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M. C. de Productos Naturales y Alimentos Análisis Químico Cuantitativo Dr. Raúl Salas Coronado 1 Enero de 2012; Huajuapan de León, Oaxaca
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M. C. de Productos Naturales y Alimentos
Análisis Químico Cuantitativo
Dr. Raúl Salas Coronado
1
Enero de 2012; Huajuapan de León, Oaxaca
2
Journals
Los artículos técnicos que involucran HPLC pueden aparecer en la mayoría de los journals que están relacionados las ciencias químicas y bioquímicas. Sin embargo la lista de journals de abajo son de especial valor para lectores que desean conservarse actualizados en los nuevos desarrollos en el campo.
• Analytical Chemistry, American Chemical Society
• Chromatographia, Springer
• Journal of Chromatographic Science, Preston
• Journal of Chromatography A, Elsevier
• Journal of Chromatography B, Elsevier
• Journal of Liquid Chromatography, Wiley
• Journal of Separation Science, Wiley
• LCGC, Advanstar
3
Reviews
Los artículos review que están relacionados con HPLC se pueden encontrar en los journals listados en la diapositiva anterior. Adicionalmente hay series de publicaciones que están destinadas en parte a HPLC, como colecciones de artículos review.
• Advances in Chromatography, Dekker
• High-Performance Liquid Chromatography. Advances and perspectives, Academic Press (publicado únicamente entre 1980 y 1986)
• Journal of Chromatography Library, Elsevier
4
CLASIFICACIÓN DE LOS
MÉTODOS DE HPLC
5
Clasificación en métodos cromatográficos de líquidos
6
Modos de separación por HPLC
7
Modo cromatográfico Comentario
Fase reversa La columna es no polar y la fase móvil es una mezcla polar de agua más disolvente orgánico. Se usa especialmente para muestras solubles en agua.
Fase normal
La columna es polar, y la fase móvil es una mezcla de disolventes orgánicos poco polares. Se usa principalmente para muestras insolubles en aguas, HPLC preparativo, y la separación de isómeros.
Fase reversa no acuosa La columna es no polar, la fase móvil es una mezcla de disolventes orgánicos; se usa muestras muy hidrofóbicas insolubles en agua.
Modos de separación por HPLC
8
Modo cromatográfico Comentario
Intercambio iónico
La columna contiene grupos cargados que pueden enlazar iones de carga opuesta de la muestra y la fase móvil es usualmente una solución acuosa de una solución buffer salina. Se usa para separar muestras ionizables.
De par iónico
Se usan las condiciones de fase reversa, excepto que a la fase móvil se le adiciona un reactivo de par iónico para generar interacciones con iones de carga opuesta presentes en la muestra. Se utiliza para la separación de ácidos o bases que son débilmente retenidos en columnas de fase reversa.
De exclusión por tamaño
Se usa una coumna inerte con una fase móvil acuosa u orgánica. Este modo cromatográfico separa en base al peso molecular y se usa principalmente para biomoléculas grandes o polímeros sintéticos.
9
10
Cromatografía de fase normal
• Partículas microporosas
esféricas de sílice muy pura
permeables al disolvente.
• Área superficial de varios
centenares de metros
cuadrados por gramo.
• Insoluble a pH < 8.
11
12
Diagrama esquemático ilustrando la
cromatografía de intercambio iónico
Iones sulfonato intercambiando
Na+ por p+ del analito
13
Diagrama esquemático ilustrando la
cromatografía de exclusión por tamaño
Mostrando que las moléculas más grandes
migran más rápido
14
Hidrofobicidad
Se presenta cuando el analito no es capaz de interacccionar con las moléculas de agua ni por interacciones ión-dipolo ni mediante puentes de hidrógeno
15
COMPONENTES DE UN EQUIPO DE
HPLC
16
Esquema de un HPLC
17
Reservorio de disolvente
Bomba
Muestra
Válvula de inyección
Columna Detector
Cromatógrafo automatizado
18
S1, S2, y S3 = Reservorios de disolvente.
DG = Sistema de degasificación.
V1, V2 y V3 = Válvulas.
Pu = Bomba.
