo-dificaciones post-transcrip-cionales que involucran des-de alteracin qumica de ba-

ses individuales (metilacio-nes), adiciones al 5' ("ca-

ping") o 3' del transcripto

(poliadenilacin), hasta la

forma ms grande de proce-samiento que involucra laseparacin de los intrones ("splicing"). Como consecuencia de estas modificacio-nes y procesamiento se obtiene como producto un ARNm funcional que ser tra-ducido a nivel ribosomal. Por lo tanto si se quiere obtener una protena eucariti-ca en bacterias, es imprescindible obtener un ADNe al ARNm en cuestin, a par-

tir del cual se llevar a cabo el donado.

El proceso de transformacin por plsmidos se caracteriza en general por ser

de baja eficiencia; por lo tanto para incrementar la misma se deben tener encuenta una serie de factores: a) eleccin de una cepa husped adecuada; en el ca-so de E. coliexisten varias recomendadas (la mayora de las cepas K12, MC1061, C 600, DH 1 , DH 5, IM 109, HB 101, etc); b) etapa de crecimiento, ya quela frecuencia de transformacin es mayor cuando el cultivo de E. coliest en lamitad tarda de la fase exponencial; c) procedimiento de transformacin emplea-

do. En general existe un modelo lo que implica la obtencin en un primer paso de

clulas "competentes" mediante un tratamiento con una solucin de CaCl 2 (50mM) en fro, luego de lo cual las clulas se ponen en contacto con la solucin delplsmido purificado incubando en hielo de 10 a 60 min. El porcentaje de clulas

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presentativa. Como llevan el origen de replicacin de un plsmido, se replican co-

mo tal dentro de la clula. Su desventaja es que por su gran tamao su nmerode copias (como plsmido) en la clula es reducido.

Tamao de la genoteca

Este es uno de los aspectos ms importantes y que consiste en determinaraproximadamente cuntos clones es necesario disponer para tener una probabili-dad p de contener una secuencia determinada de ADN. Se debe asumir una re-

presentacin de secuencias al azar, que cada inserto es de igual tamao y que eltamao genmico del organismo sea conocido. As, si "a" es el tamao del inserto

y "b" es el tamao del genoma (en las mismas unidades), luego una genoteca de

N clones tendr una probabilidad p de contener determinada secuencia:

As por ejemplo para E. coli con un geoma de 4.2x10 3 Kb y si a = 20 Kb, si se

fija p = 0.99 (99% de probabilidad de contener determinada secuencia), el valorde N ser de 9.6 x 10 2 clones.

Identificacin de clones de inters

La identificacin de los clones de inters entre cientos o miles de clones re-

presenta un problema que demanda tiempo y que depende de la sensibilidad yespecificidad del sistema de deteccin. Muchos mtodos utilizan sondas radiacti-

vas de gran especificidad que contienen secuencias complementarias al ADN deinters.

La identificacin puede hacerse obteniendo una rplica de las colonias en un

filtro, las cuales son posteriormente lisadas, el ADN fijado al filtro, hibridizadocon la sonda y detectado por autoradiografa.

En otros casos se puede utilizar un vector de expresin que posea un operndentro del cual se inserta al ADN. Si se dispone de un plsmido con un opern

lactosa (lac) inducible, se puede insertar en fase el fragmento de ADN dentro del

gen lac Z, obtenindose as una protena de fusin de la B=galactosidasa. Si laprotena de inters a producir es txica para la clula, esto se supera empleandoclulas que elaboren represores del opern lac. Cuando la concentracin celular

del cultivo es elevada, se induce la expresin con isopropil-B-D-tiogalactopiran-

sido (IPTG), detectndose la presencia de la protena de inters por mtodos in-munolgicos. Finalmente para aumentar la estabilidad de la protena a producir,a la cual contribuye la estructura de la B-galactosidasa, se usan huspedes defi-cientes en proteasas.

Perspectivas de la ingeniera genticaAdems de E. col como organismo husped de genes extraos, se han utili-

zado Bacillus subtilis y levaduras como Saccharomyces cereuisiae y Schizosac-charomyces pombe, distintos Streptoinyces y Agrobacterium tuinefaciens. Final-

mente tambin otras clulas como las vegetales pueden ser empleadas para la in-sercin de genes extraos.

