Manipulación genética de animales de laboratório - Biotech... · Manipulación genética de...

Manipulación

genética de

animales de

laboratório

Conceptos y Técnicas

en Biotecnología

2011

Flávio S. J. de Souza

El ratón (Mus musculus)

- principal modelo mamífero utilizado en investigación genética:

- pequeño tamaño

- rápida reproducción

- disponibilidad de muchas cepas bien caracterizadas

- existencia de muchos mutantes

- disponibilidad de técnicas de manipulación genética

transgénicos

knockouts

Origen del ratón de laboratório

Ancestral

Mus musculus species

domesticus

subspecies

castaneus

subspecies

molossinus

subspecies

musculus

subspecies

1 million

years

European

‘fancy’ mouse

East Asian

‘fancy’ mouse

2000

years

Laboratory

mouse

100

years

hCG/LH

meiosis I

ovulation

fertilisation

meiosis II - formation of pronuclei

first division

early 8-cell stage

compacted 8-cell stage

compaction

tigth junctions

external cell

morula (32-cell stage)

internal cell

inner cell mass

blastocyst

trophoblast cell

blastocoel

cavitation

Blastocyst formation:

morula compaction

hatching

blastocyst

Transgenesis

zygotes (10-25 zygotes)

microinjection

microinjected zygotes

Knock-out

genetically- modified ES cells

blastocysts

chimaeric blastocysts

Blastocyst

Fertilised oocyte morula

inner cell mass

trophoectoderm extraembryonic tissues

extraembryonic & embryonic tissues

inner cell mass trophoectoderm

primitive ectoderm

primitive endoderm endoderm

intestine, lungs, liver...

germ cells

ectoderm

skin, nervous system...

mesoderm

somites

muscles, vertebrae, dermis

kidneys, heart, genital ridges...

extraembryonic mesoderm

allantois, amnion

visceral yolk sac

syncyotrophoblast

parietal yolk sac

chorion

Stem cell hierarchy:

(puede originar

todo el organismo)

(ICM: puede originar

las 3 capas germinales)

(originan

celulas

de un linaje

limitado)

Embryonic stem cells:

-Pluripotent cell lines derived from embryos:

-ES cells: derived directly from inner cell mass (ICM) cells of blastocyst

-Embryonic carcinoma (EC) cells : derived from teratocarcinomas after ICM cell transplant

ES cells

Blastocyst

EC cells

Teratocarcinoma

6.5-7.5 dpc

8.5 dpc primordial germ cells

PGC culture

EG cells

-Embryonic germ (EG) cells : derived from cultured primordial germ cells (PGC)

cannot originate germ cells

homologous recombination

chimaeric mouse

-Derived from the inner cell mass of blastocyst. -Capable of unlimited divisions without differentiating (long-term self-renewal). -Maintain a stable, diploid, normal karyotype. -Can give rise to differentiated cell types that are derived from all three primary germ layers of the embryo (endoderm, mesoderm, and ectoderm), including the germ line. -Expresses the transcription factor Oct-4, which maintains ES cells in a proliferative, non-differentiating state. -Can be induced to continue proliferating or to differentiate. -Spend most of their time in the S phase of the cell cycle, during which they synthesise DNA. -Do not show X inactivation.

Properties of pluripotent ES cells:

Manipulaciones genéticas

Ratones transgénicos

Ratones knockouts

-incorporación de un gen foráneo (transgen) en el ratón

- deleción de un gen endógeno del ratón

Manipulaciones genéticas

Ratones knockouts


-incorporación de un gen foráneo (transgén) en el ratón

-recombinación no homóloga

-integración al azar en el genoma

-múltiples cópias del transgén integradas

-microinyección del transgén en el pronúcleo de cigotas de ratón

deteccíon de expresión: hibridación in situ

: inmunohistoquímica (tag)

: fluorescencia (GFP)

: beta-gal staining (lacZ)


Gen de interés

transgén:

-promotor y

-enhancer

-cDNA

-gen con intrones/exones

-reportero (GFP, lacZ)

pA

-intron

-3' UTR

transgén

cigota

pipeta "holding" pronúcleo

pipeta inyectora


pipeta holding

pipeta inyectora

Microinyección

Microinyección

flujo laminar

incubadora 37C/CO2

aparato de microinyección

transgén

hembras 4 w/o

superovuladas

microinyección pronuclear

(100-200 cigotas)

transferencia a hembra

pseudopreñada

(30 embriones/hembra)

nacimiento de posibles

transgénicos (20 días)

genotipificación de los ratones

destetados (20 días)