Pre = Sensor de presión.
Inj = inyector.
C = columna.
F = Colector de fracciones.
RC = Baño de reacción.
RR = Reactivo de reacción.
D = Detector.
W = residuos.
T1 y T2 = Hornos.
COM = Computadora.
Pro = Programador de disolvente.
Pri = Impresora.
INT = Integrador o registrador.
19
Detector de
Ultravioleta
Columna
Puerto de
inyección
Dos bombas para
elución en gradiente
Computadora para
control y presentación
de datos
Equipo de HPLC Hitachi
20
Organizador
Detector de UV
Horno de columna
Automuestreador
Bomba
Reservorio de fase móvil
21
Reservorio
venteo
Frita de entrada
Aparato de filtración de fase móvil para
vacío
22
Membrana de filtración
Embudo de filtración
Frita soporte
Tapón inerte Vacío
Matraz para vacío
Solubilidad del oxígeno en etanol
23
(----) Concentración de oxígeno después de mezclar aire saturado en agua con
etanol (antes de liberar el exceso de oxígeno).
(____) Concentración de saturación en la mezcla.
Oxígeno en exceso
Frac
ció
n m
ol d
e O
2 x
10
4
Fracción mol de etanol
Efecto del burbujeo de He sobre la respuesta
del detector al naftaleno
24
He He Aire
Flu
ore
scen
cia
A
bso
rba
nci
a d
e U
V
Tiempo (min)
(a) Detección en UV a 254 nm. (b) Detección en fluorescencia a una excitación de 250 nm y una emisión de 340 nm.
Diagrama de un aparato de membrana para
degasificar dos disolventes, A y B
25
Entrada de fase móvil
Entrada
Salida
Vacío
Vacío Tubo permeable al gas
Fase móvil
Gas disuelto
Salida de fase móvil
Diámetros internos para tubing común para
presión alta
26
Diámetro interno (pulg) Diámetro interno (mm)a Volumen (L/cm)
a Valor nominal (calculado a partir de las dimensiones en pulg). b Solamente disponible en PEEK. c Disponible solamente en acero inoxidable.
Guía para longitud de tubing
27
Accesorios (fittings) para aplicaciones de
presión baja
28
Brida
(extremo abocinado)
Arandela Tuerca Tubing
Conicidad
interna
Tuerca de apretado con dedos, rebordeada
Contera
invertida
Contera = ferrule Puerto de
fondo plano
Contera
invertida
Unión
Roscas de
tuerca
Extremo del tubo
Accesorios (fittings) para aplicaciones de presión
alta
29 a) Tubos, conteras (ferrules) y tuercas de acero inoxidable convencional, b) Cuerpos de unión, c) Unión montada correctamente, d) Tuercas de apretado con dedos, conteras y puertos de PEEK.
Tuerca de apretado con dedos, rebordeada
Contera Tuerca
Extremo del tubo
Puerto
Conteras
(Ferrules)
Cuerpos de unión
Efecto del retroceso de contera (ferrule
setback) en el racor de montaje de tubing
30
Racor = Pieza metálica con dos
roscas internas en sentido inverso
que sirve para unir tubos y otros
perfiles cilíndricos
Retroceso
de contera
Fugas
Volumen de hueco
31
Tubing
32
Diámetro externo: 1/16”
Diámetro interno (mm) Color Line
0.13 Rojo
0.17 Amarillo
0.25 Azul
0.50 Naranja
0.75 Verde
1.00 Gris
SISTEMA DE BOMBEO E INYECCIÓN
33
Sistema de entrega de eluyente
• La bomba es el corazón del HPLC y debe satisfacer una serie de requisitos. Se debe entregar un flujo libre de pulsos y constante (estabilidad: < 5 %, o usualmente < 1 L) lo cual debe ser reproducible a presiones superiores a los 50 MPa.
• El volumen interno de la bomba debe ser muy pequeño para que permita cambios de eluyente rápidos y precisos.
• El material de las líneas de flujo (tubing) debe ser compatible con todos los tipos de disolvente, incluyendo disolventes orgánicos, y disoluciones ácidas y básicas.
