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• Macronutrientes, micronutrientes y factores de crecimiento.

• Medios de cultivo. Técnica Aseptica.

NUTRICIÓN Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS

DRA. FLOR TERESA GARCÍA HUAMÁN

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Una característica de las células es su capacidad para llevar a cabo reacciones químicas y organizar sus moléculas para formar estructuras específicas. La expresión final de esta organización es el crecimiento(reproducción).

Antes que una célula se divida, deben ocurrir muchas reacciones químicas en la célula; estas reacciones se denominan metabolismo.

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• Las reacciones metabólicas o bien liberan energía o consumen energía.

Reacciones Catabólicas: Liberan energía.

Reacciones anabólicas: Consumen energía

• En la célula ocurren varios tipos de reacciones anabólicas y catabólicas.

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Las células están compuestas fundamentalmente de macromoléculas y agua, y que las macromoléculas se componen de unidades más pequeñas denominados monómeros.

La nutrición microbiana consiste en suministrar a las células los ingredientes químicos que necesitan para hacer monómeros.

Estos compuestos químicos son los nutrientes.

NUTRICIÓN MICROBIANA

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Diferentes organismos necesitan diferentes tipos de nutrientes y a menudo los requerimientos son específicos.

Además, no todos los nutrientes se requieren en las mismas cantidades; algunos llamados, MACRONUTRIENTES, se necesitan en grandes cantidades; mientras que otros llamados MICRONUTRIENTES se requieren en menores cantidades, y a veces sólo en cantidades trazas

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MACRONUTRIENTES

CARBONO Y NITROGENO:Muchos procariontes necesitan algún tipo de compuesto orgánico como fuente de carbono. Las bacterias pueden asimilar varios compuestos orgánicos carbonatados y usarlos para hacer nuevo material celular. Los aminoácidos, los ácidos grasos, los ácidos orgánicos, los azúcares, las bases nitrogenadas, los compuestos aromáticos y un sinfín de compuestos orgánicos de otro tipo pueden ser usados por una u otra bacteria.

Algunos procariotas son autótrofos, capaces de construir todas sus estructuras orgánicas a partir del dióxido de carbono (CO2) con la energía obtenida de la luz o compuestos inorgánicos.

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En peso seco, una célula típica contiene un 50% de carbono; el carbono es el principal elemento de todas las clases de macromoléculas.

Después del carbono el siguiente elemento más abundantes en la célula es el nitrógeno. En una bacteria típica alrededor del 12% de su peso seco es nitrógeno, este elemento es importante en las proteínas, en los ácidos nucleicos y en otros constituyentes celulares. En la naturaleza, el nitrógeno se presenta en forma inorgánica y orgánica.

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Sin embargo, la mayor parte del nitrógeno natural disponible está en forma inorgánica, como amoniaco(NH3), nitratos (NO3

-) o N2. La mayoría de las bacterias son capaces de usar amoniaco como única fuente de nitrógeno, y otras muchas pueden usar nitratos. El nitrógeno gaseoso N2 puede ser usado como fuente de nitrógeno por algunas bacterias, las bacterias fijadoras de nitrógeno.

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OTROS MACRONUTRIENTES: P, S, K, Mg, Ca, Na.El fósforo se presenta en la naturaleza en forma de fosfatos orgánicos e inorgánicos, y la célula lo necesita fundamentalmente para la síntesis de ácidos nucleicos y fosfolípidos.

El azufre se requiere por que es un componente estructural de los aminoácidos cisteína y metionina y porque se presenta en ciertas vitaminas, como la tiamina, la biotina y el ácido lipoico, así como en la coenzima A.

El azufre sufre una serie de transformaciones químicas en la naturaleza, muchas de las cuales son llevadas a cabo exclusivamente por microorganismos y es utilizado por ellos en varias formas químicas. La mayoría del azufre celular procede de fuentes inorgánicas, ya sean sulfatos (SO4) o sulfuros (HS-).

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El POTASIO es necesario en todos los organismos. Una gran diversidad de enzimas lo requieren específicamente como por ejemplo algunas implicadas en la síntesis de proteínas.

El MAGNESIO funciona como estabilizador de los ribosomas, las membranas celulares y los ácidos nucleicos, y también se necesita para la actividad de muchas enzimas.

El CALCIO (que no es un nutriente esencial para el crecimiento de muchos microorganismos) ayuda a estabilizar la pared celular bacteriana y tiene una función importante en la termo resistencia de las endosporas. .

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El SODIO es requerido por algunos microorganismos, aunque no todos, y su necesidad suele ser un reflejo del hábitat del microorganismo. Por ejemplo, el agua de mar tiene un elevado contenido de sodio y los microorganismos marinos normalmente lo requieren para su crecimiento; en cambio, otras especies muy relacionadas, pero de agua dulce, crecen bien en ausencia de este elemento.

