M-44 a2 Disco Difusion Para Levaduras 2013
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PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIFUNGICA PARA LEVADURAS POR DISCO DIFUSION M44-A2, M44-S3 (2009)
Lic. ROBERTO E. ROJAS LEON Instituto Nacional de Salud del Niño
[email protected] 2013
Practical handbook of microbiology, 2008
EVOLUCION TAXONOMICA DE LAS LEVADURAS
Fuente Referencia
Nº Géneros
Nº Especies
Incremento %
Incremento % Año
Epidemiología
• Levaduras en IIH del torrente sanguíneo – 41.4%, comunicación personal (INSN, 2006-
2008) • Entre 1999 y 2000, casos de sepsis por
hongos se incrementa en 207% (USA) – Candida spp, Aspergillus spp y Cryptococcus
spp
CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, 20(1):133-163, 2007
CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, 20(1):133-163, 2007
Normas CLSI
• Incremento de IFI y de antifúngicos – Pruebas de susceptibilidad antifúngica
GANAN reconocimiento • Métodos de referencia tanto macro y
microdilución de CLSI – Levaduras, M27
• P (1992); T (1995); A (1997); A2 (2002) – Mohos, M38
• P (1998); A (2002)
P 2003 A 2004
Método disco difusión
• Solo para levaduras – Solo para Candida spp.
• No abarca otros géneros de levaduras ni dimórficos en su fase de levadura
• Azoles y equinocandinas • Resultados, 20 a 24 h. de incubación • Mueller-Hinton en lugar de RPMI
– Disponibilidad – Bajo costo
Método disco difusión
• Punto de corte – Caspofungina – Fluconazol – voriconazol
Método disco difusión
• Parámetros de QC – Caspofungina – Fluconazol – Posaconazol – voriconazol
Selección de los antimicrobianos en disco para pruebas de rutina y reporte
• Pese a criterios interpretativos, no recomendado en rutina: – Decisión tomada por médico infectólogo,
comité de farmacia y terapéutica, personal de microbiología clínica y el comité IIH.
• Para minimizar confusión, emplear nombres genéricos.
• Número de agentes testados, deben ser limitados, aún con pocos antifúngicos.
Equipo y materiales
• Incubadora a 35 ºC (±2 ºC), con ambiente aeróbico.
• Estándar de turbidez McFarland 0.5 • Hisopos de algodón estériles • Solución salina fisiológica estéril (8.5 g/L
NaCl; 0.85%).
Reactivos
• Medio Agar Mueller-Hinton + Glucosa 2% + Azul de Metileno 0.5 μg/mL (MHS) – Fácil disponibilidad – Aceptable reproducibilidad lote a lote – Suplemento
• Glucosa 2%, apropiado crecimiento • Azul de metileno 0.5 μg/mL, incrementa zona de
definición – Puede ser suplementado ya sea pre o pos
producción
Guía Práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica, Pemán. 2007
Preparación del medio de Mueller-Hinton agar suplementado (1) y suplementación de las placas de MHA (2).
Reactivos
• pH de MHS – 7.2 – 7.4, Tº amb. después de solidificado
• Macerar medio para sumergir el electrodo • Dejar que una pequeña cantidad de agar se
solidifique alrededor del electrodo en un recipiente de vidrio
• Usar electrodo de superficie calibrado
• Humedad – Exceso en la superficie, secar en incubadora
o cabina de flujo laminar, tapa entreabierta (10-30 min).
Reactivos
• Almacenamiento de discos – Refrigerar los recipientes a ≤ 8 ºC o
congelación a -14 ºC, hasta ser utilizados. • Preparación del estándar de turbidez
– Estándar de turbidez McFarland 0.5
PROCEDIMIENTO
• Preparación del inóculo – Cepas subcultivadas, sobre AS ó ASD
(pureza y viabilidad). Tº 35 ºC (±2 ºC) – Inóculo preparado picando 5 colonias
distintas de aprox. 1 mm de Ø, 24 h, 5 ml de SSF estéril
– Agitar por 15 s y ajustar turbidez (1x106 a 5x106 cel/mL
Preparación inóculo levaduras (M44-A2).
Guía Práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica, Pemán. 2007
Desarrollo de Levaduras sobre ASD 2%: Gold Standar
Verificar pureza del aislamiento: evita dolores de cabeza
bacterias
Chrom Agar: excelente alternativa
Coinfección
PROCEDIMIENTO • Inoculación de las placas
– Dentro de los 15 min después de ajustar la turbidez del inóculo, embeber el hisopo en la suspensión, rotar varias veces y presionar firmemente contra la pared interna del tubo evitando el nivel del fluido.
– Agar MHS es inoculado por estriado uniforme del hisopo en toda su superficie, dos o mas veces, rotando la placa aprox. 60º cada vez, finalmente el borde del agar.
– Tapa entreabierta, 3-5 min., no mas de 15 min
PROCEDIMIENTO • Aplicación de los discos
– Los discos son dispensados sobre la superficie de la placa inoculada, ligera presión, aproximación entre discos no menor de 24 mm de centro a centro
– Invertir las placas e incubar dentro de los 15 min después que los discos son aplicados
DISCOS DE FLUCONAZOL
25 μg
DISCOS DE VORICONAZOL
1 μg
PROCEDIMIENTO • Lectura de las placas e interpretación
– Examinar después de 20-24 h de incubación – Zonas de inhibición uniformemente circulares y
desarrollo semiconfluente – Sobre fondo negro no reflejante, iluminado – Medir el diámetro de prominente reducción de
crecimiento – Ignorar microcolonias en los bordes o grandes
colonias dentro de la zona de inhibición. – Leer a las 48 h solo cuando insuficiente
desarrollo es observado a las 24 h
M44-S3 2009
INTERPRETACION
J Clin Microb; 2008, 46(6):1927-1929
CONTROL DE CALIDAD
• Propósito (monitorear) – Precisión (repetitibilidad) y exactitud – Performance de reactivos – Performance de la persona que realiza la
prueba y lee los resultados
CONTROL DE CALIDAD
• Utilizar cepas de referencia para el QC – Candida albicans ATCC 90028 – Candida parapsilosis ATCC 22019 – Candida tropicalis ATCC 750 – Candida krusei ATCC 6258.
CONTROL DE CALIDAD • Almacenamiento de cepas para el QC
– Minimizar posibilidad de mutación – APD a -70 ºC – Cepas de trabajo, AS o ASD a 2-8 ºC,
subcultivadas cada semana, no mas de tres semanas
– Cepas congeladas o liofilizadas, subcultivadas al menos dos veces antes de su uso
CONTROL DE CALIDAD • Diámetros límites del control de calidad
– Diario, si es satisfactorio semanal
CARTILLA DE MICOTECA
MUCHAS GRACIAS