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PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO. AmpliLute Liquid Media Extraction Kit 50 Tests P/N: 03750540 190 LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test 48 Tests P/N: 04391853 190 LINEAR ARRAY Detection Kit 96 Tests P/N: 03378179 190 24-Well Tray with Lid 1 Each P/N: 03140725 001 USO PREVISTO La prueba de genotipado del HPV (virus del papiloma humano) LINEAR ARRAY es una prueba cualitativa in vitro para la detección del virus del papiloma humano en muestras clínicas. La prueba utiliza la amplificación del ADN objetivo mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la hibridación del ácido nucleico y detecta treinta y siete genotipos de ADN del HPV anogenital [6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 (MM9), 81, 82 (MM4), 83 (MM7), 84 (MM8), IS39 y CP6108] en células cervicales obtenidas y conservadas con PreservCyt ® . RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA Las infecciones persistentes por el virus del papiloma humano (HPV) son la principal fuente de cáncer cervical y de su afección precursora, la lesión escamosa intraepitelial (SIL) 1-3 . La presencia de HPV está relacionada con más de un 99% de los casos de cáncer cervical en todo el mundo 3 . El HPV es un virus ADN bicatenario pequeño sin envuelta con un genoma de unos 8.000 nucleótidos. Existen más de 100 genotipos de HPV distintos, y unos 40 genotipos distintos de HPV que pueden infectar la mucosa genital humana. Sin embargo, sólo un subconjunto de los genotipos virales de transmisión sexual están relacionados con la displasia cervical de grado alto y el cáncer cervical 3-5 . Se trata de genotipos de HPV calificados de alto riesgo, mientras que los genotipos de HPV de bajo riesgo suelen relacionarse con lesiones intraepiteliales de grado bajo o condilomas. Las infecciones de transmisión sexual por HPV son muy comunes. Se estima que hasta un 75% de mujeres están expuestas al virus HPV en algún momento de su vida 6 . La mayoría de las infecciones por HPV desaparecen de forma espontánea, pero la persistencia de un virus HPV de alto riesgo constituye un factor de riesgo importante para el desarrollo de cáncer cervical. En los países desarrollados en los que se aplican programas de detección de cáncer cervical se utiliza el examen de Pap (cuyo nombre deriva de su autor, el doctor George Papanicolaou) desde mediados de los años 50 como herramienta principal para detectar síntomas precursores del cáncer cervical. A pesar de que se ha reducido drásticamente la tasa de mortalidad por cáncer cervical en estos países, el examen de Pap requiere que la interpretación la efectúen citopatólogos con gran experiencia y la prueba presenta un relativo nivel de imprecisión con una elevada tasa de falsos negativos. Las anormalidades citológicas observadas en el examen de Pap se deben principalmente a la infección por el HPV; no obstante, algunas variaciones inflamatorias o de las muestras pueden dar lugar a falsos positivos de la prueba de Pap. El cribado de un examen de Pap anormal obliga a repetir la prueba, a realizar una colposcopia y una biopsia. Una lesión de grado alto confirmada por histiología puede eliminarse mediante cirugía para evitar el desarrollo de un cáncer cervical invasivo. El virus del papiloma humano es muy difícil de cultivar in vitro, y no todos los pacientes infectados por el HPV presentan un título de anticuerpos demostrable. Por lo tanto, las pruebas del ácido nucleico (ADN) mediante la PCR constituyen un método sensible y no invasivo para determinar la presencia de una infección cervical activa por HPV. Entre las aplicaciones conocidas de las pruebas de genotipado del HPV figura la evaluación de la obtención y eliminación de tipos de HPV específicos 7 ; la supervisión de la persistencia de tipos específicos de genotipos asociados con un riesgo elevado de enfermedades cervicales y carcinogénesis cervical 8 ; la efectividad de las terapias excisionales 9 , la radioterapia 10 o la quimioterapia 11 para el tratamiento de lesiones causadas por HPV (tratamiento); la obtención de genotipos mediante programas de detección específicos previos y posteriores a la introducción de la vacuna 12 ; y la facilitación de investigaciones epidemiológicas sobre la historial natural de las infecciones por HPV. 1 EXTRN LA HPV GT LA DK LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test
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PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO.
AmpliLute Liquid Media Extraction Kit 50 Tests P/N: 03750540 190
LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test 48 Tests P/N: 04391853 190
LINEAR ARRAY Detection Kit 96 Tests P/N: 03378179 190
24-Well Tray with Lid 1 Each P/N: 03140725 001
USO PREVISTO
La prueba de genotipado del HPV (virus del papiloma humano) LINEAR ARRAY es una pruebacualitativa in vitro para la detección del virus del papiloma humano en muestras clínicas. La pruebautiliza la amplificación del ADN objetivo mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa(PCR) y la hibridación del ácido nucleico y detecta treinta y siete genotipos de ADN del HPVanogenital [6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66,67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 (MM9), 81, 82 (MM4), 83 (MM7), 84 (MM8), IS39 y CP6108] en célulascervicales obtenidas y conservadas con PreservCyt®.
RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA
Las infecciones persistentes por el virus del papiloma humano (HPV) son la principal fuente de cáncercervical y de su afección precursora, la lesión escamosa intraepitelial (SIL)1-3. La presencia de HPV estárelacionada con más de un 99% de los casos de cáncer cervical en todo el mundo3. El HPV es un virusADN bicatenario pequeño sin envuelta con un genoma de unos 8.000 nucleótidos. Existen más de 100genotipos de HPV distintos, y unos 40 genotipos distintos de HPV que pueden infectar la mucosa genitalhumana. Sin embargo, sólo un subconjunto de los genotipos virales de transmisión sexual estánrelacionados con la displasia cervical de grado alto y el cáncer cervical3-5. Se trata de genotipos de HPVcalificados de alto riesgo, mientras que los genotipos de HPV de bajo riesgo suelen relacionarse conlesiones intraepiteliales de grado bajo o condilomas. Las infecciones de transmisión sexual por HPV sonmuy comunes. Se estima que hasta un 75% de mujeres están expuestas al virus HPV en algún momentode su vida6. La mayoría de las infecciones por HPV desaparecen de forma espontánea, pero lapersistencia de un virus HPV de alto riesgo constituye un factor de riesgo importante para el desarrollode cáncer cervical.
En los países desarrollados en los que se aplican programas de detección de cáncer cervical se utiliza elexamen de Pap (cuyo nombre deriva de su autor, el doctor George Papanicolaou) desde mediados delos años 50 como herramienta principal para detectar síntomas precursores del cáncer cervical. A pesarde que se ha reducido drásticamente la tasa de mortalidad por cáncer cervical en estos países, elexamen de Pap requiere que la interpretación la efectúen citopatólogos con gran experiencia y la pruebapresenta un relativo nivel de imprecisión con una elevada tasa de falsos negativos. Las anormalidadescitológicas observadas en el examen de Pap se deben principalmente a la infección por el HPV; noobstante, algunas variaciones inflamatorias o de las muestras pueden dar lugar a falsos positivos de laprueba de Pap. El cribado de un examen de Pap anormal obliga a repetir la prueba, a realizar unacolposcopia y una biopsia. Una lesión de grado alto confirmada por histiología puede eliminarsemediante cirugía para evitar el desarrollo de un cáncer cervical invasivo.
El virus del papiloma humano es muy difícil de cultivar in vitro, y no todos los pacientes infectadospor el HPV presentan un título de anticuerpos demostrable. Por lo tanto, las pruebas del ácidonucleico (ADN) mediante la PCR constituyen un método sensible y no invasivo para determinar lapresencia de una infección cervical activa por HPV. Entre las aplicaciones conocidas de las pruebasde genotipado del HPV figura la evaluación de la obtención y eliminación de tipos de HPVespecíficos7; la supervisión de la persistencia de tipos específicos de genotipos asociados con unriesgo elevado de enfermedades cervicales y carcinogénesis cervical8; la efectividad de las terapiasexcisionales9, la radioterapia10 o la quimioterapia11 para el tratamiento de lesiones causadas por HPV(tratamiento); la obtención de genotipos mediante programas de detección específicos previos yposteriores a la introducción de la vacuna12; y la facilitación de investigaciones epidemiológicassobre la historial natural de las infecciones por HPV.
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EXTRN
LA HPV GT
LA DK
LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test
PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO
La prueba de genotipado del HPV LINEAR ARRAY se basa en cuatro procesos principales: preparaciónde las muestras; amplificación mediante PCR13 del ADN objetivo mediante primers para HPV; hibridaciónde los productos amplificados con sondas oligonucleótidas; y detección de los productos amplificadosfijados a las sondas mediante determinación colorimétrica.
La preparación de las muestras mediante el kit de extracción de material líquido AmpliLute prepara elADN objetivo del HPV y el ADN genómico humano para la amplificación mediante PCR. El reactivo demezcla maestra contiene primers para la amplificación del ADN de 37 genotipos de HPV y el gen de laß-globina humana. La detección y determinación del genotipo se realiza mediante el ADN amplificadodesnaturalizado y una matriz de sondas oligonucleótidas que permiten identificar de forma independientegenotipos de HPV individuales.
Preparación de la muestra
El ADN del HPV se libera por acción de la lisis de las muestras de células cervicales bajo condiciones dedesnaturalización a temperaturas elevadas. La lisis se lleva a cabo ante la presencia de la proteinasa K,un agente caotrópico y detergente. A continuación se procede al aislamiento y purificación del ADN enuna columna y a la elución con el reactivo de elución. El gen de la ß-globina se aísla de forma simultáneay garantiza la adecuación celular, la extracción y amplificación de cada muestra procesadaindividualmente.
Amplificación mediante PCR
Selección del objetivo
La prueba de genotipado del HPV LINEAR ARRAY utiliza primers biotinilados para definir una secuenciade nucleótidos en la región L1 polimórfica del genoma del HPV, con una longitud de aproximadamente450 pares de bases. Un lote de primers de HPV presente en la mezcla maestra está diseñado paraamplificar el ADN del HPV de 37 genotipos de HPV14, incluidos 13 genotipos de alto riesgo (16, 18, 31,33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68)3-5. Las secuencias de las sondas de captura están ubicadas enregiones polimórficas de L1 limitadas por estos primers. Un par de primers adicional se dirige al gen dela ß-globina para controlar la adecuación de las células, la extracción y la amplificación.
Amplificación del objetivo
La polimerasa de ADN AmpliTaq® Gold se utiliza para “iniciar en caliente” la amplificación del ADNobjetivo de HPV y el control de la ß-globina. Primero se calienta la mezcla de reacción de la PCR paraactivar la polimerasa de ADN AmpliTaq Gold, desnaturalizar el ADN vírico y el ADN genómico humano, yexponer las secuencias objetivos del primer. A medida que la mezcla se enfría (tanto en sentidoascendente como descendente), los primers inician la fase de annealing con el ADN objetivo. Lapolimerasa de ADN AmpliTaq Gold, en presencia de Mg2+ y un exceso de dNTP, prolonga la alineaciónde los primers a lo largo de las plantillas objetivo para producir una molécula de ADN objetivo de HPVbicatenario con 450 pares bases aproximadamente o una molécula de ADN de ß-globina con 268 paresbases denominada amplicón. Este proceso se repite un número determinado de ciclos, en los cuales sedobla el volumen de ADN amplicón. La amplificación se produce sólo en la región del genoma de HPV odel gen ß-globina comprendida entre el par de primers adecuado. No se amplifica el genoma completo.