• Se utilizan ampliamente las bombas de pistón reciprocante.
34
Bomba reciprocante de pistón simple
35
Diseño de válvulas de retención (check)
36
Diseños de bombas con sus correspondientes
perfiles de flujo y presión
37
(a) Bombas de pistón simple
reciprocante.
(b) Efecto de la forma de una leva
impulsora.
(c) Bomba de pistón dual.
(d) Diseño de pistón en cascada (tandem)
o acumulador.
Mezclado en línea (on line)
Para métodos isocráticos la fase móvil se puede manejar mezclada; no son
requeridos mezclados adicionales en el interior del sistema de HPLC.
La mayoría de los usuarios toman ventajas de la conveniencia de un mezclado
en línea y el uso de un sistema HPLC para mezclar la fase móvil para métodos
isocráticos. Sin embargo, en algunos casos este tipo de mezclado puede afectar
la línea base, por ejemplo en detecciones con un detector de índice de
refracción.
Los mezclados en línea se pueden realizar a través de tres técnicas:
• Mezclado a alta presión
• Mezclado a baja presión
• Sistemas híbridos.
38
39
Sistema HPLC con un mezclador de presión
alta
40
Volumen de residencia (dwell-volume) localizado dentro las líneas punteadas.
41
Sistema HPLC con un mezclador de presión
baja
Volumen de residencia (dwell-volume) localizado dentro las líneas punteadas.
Pasos para medir el volumen de residencia
usando un detector de UV
1. Desconectar la columna y remplazarla con una unión de volumen muerto
cero.
2. Colocar acetona al 0.5 % en el reservorio B y agua en el reservorio A..
3. Establecer un programa de gradiente lineal desde 0% hasta 100% de B en
10 min a una velicidad de flujo de 1.0 mL/min y una longitud de onda de
detección de 254 nm.
4. Iniciar el gradiente de disolvente y el sistema de adquisición de datos para
registrar la señal del detector.
5. Medir el punto de intersección del trazo de absorbancia extrapolada con
la línea base para registrar el tiempo de residencia. Multiplicar el tiempo
de residencia por la velocidad de flujo para obtener el volumen de
residencia.
42
Trazo de gradiente de absorbancia usado para
medir el volumen de residencia
43
Sistema de mezclado híbrido con válvulas
dosificadoras para los disolventes A, B, C montado
sobre el cabezal de la bomba
44
(a) Vista de la sección cruzada (a) Vista de la sección frontal
Las dos etapas de una inyección incorporando
45
Válvula de inyección de muestra operada en
modo de llenado parcial de loop
46
(b)
Inyección parcial de loop
Muestra
Fase móvil
(a)
Cargar Inyectar
Entrada de
muestra Residuos
(a) Posición de carga (b) Posición de inyección
Las flechas muestran la dirección del flujo. s = entrada de la muestra w = a residuos p = fase móvil desde la bomba c = a columna
Circuito de inyección (Loop)
Las dimensiones del circuito de inyección (loop) son importantes. Las inyecciones más confiables se obtienen con una técnica conocida como de "sobrellenado". Cuando se utiliza la técnica de sobrellenado una inyección de la muestra se hará que sea 3 a 5 veces mayor que el volumen del circuito de inyección.
47
Inyector
48
Referencia Descripción
UP-7725 Inyector analítico, modo dual en Acero Inoxidable.
UP-7725i Inyector analítico, modo dual con inyección remota en Acero
Inoxidable
UP-9725 Inyector analítico, modo dual en PEEK
UP-9725i Inyector analítico, modo dual con inyección remota en PEEK.
UP-7000 Inyector con válvula de conmutación de (1/16") de 6 puertos,
con inyección remota, en acero inoxidable
UP-7000L
Inyector con válvula de conmutación de (1/16") de 6 puertos
para diámetros grandes, con inyección remota, en acero
inoxidable.
UP-7010 Inyector analítico (1/16"), modo simple en Acero Inoxidable.
UP-3000-038 Inyector con válvula de conmutación de (1/8") de 6 puertos, con
inyección remota, en acero inoxidable.