Desde el punto de vista tecnolgico se trata de favorecer la sntesis del pro-

ducto del gen clonado, incrementando el contenido de copias del gen en la clula.En el caso de genes clonados en plsmidos, esto se logra aumentando el nmerode plsmidos, cuyo nmero de copias es regulado a travs de funciones codifica-

das en su genoma; sin embargo esto tiene un lmite. Numerosos estudios experi-mentales de recombinantes de E. coli y S. cereuisiae han demostrado que la pre-

sencia de plsmidos reduce la velocidad de crecimiento de la clula husped y

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concomitantemente la actividad de sntesis total de protenas. Esto probablemen-

te ocurra debido a una competicin entre las actividades dirigidas por el plsmi-

do y la clula husped por precursores comunes, energa qumica, represores y

activadores, enzimas, etc..

Esto se ha superado con el empleo de promotores regulables y controles sobre

la replicacin del plsmido, los cuales se manejan a travs del medio de cultivo.

Se ha observado en muchos procesos que el producto del gen clonado en E.

coli exhibe un mximo con respecto a un valor de u. Esto implica que existe un u

ptimo para maximizar la produccin en sistema continuo, dependiendo de la

naturaleza del plsmido y la estabilidad del producto del gen.

Es evidente que el futuro es sumamente alentador. Como ya se mencion, la

combinacin de la ingeniera gentica con eficientes procesos fermentativos en

gran escala, pueden suministrar un gran nmero de productos de inters indus-

trial, los cuales pueden ser difciles o imposibles de obtener a partir de sus fuen-

tes naturales. As es posible obtener hormona de crecimiento humano, intefern,

interleukina humana, insulina, la expresin en plantas de genes bacterianos pa-

ra el control de plagas, antgenos para nuevas y ms efectivas vacunas con me-

nor reactogenicidad, como es el caso en hepatitis B, aftosa, etc..

Tambin las manipulaciones genticas se han empleado en el mejoramiento

de la productividad en fermentaciones. Un ejemplo es la produccin de treonina

por un mutante de E. col resistente a anlogos, donde el opern entero de treoni-

na fue introducido en un plsmido, el cual se incorpora al organismo por trans-

formacin. Su nmero de copias fue de aproximadamente 20 y la actividad de las

enzimas del opern se increment de 40 a 50 veces. La cepa obtenida produce 30

g l-1

ms que la original.

Otro avance importante se logr mediante manipulaciones en Streptomyces,

las cuales han permitido mediante la introduccin de genes, la obtencin de nue-

vos antibiticos.

Un aspecto fundamental de la tecnologa es la seleccin de cepas estables, de-

bido a que mutantes espontneos que pueden aparecer tienen en general meno-

res rendimientos y mayores valores de velocidad decrecimiento, por lo cual en

fermentaciones largas ("batch" alimentado, continuo) podran desplazar a la cepa

original.

Evidentemente las nuevas cepas obtenidas debern ser estudiadas en su

comportamiento en gran escala, especialmente en lo relacionado con la estabili-

dad y niveles de produccin.

Habiendo tratado ya los aspectos fundamentales referidos a los microorga-

nismos consideraremos en el prximo captulo los correspondientes a los medios

empleados en las industrias de fermentacin.

Lecturas recomendadas

1. ADN recombinante. Introduccin a la ingenieriagentica. J.D. Watson, J. Tooze,D.T.Kurtz. Ed. Labor, 1986.

2. Biotechnology. Vol. 1. Microbial Fundamentals. Ed. H.J. Rehm, G. Reed, Verlag Che-mie, 1981.

3. DNA cloning. Volume I. A practical approach. Ed. D.M. Glover. IR LPress Limited

1985.

4. Genetics. Geoffrey Zubay. Ed. The Banjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987

5. Methods in Microbiology. Ed. J.R. Norris, D.W. Ribbons. Vol. 3A. Academic Press

1970.