Amplificación selectiva
La amplificación selectiva del ácido nucleico objetivo de la muestra se logra en la prueba de genotipadodel HPV LINEAR ARRAY mediante el uso de la enzima AmpErase (uracil-N-glicosilasa) y el trifosfato dedesoxiuridina (dUTP). La enzima AmpErase reconoce y cataliza la destrucción de las cadenas de ADNque contienen desoxiuridina15, pero no del ADN que contiene desoxitimidina. El ADN natural carece dedesoxiuridina, que sin embargo está siempre presente en el amplicón debido al uso de trifosfato dedesoxiuridina además del trifosfacto de desoxitimidina del reactivo de la mezcla maestra; por lo tanto,sólo el amplicón contiene desoxiuridina. La desoxiuridina hace al amplicón contaminante susceptible dedestrucción por la enzima AmpErase antes de la amplificación del ADN objetivo. La enzima AmpErase,que se incluye en el reactivo de mezcla maestra, cataliza la escisión del ADN que contiene desoxiuridinaen la posición de los residuos de desoxiuridina abriendo la cadena de desoxirribosa en la posición C1.Cuando se calienta en el primer paso del ciclo térmico al pH alcalino de la mezcla maestra, la cadena deADN del amplicón se rompe en la posición de la desoxiuridina, lo que hace que el ADN ya no puedaamplificarse. La enzima AmpErase es inactiva a temperaturas superiores a los 55ºC, es decir, durante lospasos de la ciclación térmica y, por consiguiente, no destruye el amplicón objetivo. Después de laamplificación, se desnaturaliza cualquier posible resto de enzima añadiendo solución dedesnaturalización, para impedir de ese modo la degradación de amplicones objetivo.
Reacción de hibridación
Después de la amplificación mediante PCR, se añade solución de desnaturalización para desnaturalizarquímicamente el amplicón del HPV y de ß-globina, y crear así ADN bicatenario. Se transfieren entoncespartes alícuotas del amplicón desnaturalizado a los correspondientes pocillos de la bandeja detipificación, que contienen cada uno tampón de hibridación y una única tira de genotipado del HPV
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LINEAR ARRAY revestida con HPV Y sondas de ß-globina. El amplicón marcado con biotina se hibridarácon alguna de las sondas oligonucleótidas sólo si el amplicón contiene la secuencia correspondiente dela sonda complementaria. Además, la tira de genotipado del HPV LINEAR ARRAY está revestida con unasonda oligonucleótica de reacción cruzada que se hibridiza con los genotipos 33, 35, 52 y 58 del HPV. Elamplicón que contiene las secuencias de mayor similitud (con sólo de 1 a 3 desapareamientos)complementarias de la sonda se hibridarán con esta línea de sonda.
Reacción de detecciónDespués de la reacción de hibridación, la tira de genotipado del HPV LINEAR ARRAY se lava a conciencia paraeliminar todo el material no fijado. A continuación, se añade a la tira el conjugado de estreptavidina y peroxidasade rábano picante. El conjugado se une al amplicón marcado con biotina e hibridado con las sondasoligonucleótidas sobre la tira. Tras lavar nuevamente la tira para eliminar el conjugado de estreptavidina yperoxidasa de rábano picante no fijado, se añade entonces a cada tira una solución substrato que contieneperóxido de hidrógeno y 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB). En presencia de peróxido de hidrógeno, elconjugado de estreptavidina y peroxidasa de rábano picante fijado cataliza la oxidación de la TMB para formarun complejo de color azul que se precipita en las posiciones de las sondas donde tiene lugar la hibridación. Latira de genotipado del HPV LINEAR ARRAY se lee visualmente comparando el patrón de las líneas azules conla guía de referencia de la tira de genotipado del HPV LINEAR ARRAY.
REACTIVOSAmpliLute Liquid Media Extraction Kit 50 pruebasKit de extracción de material líquido AmpliLute
P/N: 03750540 190CAR 1 x 310 µg(ARN transportador)
ARN sintético liofilizado(Añadir AVE)
PK 1 x 1,25 ml(Proteinasa K)
Proteinasa K, Serina proteinasa, tritirachium albumXn Proteinasa K
Nocivo
R: 36/37/38-42/43 Irrita los ojos, la piel y las vías respiratorias. Posibilidad desensibilización por inhalación y por contacto con la piel.
S: 23-24-26-36/37 No respirar los aerosoles. Evítese el contacto con la piel. Encaso de contacto con los ojos, lávense inmediata yabundantemente con agua y acúdase a un médico. Úsenseindumentaria y guantes de protección adecuados.
AVE 4 x 2 ml(Tampón de elución)
Agua exenta de ribonucleasa< 0,09% de azida sódica
AW2 1 x 13 ml(Tampón de lavado 2)
Tampón Tris-HCl< 0,09% de azida sódica(Añadir etanol absoluto)
ATL 1 x 10 ml(Tampón de lisis del tejido)
EDTA≤ 10% de sulfato de sodio y dodecilo
AL 1 x 33 ml(Tampón de lisis)
≤ 50% HCl de guanadinaXn 25-50% de HCl de guanadina
Nocivo 3
+
+
EXTRN
R: 22-36/38 Nocivo por ingestión. Irrita los ojos y la piel.S: 13-26-36-46 Manténgase lejos de alimentos, bebidas y piensos. En caso de
contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantementecon agua y acúdase a un médico. Úsese indumentariaprotectora adecuada. En caso de ingestión, acúdaseinmediatamente al médico y muéstresele la etiqueta o elenvase.
EXT 50 pcs(Extendedores de columna, 3 ml)
VC 50 pcs(Conectores de VAC)
ELT 50 pcs(Tubos de elución, 1,5 ml)
CLM 50 pcs(Columnas QIAamp® MinElute™)
Membrana de silicio
LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test 48 pruebasPrueba de genotipado del HPV LINEAR ARRAY
(P/N: 04391853 190)
HPV MMX 4 x 0,58 ml(Mezcla maestra de HPV LINEAR ARRAY)
Tampón trisCloruro potásico< 0,02% de polimerasa de ADN AmpliTaq Gold (microbiana)< 0,1% de enzima AmpErase (uracil-N-glicosilasa) (microbiana)< 0,001% dATP, dCTP, dUTP, dGTP, dTTP< 0,001% de cada uno de los primers ascendente y descendente (biotinilados)0,06% de azida sódica
HPV Mg2+ 4 x 0,125 ml(Solución de magnesio del HPV LINEAR ARRAY)
< 1% Cloruro magnésico Marcador de amaranto0,05% de azida sódica
HPV (+) C 4 x 0,5 ml(Control positivo del HPV LINEAR ARRAY)
Tampón Tris-HCl EDTA< 0,002% de ARN poli Ar (sintético)< 0,001% de ADN plásmido no infeccioso (microbiano) con secuencias de HPV< 0,001% de ADN plásmido no infeccioso (microbiano) con secuencias de ß-globina 0,05% de azida sódica
HPV (–) C 4 x 0,5 ml(Control negativo del HPV LINEAR ARRAY)
Tampón Tris-HCl EDTA< 0,002% de ARN poli Ar (sintético)0,05% de azida sódica
HPV Strip 4 x 12 pruebas(Tira de genotipado del HPV LINEAR ARRAY)
Tira de nilón revestida con sondas de ADN de HPV y una sonda de ADN de ß-globina humana (con concentraciones de sonda elevadas y reducidas)
LINEAR ARRAY Detection Kit Kit de detección LINEAR ARRAY 96 pruebas
(P/N: 03378179 190)
DN 2 x 12 ml(Solución de desnaturalización)
1,6% de hidróxido de sodio
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LA HPV GT
LA DK
EDTAAzul timol
Xi 1,6% (p/p) de hidróxido de sodio
Irritante
SDS 4 x 27 ml(Concentrado de SDS)
20% de lauril sulfato de sodio (SDS)1% de ProClin 150
SSPE 2 x 160 ml(Concentrado de SSPE)
Solución de fosfato de sodio Cloruro de sodio EDTA1% de ProClin 150
SA-HRP 2 x 2 ml(Conjugado de estreptavidina y peroxidasa de rábano picante)
Conjugado de estreptavidina y peroxidasa de rábano picanteTampón ACES Cloruro de sodio1% de ProClin 150
CIT 2 x 36 ml(Concentrado de citrato)
Solución de citrato
SUB A 3 x 160 ml(Sustrato A)
Solución de citrato0,01% de peróxido de hidrógeno0,1% de ProClin 150
SUB B 3 x 40 ml(Sustrato B)
0,1% de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB)40% de dimetilformamida (DMF)
T 40% (p/p) de dimetilformamida (DMF)
Tóxico
R: 61-20/21-36 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto.Nocivo por inhalación y en contacto con la piel. Irrita los ojos.
S: 53-45 Evítese la exposición - recábense instrucciones especialesantes del uso. En caso de accidente o malestar, acúdaseinmediatamente al médico (si es posible, muéstrese laetiqueta).
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
A. PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO.
B. Esta prueba está diseñada para ser utilizada con células cervicales humanas conservadas conPreservCyt.
C. No se debe pipetear con la boca.
D. No se debe comer, beber ni fumar en las áreas de trabajo del laboratorio. Deben usarse guantesdesechables, batas de laboratorio y protección ocular cuando se manipulen las muestras o losreactivos del kit. Lávese a conciencia las manos después de manipular las muestras y losreactivos de las pruebas.
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+
E. Evite la contaminación microbiana y por ADN de los reactivos al extraer partes alícuotas de lasbotellas de reactivos. Se recomienda el uso de pipetas estériles desechables y puntas exentas deADN y DNasa.
F. No mezcle reactivos de diferentes lotes o de distintas botellas de un mismo lote.
G. Elimine los reactivos no utilizados y los desechos de acuerdo con las reglamentaciones nacionales,federales, estatales y locales.
H. No utilice los kit con posterioridad a la fecha de caducidad.
I. Puede solicitar hojas de datos de seguridad del material (Safety Data Sheets, SDS) en las oficinaslocales de Roche.
J. El flujo de trabajo del laboratorio debe discurrir de modo unidireccional, comenzando en el área depreamplificación y procediendo hacia el área de postamplificación (amplificación/detección). Lasactividades de preamplificación deben comenzar con la preparación de los reactivos y seguir con lapreparación de las muestras. Los materiales y equipos utilizados deben estar dedicados a cadaactividad de preamplificación y no usarse para otras actividades ni transferirse de un área a otra. Encada área es preciso el uso de guantes que se cambiarán antes de abandonarla. Los equipos ymateriales utilizados para la preparación de reactivos no deben usarse para actividades depreparación de muestras ni para pipetear o procesar ADN amplificado u otras fuentes de ADNobjetivo. Los materiales y equipos utilizados en la postamplificación deben permanecer en el área depostamplificación en todo momento.
K. Las muestras deben manipularse como si fueran infecciosas utilizando procedimientos deseguridad de laboratorio como los indicados en la publicación Biosafety in Microbiological andBiomedical Laboratories16 y en el Documento M29-A del CLSI17. Limpie y desinfecteminuciosamente todas las superficies de trabajo usando una solución recién preparada dehipoclorito de sodio al 0,5% de agua destilada o desionizada.
NOTA: la lejía doméstica comercial contiene normalmente hipoclorito de sodio en unaconcentración del 5,25%. Mediante dilución en proporción 1:10 de la lejía doméstica seobtendrá una solución de hipoclorito de sodio al 0,5%.
L. AW2, AVE, HPV MMX, HPV Mg2+, HPV (–) C y HPV (+) C contienen azida sódica. La azida sódicapuede reaccionar con las conducciones de plomo o cobre para formar azidas metálicas muyexplosivas. Cuando elimine soluciones que contengan azida sódica vertiéndolas en fregaderos delaboratorio, deje correr abundante agua para evitar la formación de depósitos de azida.
M. Utilice protección ocular, bata de laboratorio y guantes desechables para manipular AL, PK, HPVMMX, HPV Mg2+, DN, SA-HRP, SUB A, SUB B y sustratos de trabajo (mezclas de reactivosSUB A y SUB B). Evite el contacto de estos materiales con la piel, los ojos o las membranasmucosas. En caso de contacto, lave inmediatamente la zona afectada con abundante agua.Pueden producirse quemaduras si se deja sin tratar. Si se derrama alguno de los reactivos, dilúyalocon agua antes de limpiarlo con un paño.
N. SUB B y el sustrato de trabajo contienen dimetilformamida, una sustancia descrita como tóxica adosis orales elevadas que puede ser nociva para el feto. Se deben evitar el contacto con la piel,la inhalación de las emanaciones y la ingestión. En caso de producirse contacto con la piel, lavela zona afectada minuciosamente con agua y jabón, y acuda al médico inmediatamente.