El HIERRO es fundamental en la respiración celular y es también un elemento clave para los citocromos y para las proteínas que contienen hierro y azufre implicadas en el transporte de electrones.

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En condiciones anaeróbicas, el hierro se encuentra por lo general en el estado de oxidación +2 y es soluble, sin embargo, bajo condiciones aeróbicas suele estar en el estado de oxidación +3 y forma varios minerales insolubles. Para obtener hierro de tales minerales, las células las producen agentes quelantes de hierro llamados sideróforos que solubilizan el hierro y lo transportan dentro de la célula.

Un grupo importante de sideróforos derivan del ácido hidroxámico y quelan el hierro férrico (Fe+3) fuertemente. Una vez que el complejo hierro-hidroxamato pasa a la célula, el hierro se libera y el hidroximato puede salir y ser reutilizado de nuevo en el transporte del hierro.

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Las bacterias como Escherichia coli y Salmonella typhimurium, producen sideróforos fenólicos, estructuralmente complejos llamados enterobactinas. Estos sideróforos derivan del compuesto aromático catecol y tienen una elevada afinidad de unión de hierro. Sin tales agentes quelante de hierro muchas bacterias serían incapaces de iniciar la infección debido a la limitación del hierro.

En las agua marinas, el hierro es prácticamente indetectable (las aguas oceánicas superficiales contienen típicamente sólo unos cuanto picogramos de hierro por mililitro) y se han encontrado bacterias marinas que producen sideróforos estructuralmente complejos capaces de secuestrar el hierro en concentraciones muy bajas.

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Estos sideróforos poseen una región peptídica unida al Fe+3 y una región lipídica que se asocia con la membrana celular.

Compuestos como la aquachelina unen hierro, se agregan en micelas y luego transportan el hierro a la célula.Algunos procariotas pueden crecer en ausencia total de hierro.

Por ejemplo, las bacterias Lactobacillus plantarum y Borrelia burgdorferii, no contienen hierro. El manganeso sustituye en estas bacterias al hierro como componente metálico de las enzimas que normalmente contienen Fe2+

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Mecanismos de captación de fierro

El hierro es un factor importante para el crecimiento de la mayoría de las bacterias. El mejor mecanismo por medio del cual las bacterias captan fierro son los sideróforos, los cuales son compuestos de bajo peso molecular que quelan (atrapan) fierro con alta afinidad. Existen tres tipos principales de sideróforos: catecoles, hidroxamatos y un tercero que es una combinación de ambos.

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Los sideróforos son producidos por la bacteria y excretados al medio en el cual se unen al fierro y el complejo sideróforo-fierro se une a receptores para sideróforo en la superficie bacteriana, una vez que se ha internalizado el complejo sideróforo-fierro, éste es roto para que libere el fierro en el interior de la bacteria.

Algunas bacterias no solo producen sus propios sideróforos sino también producen receptores capaces de unir sideróforos producidos por otras bacterias.

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MICRONUTRIENTES (Elementos traza)

Aunque los micronutrientes se requieren en muy pequeñas cantidades son tan importantes para el funcionamiento celular como los macronutrientes. Los micronutrientes son metales, muchos de los cuales tienen una función estructural en varias enzimas (los catalizadores de las células).

Debido a que la necesidad de estos elementos traza es muy pequeña en cuanto a su concentración, con frecuencia no es necesario añadirlos a los medios de cultivo para cultivar microorganismos en el laboratorio.

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No obstante, si un medio de cultivo contiene compuestos muy puros, disuelto en agua destilada de elevada pureza, puede darse una deficiencia en algún elemento traza. En tales casos, se añade al medio una pequeña cantidad de una solución de metales traza a fin de suministrar los metales necesarios.

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FACTORES DE CRECIMIENTO

Los factores de crecimiento son compuestos orgánicos que, como los micronutrientes, se necesitan en muy pequeñas cantidades y sólo por algunas células. Los factores de crecimiento son vitaminas, aminoácidos, purinas, pirimidinas.

Aunque la mayoría de los microorganismos son capaces de sintetizar estos compuestos, en algunos casos es necesario suministrarlos en el medio de cultivo.

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Las vitaminas son los factores de crecimiento que se necesitan con mayor frecuencia. Muchas vitaminas funcionan formando parte de coenzimas. La mayor parte de los microorganismos son capaces de sintetizar todos los componentes de sus coenzimas, pero algunos no lo son y necesitan que se les suministren ciertas partes de estas coenzimas en forma de vitaminas.