6. Principles of Fermentation Technology. P.F. Stanbury and A. Whitaker. Pergamon

Press, 1984

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http://approach.ed.d.m.glover.irl/http://d.w.ribbons.vol.3a.academic/http://d.w.ribbons.vol.3a.academic/http://d.w.ribbons.vol.3a.academic/http://approach.ed.d.m.glover.irl/http://approach.ed.d.m.glover.irl/


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tienen el carbono del C02 como las algas y algunas bacterias, y los heterotrficosque necesitan compuestos orgnicos como fuente de carbono. Otro factor esencialest determinado por las condiciones del cultivo, si es aerobio o anaerobio. El 02es uno de los oxidantes ms comunes en el metabolsmo energtico. En la ausen-cia del 0 2 , el N03 o S04 son utilizados como aceptores de electrones por algu-nas bacterias. Las bacterias metanognicas son auxtrofos anaerobios que utili-zan H2 para reducir el C02 a CH4 para obtener energa. Otras protistas obtienensu energa, en condiciones anaerobias por reaccin de xido-reduccin realizadas

sobre compuestos orgnicos. Las fuentes de carbono cumplen tambin el rol deser fuente de energa.

Otro requerimiento nutricional est constituido por las fuentes de nitrgenoque pueden ser de naturaleza inorgnica u orgnica. El nitrgeno es utilizado pa-ra la biosntesis de protenas, cidos nucleicos y polmeros de la pared celular.Para la sntesis de protena se requieren en general L-aminocidos, aunque tam-

bin son necesarios algunos aminocidos de la serie D como D-alanina y D-aspr-

tico para su incorporacin a la pared de la clulas. En algunos casos se requierentambin pptidos de histidina.

Los requerimientos de otros macronutrientes como el P y el S son suminis-trados en forma de P04H y S04 (o aminocidos azufrados). El fsforo se incor-pora en cidos nucleicos, y polmeros celulares. El S es asimilado para la sntesis

de aminocidos azufrados, y adems se necesita para la biotina, coenzima A, tia-mina y otros componentes.

Los requerimientos de K y Mg son tambin esenciales. Una parte importantedel primero est unida al RNA de manera que los requerimientos de K aumentan

con los factores que influyen en el aumento del RNA de las clulas, como la velocidad de crecimiento. El in K actua como coenzima y probablemente acta comocatin en la estructura aninica de varios componentes celulares. El in Mg esesencial para la estabilidad de los ribosomas y actua como cofactor en numerosasreacciones del metabolismo. Tanto el K como el Mg se incorporan a los medios enforma de sales como fosfato y sulfato.

Con respecto a los micronutrientes se distinguen 2 categoras: a) Los que son

frecuentemente esenciales para el crecimiento como Ca, Mn, Fe, Co, Cu y Zn y b)los que son raramente esenciales como B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se, Mo,Sn, e I. En general los requerimientos de trazas de elementos son conocidas cua-

litativamente. A veces es difcil demostrar un requerimiento de un micronutrien-te porque generalmente est presente en suficiente cantidad como impureza de

los componentes principales. Los requerimientos de stos compuestos pueden au-

mentar varias veces cuando el cultivo ha estado sujeto a "strees", como por ejem-

plo por aumento de temperatura por encima de un valor ptimo.Los requerimientos de factores de crecimiento comprenden ciertos aminoci-

dos y vitaminas del grupo B como tiamina, riboflavina, cido pantottico, niaci-na, etc., que representan para muchas bacterias y levaduras factores esencialesen los medios sin los cuales no se produce crecimiento celular. La mayor parte de

las vitaminas son constituyentes de co-enzimas. Otros factores de crecimientoson las purinas, poliaminas, putrescinas, cte..

En algunos procesos existe la necesidad de efectuar otros agregados, a parte

de los nutrientes requeridos por los microorganismos y que representan los re-querimientos especficos del proceso considerado.

Un ejemplo es el caso de los precursores que constituye la base de una mol-

cula que debe ser sintetizada por el microorganismo, como el cido fenil actico

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para la penicilina. Otro ejemplo es el agregado de ciclo dextrinas en procesos deproduccin de Bordetella pertussis que puede actuar como complejante de inhibi-dores de crecimiento celular. El agregado de cloruros o bromuros en el caso de al-

gunos antibiticos como cloro y bromotetraciclinas, tetraciclidas producidas porel Streptomyces aureofaciens, responde tambin a requerimientos especficos pa-ra inhibir la sntesis de productos no deseados, como ocurre tambin con el agre-

gado de mananos y barbitricos en la produccin de estreptomicina por S. griseus.

El agregado de sulfato, en el proceso de fermentacin alcohlica, que favorecela formacin de glicerol, es otro ejemplo de un requerimiento especfico.