O. AL contiene hidrocloruro de guanadina, que puede dar lugar a compuestos altamente reactivos sise combina con lejía. Si se derrama líquido que contenga este tampón, límpielo con un detergenteapto para laboratorio y agua. Si el líquido vertido contiene agentes potencialmente infecciosos,limpie el área afectada primero con detergente para laboratorio y agua y luego con una soluciónde hipoclorito de sodio al 0,5%. No añada lejía ni soluciones ácidas directamente a los residuosque contengan AL.
P. Los contenedores de vidrio o plástico sometidos a una presión negativa al vacío puedenimplosionar durante su utilización, lo que puede provocar daños personales. Se recomiendautilizar protección ocular para manipular contenedores de vidrio o plástico sometidos a presionesnegativas al vacío para protegerse de daños. Sólo deben utilizarse los contenedores diseñadosespecíficamente para este uso. No utilice ningún contenedor para aplicaciones de vacío si no seha diseñado para soportar el vacío; si el contenedor presenta grietas, zonas peladas u otro tipode desgaste; si se ha sujetado de forma que genere estrés o si el contenedor se sostienemanualmente.
REQUISITOS DE ALMACENAMIENTO Y MANIPULACIÓN
A. No congele los reactivos si no se indica lo contrario.
B. Almacene los reactivos CLM y PK del kit de extracción de material líquido AmpliLute a unatemperatura comprendida entre 2 y 8ºC. Almacene el resto de los reactivos del kit de extracción
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de material líquido AmpliLute a una temperatura comprendida entre 2 y 25ºC. Una vez abiertos,pueden guardarse las partes sobrantes de AL, ATL y AVE para futuras pruebas hasta la fecha decaducidad indicada siempre y cuando se conserven en las condiciones descritas más arriba.Después de haberse reconstituido con AVE, CAR puede conservarse durante 24 horas a 2-8ºC,o extraerse partes alícuotas y almacenarlas a -20ºC hasta la fecha de caducidad. Después deañadir etanol absoluto a AW2, las partes sobrantes pueden almacenarse a 2-25ºC durante 1 añoo hasta la fecha de caducidad (hasta la fecha más próxima). Después de añadir el reactivo CARreconstituido al reactivo AL, las partes sobrantes del reactivo AL de trabajo pueden almacenarsea 2-8ºC durante un máximo de 48 horas.
C. Almacene los reactivos HPV MMX y HPV Mg2+ a 2-8ºC. Sin abrir, estos reactivos se conservanestables hasta la fecha de caducidad indicada. Una vez abierto el envase, debe desecharsecualquier porción sobrante. La mezcla maestra de trabajo (preparada añadiendo HPV Mg2+ a HPV MMX) debe almacenarse a 2-8ºC y utilizarse en un máximo de 6 horas tras las preparación.
D. Almacene los reactivos HPV (–) C y HPV (+) C a 2-8ºC. Sin abrir, estos reactivos se conservanestables hasta la fecha de caducidad indicada. Una vez abiertos, deben descartarse las porcionessobrantes.
E. Almacene el reactivo HPV Strip a 2-8ºC. Sin abrir, este reactivo permanece estable hasta la fechade caducidad indicada. Una vez abierto el envase, deben desecharse las tiras sobrantes.
F. Almacene el reactivo DN a 2-25ºC. Sin abrir, DN se conserva estable hasta la fecha de caducidadindicada. Una vez abierto, DN se mantiene estable durante 3 meses a una temperaturacomprendida entre 2 y 25ºC (o hasta la fecha de caducidad, la que sea más próxima).
G. Almacene los reactivos CIT, SA-HRP, SUB A y SUB B a 2-8ºC. Sin abrir, estos reactivos seconservan estables hasta la fecha de caducidad indicada. Una vez abiertos, permanecen establesdurante 3 meses a una temperatura comprendida entre 2 y 8ºC (o hasta la fecha de caducidad, laque sea más próxima).
H. Almacene SDS y SSPE a 2-8ºC. Sin abrir, estos reactivos se conservan estables hasta la fecha decaducidad indicada. Una vez abiertos, estos reactivos permanecen estables durante 3 meses auna temperatura comprendida entre 2 y 8ºC (o hasta la fecha de caducidad, la que sea máspróxima). Durante el almacenamiento a una temperatura comprendida entre 2 y 8ºC, se formanprecipitados en SDS y SSPE. Antes de su uso, caliéntelos a 53ºC ± 2ºC durante un tiempomáximo de 30 minutos y mézclelos bien para disolver el material precipitado. Los tampones dehibridación y de lavado de trabajo, preparados diluyendo SDS y SSPE con agua destilada odesionizada, deben almacenarse a temperatura ambiente en un recipiente limpio y cerrado; semantienen estables durante 30 días a partir de la fecha de preparación.
I. El conjugado de trabajo debe prepararse cada día mezclando SA-HRP con tampón de lavadoambiental, solución que se mantiene estable durante 3 horas a temperatura ambiente.
J. El sustrato de trabajo debe prepararse cada día mezclando SUB A con SUB B; se mantieneestable durante 3 horas a temperatura ambiente si se protege de la luz. No exponga SUB A, SUBB o el substrato de trabajo al contacto con metales, agentes oxidantes o la luz directa.
K. El tampón de citrato de trabajo, preparado diluyendo CIT con agua destilada o desionizada, debealmacenarse a temperatura ambiente en un recipiente limpio y cerrado; se mantiene estable durante30 días a partir de la fecha de preparación.
MATERIALES SUMINISTRADOS
A. AmpliLute Liquid Media Extraction KitKit de extracción de material líquido AmpliLute(P/N: 03750540 190)
CAR(ARN transportador)
PK(Proteinasa K)
AVE(Tampón de elución)
AW2(Tampón de lavado 2)
ATL(Tampón de lisis del tejido)
AL(Tampón de lisis)
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EXTRN
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EXT(Extendedores de columna, 3 ml)
VC(Conectores de VAC)
ELT(Tubos de elución, 1,5 ml)
CLM(Columnas QIAamp® MinElute™)
B. LINEAR ARRAY HPV Genotyping TestPrueba de genotipado del HPV LINEAR ARRAY(P/N: 04391853 190)
HPV MMX(Mezcla maestra de HPV LINEAR ARRAY)
HPV Mg2+
(Solución de magnesio del HPV LINEAR ARRAY)
HPV (+) C(Control positivo del HPV LINEAR ARRAY)
HPV (–) C(Control negativo del HPV LINEAR ARRAY)
HPV Strip(Tira de genotipado del HPV LINEAR ARRAY)
Guía de referencia(Guía de referencia de la prueba de genotipado del HPV LINEAR ARRAY)
C. LINEAR ARRAY Detection KitKit de detección LINEAR ARRAY(P/N: 03378179 190)
DN(Solución de desnaturalización)
SDS(Concentrado de SDS)
SSPE(Concentrado de SSPE)
SA-HRP(Conjugado de estreptavidina y peroxidasa de rábano picante)
CIT(Concentrado de citrato)
SUB A(Sustrato A)
SUB B(Sustrato B)
D. 24-Well Tray with LidBandeja de 24 pocillos con tapa(P/N: 03140725 001)
MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS
Área de preamplificación - preparación de reactivos
• Para el sistema termociclador GeneAmp® PCR System 9700 con un bloque de platarecubierto en oro de 96 pocillos de Applied Biosystems, utilice tubos de reacciónMicroAmp® (AB# N801-0533), tapones (AB# N801-0535 o AB# N801-0534), juegos debandeja/retenedor (AB# 403081) o conjuntos (AB# 403083) y bases (AB# N801-0531) deMicroAmp
• Bolsa de plástico resellable• Pipeta Eppendorf Multipette®*• Eppendorf Combitip® plus de 1,0 ml o 1,25 ml (estéril, en envase individual)*• Pipeteadores (con capacidad para 50 µl y 125 µl)* con puntas exentas de ADN y DNasa con
filtro para aerosol o desplazamiento positivo• Guantes desechables, no empolvados
LA DK
LA HPV GT
Área de preamplificación - preparación de muestras y controles
• Pipeta Eppendorf Multipette*
• Eppendorf Combitip plus de 1,0 ml y 5,0 ml (estéril, en envase individual)*
• Pipeteadores (con capacidad para 20 µl, 200 µl y 1000 µl)* con puntas exentas de ADN yDNasa con filtro para aerosol o desplazamiento positivo
• Tubos de tapón de rosca de 2,0 ml (Sarstedt 72.693.005 o equivalentes)
• Bandeja para tubos (Sarstedt 93.1428 o equivalente)
• Etanol absoluto según las especificaciones ACS
• Tubos de polipropileno cónicos y estériles de 15 ml y 50 ml: (Corning 430052 y 430290 oequivalente)
• Pipetas serológicas estériles y desechables (5 ml, 10 ml y 25 ml)
• Pipet-Aid® (Drummond 4-000-100 o equivalente)
• Microcentrífuga (min. RCF 12,500 x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M, o equivalente
• Agitador
• Bloques de calor en seco a 56ºC ± 2ºC y 70ºC ± 2ºC
• Colectorde vacío (p. ej., QIAvac24, Nº de catálogo 19403; QIAvac 24 Plus, Nº de catálogo 19413con sistema de conexión QIAvac, Nº de catálogo 19419)
• Fuente de vacío [p. ej., a una bomba capaz de generar un vacío de -800 a -900 mbar,modelo KNF Neuberger LABOPORT® UN840.3FTP (115 V, 60 Hz) o modelo N840.3FT.18(230 V, 50 Hz) o bomba de vacío QIAGEN P/N: 84000 (110 V, 60 Hz), 84010 (115 V, 60 Hz),o 84020 (230 V, 50 Hz)] con conexión al colector
• Regulador de vacío (QIAGEN Nº de catálogo 19530), opcional
• Tubos de recolección (2 ml, QIAGEN Nº de catálogo 19201), opcional
• Guantes desechables, no empolvados
Área de postamplificación - amplificación/detección
• Termociclador GeneAmp PCR System 9700 con un bloque de plata recubierto en oro de 96pocillos (Applied Biosystems, P/N: 4314878)
• Pipetas serológicas de poliestireno, estériles y desechables (5 ml, 10 ml y 25 ml)
• Pipeteador multicanal (capacidad para 100 µl)*
• Pipeteadores (con capacidad para 20 µl, 200 µl y 1000 µl)* con puntas exentas de ADN yDNasa con filtro para aerosol o desplazamiento positivo
• Agitador
• Agua destilada o desionizada
• Baño de agua a 53ºC ± 2ºC con agitación a 60 RPM aproximadamente (Bellco Hotshaker Plus, P/N: 774622110 o equivalente)
• Agua de baño a 53ºC ± 2ºC
• Agitador orbital capaz de producir 60 RPM aproximadamente
• Fórceps de acero inoxidable (VWR #: 30033-042 o equivalente)
• Rotulador permanente resistente al agua, al calor y a sustancias químicas (Sharpie® IndustrialSuper Permanent, P/N: 13801 o equivalente)
• Aparato de aspiración por vacío con un depósito de colección de líquido adecuado (con filtroBüchner de pared gruesa de la marca PYREX®, Corning P/N: 5340-2L, o equivalente)
• Aspirador/divisor de corrientes de agua de 12 canales (Art Robbins Instruments, P/N: 102-5020-12)
• Peso en forma de anillo de plomo de una libra (VWR #: 29700-004 o equivalente)
• Matraces o frascos de almacenamiento de 1, 2 y 3 litros
• Vasos de precipitados de 100 ml, 250 ml y 500 ml
• Probetas graduadas de 100 ml, 250 ml, 500 ml y 1 litro
• Pipeta Eppendorf Multipette*
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• Eppendorf Combitip plus de 50 ml (estéril, en envase individual)*
• Adaptador de 50 ml Eppendorf Biopur (P/N: 0030 069.480)
• Láminas de acetato (opcional)
• Solución de limpieza de la bandeja RBS35 (VWR #: PI27952 / Pierce #: 27952)
• Guantes desechables, no empolvados
* La precisión de los pipeteadores debe estar dentro del 3% del volumen indicado. Para evitar la contaminacióncruzada de la muestra y el amplicón, deben usarse puntas exentas de ADN y DNasa con filtro para aerosol odesplazamiento positivo cuando así se especifique.
