Las Recomendaciones de la OIE para la Validación aportan información detallada y ejemplos que

respaldan la norma de validación de la OIE publicada como Capítulo 1.1.5 del Manual Terrestre, o

como Capítulo 1.1.2 del Manual Acuático. El Término “Norma de Validación de la OIE” de esta

Directriz hace referencia a estos capítulos.

La detección e identificación de un agente es una prueba confirmativa de infección o enfermedad

por un agente patógeno determinado. Existen muchos métodos analíticos directos e indirectos

distintos. Las pruebas clásicas de detección directa1 del antígeno son la microscopía electrónica, la

microscopía óptica (como la observación de signos histopatológicos exclusivos o patognomónicos,

la identificación de parásitos in situ, etc.), el aislamiento del virus, el cultivo bacteriano y las

técnicas de digestión de parásitos.

Muchas técnicas directas requieren

procedimientos secundarios que

contribuyan a la caracterización e

identificación de estos agentes

(como la inhibición de la

hemaglutinación o las pruebas de

neutralización vírica, las tinciones

especiales de bacterias u hongos,

etc.). Las pruebas de detección

indirecta del agente patógeno y, en

concreto, de antígeno (Ag) son el

enzimoinmunoanálisis (ELISA), las

pruebas de inmunofluorescencia o

inmuno-peroxidasa, las técnicas de inmunotransferencia, los chips de ADN, la separación celular

activada por fluorescencia (FACS) y los biosensores. A menudo, se utilizan métodos directos e

indirectos en tándem, por ejemplo, puede utilizarse una técnica directa para aislar, enriquecer y/o

extraer el microorganismo seguida de técnicas indirectas para caracterizar e identificar el agente

patógeno.

Los ejemplos que se dan a continuación varían en gran medida en cuanto a requisitos de

laboratorio. De entre las pruebas que se realizan a pie de explotación (como los dispositivos de

flujo lateral) también las hay de detección de antígeno. Son fáciles de utilizar y se desarrollaron

para analizar animales en condiciones de campo, pero pueden tener aplicación en el laboratorio. El

coste, la infraestructura de laboratorio, la biocontención/protección, la sofisticación técnica, las

habilidades de interpretación, el tiempo de espera de los resultados, la capacidad de procesar gran

cantidad de muestras por unidad de tiempo, las características de rendimiento diagnóstico, la

1 En el contexto de la detección directa e indirecta de un analito, el término “directa” hace referencia al microorganismo o a

sus antígenos, como en el caso de la detección directa mediante microscopía. El término “indirecta” hace referencia a la respuesta del hospedador contra el microorganismo, (por ejemplo, detección indirecta inferida por la detección de anticuerpos contra el microorganismo). En el contexto de los métodos de diagnóstico que se utilizan para detectar infección, la microscopía es un medio de observación directa del microorganismo, mientras que emplear un reactivo que infiera la presencia del agente (como un enzima conjugado con un anticuerpo purificado que sea específico del agente) es un método indirecto.

Consideraciones prácticas a la hora de escoger el formato de una prueba

¿Es fundamental que la prueba tenga una capacidad alta de procesado de muestras por unidad de tiempo? ¿Se automatizará la prueba?

¿Se utilizará como prueba de rebaño o para analizar animales específicos?

¿Cuál es el tiempo de espera de los resultados? ¿Es adecuado?

¿Qué nivel de sofisticación se precisa para ejecutar la prueba?

¿Qué habilidades se precisan para interpretar los resultados?

¿Será la prueba factible para ser utilizada en mi laboratorio?

¿Será fácil de transferir a otros laboratorios?

repetibilidad y la reproducibilidad son parámetros importantes a tener en cuenta para que la prueba

elegida sea adecuada. También varían en cuanto a la idoneidad para cada aplicación diagnóstica.