El diseo correcto tiene que ver con las caractersticas bioqumicas propias y

evolucin de los parmetros de cada proceso. Por ejemplo, un proceso caracteriza-do por un descenso continuo de pH, debido al uso de una sal de amonio comofuente de nitrgeno, obliga a considerar en su diseo algn agregado que no co-

rresponda a una exigencia nutricional, como es el caso del control de pH del mis-mo. Este puede efectuarse por agregados al medio de agentes "buffer" como mez-clas de fosfatos o de carbonato de calcio o como ms generalmente se hace, conagregados peridicos de soluciones alcalinas que pueden efectuarse en forma msconveniente mediante un control automtico de pH. El diseo de un medio espe-cfico para la produccin de cido ctrico debe considerar la influencia negativa

que para el proceso tiene un exceso de hierro en su composicin; por lo tanto di-

cho medio debe disearse de manera tal que su preparacin (a partir de diversasmaterias primas) considere una eliminacin total del hierro y posterior agregadodel mismo en cantidades controladas.

Disponibilidad de los componentes

Aparte de su presencia en el medio de cultivo, los nutrientes deben estar dis-ponibles para ser usados por la clula.

Es importante mencionar la disponibilidad correspondiente a iones metlicos

cuya concentracin es modificada por quelacin, ya que muchos constituyentesdel medio y productos del metabolismo actan como agentes complejantes o precipitantes, _por ejemplo aminocidos, hidroxicidos, hidrxidos, y los anionesP04 y C03

-2 .

Por lo tanto, con el objeto de controlar su concentracin y prevenir la precipi-

tacin de los iones metlicos, es necesario o esencial quelar el ion mediante algn

agente quelante agregado, como el EDTA (Acido Etilendiaminotetraactico).

En medios complejos de uso industrial la situacin es an ms complicada ya

que existe una gran variedad de sustancias orgnicas, las cuales pueden quelar,

secuestrar o absorber iones metlicos reduciendo la concentracin inica disponible. Entre dichos compuestos podemos citar: aminocidos, protenas, cidos org-

nicos, polifenoles, polifosfatos y materiales coloidales.

En general se puede decir que todo material insoluble presente en el mediode cultivo va a tener una determinada capacidad de unin a elementos metlicos

disminuyendo su concentracin efectiva, como ocurre tambin con los aminocidos y protenas que tienen los grupos reactivos R-COO-, RHN

-, RS-

, RO , queson los ms importantes. La dinmica de formacin del complejo est determina-

da por la constante de equilibrio de formacin del complejo metal-ligando, y por

la velocidad a la cual el equilibrio es obtenido. La constante de equilibrio para laformacin del complejo del in metlico (M) con el ligando (L) se expresa de la si-guiente forma:

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donde las cargas del catin y ligando estn omitidas.

El valor de K es prcticamente independiente de la naturaleza del ligando,ya que depende particularmente del ion metlico. Se puede hacer una lista detrminos de valores decrecientes de la constante de equilibrio como sigue: Fe+3 >Pb

2+ > Cu

2+ > Ni2+

> Co3 + > Zn 2+ > Co

2+> Cd2+> Fe 2+ > Mn 2+ > Mg

2+> Ca2+ >

Sr2+ > Ba 2+ > Na+ > K+ > y de la cual se puede deducir, por ejemplo, que el ionCu

2+ estar fundamentalmente como complejo mientras que Ca2+

Na+ y K+ esta-rn en forma de iones metlicos libres.

Por otro lado la velocidad a la cual se alcanza el equilibrio tiene tambin unaserie de orden decreciente de velocidades de acuerdo al ion: Sr 2 + > Ca2

+ > Zn2+ >Mn

2+> Fe

2+ > Co

2+ > Mg

2+ > Ni 2+. De ambas consideraciones surge por ejemplo

que cuando se alcanza el equilibrio el ion Ca2+

estar casi siempre libre para serutilizado y si est complejado se har rpidamente disponible, en cambio el Mg2+

estar generalmente libre pero si est complejado se har disponible muy lenta-

mente. En la misma forma se puede deducir que el Co2+

estar fundamentalmen-

te en forma complejada siendo disponible adems a muy baja velocidad. Por esarazn ese elemento es potencialmente limitante.

En conclusin, es importante tener en cuenta la naturaleza de los compues-

tos orgnicos que tienen capacidad para actuar como ligandos, y s

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