UP-3000 Inyector con válvula de conmutación de (1/8") de 6 puertos, con
inyección remota, en PEEK.
UP-9010 Inyector analítico (1/16"), modo simple en PEEK
Jeringas
49
Especificaciones de jeringas y agujas
50
COLUMNAS
51
Tipos de columnas para HPLC basadas en el
diámetro interno (i.d)
52
La columna y la guarda columna
La HPLC consta típicamente de dos columnas: una columna analítica
responsable de la separación y una guarda columna que se coloca antes de la
columna analítica para protegerla de la contaminación.
53
Guarda columnas
54
Comparativo de cromatogramas mostrando el
desempeño con y sin guarda columna
55
Columnas analíticas
Las columnas más utilizadas se fabrican en acero inoxidable y tienen
diámetros internos de 2.1 a 4.6 mm y longitudes que oscilan entre 30 y 300
mm, aproximadamente.
Estas columnas se empacan con partículas de sílice poroso de 3-10 m, de una
forma irregular o esférica.
Las eficacias de columna típicas son de N = 40,000 a 60,000 platos teóricos/m.
56
Micro-columnas (Micro-bore)
Las micro-columnas utilizan menores cantidades de disolvente, ya que la
muestra se diluye en menor medida, produciendo señales mayores en el
detector.
Estas columnas se fabrican con capilares de sílice fundida, con diámetros
internos de 44 a 200 m y longitudes de hasta varios metros.
Se han preparado micro-columnas llenas con partículas de 3 a 5 m y eficacias
de columna que alcanzan hasta 250,000 platos teóricos/m.
57
Micro-columnas capilares abiertas
La micro-columnas capilares abiertas tienen diámetros de 1-50 m y
longitudes de hasta 1 m.
Estas columnas que no tienen material empacado, proporcionan eficacias de
columna de hasta 1 millón de platos teóricos.
58
Columnas rápidas LC
El uso de columnas cortas (15-50 mm) empacadas con pequeñas partículas (
por ejemplo < 3 m) tiene varios beneficios significativos en el análisis de
mezclas simples.
• Análisis isocrático (1-3 min) o de gradiente (2-10 min) rápidos
• Desarrollo y validación de métodos rápidos
• Consumo bajo de disolventes (50-80%) menor que en las columnas
convencionales
• Incremento en la sensibilidad de masa (2-5 veces)
59
Diagrama ilustrando la versatilidad de columnas
rápidas LC en alta velocidad y alta resolución
60
Columnas basadas en sílice de pureza alta
61
Comparativo de cromatogramas mostrando el efecto
de la pureza de la sílice en la forma de los picos de
analitos básicos
62
El desarrollo de sílice de pureza alta
(99.995 %) con <50 ppm de metales
permitió mejorar la reproducibilidad
de picos de analítos básicos. Este
problema no se debe al número de
grupos silanoles presentes en la fase
estacionaria, se debe más a la
actividad de estos.
Selección de columna
63
64
Ejemplo para una columna de fase reversa C18
65
Separación como una función del % de fase
móvil B
66
Muestra de herbicida
1. Monolinuron
2. Metobromuron
3. Diuron
4. Propazina
5. Cloroxuron
Condiciones
Columna C18 150 x 4.6 mm, 5 m
Fase móvil: Mezcla de
metanol/agua
Flujo: 2 mL/min
Temperatura ambiente
1
2
3
4 5
FASE MÓVIL
67
Tipos de interacciones entre moléculas de
disolvente y analito
1. Interacciones dipolares, se presentan cuando el analito y el disolvente
poseen momentos dipolares.
2. Dispersión, se presentan debido a la atracción entre moléculas vecinas.
3. Interacciones dieléctricas, favorecen la solubilidad de especies iónicas
en disolventes polares.
4. Enlaces de hidrógeno entre moléculas de disolvente y analito cuando uno
de ellos corresponde a un donador de protones y el otro a un aceptor de
protones.
68
Fuerza eluotrópica = Describe la fuerza de una fase móvil para eluir analitos
desde una fase estacionaria.