RECOLECCIÓN, TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA
NOTA: manipule todas las muestras como si pudieran transmitir agentes infecciosos.
A. Recolección de muestras
Sólo se han validado las muestras de células cervicales conservadas en PreservCyt (vial para Pap líquidoThinPrep®) de Cytyc Corporation (Marlborough, Massachusetts) para su uso con la prueba degenotipado del HPV LINEAR ARRAY. Observe las instrucciones del fabricante para obtener las muestrasde células cervicales en la solución PreservCyt.
B. Transporte de la muestra
Las muestras de células cervicales recopiladas en PreservCyt pueden transportarse a una temperaturacomprendida entre 2 y 30ºC. El transporte de las muestras de células cervicales debe cumplir lareglamentación local, estatal, federal y nacional para el transporte de agentes etiológicos18.
C. Almacenamiento de la muestra
Las muestras de células cervicales conservadas en PreservCyt pueden almacenarse a temperaturaambiente durante 21 días o entre 2 y 8ºC durante 12 semanas.
INSTRUCCIONES DE USO
NOTA: deje que se ambienten todos los reactivos (15-30ºC) antes de utilizarlos, salvo que seindique lo contrario. Examine visualmente los reactivos para comprobar si hay suficientevolumen de reactivo antes de comenzar el procedimiento de la prueba.
NOTA: las muestras de células cervicales deben estar a temperatura ambiente (15-30ºC) antes deser utilizadas.
NOTA: utilice pipeteadores con puntas con filtro para aerosol o desplazamiento positivo cuandoasí se especifique. Extreme las precauciones para asegurar una amplificación selectiva.
Tamaño de análisis:
Cada kit de extracción de material líquido AmpliLute contiene reactivos suficientes para 50 pruebas.Cada kit de detección LINEAR ARRAY contiene reactivos suficientes para 96 pruebas. Cada prueba degenotipado del HPV LINEAR ARRAY contiene reactivos suficientes para procesar cuatro series de 12determinaciones, que podrán realizarse de forma separada o simultánea. En cada serie de pruebas deun máximo de 22 muestras se debe incluir al menos una réplica del control negativo del HPV LINEARARRAY y del control positivo del HPV LINEAR ARRAY (véase la sección “Control de calidad”).
Los reactivos de amplificación se presentan envasados en viales de un solo uso con capacidad para 12pruebas. El control negativo del HPV LINEAR ARRAY y el control positivo del HPV LINEAR ARRAY sepresentan envasados en viales de un solo uso. Las tiras de genotipado del HPV LINEAR ARRAY sesuministran envasadas en bolsas de un solo uso con capacidad para 12 pruebas. Se hace un uso máseficiente de los reactivos cuando las muestras y los controles se procesan en lotes múltiplos de 12.
Flujo de trabajo:
La prueba de genotipado del HPV LINEAR ARRAY puede completarse en un día o en el transcurso dedos días. Si la prueba va a terminarse en un día, siga las instrucciones que encontrará en las Partes A aD en el orden indicado. Si se va a realizar la prueba durante 2 días, puede detenerse el procedimientouna vez finalizada la preparación de muestras y controles (Parte B) o bien después de la amplificación(Parte C).
Para realizar la preparación de la muestra y el control durante el día 1 y la amplificación y detección enel día 2, siga los Pasos B.1 a B.29 y almacene las muestras y los controles procesados como se indicaen el paso B.29. En el día 2, empiece por la Parte A (Preparación de los reactivos) y luego ambiente lasmuestras y los controles procesados a temperatura ambiente y continúe con el Paso B.30.
NOTA: no someta las muestras y los controles procesados a más de 1 ciclo decongelación/ambientación.
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Para completar la preparación de las muestras y los controles y la amplificación en el día 1 y el procesode detección en el día 2, realice la Parte A (Preparación de los reactivos), B (Preparación de muestras ycontroles) y C (Amplificación) el día 1 y almacene el amplicón desnaturalizado a una temperaturacomprendida entre 2 y 8ºC como se indica en el Paso C.6. Continúe con la Parte D (Detección LINEARARRAY) el día 2.
A. Preparación de los reactivos
Realizada en: Área de preamplificación - preparación de reactivos
1. Determine el número de tubos de reacción necesarios para llevar a cabo la prueba con loscontroles y las muestras. Coloque los tubos en la bandeja MicroAmp y bloquéelos en posicióncon el retenedor.
2. Prepare la mezcla maestra de trabajo añadiendo 125 µl de HPV Mg2+ a un vial de HPV MMX.No es necesario medir el volumen de mezcla maestra. Añada 125 µl de HPV Mg2+ al vialentero de HPV MMX. Vuelva a colocar el tapón del tubo e inviértalo de 10 a 15 veces paramezclar bien su contenido. No agite la mezcla maestra de trabajo. El colorante rosado de HPV Mg2+ se utiliza para confirmar visualmente que se ha añadido HPV Mg2+ al reactivo HPV MMX. Deseche la solución HPV Mg2+ sobrante.
3. Añada 50 µl de mezcla maestra de trabajo a cada tubo de reacción utilizando una pipetaMultipette o un pipeteador con punta con filtro para aerosol o desplazamiento positivo. Notapone aún los tubos de reacción.
4. Introduzca la bandeja que contiene la mezcla maestra de trabajo y un número apropiado detapones para tubos de reacción en una bolsa de plástico resellable; mantenga la bolsacorrectamente sellada hasta el momento de su utilización. Desplácese a la zona depreparación de muestras y controles del área de preamplificación. Almacene las bandejas quecontengan la mezcla maestra de trabajo a una temperatura comprendida entre 2 y 8°C en lazona de preparación de muestras y controles del área de preamplificación hasta que finalicela preparación de muestras y controles. La mezcla maestra de trabajo se mantiene establedurante 6 horas a una temperatura comprendida entre 2 y 8°C en los tubos de reacciónsellados en el interior de la bolsa de plástico.
B. Preparación de muestras y controles
Realizada en: Área de preamplificación - preparación de muestras y controles
1. Establezca la temperatura de un bloque de calor en seco a 56ºC ± 2ºC.
2. Establezca la temperatura de otro bloque de calor en seco a 70ºC ± 2ºC.
3. Equilibre los reactivos, las muestras y los controles a temperatura ambiente (durante 15minutos como mínimo). Si se ha formado algún precipitado en el reactivo ATL o AL, disuélvalocalentándolo a 70ºC y agitándolo suavemente.
NOTA: los Pasos B.4-B.6 pueden realizarse durante la incubación de las muestras/loscontroles con PK y ATL (Paso B.10).
4. Disuelva el reactivo CAR liofilizado añadiendo 310 µl de AVE. Agítelos durante 10 segundos.Escriba las iniciales y la fecha del vial.
NOTA: el reactivo CAR disuelto se mantiene estable a una temperatura comprendida entre2 y 8ºC durante 24 horas; también puede extraerse una parte alícuota y congelarlaa -20ºC. No congele ni ambiente el reactivo CAR disuelto más de 3 veces.
5. Añada 30 ml de etanol absoluto al reactivo AW2. Escriba las iniciales y la fecha en la botella.Mezcle AW2 diluido mediante agitación.
NOTA: el reactivo AW2 diluido puede almacenarse a temperatura ambiente durante 1 añoo hasta la fecha de caducidad, la que sea más próxima.
6. Prepare el reactivo AL de trabajo añadiendo el volumen adecuado del reactivo CAR disueltoa AL como se muestra en la tabla 1. Agite el contenido suavemente invirtiendo el tubo 10veces. No agite el contenido para evitar la formación de espuma.
Tabla 1Preparación del reactivo AL de trabajo
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Número de muestras/controles para procesar
Reactivos 12 24 36 48 60 72 96
CAR (ml) 0,04 0,07 0,10 0,13 0,16 0,20 0,25
AL (ml) 4,0 7,0 10,0 13,0 16,0 20,0 25,0
NOTA: el reactivo AL de trabajo se mantiene estable a una temperatura comprendida entre2 y 8ºC durante 48 horas.
7. Identifique un tubo con tapón de rosca de 2 ml para cada muestra y control que vaya aprocesar.
NOTA: no utilice tubos de tapón de rosca de 1,5 ml ni tubos en forma cónica ya que puedeninterferir en la transferencia de calor durante la incubación y evitar que se completela lisis correctamente.
8. Añada 80 µl de ATL a cada tubo.
9. Agite cada muestra y control durante 10 segundos. Añada 250 µl de cada muestra y controlal tubo debidamente identificado.
10. Añada 20 µl de PK a cada tubo. Tapone los tubos y agítelos durante 10 segundos. Incube lostubos a 56ºC ± 2ºC durante 30 minutos en un bloque de calor en seco.
11. Durante la incubación de las muestras y los controles, conecte el colector de vacío QIAvac 24(o QIAvac 24 Plus) según el manual de instrucciones del colector de vacío QIAGEN. Extraigaun CLM por muestra y control de los paquetes blister e identifíquelo. Guarde los tubos derecolección de desechos para utilizarlos en el Paso B.23. Abra la tapa del CLM e introdúzcaloen el VC. Introduzca EXT en el CLM.
12. Cuando termine la incubación a 56ºC ± 2ºC, añada 250 µl de reactivo AL de trabajo a cadatubo. Tapone los tubos y agítelos durante 10 segundos a velocidad máxima.
NOTA: es probable que se forme un precipitado blanco al añadir AL de trabajo. Elprecipitado no interfiere en el procedimiento AmpliLute y se disuelve durante lapróxima incubación.
13. Incube los tubos a 70ºC ± 2ºC durante 15 minutos en un bloque de calor en seco. Agite lasmuestras y los controles de vez en cuando durante el período de incubación.
14. Cuando termine la incubación de las muestras y los controles a 70ºC ± 2ºC, añada 300 µl deetanol absoluto a cada tubo. Tapone los tubos y agítelos durante 15 segundos a velocidadmáxima.
15. Incube los tubos a temperatura ambiente durante 5 minutos. Centrifugue los tubos con unacentrífuga de mesa de trabajo a la velocidad máxima.
16. Transfiera el lisado de cada tubo al CLM correspondiente. Deje incubar la solución durante 1minuto como mínimo.
17. Encienda la bomba de vacío. Aplique el vacío al colector para eliminar todos los lisados ycontinúe con la aplicación de vacío durante 1 minuto más como mínimo. Siga lasinstrucciones del manual para el colector de vacío QIAGEN para desconectar el vacío delcolector.
NOTA: si el lisado de una muestra o control individual no ha pasado por completo por lamembrana, coloque el CLM en un tubo de recolección de 2 ml limpio, ciérrelo conel tapón y centrifúguelo a velocidad máxima durante 1 minuto o hasta que el lisadopase por completo. Pueden adquirirse tubos de recolección de 2 ml adicionales porseparado (consulte “MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS”).
18. Añada 750 µl de AW2 a cada CLM. Deje incubar la solución durante 1 minuto como mínimo.
19. Encienda la bomba de vacío. Aplique el vacío al colector para eliminar todo el líquido ycontinúe con la aplicación de vacío durante 1 minuto más como mínimo. Siga lasinstrucciones del manual para el colector de vacío QIAGEN para desconectar el vacío delcolector.
20. Añada 750 µl de etanol absoluto a cada CLM. Deje incubar la solución durante 1 minuto comomínimo.
21. Encienda la bomba de vacío. Aplique el vacío al colector para eliminar todo el líquido ycontinúe con la aplicación de vacío durante 1 minuto más como mínimo. Siga lasinstrucciones del manual para el colector de vacío QIAGEN para desconectar el vacío delcolector.
22. Extraiga con cuidado el reactivo EXT de cada CLM. Deseche el reactivo EXT.
NOTA: para evitar la contaminación cruzada, no toque el CLM adyacente al extraer el EXT.