PCR, Southern blot

-myf5-lacZ transgenic

13.5 dpc embryo

Patapoutian et al. 1993


-regiones regulatórias del gen de la proopiomelanocortina:


de Souza et al., 2005

ACTH immuno

(endogenous POMC)

POMC-EGFP fluorescence


EGFP transgene neuronal enhancers

POMC

-deleción de un gen endógeno en el ratón

-recombinación homóloga

-integración sítio-específica en el genoma

-manipulación en cultivo de células ES de ratón (129X1/SvJ )

-necesita un marcador de selección

Ratones knockout

Ratones knockout: pasos

• Identificación y clonado del gén de interés

• Disrupción del gen de interés en un vector adecuado

• Introducción del gen mutado en células ES en cultivo

• Introducción de las células ES modificadas en

blastocistos

• Transferencia del blastocisto a una madre receptora

• Identificación de crias con la modificación

• Retrocruza (backcross) por 10 generaciones

• Analisar fenotipo

Ratones knockout

5’ 3’

gen salvaje (129X1/SvJ ES cell)

1 2 3 4

vector

5’ 3’ Neomycin

Resistance

Cassette

1 2 4

recombinación

homóloga

Ratones knockout Recombinación homologa en ES cells en cultivo

129X1/SvJ Stem Cell 129X1/SvJ Stem Cell

C57BL/6J Blastocyst

Inyección de ES cells modificadas (cepa 129) en blastocistos salvajes (cepa C57)

Generación de ratones

knockout con ES cells

modificadas

non-chimaeric

strong chimaera

weak chimaera

-129X1/SvJ = marrón

-C57BL/6 = negra chimaera = "atigrada"

WT KO kidney

BMP7 knockout

Dickkopf-1 knockout

Knockout de enhancers de proopiomelanocortina

(POMC)

Neomycin

Resistance

Cassette

nPE1 nPE2

(delecionado)

1 2 3

POMC

wild-type

POMC neuronal enhancer

knockout

Sistema Cre-LoxP

- sistema para la creación de knockouts controlados por la expresión

la recombinasa viral Cre

loxP (34 bp): ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT

- la recombinasa Cre reconoce sitios loxP en secuencias de DNA

y excisa las secuencias flanqueadas por los sitios

Cre Recombinase

= ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT

LoxP 34 bp directional sequence

LoxP

Neo Cassette

LoxP exon X exon Y

LoxP exon X exon Y

Sistema Cre-LoxP

Cre Recombinase

= ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT

LoxP 34 bp directional sequence

LoxP exon X exon Y

LoxP LoxP exon X exon Y exon W

knockout condicional Sistema Cre-LoxP

- lineas de ratones con cre bajo un promotor especifico permiten

knock-outs espaciales y temporales

Sistema Cre-LoxP

marcador de

selección

(neo cassette)

- sistema Cre-loxP inducible: actividad de recombinasa Cre regulada

por un ligando

- Cre-ER: fusión de Cre con dominio de unión a estrógeno (mutado)

- activación de Cre por inyección de tamoxifeno (análogo de estrógeno)

inactivo activo

agonista ligand-binding

domain

Sistema Cre-LoxP

HSP

tamoxifeno: libera Cre-ER de HSP90

: Cre-ER entra al nucleo

: recombinación

Proyectos genoma

terminados

-Mus musculus (ratón)

-Homo sapiens (humano)

-Rattus norvegicus (rata)

-Bos taurus (vaca)

-Canis familiaris (perro)

-Oryctolagus cuniculus (conejo)

-Equus caballus (caballo)

-Gallus gallus (gallina)

en progreso

-Sus scrofa (chancho)

-Ovis aries (oveja)

- otros...

www.ensembl.org

Mouse resources

Genome sequence

-Ensembl (www.ensembl.org)

-UCSC genome browser (genome.ucsc.edu)

Strain phenotypes

-Mouse phenome (www.jax.org/phenome)

Mutant distributors

-Jackson Induced Mutant Resource (www.jax.org/imr/index.html)

-Mutant Mouse Regional Resource Centers (www.mmrrc.org)

Knockout lines

-Knockout Mouse Project (www.komp.org)

Manipulación genética molecular de animales de granja

Transgénicos: microinyección pronuclear

(cerdos, conejos, ovejas, cabras, vacas)

Knockouts: imposible...