69
Fuerza eluotrópica y viscosidad de
disolventes usados como fase móvil
Serie eluotrópica para la alúmina
Fuerza del disolvente
70
= parámetro de fuerza del disolvente
k’ = factor de capacidad
As = surface cross section occupied by solute
nb = describes the molecular cross section occupied on the adsorbent surface by the solvent molecule b in units of 0.085 nm2
a = describes the activity parameter of the adsorbent surface
Ejemplo de cálculo de la fuerza de una mezcla
binaria de disolventes
71
Efecto de la fuerza eluotrópica
El orden de elución de 7 azúcares homólogos indica que la fase estacionaria es
polar y que la fuerza elutrópica de la fase móvil disminuye conforme la masa
molecular incrementa.
72
Propiedades de disolventes
73
a Longitud de onda a la cual
absorbe el disolvente
b Índice de refracción
c Punto de ebullición
d Parámetro de fuerza del
disolvente
Otra manera de elegir la fase móvil
La elección de la fase móvil se puede hacer a través del índice de polaridad
(P´). El cual es una medida cuantitativa de la polaridad del disolvente.
Mezclando dos o varios disolventes se puede obtener una fase movil de
polaridad intermedia.
74
𝑃´𝐴𝐵 = 𝐴𝑃´𝐴 + 𝐵𝑃´𝐵
Donde: 𝑃´𝐴 y 𝑃´𝐵 = índices de polaridad de los disolventes A y B
𝐴𝑦 𝐵 = fracciones de volumen de los disolventes A y B
Relación entre índice de polaridad y el factor
de capacidad
•Una guía útil cuando se utilizan los índices de polaridad es que un cambio de
su valor en 2 unidades corresponde aproximadamente a un cambio de 10
veces el factor de capacidad.
•El cambio del índice de polaridad de la fase móvil mediante la alteración de
las cantidades relativas de dos disolventes proporciona un medio para variar
el factor de capacidad del soluto.
•Sin embargo estos cambios no son muy selectivos.
75
Propiedades de las fases móviles usadas en
HPLC
76
Miscibilidad de los disolventes para HPLC
77
Elementos del sistema cromatográfico
78
DETECTORES
79
80
CARACTERÍSTICAS IDEALES DE
LOS DETECTORES
1. Tener sensibilidad alta y respuesta predecible
2. Responder a todos los solutos, o tener una especificidad predecible
3. No afectarse por los cambios de temperatura o fase móvil
4. Responder de manera independiente a la fase móvil
5. No contribuir al ensanchamiento de los picos extra-columna
6. Ser confiable y conveniente de usar
7. Tener una respuesta que incremente linealmente con la cantidad de soluto
8. No destruir al soluto
9. Proporcionar información cualitativa de los picos detectados
10. Ser fácil de manipular y barato
Detectores con sensibilidad a la concentración
o masa
81
Los detectores con sensibilidad a la concentración producen una señal, S, la
cual es proporcional a la concentración, c, de la muestra en el eluato.
Los detectores con sensibilidad a masa producen una señal la cual es proporcional
al flujo de masa, por ejemplo, al número, n, de moléculas en la muestra o iones por
unidad de tiempo, t, en el eluato.
Selectividad de los detectores
82
Ruido
83
El aumento de la amplificación de la señal del detector muestra que la línea base es
irregular incluso cuando no hay picos eluidos. El ruido de frecuencia alta (a corto plazo) se
atribuye a una tierra inadecuada del detector y/o al registrador o también a la amplificación
electrónica. Sin embargo, un nivel de ruido mínimo persiste a pesar de
La amplificación electrónica consiste en magnificar la señal detectada. Este procedimiento
también puede incrementar el nivel de ruido.
(a) Ruido de alta frecuencia (a) Ruido de baja frecuencia (de corto plazo)
Meyer V. Practical High-Performance Liquid Chromatography. Fourth Edition, Wiley Ed., (2004)
Efecto de la velocidad de adquisición de datos
en la detección de ruido
84
(a) Una velocidad de
colección de datos de 15
Hz
(b) Una velocidad de
colección de datos de 1
Hz
Señ
al d
el d
etec
tor
(V
)
Tiempo (min)
Snyder L., Kirkland J. J., Dola J. W. Introduction to modern liquid chromatography. Third Edition, Wiley Ed., (2010)
Constante de tiempo
La constante de tiempo, , es una medida de qué tan rápido un detector puede registrar
un pico. Conforme el detector trabaja junto con la adquisición de datos , la constante de
tiempo de esta combinación es un factor importante.