23. Coloque cada CLM en un tubo de recolección de desechos (del Paso B.11) y cierre la tapa.Centrifugue los conjuntos resultantes a una velocidad RPM máxima durante 3 minutos.
24. Identifique un ELT para cada muestra y control.
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25. Deseche los tubos de recolección de desechos y coloque cada CLM en el ELTcorrespondiente.
26. Abra la tapa de cada CLM e incúbelos a temperatura ambiente durante 15 minutos.
27. Añada 120 µl de AVE a cada CLM. Cierre todas las tapas.
NOTA: asegúrese de que el AVE está equilibrado a temperatura ambiente antes de añadircada CLM.
28. Incube los conjuntos resultantes a temperatura ambiente durante 5 minutos y centrifúguelosa una velocidad RPM máxima durante 1 minuto.
29. Elimine y deseche el CLM de los conjuntos resultantes y coloque los tapones en los tubos.Amplifique las muestras y controles procesados inmediatamente, o almacénelos a unatemperatura comprendida entre 2 y 8ºC; también puede congelarlos a ≤ -20ºC. Las muestrasy los controles procesados pueden almacenarse a temperatura ambiente durante 6 horascomo máximo, a 2-8ºC hasta 7 días o a -20ºC o menos durante 8 semanas; no debeexcederse el límite de un ciclo de congelación/ambientación. La realización de más de unciclo de congelación/ambientación puede provocar la pérdida de señal.
30. Añada 50 µl de cada muestra y control procesados a los tubos de amplificación apropiadosque contengan la mezcla maestra de trabajo. Utilice una punta nueva con filtro para aerosolo desplazamiento positivo para cada muestra y control. Tapone los tubos de amplificación.
NOTA: si las muestras y los controles procesados se almacenan congelados, deje que sedescongelen a temperatura ambiente. Una vez descongelados, agite con fuerza lasmuestras y los controles procesados durante 10 segundos. Si las muestras y loscontroles procesados se almacenan a 2-8ºC, agítelos con fuerza durante 10segundos antes de añadirlos a la mezcla maestra de trabajo.
NOTA: la amplificación en el termociclador GeneAmp PCR System 9700 con un bloque deplata recubierto en oro de 96 pocillos de Applied Biosystems debe comenzar antesde transcurrir 45 minutos de la adición de las muestras y los controles procesadosa la mezcla maestra de trabajo.
31. Transfiera las muestras y los controles preparados en la bandeja de amplificación al área deamplificación/detección. La porción sobrante de las muestras y los controles procesadosdebe almacenarse según las instrucciones especificadas en el paso B.29.
C. Amplificación
Realizada en: área de postamplificación - amplificación/detección
1. Coloque el conjunto bandeja/retenedor en el bloque del termociclador.
2. Programe el termociclador GeneAmp PCR System 9700 con un bloque de plata recubierto enoro de 96 de Applied Biosystems para la prueba de genotipado del HPV LINEAR ARRAY dela siguiente forma:
Programa HOLD: 2 minutos, 50°C Programa HOLD: 9 minutos, 95°C Programa CYCLE (40 ciclos): 30 segundos, 95ºC; 1 minuto, 55ºC; 1 minuto, 72ºCPrograma HOLD: 5 minutos, 72ºCPrograma HOLD: 72ºC indefinidamente
En los programas CYCLE, establezca la velocidad de rampa en un 50%. Asigne el nombre delmétodo y el nombre de usuario tal como se requieran. Encontrará información adicional acercade la programación y el funcionamiento del termociclador en el Manual del usuariocorrespondiente al termociclador GeneAmp PCR System 9700 con un bloque de platarecubierto en oro de 96 pocillos de Applied Biosystems.
3. Inicie el programa METHOD. En la pantalla “Method Options”, establezca la velocidad derampa “Ramp Speed” en el valor “Max” y el volumen de reacción “Reaction Volume” en“100 µL”. Vuelva a pulsar START. El programa se ejecutará durante 3 horas y 15 minutosaproximadamente.
4. Extraiga la bandeja del termociclador en las 4 horas siguientes al inicio del programa HOLD final,colóquela en la base MicroAmp y continúe inmediatamente con el paso 5. No permita que lostubos de reacción permanezcan en el termociclador durante más de 4 horas. NOINTRODUZCA MUESTRAS AMPLIFICADAS EN EL ÁREA DE PREAMPLIFICACIÓN. LASMUESTRAS Y LOS CONTROLES AMPLIFICADOS DEBEN CONSIDERARSE COMO UNAFUENTE IMPORTANTE DE CONTAMINACIÓN POTENCIAL.
5. Retire los tapones de los tubos de reacción con cuidado para evitar la creación de aerosolesde los productos de amplificación. Pipetee inmediatamente 100 µl de DN en la primeracolumna (o fila) de tubos de reacción usando un pipeteador multicanal con puntas con filtro
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para aerosol; realice cinco veces un movimiento ascendente y descendente del pipeteadorpara mezclar el contenido de los tubos. Repita este procedimiento con cada columna (o fila)utilizando un juego nuevo de puntas.
6. El amplicón desnaturalizado se puede conservar a temperatura ambiente durante 5 horascomo máximo antes de proceder a la detección (Parte D). Si no es posible llevar a cabo lareacción de detección en un plazo de 5 horas, vuelva a taponar los tubos con tapones nuevosy almacene el amplicón desnaturalizado a una temperatura comprendida entre 2 y 8ºC duranteun período máximo de 7 días.
D. Detección LINEAR ARRAY
Realizada en: área de postamplificación - amplificación/detección
NOTA: Durante el procedimiento de detección, no permita que las muestras salpiquen deun pocillo de la bandeja a otro. El agua del baño no debe salpicar tampoco en lospocillos de la bandeja. No apile las bandejas de 24 pocillos.
1. Caliente todos los reactivos de detección a temperatura ambiente. 2. Precaliente un baño de agua a 53ºC ± 2ºC. 3. Precaliente el baño de agua con agitación a 53ºC ± 2ºC con una velocidad de agitación de
60 RPM aproximadamente. Asegúrese de que el baño contenga agua suficiente para calentarla bandeja de 24 pocillos, pero no tanta como para que se produzcan salpicaduras hacia elinterior de la bandeja de 24 pocillos. Para evitar que el agua entre en la bandeja durante laagitación, el agua no debe cubrir más de 1/4 de la pared externa (aproximadamente 0,5 cm).
4. Prepare tampón de hibridación de trabajo de la siguiente forma: Examine las solucionesSSPE y SDS y, si es necesario, caliéntelas a 53ºC ± 2ºC en un baño de agua para volver adisolver el precipitado formado. Añada 100 ml de SSPE a 388 ml de agua destilada odesionizada. Mezcle bien. Añada 12,5 ml de solución SDS y mezcle bien. El tampón dehibridación de trabajo es suficiente para 100 tiras de genotipado del HPV LINEAR ARRAY.El tampón de hibridación de trabajo debe almacenarse a temperatura ambiente en unrecipiente limpio; es estable durante 30 días.
5. Prepare tampón de lavado ambiental de trabajo de la siguiente forma: Examine lassoluciones SSPE y SDS y, si es necesario, caliéntelas a 53ºC ± 2ºC en un baño de agua paravolver a disolver el precipitado formado. Añada 133 ml de SSPE a 2.520 ml de agua destiladao desionizada. Mezcle bien. Añada 13,3 ml de solución SDS y mezcle bien. El tampón delavado ambiental de trabajo es suficiente para 100 tiras de genotipado del HPV LINEARARRAY. El tampón de lavado ambiental de trabajo debe almacenarse a temperaturaambiente en un recipiente limpio; es estable durante 30 días.
6. Prepare tampón de lavado astringente de trabajo de la siguiente forma: Para cada tira de laprueba, extraiga 5 ml de tampón de lavado ambiental de trabajo (preparado en el pasoanterior) y añádalos a una botella de solución de lavado limpia con el tamaño adecuado. (Porej., para una serie analítica de 24 tiras, extraiga 120 ml de tampón de lavado ambiental detrabajo y añádalos a la botella de solución de lavado.) El tampón de lavado astringente detrabajo debe prepararse antes de cada serie analítica.
7. Caliente el tampón de hibridación de trabajo y el tampón de lavado astringente de trabajo enel baño de agua a 53ºC ± 2ºC durante 15 minutos como mínimo. Deje el tampón dehibridación de trabajo y el tampón de lavado astringente de trabajo en el baño de agua hastael momento de usarlos.
8. Prepare tampón citrato de trabajo de la siguiente forma: Examine la solución CIT y, si esnecesario, caliéntela a 53ºC ± 2ºC en un baño de agua para disolver el precipitado formado.Añada 25 ml de solución CIT a 475 ml de agua destilada o desionizada. Mezcle bien. El tampóncitrato de trabajo es suficiente para 100 tiras de genotipado del HPV LINEAR ARRAY. El tampóncitrato de trabajo debe almacenarse a temperatura ambiente en un recipiente limpio; es establedurante 30 días.
9. Extraiga el número necesario de tiras de genotipado del HPV LINEAR ARRAY de la bolsa detiras HPV Strip con unos fórceps limpios.
10. Etiquete cada una de las tiras HPV Strip con la correspondiente identificación de muestra ocontrol; utilice para ello un rotulador permanente resistente al agua, al calor y a sustanciasquímicas.
11. Coloque las tiras con las líneas de sonda en posición vertical en el pocillo correspondiente dela bandeja de 24 pocillos.
12. Añada 4 ml de tampón de hibridación de trabajo previamente calentado en cada pocillo quecontenga una tira etiquetada.
13. Con la ayuda de un pipeteador con punta con filtro para aerosol o desplazamiento positivo,pipetee con cuidado 75 µl de amplicón desnaturalizado en el pocillo correspondiente que
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contenga una tira etiquetada. Balancee suavemente la bandeja tras cada adición. Utilice unapunta nueva para cada adición de amplicón.
14. Cubra la bandeja de 24 pocillos con la tapa e introduzca la bandeja en el baño de agua conagitación a 53ºC ± 2ºC. Coloque un peso (anillo) de plomo de 1 libra (0,45 kg) sobre la tapade la bandeja con el fin de mantener la bandeja de 24 pocillos en una posición fija dentro delbaño de agua con agitación. Deje actuar la hibridación durante 30 minutos con una velocidadde agitación de 60 RPM aproximadamente.
15. Durante la hibridación (paso 14), prepare conjugado de trabajo de la siguiente forma: Añada15 µl de SA-HRP a 5 ml de tampón de lavado ambiental de trabajo por cada tira que se estéprobando. Mezcle bien. El conjugado de trabajo debe almacenarse a temperatura ambienteen un recipiente limpio; es estable durante 3 horas.
16. Retire la bandeja de 24 pocillos del baño de agua con agitación y extraiga el tampón dehibridación de trabajo de los pocillos mediante aspiración por vacío.
17. Añada 4 ml de tampón de lavado ambiental de trabajo en cada pocillo que contenga una tira.Balancee suavemente 3 ó 4 veces la bandeja de 24 pocillos para lavar las tiras y aspireinmediatamente por vacío el tampón de lavado ambiental de trabajo de los pocillos.
18. Añada 4 ml de tampón de lavado astringente de trabajo previamente calentado en cadapocillo que contenga una tira. Limpie la posible condensación de la tapa de la bandeja conuna toallita de papel limpia, coloque la tapa sobre la bandeja de 24 pocillos y vuelva aintroducir la bandeja de 24 pocillos en el baño de agua con agitación a 53ºC ± 2ºC. Coloqueun peso (anillo) de plomo de 1 libra (0,45 kg) sobre la tapa de la bandeja con el fin de mantenerla bandeja de 24 pocillos en una posición fija dentro del baño de agua con agitación. Incubedurante 15 minutos con una velocidad de agitación de 60 RPM aproximadamente.
19. Retire la bandeja de 24 pocillos del baño de agua con agitación y extraiga el tampón de lavadoastringente de trabajo de los pocillos mediante aspiración por vacío.