Contrariamente a lo que ocurre con las pruebas serológicas o de detección de anticuerpos, las

pruebas de detección de Ag dependen en gran medida del tiempo que haya transcurrido desde

que empezaron los signos clínicos y de la patogenia de la enfermedad y la concentración de

agente patógeno en ciertos tejidos y/o líquidos. El éxito del diagnóstico dependerá del momento en

que se tomen las muestras y del tipo de muestras que se obtengan (tejidos/lesiones afectados,

raspados, hisopos, sangre y otros líquidos corporales), así como de las condiciones de

almacenamiento y de la integridad de la muestra durante el transporte. Para ciertas aplicaciones,

puede ser adecuado analizar animales y/o muestras específicos (por ejemplo, para pruebas

confirmativas), mientras que para otros propósitos (por ejemplo, el cribado), puede resultar

eficiente y efectivo combinar las muestras de varios animales. La elección de la muestra adecuada

exige un buen conocimiento de la enfermedad y del efecto de la matriz de la muestra en el agente

patógeno (por ejemplo, hisopos cloacales o traqueales en el caso de la influenza aviar).

Las pruebas de detección de ácido nucleico (NAD) están sustituyendo cada vez más a los

sistemas clásicos de detección de antígeno. Para el desarrollo y optimización de las NAD, por favor

consúltese el Capítulo 3.6.3. Aunque estas pruebas de NAD pueden parecer las de elección para

muchas aplicaciones, no siempre son las más prácticas o eficientes. En la mayoría de los casos,

sigue siendo necesario y prudente, al menos para el primer caso, cultivar el agente en medios

selectivos o en líneas celulares o huevos susceptibles para facilitar una mayor caracterización y la

identificación. Aunque la genotipificación es un aspecto importante, sobre todo en la epidemiología

molecular, también son importantes otros medios de caracterización del agente, como la

serotipificación, la patotipificación o la biotipificación. Los agentes patógenos cultivados y

conservados tienen un enorme valor histórico y también son una fuente importante de materiales

de referencia.

Debido a su aplicación en todo el mundo, en esta Directriz sobre Validación de la OIE el ELISA de

Ag se utiliza como ejemplo de aplicación de las mejores prácticas en las pruebas de detección de

antígenos. La mayoría de procesos básicos que se emplean para validar otros tipos de pruebas de

detección de antígeno se podrán deducir por extrapolación de los que se utilizan para validar los

ELISA. Dadas las muchas similitudes conceptuales entre las pruebas de detección de antígeno y

las de detección de anticuerpos, en esta Directriz sobre Validación de la OIE a menudo se remite al

lector a el Capítulo3.6.1 sobre detección de anticuerpos.

El propósito previsto para la prueba es un factor clave que servirá para orientar las decisiones relativas a la elección y desarrollo inicial de la prueba candidata. Dadas las categorías de “idoneidad para el propósito” que define la OIE y que se muestran en la Tabla 1, los sistemas de detección de Ag pueden ser adecuados para ciertas aplicaciones. En los programas de erradicación o vigilancia de las enfermedades, en general es necesario analizar gran cantidad de muestras, haciendo énfasis en la sensibilidad diagnóstica y en la capacidad de procesado de muestras por unidad de tiempo. Por el contrario, la confirmación de casos clínicos no comporta el análisis de grandes cantidades de muestras, pero la especificidad diagnóstica y los tiempos de espera de los resultados son muy importantes. Al principio, deben tenerse muy en cuenta las preguntas indicadas en el cuadro de texto.

Características de la prueba

Factores que influyen en la idoneidad de una prueba para el propósito previsto

1* 2* 3* 4* 5* 6*

a b

Sensibilidad diagnóstica (DSe) +++ +++ +++ +++

Especificidad diagnóstica (DSp) + + + +++

Características de la prueba

Factores que influyen en la idoneidad de una prueba para el propósito previsto

1* 2* 3* 4* 5* 6*

a b

Valor predictivo positivo (PPV) + + + +++

Valor predictivo negativo (NPV) +++ +++ +++ +++

Capacidad de procesado de muestras por unidad de tiempo +++ ++ + –

Tiempo necesario para obtener los resultados + + + +++

Capacidad de GC (garantía de calidad) +++ +++ +++ +++

Reproducibilidad +++ +++ +++ +++

Repetibilidad +++ +++ +++ +++

Otras características, como la sofisticación técnica de la prueba y la habilidad necesaria para la interpretación dependerán de la enfermedad o infección que se esté estudiando.