Clonación

Dolly Polly

primero mamífero clonado a partir de una célula adulta por transferencia nuclear

Dolly the sheep

primero mamífero clonado a partir de una célula fetal en cultivo

Manipulación genética molecular de mamíferos

- producción de proteinas recombinantes (p. ej:

hormonas de mamifero en leche, etc)

Aplicaciones potenciales

- mejoramiento de la calidad nutricional de carne o

leche (p. ej: leche con más proteinas, carne de cerdo

con omega-3 etc)

- generación de mejores modelos de enfermedades

humanas (p. ej: cerdos con fibrosis quistica, monos

con enfermedad de Huntington)

Gene-targeted sheep Nature. 2000 Jun 29

- gene targeting en fibroblastos fetales de oveja

COLT2 transgene:

beta-lactoglobulin promoter (BLG)

human a2-anti-trypsin (AAT)

AAT humana en

leche de oveja

Nature. 2000 Jun 29

Nature. 2000 Jun 29

transfeccion de fibroblastos fetales bovinos

fusion celular con ovocitos

beta-casein

kappa-casein

transgenes:

vacas transgenicas clonadas

8-20% mas beta-caseina

100% mas kappa-caseina

en la leche de algunas vacas

transgenicas

- transfeccion de fibroblastos de fetos bovinos:

lisostafina (hidrolasa de peptidoglicanos) con promotor de beta-lactoglobulina ovina

- vacas transgénicas resistentes a la mastitis (Staphylococcus aureus)

fibroblastos fetales de vacas: deleción de los alelos de PRNP (prion) por

recombinación homóloga seguido de clonación

vacas PRNP -/-

-1,3-galactosyl de celulas de chancho causan

rechazo en primates en xenotransplantes

- manipulación de fibroblastos fetales (knockout de -1,3-Gal) seguida de clonación

APRT: resistencia a G418

Bip: internal ribosomal entry site

locus

endogeno

vector

- modelo de fibrosis quística:

knockout del gen CFTR en cerdos

- deleción del exon 10 por un cassette

de neo

- manipulación de fibroblastos fetales

seguido de clonación

- cerdos tienen los mismos síntomas

de humanos con fibrosis quística

sintomas en humanos:

- obstrucción del intestino

- insuficiencia pancreatica

- deformidades en el higado

- inflamación crónica del pulmón

modelos de ratón:

- fenotipo suave

cerdo modelo:

- obstrucción del intestino

- insuficiencia pancreatica

- deformidades en el higado

Transgénesis con vectores virales

- transgenes de interés insertados en vectores derivados de lentivirus

- alternativa a la inyección pronuclear

vantajas: alta eficiencia de transgénesis

: alta supervivencia de embriones manipulados

desvantajas: baja capacidad para inserto (c. 10 kb)

: bioseguridad con lentivirus

lentivirus: retrovirus (RNA) capaz de insertarse en el genoma

: capaz de infectar tanto celulas en división (p. ej. cigota)

como celulas que no se dividen (p. ej. ovocito)


LTR: long terminal

repeats


inyección pronuclear x vectores lentivirales


vectores lentivirales: especies e eficiencia


- primates transgénicos:

hair nails

placenta


human huntingtin

with Q CAG-repeats

GFP

- Huntington's: enfermedad genética degenerativa dominante no tratable;

causada por repeats de CAG (glutamina) en la huntingtina

- 130 oocitos tratados con retrovirus

- 5 nacimientos de transgénicos (100%)


- monos transgénicos con sintomas semejantes a Huntington's:

distonia, corea, dificultad de deglutición


anti-HTT polyQ

immunostaining nuclear inclusions

neuropils (array-like)


Callithrix jacchus


Callithrix jacchus

-gestation time: 144 days

-sexual maturity: 12-18 months

-offspring per female lifespan: 40-80

Macaca sp. (Rhesus)

-gestation time: 135-195 days

-sexual maturity: 3 years

-offspring per female lifespan: 10


lentiral injection into: oocytes followed by intracytoplasmic sperm injection

: zygotes from natural mating

EGFP transgenic


born transgenic pup (F1)

transgenic blastocysts

transgenic skin

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