20. Añada 4 ml de conjugado de trabajo en cada pocillo que contenga una tira. Limpie la posiblecondensación de la tapa de la bandeja con una toallita de papel limpia, coloque la tapa sobrela bandeja de 24 pocillos e introduzca la bandeja de 24 pocillos en el agitador orbital atemperatura ambiente. Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente (15-30ºC) conuna velocidad de agitación de 60 RPM aproximadamente.
21. Retire la bandeja de 24 pocillos del agitador orbital y extraiga el conjugado de trabajo de lospocillos mediante aspiración por vacío.
22. Añada 4 ml de tampón de lavado ambiental de trabajo en cada pocillo que contenga una tira.Balancee suavemente 3 ó 4 veces la bandeja de 24 pocillos para lavar las tiras y aspireinmediatamente por vacío el tampón de lavado ambiental de trabajo de los pocillos.
23. Añada 4 ml de tampón de lavado ambiental de trabajo en cada pocillo que contenga una tira.Limpie la posible condensación de la tapa de la bandeja con una toallita de papel limpia,coloque la tapa sobre la bandeja de 24 pocillos e introduzca la bandeja de 24 pocillos en elagitador orbital a temperatura ambiente durante 10 minutos con una velocidad de agitaciónde 60 RPM aproximadamente.
24. Retire la bandeja de 24 pocillos del agitador orbital y extraiga el tampón de lavado ambientalde trabajo de los pocillos mediante aspiración por vacío.
25. Añada 4 ml de tampón de lavado ambiental de trabajo en cada pocillo que contenga una tira.Coloque la tapa sobre la bandeja de 24 pocillos e introduzca la bandeja de 24 pocillos en elagitador orbital a temperatura ambiente durante 10 minutos con una velocidad de agitaciónde 60 RPM aproximadamente.
26. Retire la bandeja de 24 pocillos del agitador orbital y extraiga el tampón de lavado ambientalde trabajo de los pocillos mediante aspiración por vacío.
27. Añada 4 ml de tampón citrato de trabajo en cada pocillo que contenga una tira. Coloque latapa sobre la bandeja de 24 pocillos e introduzca la bandeja de 24 pocillos en el agitadororbital a temperatura ambiente durante 5 minutos con una velocidad de agitación de 60 RPMaproximadamente.
28. Prepare sustrato de trabajo de la siguiente forma: Añada 4 ml de SUB A a 1 ml de SUB B porcada tira que se esté probando. Mezcle bien. El sustrato de trabajo debe almacenarse atemperatura ambiente en un recipiente limpio, protegido de la exposición a la luz directa; esestable durante 3 horas.
29. Retire la bandeja de 24 pocillos del agitador orbital y extraiga el tampón citrato de trabajo delos pocillos mediante aspiración por vacío.
30. Añada 4 ml de sustrato de trabajo en cada pocillo que contenga una tira. Coloque la tapasobre la bandeja de 24 pocillos e introduzca la bandeja de 24 pocillos en el agitador orbital atemperatura ambiente durante 5 minutos con una velocidad de agitación de 60 RPMaproximadamente.
15
31. Retire la bandeja de 24 pocillos del agitador orbital y extraiga el sustrato de trabajo de lospocillos mediante aspiración por vacío.
32. Añada 4 ml de agua destilada o desionizada en cada pocillo que contenga una tira. Las tirasse pueden almacenar dentro de agua destilada o desionizada a temperatura ambiente duranteun período máximo de un día para su posterior interpretación.
Limpieza de la bandeja de 24 pocillos
Realizada en: área de postamplificación - amplificación/detección
NOTA: las bandejas de 24 pocillos son desechables aunque también se pueden reutilizar.Para volver a utilizar las bandejas, debe realizar este procedimiento de limpiezadespués de cada uso.
1. Prepare una solución al 10% de RBS35 añadiendo 1 parte de RBS35 a 9 partes de aguadestilada o desionizada.
2. Llene cada uno de los pocillos de la bandeja con la solución al 10% y déjelos en remojodurante la noche a temperatura ambiente.
3. Enjuague concienzudamente la bandeja con agua destilada o desionizada.4. Seque completamente la bandeja antes de usarla.
RESULTADOS
Asegúrese de que los resultados de los controles de la serie analítica son válidos (consulte el apartadoControl de calidad). Si la serie analítica no es válida, repítala por completo (preparación de las muestras,amplificación y detección LINEAR ARRAY).
Interprete la tira de genotipado del HPV LINEAR ARRAY de cada serie analítica válida. Para ello, extraiga latira de la bandeja de 24 pocillos con unos fórceps limpios. Coloque la tira sobre una superficie no porosalimpia (por ej., una lámina de acetato) y alinee la guía de referencia de la prueba de genotipado del HPVLINEAR ARRAY con la línea de referencia (REF) marcada con tinta en la parte superior de la tira. Anote lasbandas positivas visibles e interprete los resultados de HPV y de ß-globina (BG) de cada tira de la siguienteforma:
16
Resultadode HPV
Resultadodel controlalto de BG
Interpretación
– – –
Resultado no válido. No se ha podido detectar el ADN del HPV, si estápresente. La ausencia de un control alto y bajo de BG indica una obtención demuestras no adecuada, un procesado incorrecto o la presencia de inhibidores.Procese otra parte alícuota de la muestra original y repita la prueba. Si la muestraoriginal no está disponible, obtenga una nueva.
– – +
Resultado no válido. Es posible que no se haya detectado el ADN del HPV, siestá presente. La ausencia de un control bajo de BG es síntoma de una obtenciónde muestras no adecuada, de un procesado incorrecto o de la presencia deinhibidores. Procese otra parte alícuota de la muestra original y repita la prueba. Sino está disponible la muestra original, deberá obtenerse una nueva.
– + +
ADN del HPV no detectado. Los resultados negativos no implican la presenciade una infección por HPV porque los resultados dependen de una obtenciónadecuada de las muestras, de su correcto procesado, de la ausencia deinhibidores y de que haya una cantidad suficiente de ADN de HPV para detectar.
+ – –
ADN del HPV detectado (comunicar genotipos). Se ha obtenido un resultadopositivo de la prueba de HPV. La ausencia de un control bajo y alto de BG essíntoma de que la obtención de las muestras, o su procesado, no se haefectuado correctamente, de la presencia de inhibidores o de un objetivo de HPVcon un título elevado. Es posible que haya otros genotipos de HPV que no sehan detectado.
+ – +
+ + +ADN del HPV detectado (comunicar genotipos). Se ha obtenido un resultadopositivo de la prueba de HPV. No puede descartarse la presencia otros genotiposde HPV en la muestra.
Resultadodel controlbajo de BG
ADN del HPV detectado (comunicar genotipos). Se ha obtenido un resultadopositivo de la prueba de HPV. La ausencia de un control bajo de BG es síntomade que la obtención de las muestras, o su procesado, no se ha efectuadocorrectamente, de la presencia de inhibidores o de un objetivo de HPV con untítulo elevado. Es posible que haya otros genotipos de HPV que no se handetectado.
Interpretación de la sonda de reacción cruzada
Las tiras de genotipado del HPV LINEAR ARRAY contienen una sonda de reacción cruzada (línea desonda 14) que se hibridiza con los genotipos 33, 35, 52 y 58 del HPV. Los resultados positivos de lasbandas de la sonda se deben interpretar de la siguiente forma:
Resultado de la banda Interpretación
33, 52/33/35/58 HPV 33*
35, 52/33/35/58 HPV 35*
58, 52/33/35/58 HPV 58*
52/33/35/58 HPV 52
* Estos resultados de la prueba no pueden descartar la coinfección con el genotipo 52 del HPV.
CONTROL DE CALIDAD
Se deben procesar como mínimo una réplica del control negativo del HPV LINEAR ARRAY y una réplicadel control positivo del HPV LINEAR ARRAY con cada serie analítica de hasta 22 muestras. Como encualquier procedimiento nuevo de laboratorio, los nuevos usuarios deben considerar el empleo decontroles positivos y negativos adicionales cada vez que realicen la prueba hasta que alcancen un altogrado de confianza en su capacidad para realizarla correctamente. No hay requisitos relacionados con laposición de los controles en la bandeja MicroAmp.
Las muestras y los controles de series analíticas con preparación de muestras independiente se puedenamplificar y detectar simultáneamente. No obstante, cada serie analítica con preparación de muestrasindependiente se debe validar individualmente mediante el conjunto de controles incluidos en la serieanalítica. Por lo tanto, es posible rechazar una serie analítica de muestras de una serie analítica comúnde amplificación y/o detección al mismo tiempo que se puede aceptar otra serie analítica según elrendimiento de los controles procesados con esas muestras.
Todas las muestras y los controles de la prueba preparados en la misma serie analítica se debenamplificar y detectar en posiciones contiguas en el termociclador y en la bandeja de detección. El ordenexacto de disposición de estas muestras y controles en el termociclador o en la bandeja de detección noes de vital importancia.
Control negativo
El resultado del ensayo del control negativo del HPV LINEAR ARRAY debe ser la ausencia de bandaspositivas. Si hay alguna banda positiva visible, no será válida toda la serie analítica. Repita la serieanalítica al completo (preparación de las muestras y los controles, amplificación y detección LINEARARRAY). Si los resultados obtenidos del control negativo del HPV LINEAR ARRAY incluyen repetidamentebandas positivas, póngase en contacto con su oficina local de Roche para recibir asistencia técnica.
Control positivo
El resultado del ensayo del control positivo del HPV LINEAR ARRAY debe ser un resultado positivointerpretado como genotipo 16 del HPV, control alto de ß-globina y control bajo de ß-globina. La bandadel control bajo de ß-globina aparecerá difuminada en comparación con la banda del control alto de ß-globina, pero debe ser visible a simple vista. Si el resultado obtenido del control positivo del HPV LINEARARRAY no es exactamente el arriba indicado, no será válida toda la serie analítica. Repita la serie analíticaal completo (preparación de las muestras y los controles, amplificación y detección LINEAR ARRAY). Silos resultados obtenidos del control positivo del HPV LINEAR ARRAY incluyen repetidamente un patrónde bandas positivas diferente al indicado, póngase en contacto con su oficina local de Roche para recibirasistencia técnica.
PRECAUCIONES DEL PROCEDIMIENTO
Como sucede con cualquier procedimiento analítico, resulta esencial observar una adecuada técnica delaboratorio para obtener un rendimiento correcto del ensayo. Debido a la elevada sensibilidad analíticade la prueba, deben extremarse las precauciones para preservar la pureza de los reactivos de los kits ylas mezclas de amplificación. Supervise atentamente la pureza de todos los reactivos. Deseche cualquierreactivo cuya pureza sea objeto de sospecha.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
1. Esta prueba se ha validado para su uso con células cervicales humanas obtenidas mediante lasolución PreservCyt. Su realización en otros tipos de muestras puede dar lugar a resultados falsospositivos o falsos negativos.
2. Esta prueba se ha validado para su uso exclusivo con el kit de extracción de material líquidoAmpliLute. Su realización en otros tipos de procedimientos de extracción de muestras puedeoriginar resultados incorrectos.
17
3. La obtención de resultados fiables depende de que los procedimientos de obtención, transportey almacenamiento de las muestras, así como su procesamiento, sean adecuados.
4. La detección del HPV depende del número de genomas virales presentes en la muestra, que sepuede ver afectado por el método de obtención de ésta y factores propios del paciente (como laedad o la presencia de síntomas) y/o la fase de infección.
5. Pueden obtenerse resultados falsos negativos debido a la inhibición de la polimerasa o a laimpropiedad de las células. Se ha añadido la amplificación de la ß-globina a la prueba degenotipado del HPV LINEAR ARRAY para permitir la identificación de las muestras procesadasque contienen sustancias que pueden interferir en la amplificación por PCR y/o en una obtencióninadecuada de las células.
6. La presencia de la enzima AmpErase en la mezcla maestra del HPV LINEAR ARRAY reduce elriesgo de contaminación del amplicón. No obstante, la contaminación de las muestras y loscontroles positivos del HPV sólo puede evitarse mediante la utilización de buenas prácticas delaboratorio y con el cumplimiento estricto de los procedimientos especificados en este boletíntécnico.