La constante de tiempo se puede definir como el tiempo mínimo requerido por un
sistema para alcanzar el 63 % de su valor en la escala total (a menudo también se
especifica un 98 %). Esta constante no debe ser mayor a 0.3 s para detectar picos de
HPLC muy finos.
Los mejores detectores ofrecen una elección de constante de tiempo.
85
Efecto de un filtro de ruido de resistencia-
capacitancia (RC)
86
Constante de tiempo
de 1.0 segundos
Señal
bruta
Res
pues
ta (
mU
A)
Tiempo (min)
•Señal bruta de l detector con 16 mUA de ruido
de corto plazo.
•Una constante de tiempo de 1 segundo reduce el
ruido a < 1 mUA
Snyder L., Kirkland J. J., Dola J. W. Introduction to modern liquid chromatography. Third Edition, Wiley Ed., (2010)
Como una regla empírica, si la constante de tiempo es
menor que el ≈10% de la amplitud del pico, la señal del
pico no se crompometerá.
Relación señal a ruido (S/N)
Esta relación es más importante que la señal o ruido usados de forma independiente
como un indicador del desempeño de un detector para un pico en particular.
La relación señal a ruido (S/N) se mide desde el centro de la línea base (ruido) a la
parte superior del pico. La contribución de la relación (S/N) a la precisión se puede
estimar como:
87
Snyder L., Kirkland J. J., Dola J. W. Introduction to modern liquid chromatography. Third Edition, Wiley Ed., (2010)
Límite de detección (LOD) y límite de
cuantificación (LOQ)
88
Donde: CV = coeficiente de variación
LOD = 3 veces S/N CVLOD = 16.7 %
LOQ = 10 veces S/N CVLOQ = 5.0 %
Mejora de la relación señal a ruido
Incremento de la señal Disminución del ruido
Mejor longitud de onda Incrementar la constante de tiempo del detector
Detector más sensible Un mayor número de datos promediados para la señal
Derivatización del analito Mejor control de temperatura
Inyectar muestras más grandes Mejor limpieza de muestra
Reducir el ancho del pico Flujo de fase móvil constante
Volumen de columna más pequeño Pureza de disolventes y reactivos alta
Número de platos mayor Cambiar columna
89
Deriva (Drift)
La deriva (Drift) describe la desviación de la línea base y aparece en la adquisición de datos como una pendiente. La deriva es normal cuando el detector está encendido. Sin embargo, tan pronto como el sistema electrónico y las lámparas alcanzan su temperatura de operación normal la línea base se estabilizará a menos que se produzca una deriva por alguno de los factores siguientes:
90
(a) Elución en gradiente
(b) La fase móvil anterior todavía no
ha sido completamente desplazada
por el nuevo disolvente, después
de un cambio de eluyente.
(c) Cambios en la composición de la
fase móvil (evaporación,
degasificado muy intenso con
helio).
(d) Cambios en la temperatura
ambiental.
Límite de Detección (LOD) y Rango dinámico
lineal (LDR)
91
Noise = Ruido Drift = Deriva
El rango lineal es más grande en un detector
de UV que en uno de índice de refracción, su
rango general es de 1 : 10,000. Por ejemplo, un
límite superior de 5 x 10-4 g/mL corresponde a
a un límite de intervalo lineal más bajo de 5 x
10-8 g/mL.
Técnicas de detección
• Propiedad bruta o medida diferencial
• Muestra específica
• Modificación de fase móvil
• Técnicas hifenadas
92
Sistemas de detección cromatográfica y sus
principios
93
Tipos de detectores HPLC
94
Muestra específica Propiedades brutas Hifenada Reacción
UV-visible Índice de refracción Espectrometría de masa
Reacción
Fluorescencia Dispersión de luz Infrarrojo
Radioactividad Descarga de corona Resonancia Magnética Nuclear
Conductividad
Nitrógeno quimioluminiscente
Detectores espectrofotométricos
La detección está basada en la Ley de Lambert-Beer.