Las bacterias lácticas, tales como los géneros Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc y otros, destacan por sus requerimientos vitamínicos complejos, mucho más amplios que los humanos. Las principales vitaminas requeridas por los microorganismos son tiamina, biotina y piridoxina

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Los medios de cultivo son sustancias nutritivas que se usan en el laboratorio para el cultivo de los microorganismos.

En microbiología, se usan dos tipos generales de medios de cultivo:

MEDIOS DE CULTIVO

Medios de cultivo químicamente definidos.

Medios de cultivo complejos.

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Los medios definidos se preparan añadiendo cantidades precisas de compuestos orgánicos o inorgánicos purificados a un volumen en agua destilada. Por tanto se sabe la composición química exacta de un medio definido.

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Los medios complejos pueden ser entonces adecuados o incluso ventajosos por varias razones. A menudo, los medios complejo se emplean hidrolizados de caseína, carne, soya, levaduras u otras sustancias muy nutritivas (pero sin embargo , no definidas químicamente). Tales hidrolizados se están disponibles comercialmente en forma de polvo y pueden ser pesados con facilidad y disueltos en agua destilada para preparar un medio.

No obstante una limitación importante al usar un medio complejo es que no se puede controlar su composición nutritiva exacta.

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CULTIVO DE MICROORGANISMOS EN EL LABORATORIO

Una vez que ha sido preparado un medio de cultivo, puede ser inoculado (es decir se le añaden microorganismos) y a continuación incubados en condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. En general, se tratará del crecimiento de un cultivo axénico o puro, esto es, de un cultivo que contiene sólo un único tipo de microorganismo.

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Para obtener y mantener un cultivo axénico o puro es esencial evitar la entrada en él de otros microorganismos. Los microorganismos no deseados llamados contaminantes, son muy ubicuos, por lo que se han diseñado técnicas microbiológicas para evitarlos.

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Un método importante para obtener cultivos axénicos o puros y para asegurar la pureza de un cultivo es el uso de medios sólidos en placas petri.

Los medios de cultivo se preparan con frecuencia en forma semisólida o sólida mediante la adición al medio líquido de un agente solidificante. Los medios sólidos inmovilizan a las células, permitiéndoles crecer y formar masas aisladas visibles llamadas colonias.

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Las colonias bacterianas pueden ser de forma y tamaño variable dependiendo del organismo, las condiciones de cultivo, el suministro de nutrientes (como la cantidad de oxígeno presente) y otros parámetros fisiológicos.

Algunas bacterias producen pigmentos que dan color a las colonias.

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Independientemente, de su posible pigmentación, las colonias permiten reconocer la pureza del cultivo; las placas que contengan más de un tipo de colonia no fueron sembradas de un cultivo axénico o puro.

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Los medios sólidos se preparan igual que los líquidos salvo que, antes de esterilizar los medios, se les añade agar como agente gelificante, normalmente 1,5%. El agar se funde durante el proceso de esterilización y el medio fundido se vierte sobre las placas petri y se deja que solidifique antes de usarse.

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Dado que los microorganismos son ubícuos , los medios de cultivo deben ser esterilizados antes de usarse. Para la mayoría de los medios de cultivo esto se realiza por calor, habitualmente mediante calor húmedo en un gran recipiente a presión llamado autoclave.

TÉCNICA ASÉPTICA

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Una vez preparado un medio de cultivo estéril, puede recibir un inóculo de un cultivo puro y cultivarlo nuevamente. Esto requiere el uso de la técnica aséptica.

La técnica aséptica consiste en una serie de procedimientos que evitan la contaminación durante la manipulación de los cultivos y los medios de cultivo estériles.

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El problema más común es la contaminación ambiental a través del aire; ya que éste siempre contiene polvo en suspensión que generalmente lleva una comunidad de microorganismos. Cuando las placas o tubos se abren deben manejarse de tal modo que los contaminantes del aire no penetren.

La transferencia aséptica de un cultivo desde un tubo con medio a otro, se realiza habitualmente con el asa bacteriológica previamente esterilizada a la llama del mechero.

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Los cultivos en los que ha habido crecimiento se pueden transferir luego a la superficie de placas con agar, donde se desarrollarán colonias como resultado del crecimiento y división de las células aisladas que han sido sembrados.

La siembra y resiembra por extensión de una colonia aislada es un método idóneo para obtener cultivos axénicos o puros a partir de mezclas complejas que contienen muchos organismos diferentes.

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Referencia bibliográfica:Madigan, M.; J. Martinko; J. Parker. 2003. Biología de los Microorganismos. 10ma

edición. Editorial Pearson Educación, S.A. España.

Analizar:

• ¿Qué significa la palabra estéril?.• ¿Qué ocurriría si los medios de cultivo no se esterilizaran

después de su preparación?• ¿Por qué es necesaria la técnica aséptica en la obtención de

cultivos axénicos o puros en el laboratorio?

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GRACIAS