7. El uso de este producto debe limitarse al personal con experiencia en el empleo de técnicas dePCR.
8. Este producto sólo se ha validado para utilizarlo con el termociclador GeneAmp PCR System 9700con un bloque de plata recubierto de oro 96 pocillos de Applied Biosystems. No utilice con esteproducto ningún otro termociclador, incluidos el GeneAmp PCR System 2400, el GeneAmp PCRSystem 9600 o el GeneAmp PCR System 9700 con bloque de aluminio.
9. Las muestras que contienen gel anticonceptivo bioadhesivo Advantage-S® pueden interferir en elrendimiento de la prueba de genotipado del HPV LINEAR ARRAY y se pueden obtener resultadosfasos positivos o no válidos.
10. Se ha demostrado que las muestras con un contenido de sangre superior al 3,5% (v/v) puedeninhibir la amplificación por PCR y se pueden obtener resultados falsos positivos.
11. La identificación de los genotipos 64 y 69 del HPV se basa en los resultados de la prueba degenotipado del HPV LINEAR ARRAY para ADN plásmido de los genotipos 64 y 69 del HPV.Durante la evaluación del rendimiento no se detectaron los genotipos 64 y 69 del HPV en unamuestra clínica.
SUSTANCIAS INTERFERENTES
Se ha demostrado que los siguientes productos de higiene íntima femenina, lubricantes, cremasantifúngicas y geles anticonceptivos no interfieren en el rendimiento de la prueba de genotipado del HPVLINEAR ARRAY.
Tabla 2
Se observaron resultados falsos negativos o no válidos para muestras positivas de HPV que conteníangel anticonceptivo bioadhesivo Advantage-S en concentraciones de 0,11 g/20 ml y superiores.
Se obtuvieron resultados negativos para muestras positivas de HPV con un contenido de sangre superioral 3,5% (v/v).
No se observaron resultados falsos negativos o no válidos para muestras positivas de HPV que conteníanmoco endocervical o exocervical.
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Espuma anticonceptiva vaginal Ortho Options™ Delfen® Crema antifúngica Mycelex® 3
Crema vaginal Clotrimazole 3 Crema medicinal Vagi-Gard®
Crema vaginal Gyne-Lotrimin® 3 Crema antipicores Vagisil®
Crema antipicores con hidrocortisona al 1% Gynecort® Supositorios vaginales homeopáticos Yeast Gard™
Fórmula de hidrocortisona Vaginex® Supositorios desodorantes Norforms®
Concentrado medicinal de ducha Betadine® Lubricante personal en gelatina K-Y Brand®
Crema vulvar externa Miconazole Lubricante íntimo Vagisil®
Envase variado Monistat® 3
Nombre del producto
PREVALENCIA DE LOS GENOTIPOS DE HPV
Se ha demostrado que la prevalencia y la distribución de los genotipos de HPV pueden variar según lazona geográfica, en todo el mundo19-21. Además, ciertos genotipos, p. ej. el 55, el 64 y el 69, parecenser genotipos noveles registrados en prevalencia baja y no asociados al cáncer cervical20,22. Losgenotipos de HPV más frecuentes asociados al cáncer cervical en prevalencia o frecuencia decrecienteson los tipos 16, 18, 45 y 31; se ha observado una variación de la frecuencia según la distribucióngeográfica para la mayoría de los genotipos, incluidos los tipos 33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 59 y 68.
Tabla 3 Prevalencia registrada de los genotipos de HPV en casos de control y cáncer cervical19-21
19
Genotipo de HPV Prevalencia (%)16 7,5 – 56,018 2,3 – 22,145 2,4 – 7,958 0,2 – 5,453 0,0 – 5,233 1,0 – 4,431 2,0 – 4,252 0,5 – 4,262 454 0,0 – 3,639 0,0 – 3,361 0,0 – 3,235 0,4 – 2,756 0,2 – 2,566 0,0 – 2,484 2,36 0,3 – 2,381 0,1 – 2,370 0,0 – 2,359 0,0 – 2,1
CP6108 0,0 – 1,883 1,672 0,0 – 1,568 0,1 – 1,242 0,0 – 1,243 0,0 – 1,255 1,173 0,1 – 1,011 0,1 – 0,840 0,0 – 0,882 0,0 – 0,667 0,544 0,0 – 0,469 0,271 0,2
IS39 0,226 0,0 – 0,264 0,157 0
EVALUACIÓN NO CLÍNICA DEL RENDIMIENTO
A. Límite de detección
Se determinó el límite de detección para los genotipos 16, 18, 31 y 45 del HPV, que representan los cuatrogenotipos con más alto riesgo de prevalencia o asociados al cáncer4. El ADN plásmido [cuantificado porespectrofotometría (absorción de 260 nm)] de cada uno de los cuatro genotipos se diluyó en 100, 300,900 y 3.000 copias/ml en solución PreservCyt con 250 ng/ml de ADN genómico humano. Se prepararoncuatro paneles de dilución independientes y se analizaron con dos lotes de reactivos, utilizando un lotede reactivos para probar dos de los paneles de dilución. Como mínimo se generaron 23 resultadosválidos en cada nivel de concentración plásmida para uno de los cuatro genotipos. Se realizó un análisisProbit para los cuatro genotipos de HPV y la tasa de resultados positivos esperada del 95% para losgenotipos 16, 18, 31 y 45 fue de 120, 815, 1.920 y 251 copias/ml, respectivamente (Tabla 4). Losgenotipos 16, 18 y 45 se detectaron con una tasa de positividad del 100% en 300, 3.000 y 900 copias/ml,respectivamente. El genotipo 31 se detectó con una tasa de positividad del 92% en 3.000 copias/ml yuna tasa de positividad del 96% en 900 copias/ml.
Tabla 4 Límite de los resultados de detección para la prueba de genotipado del HPV LINEAR ARRAY
*n=23
**n=24
B. Inclusividad de los genotipos: ADN plásmido
La inclusividad de los genotipos se determinó mediante el análisis de 36 plásmidos de genotipos de HPV(6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 81, 82, 83, 84, IS39 y CP6108). El ADN plásmido para el genotipo 52 del HPV no estuvo disponiblepara la prueba. La inclusividad para el tipo 52 del HPV se demostró en estudios con una muestra clínica(apartado C). Para los genotipos 16, 18, 31 y 45 del HPV se comprobó la inclusividad en el límite delestudio de detección. Los 32 stocks restantes de ADN plásmido disponible del genotipo del HPV secuantificaron mediante espectrofotometría (absorción de 260 nm), diluidos en 900 copias/ml en soluciónPreservCyt y se probaron a continuación en réplicas de seis mediante dos lotes de reactivos. Para losgenotipos de HPV en los que no se detectó una tasa de positividad del 100% en 900 copias/ml serealizaron pruebas adicionales con concentraciones de ADN plásmido crecientes hasta que se determinóel nivel de inclusividad del 100% (n=6) para el genotipo en cuestión. Los resultados demostraron que laprueba de genotipado del HPV LINEAR ARRAY puede detectar 36 genotipos de HPV a partir de ADNplásmido del HPV en varios niveles de concentración según el genotipo del HPV (Tabla 5).
20
Genotipo deHPV
Tasas de resultados positivos observadas Tasa de resultadospositivos del 95%esperada segúnanálisis Probit
(copias/ml)3.000
(copias/ml)900
(copias/ml)300
(copias/ml)100
(copias/ml)
16 100%* 100%** 100%** 71%** 120
18 100%** 92%** 92%** 75%** 815
31 92%** 96%** 75%** 33%** 1.920
45 100%** 100%** 96%* 79%** 251
Genotipos de HPV de bajo y alto riesgo
Nº
de
po
sit
ivo
s
33
3
76
23
4
50
6
22
48
3
29
26
47
32
47
21 21
25
39
35 35
42
29
9
19 19
2
11
15 15
7
25
37
2
40
0
10
20
30
40
50
60
70
80
6
11
16
18
26
31
33*
35*
39
40
42
45
51
52
53
54
55
56
58*
59
61
62
66
67
68
70
71
72
73
81
82
83
84
IS39
CP6108
Tabla 5 Inclusividad de los genotipos para la prueba de genotipado del HPV LINEAR ARRAY
* El nivel de inclusividad es igual a una tasa de resultados positivos del100% (n=6) en las concentraciones indicadas excepto para losgenotipos 16, 18, 31 y 45 del HPV, donde la concentración indicadaes la tasa de resultados positivos del 95% esperada según el análisisProbit.
C. Inclusividad de los genotipos: muestras clínicas
Durante las evaluaciones del rendimiento, se obtuvieron un total de 451 muestras clínicas positivas delHPV mediante la prueba de genotipado del HPV LINEAR ARRAY. Con la prueba de genotipado del HPVLINEAR ARRAY se detectaron 35 de los 37 genotipos de HPV (6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42,45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 66, 67, 68, 70, 71, 72, 73, 81, 82, 83, 84, IS39 y CP6108) enmuestras clínicas, lo que demuestra la inclusividad. La distribución de estos genotipos de HPV semuestra en la ilustración 1. En las evaluaciones de rendimiento no se detectaron los genotipos 64 y 69del HPV en una muestra clínica.
Ilustración 1 Distribución de los genotipos de HPV en muestras clínicas positivas del HPV LINEAR ARRAY
(n=451) a lo largo de las evaluaciones de rendimiento
* Para 58 muestras clínicas que resultaron positivas para ADN del HPV 33, HPV 35 y/o HPV 58, no se pudo descartar lacoinfección con el genotipo 52 del HPV.
21
Genotipo deHPV
Nivel deinclusividad*(copias/ml)
6 90011 90016 12018 81526 90031 192033 500035 90039 90040 5000042 3000045 25151 90053 90054 90055 90056 500058 900
Genotipo deHPV
Nivel deinclusividad*(copias/ml)
59 90061 90062 90064 30000066 90067 3000068 90069 90070 90071 90072 90073 90081 90082 90083 90084 900
CP6108 900IS39 1500
D. Reproducibilidad
La reproducibilidad se evaluó con 3 lotes de reactivos, 5 combinaciones de instrumentos(termocicladores y baños de agua) y 3 usuarios en un total de 15 series analíticas. Cada usuario realizóun total de 5 series analíticas con cada uno de los tres lotes de reactivos y efectuó una serie analítica encada una de las 5 combinaciones de instrumentos. Se preparó un panel de cuatro miembros consistenteen un lote de cuatro genotipos de HPV (16, 18, 31 y 45) en solución PreservCyt con 250 ng/ml de ADNgenómico humano. Los miembros del panel se prepararon con cada genotipo en 2.000 copias/mlademás de en 3, 10 y 100 veces la concentración de la tasa de resultados del 95% esperada según elanálisis Probit determinada en el límite del estudio de detección. Todos los miembros del panel seprobaron por triplicado mediante un lote de reactivos para cada serie analítica. Para los genotipos 16, 18,31 y 45 del HPV, se obtuvo una tasa de resultados positivos del 99% en 2.000 c/ml y en 3 veces laconcentración de la tasa de resultados del 95% esperada según el análisis Probit. Se obtuvo una tasade resultados positivos del 100% para los genotipos 16, 18, 31 y 45 del HPV en concentraciones 10veces superiores a la concentración de la tasa de resultados del 95% esperada según el análisis Probity en concentraciones superiores (Tabla 6). No se observó ninguna diferencia significativa entre distintasseries analíticas, lotes, usuarios, ni instrumentos.
Tabla 6 Reproducibilidad para la prueba de genotipado del HPV LINEAR ARRAY
E. Especificidad analítica: microorganismos distintos del HPV
Para valorar la especificidad de la prueba para la exclusión de microorganismos distintos del HPV, seañadieron las bacterias, virus, protozoos o levaduras cultivados que aparecen en la tabla 7 a la soluciónPreservCyt con 250 ng/ml de ADN genómico humano y se analizaron con la prueba de genotipado delHPV LINEAR ARRAY. Las concentraciones de microorganismos probadas variaban entre 3.5e2 hasta2.0e3 IFU/ml para C. trachomatis, 1e6 PFU/ml para el virus del herpes, 8e5 células/ml para T. vaginalis, 2e2hasta 2e3 CFU/ml para C. neoformans y 1,5e4 hasta 9,8e9 CFU/ml para el resto de microorganismos aexcepción de H. ducreyi, M. hominis y N. gonorrhoeae, para los que no se conocían las concentraciones.Los resultados indicaron que la prueba de genotipado del HPV LINEAR ARRAY no sufrió una reaccióncruzada con una variedad de virus, bacterias, protozoos y levaduras que pudieron estar presentes en lasmuestras cervicales.