95
A = *c*b
Celdas de flujo de un detector de UV
96
(a) Construcción de una celda de
flujo de camino Z típica
(b) Celda de flujo con superficie
interna reflectiva
Esquemas de detectores de UV mono- y
policromático
97
(a) Detector de absorbancia de
UV/vis (monocromático)
(b) Detector de arreglo de fotodiodos
(policromático)
Selectividad de longitud de onda para
detección UV
98
Los cromatogramas representan una mezcla de varios pesticidas registrados a tres
diferentes longitudes de onda. En un análisis cuantitativo se deben determinar los
factores de respuesta de cada uno de los compuestos.
Representación tridimensional, I = f(t, ), de una
separación cromatográfica detectada con un
arreglo de fotodiodos
99
Funciones de un detector de arreglo de
fotodiodos
100
(a) Registro de un espectro durante la
separación.
(b) Registro de un cromatograma a
diferentes longitudes de onda
(c) Control de la pureza de un pico
(d) Cromatograma con y sin substracción
de una longitud de onda de una
referencia
Características de un detector de UV
101
• Capaz de tener una sensibilidad alta
• Buen intervalo lineal (>105)
• Se puede fabricar con volúmenes de celda pequeños para minimizar el
ensanchamiento de pico extra-columna
• Relativamente insensible a los flujos de la fase móvil y cambios de temperatura
• Muy confiable
• Fácil de operar
• No destruye la muestra
• Respuesta ampliamente variable para diferentes solutos
• Compatible con la elución en gradiente
• Se puede seleccionar una longitud de onda de detección
• Son comunes la revisión de calibración y solución de problemas internos
Detector de fluorescencia
102
103
Reacciones fluorogénicas de catecolaminas
104
Cromatograma de un derivado de DPE-
catecolaminas en plasma humano
105
Pico Compuesto Concentración
(pmol/mL de plasma)
1 Norepinefrina 1.72
2 Epinefrina 0.56
3 Dopamina 0.21
4 Isoproterenol
(estándar interno)
0.5
1 pmol = 1 x 10-12 mol
Columna: TSK gel ODS-120T (5 m; 150 x 4.6 mm);
Fase móvil: ACN-MeOH-buffer clorhidrato-tris 50 mM (pH = 7.0)
(5:1:4 v/v/v).
TSK-gel fase reversa
106
Las columnas de base sílice TSK-gel son para fase reversa.
TSK dispone de una amplia gama de columnas, con diferentes porcentajes de
recubrimiento, grado de end-capping, etc., que cubren un amplio campo de
aplicaciones.
La nomenclatura usada por Toso caracteriza individualmente cada relleno. Así, por
ejemplo, un relleno ODS-80TM indica un relleno de 80 A de poro funcionalizados
con grupos octadecilsilano.
La letra T significa que ha sido sometido a un proceso de end-capping con grupos
TMS.
La partícula A describiría un relleno sin endcapping y la M significaría que el
recubrimiento es de tipo monocapa de grupos C18. Si aparece una S en la
descripción, significará que el proceso de end-capping es total.
107
Detector de índice de refracción
Los detectores de índice de refracción no son selectivos y se usan
frecuentemente para complementar los detectores de UV. Ellos detectan todas
las zonas de elución que tienen un índice de refracción diferente a la de la fase
móvil pura. La señal es más intensa conforme la diferencia de los índices de
refracción del eluyente y la muestra sea mayor. En casos críticos, el límite de
detección se puede mejorar por una adecuada selección del disolvente.
108
Refractómetro de deflexión
Detector electroquímico
109
El potencial entre el electrodo de trabajo y el de referencia se puede seleccionar. La
corriente que resulta de la reacción electroquímica se transporta a través de un electrodo
auxiliar que no influye en el potencial del electrodo de referencia. El electrodo de trabajo
se compone de carbón vítreo, pasta de carbono u oro amalgamado. Con frecuencia, se
utiliza como electrodo de referencia un electrodo de plata/cloruro de plata o un calomelano.