22
Miembro delpanel
ADN deHPV 16
(copias/ml)
ADN deHPV 18
(copias/ml)
ADN deHPV 31
(copias/ml)
ADN deHPV 45
(copias/ml)
Númeroprobado
Resultados de la prueba degenotipado del HPV LINEAR
ARRAY HPV positivo
Resultadospositivos % 95% IC
100X 12.000 81.500 192.000 25.100 135 135 100% 98-100%
10X 1.200 8.150 19.200 2.510 135 135 100% 98-100%
3X 360 2.445 5.760 753 135 133 99% 95-100%
2.000 (c/ml) 2.000 2.000 2.000 2.000 135 133 99% 95-100%
Tabla 7 Microorganismos distintos del HPV probados
F. Especificidad analítica: genotipos de HPV
La especificidad de los genotipos de HPV de cada línea de sonda del HPV de la tira del HPV se evaluómediante la prueba de elevadas concentraciones de ADN plásmido de HPV para 36 genotipos de HPV(6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 81, 82, 83, 84, IS39 y CP6108). El ADN plásmido para el genotipo 52 del HPV no estuvo disponiblepara la prueba. Los stocks disponibles de ADN plásmido del HPV se cuantificaron mediante la mediciónde la absorbancia de 260 nm en un espectrofotómetro y se diluyeron en 500.000 copias/mL en tampónTE (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8.0). Se amplificaron y detectaron por duplicado todos los genotiposplásmidos del HPV mediante la prueba de genotipado del HPV LINEAR ARRAY. Los resultadosdemostraron la especificidad de los genotipos de HPV sólo para la línea de sonda esperada para los 36genotipos de HPV evaluados con ADN plásmido. Además, la especificidad del genotipo 52 del HPV parala línea de sonda esperada se demostró en la prueba de una muestra clínica (genotipo confirmado porsecuenciación) con un título de HPV desconocido.
G. Sensitividad y especificidad para la detección del HPV a partir de muestras clínicas
La sensibilidad y la especificidad de la prueba de genotipado del HPV LINEAR ARRAY para detectar ADNde HPV de alto riesgo de muestras clínicas se valoró mediante la prueba de 698 muestras cervicalesobtenidas en solución PreservCyt. Para el alcance de este estudio, se clasificaron como de alto riesgolos genotipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 del HPV. 487 de estas muestras fueronnegativas y 211 positivas para el HPV de alto riesgo mediante la prueba de ADN de HPV de alto riesgoHybrid Capture® 2 (prueba del HPV HC2). La presencia o ausencia de ADN de HPV de alto riesgo en lasmuestras se determinó mediante la concordancia entre las dos pruebas. Los resultados discordantes seresolvieron en análisis posteriores de las muestras mediante la prueba del HPV AMPLICOR®. Según losresultados consensuados de 2 de los 3 ensayos, se determinó la verdadera disposición para cadamuestra clínica (es decir, positivo verdadero para ADN de HPV de alto riesgo o negativo verdadero para
23
Achromobacter xerosis Eikenella corrodens Mycobacterium avium
Acinetobacter sp. genospecies 3 Enterobacter cloacae Mycoplasma hominis
Actinomyces isrealii Enterococcus faecalis Neisseria gonorrhoeae
Aerococcus viridans Erysipelothrix rhusiopathiae Pasteurella maltocida
Aeromonas hydrophila Escherichia coli Pediococcus acidilactica
Agrobacterium radiobacter Ewingella americana Peptostreptococcus productus
Alcaligenes faecalis Flavobacterium meningosepticum Prevotella corporis
Bacteriodes fragilis Gamella morbillorum Proteus mirabilis
Bifidobacillus longum Gardnerella vaginalis Providencia stuartii
Bifidobacterium adolescentis Haemophilus ducreyi Pseudomonas aeruginosa
Branhamella catarrhalis Herpes simplex virus 1 Rahnella aquatilis
Brevibacterium linens Herpes simplex virus 2 Salmonella minnesota
Candida albicans Kingella kingae Serratia denitrificans
Chlamydia trachomatis tipo D Klebsiella pneumoniae ss ozaenae Staphylococcus aureus
Chlamydia trachomatis tipo F Lactobacillus vaginalis Streptococcus anginosus
Chromobacter violaceum Lactococcus lactis cremoris Streptococcus epidermidis
Clostridium perfringens Legionella pneumophila Treponema phagedenis
Corynebacterium genitalium Leuconostoc paramesenteroides Trichomonas vaginalis
Cryptococcus neoformans Micrococcus luteus Vibrio parahaemolyticus
Deinococcus radiopugnans Moraxella osloensis Yersinia enterocolitica
Derxia gummosa Morganella morganii
ADN de HPV de alto riesgo). Los resultados de la prueba de genotipado del HPV LINEAR ARRAY semuestran en la tabla 8. De las 485 muestras clínicas que fueron negativos falsos del ADN de HPV de altoriesgo, 118 muestras clínicas resultaron positivas para el ADN de HPV de bajo riesgo mediante la pruebade genotipado del HPV LINEAR ARRAY. La distribución de los genotipos de HPV de bajo riesgodetectados en estas 118 muestras clínicas se muestra en la ilustración 2. La sensitividad y laespecificidad para la presencia de ADN de HPV de alto riesgo en muestras cervicales obtenidas ensolución PreservCyt fue del 96% y del 99%, respectivamente, para la prueba de genotipado de HPVLINEAR ARRAY (tabla 9).
Tabla 8 Resultados de las muestras clínicas mediante la prueba de genotipado del
HPV LINEAR ARRAY
* Un resultado positivo significa positivo para elADN de HPV de alto riesgo; las muestraspositivas sólo para el ADN de HPV de bajoriesgo se clasifican como negativas para esteanálisis.
Tabla 9 Especificidad y sensitividad de la prueba de genotipado del HPV LINEAR ARRAY
para ADN de HPV de alto riesgo
* Intervalo de confianza del 95% mediante elmétodo de Wald
Ilustración 2 Distribución de los genotipos de HPV de bajo riesgo en muestras clínicas que fueron
negativos para el ADN de HPV de alto riesgo (n=118) en las evaluaciones de especificidad ysensitividad
24
10
2
1
2
11
18
5
6
11
6
4
2
6 6
23
1
89
5
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
6 11 26 40 42 53 54 55 61 62 66 67 70 72 73 81 82 83 84
CP
6108
Genotipos de HPV de bajo riesgo
Nº
de
po
siti
vos
Resultados* de laprueba de
genotipado del HPVLINEAR ARRAY
Número de muestras clínicas
Positivo verdadero 197
Negativo verdadero 485
Falso negativo 9
Falso positivo 3
No válido 4
Total 698
Parámetro Estimación 95% IC*
Sensitividad 96% 92 – 98%
Especificidad 99% 98 – 100%
H. Fallo de todo el sistema
La tasa de fallo de todo el sistema de la prueba de genotipado del HPV LINEAR ARRAY se determinómediante la evaluación de 135 resultados de la prueba para cada uno de los cuatro genotipos de HPV(16, 18, 31 y 45) en concentraciones tres veces mayor que el límite de detección (el límite de detecciónse definió como la tasa de resultados positivos del 95% prevista según el análisis Probit). Las solucionesde la prueba que contienen ADN plásmido para los cuatro genotipos de HPV se prepararon en soluciónPreservCyt y también contenían 250 ng/ml de ADN genómico humano. De forma colectiva, de las 540pruebas totales de los cuatro genotipos de HPV, se observaron dos sucesos de error del sistema (HPVnegativo y ß-globina positiva) para una tasa de fallo de todo el sistema del 0,4%.
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REFERENCIAS
1. Burd, Eileen M. 2003. Human Papillomavirus and Cervical Cancer. Clinical Microbiology Reviews.16:1-17.
2. zur Hausen, H. 2002. Papillomaviruses and Cancer: From Basic Studies to Clinical Application. NatRev Cancer. 2(5):342-50.
3. Walboomers, Jan M. M., Marcel V. Jacobs, M. Michele Manos, et al. 1999. Human Papillomavirusis a Necessary Cause of Invasive Cervical Cancer Worldwide. Journal of Pathology. 189:12-19.
4. Bosch, F. Xavier, M. Michele Manos, Nubia Munoz, et. al. International Biological Study on CervicalCancer (IBSCC) Study Group. 1995. Prevalence of Human Papillomavirus in Cervical Cancer: aWorldwide Perspective. Journal of the National Cancer Institute, Vol. 87, No. 11:796-802.
5. Davies, Philip, Janet Kornegay, and Thomas Iftner. 2001. Current methods of testing for humanpapillomavirus. Best Practice and Research Clinical Obstetrics and Gynaecology. Vol. 15, No. 5:677-700.
6. Koutsky, L. 1997. Epidemiology of genital human Papillomavirus infection. American Journal ofMedicine. 102(5A):3-8.
7. Richardson, H., et al. 2003. The Natural History of Type-Specific Human Papillomavirus Infectionsin Female University Students. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention, Vol. 12:485-490.
8. Kjaer, S., et al. 2002. Type specific persistence of high risk human papillomavirus (HPV) as indicatorof high grade cervical squamous intraepithelial lesions in young women: population basedprospective follow up study. BMJ. Vol. 325:572.
9. Costa, S., et al. 2003. Factors predicting human papillomavirus clearance in cervical intraepithelialneoplasia lesions treated by conization. Gynecologic Oncology, 2003, August; 90(2):358-365.
10. Yutaka, N., et al. 2004. Persistence of human papillomavirus infection as a predictor for recurrencein carcinoma of the cervix after radiotherapy. American Journal of Obstetrics and Gynecology,2004, 191, 1907-1913.
11. Nobeyama, H., et al. 2004. Association of HPV infection with prognosis after neoadjuvantchemotherapy in advanced uterine cervical cancer. International Journal of Molecular Medicine,2004, July; 14(1):101-105.
12. Koutsky, L., et al. 2002. A Controlled Trial of a Human Papillomavirus Type 16 Vaccine, NEJM, Vol.347(21):1645-1651.
13. Myers, T.W. and Gelfand, D.H. 1991. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermusthermophilus DNA polymerase. Biochemistry 30:7661-7666.
14. Gravitt P.E., C. L. Peyton, T. Q. Alessi, C.M.Wheeler, F. Coutlée, A. Hildesheim, M.H. Schiffman,D.R. Scott, and R.J. Apple. 2000. Improved Amplification of Genital Human Papillomaviruses.Journal of Clinical Microbiology 38:357-361.
15. Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to controlcarry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125-128.
16. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and BiomedicalLaboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
17. Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of Laboratory Workers from InfectiousDisease Transmitted by Blood, Body Fluids, and Tissue. Approved Guideline. CLSI DocumentM29-A Villanova, PA:NCCLS, 1997.
18. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp.
19. Clifford, et al., Human papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide: a meta analysis,British Journal of Cancer, (2003) 88, 63-73.
20. Peyton, et al., Determinants of Genital Human Papillomavirus Detection in a US Population, TheJournal of Infectious Diseases, 2001; 183:1554-1564.
21. Muñoz, et al., Epidemiologic Classification of Human Papillomavirus Types Associated withCervical Cancer, New England Journal of Medicine, 2003: 348:518-527.
22. Bernard, et al., Identification and Assessment of Known and Novel Human Papillomaviruses byPolymerase Chain Reaction Amplification, Restriction Fragment Length Polymorphisms,Nucleotide Sequence, and Phylogenetic Algorithms, The Journal of Infectious Diseases, 1994;170:1077-1085.
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27
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