El bloque de acero representa al electrodo auxiliar. Se extrae la corriente generada por la
reacción electroquímica, manteniendo así un potencial constante en la celda.
Esquema de un detector electroquímico
110
(a) Vista superior de una celda de flujo ensamblada
(b) Diagrama de celda expuesta (c) Detalle de la celda de electrodo
dual
Gasket = junta
111
Compuestos detectados con un detector
electroquímico
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Algunos compuestos que no pueden detectarse con un detector electroquímico son: • Éteres • Hidrocarburos alifáticos • Alcoholes • Ácidos carboxílicos
a Detección dependiente de la estructura
Voltamperometría cíclica
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La voltamperometría cíclica se puede utilizar para determinar qué compuestos pueden ser detectados por este método y las mejores posibilidades para su uso. La voltamperometría cíclica consiste en variar
de una manera cíclica el potencial de un
electrodo estacionario (de trabajo) inmerso en
una solución y medir la corriente resultante.
Esta señal de excitación de potencial barre el
potencial del electrodo de trabajo en dirección
de ida y vuelta entre dos valores designados. El
barrido regresa a la misma velocidad y permite
la visualización de un voltamperograma
completo con las formas de las ondas anódicas
(oxidación) y catódicas (reducción), unas sobre
la otra como se muestra en la figura.
Efecto de un potencial aplicado en la respuesta de un
detector usando una detección electroquímica
Condiciones
Columna: Zorbax C18 de 25 x 0.46 cm y 10 m.
Fase móvil: MeOH al 2%-buffer (fosfato 25 mM, pH 2, más trietilamina 5 mM.
114
Detección fluorescente versus detección
electroquímica
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(ácido acético)-indol IAA
EC = Detección electroquímica
FD = Detección fluorescente
Detector de dispersión de luz evaporativo
(ELSD)
El ELSD es un instrumento para la detección
no selectiva de analitos no volátiles. El eluato
es nebulizado en una corriente de gas inerte.
Las gotas de líquido se evaporan,
produciendo partículas sólidas que pasan a
través de un haz de un láser. La luz dispersada
se registra por un fotodiodo.
La respuesta del detector es una función
compleja de la cantidad de analito inyectado y
no de su composición química o de la
presencia de ciertos grupos funcionales.
116
Principios de un detector de dispersión de luz evaporativo y sus
aplicaciones para constituyentes en plantas
Droga antimalaria y anticancerígena
Ajenjo dulce (Artemisia annua)
117
Condiciones
Muestra: Extracto de ajenjo dulce
Columna: Nucleosil 100 C18, 12.5 cm x 4 mm y 5 m
Fase móvil: solución de ácido trifluoroacético (pH 3)/Acetonitrilo (39:61), 1 mL/min
1 = artemisina 2 = ácido artemisínico
Detectores quirales
(Polarímetro)
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Detector de dicroísmo circular (CD)
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Detectores quirales
CD = Dicroísmo circular
ORD = Rotación óptica
UV = Ultravioleta
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S/N = 49.6
S/N = 10.9
S/N = 113.4
Muestra inyectada = 10 g de ibuprofeno
Ibuprofeno
Técnicas de detección hifenadas
121
Identificación de picos por LC-MS, LC-MS-MS, LC-UV y LC-NMR
Cro
mat
og
ram
a
Gentiana ottonis
Condiciones:
Muestra: Extracto de Gentiana ottonis.
Columna: Nova-Pak C18, 15 cm x 3.9 mm
i.d., 4 m.
Fase móvil: 1 mL/min de H2O-ACN con ácido
trifluoroacético, gradiente de 5 a
65% de ACN en 50 min.
Detectores: UV a 254 nm; MS con interfase
termospray e instrumento
cuadrupolar; UV de arreglo de
diodos; NMR, disolvente D2O,
flujo detenido.
Wolfender J. L., Rodríguez S., Hostettmann, (1998). J. Chromatogr. A, 794, 299.
Desarrollo de un método
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• Sensibilidad de detección y selectividad
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Preparative HPLC
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