NB Las pruebas de NAD también pueden utilizarse para la detección de agentes patógenos, y se abordan en la Directriz sobre Validación 3.6.3 de la OIE.

Símbolos: +++ = esencial; + = menos importante; – = no importante

* Propósitos básicos para los cuales una prueba puede ser considerada idónea: 1. Contribuir a demostrar la ausencia de infección en una población dada. 2. Certificar la ausencia de infección o la presencia del agente en animales individuales o sus productos antes de la

comercialización o desplazamiento 3. Contribuir a la erradicación de la enfermedad o a eliminar la infección de poblaciones dadas 4. Diagnóstico confirmativo de casos clínicos (incluye la confirmación de resultados positivos obtenidos en pruebas de

cribado) 5. Determinar la prevalencia de la infección o exposición para facilitar el análisis del riesgo 6. Determinar el estado inmunitario en animales individuales o en poblaciones (post-vacunal)

Para los grupos de ausencia de enfermedad, que se indican en los propósitos (Tabla 1), las pruebas de cribado basadas en la detección de anticuerpos y de alta sensibilidad diagnóstica (DSe) son las de elección siempre que una respuesta inmunitaria detectable sea un indicador significativo de infección. No obstante, puede haber ciertas situaciones de enfermedad en que la respuesta inmunitaria humoral puede ser ambigua y en que puede ser más adecuada la detección del agente patógeno (por ejemplo, infecciones por micobacterias o tripanosomas). En estos casos, las pruebas de detección de Ag pueden ser más efectivas. Las pruebas de cribado de antígeno deben ofrecer una DSe alta. Las pruebas de DSe alta dan lugar a porcentajes bajos de falsos negativos (FN) y cuando se aplican a poblaciones con prevalencia baja, el NPV se encuentra en su máximo nivel. Dado que la DSe y la especificidad diagnóstica (DSp) suelen ser inversamente proporcionales, una disminución en la DSp dará lugar a un aumento del porcentaje de falsos positivos (FP). Por lo tanto, todos los resultados positivos de las pruebas de cribado deben someterse a algún tipo de prueba confirmativa para comprobar si son correctos. Las pruebas confirmativas suelen tener una DSp alta y, por lo tanto, una tasa de FP baja. Estas pruebas suelen ser más sofisticadas y exigen una mejora de las habilidades de interpretación.

En la lista de las Pruebas Prescritas para el Comercio Internacional del Manual Terrestre hay varias enfermedades en que la identificación del agente patógeno está considerado el método de elección. Aunque en muchos casos esto implica el cultivo del microorganismo o la detección del ácido nucleico, puede haber situaciones en que una prueba de detección de antígeno sea adecuada para este propósito. Para evitar el riesgo de propagación de la enfermedad debido al comercio, debe optarse por una prueba que ofrezca una DSe alta.

Si el propósito de la prueba es erradicar la enfermedad o eliminar la infección de poblaciones dadas, las pruebas de elección serán las de cribado de antígeno, como las pruebas de cribado de

anticuerpos, de DSe moderada a alta. No obstante, el razonamiento es ligeramente distinto porque la prueba probablemente se realizará a nivel de rebaño o de compartimiento. Al principio de la campaña, cuando la prevalencia de la enfermedad es alta, es idóneo trabajar con DSe y DSp moderadas porque en este momento tanto el porcentaje de FP como el de FN son menos relevantes y puede tolerarse un nivel moderado de error analítico. En función del tipo de enfermedad y de la rapidez con que se propague, puede resultar crucial que la capacidad de procesado de muestras por unidad de tiempo sea alta y que los tiempos de espera de los resultados sean cortos. Normalmente, en este momento se toman decisiones sin realizar pruebas confirmativas.

En las últimas fases de la campaña, está justificada una DSe más alta porque el porcentaje de FN se convierte en el factor más crítico. De forma muy similar a lo que ocurre con el Propósito 1, los animales que dan resultados positivos tendrán que someterse a algún tipo de prueba confirmativa para comprobar si estos resultados son correctos. En estas últimas fases, los sistemas de detección de antígeno y/o ácido nucleico son fundamentales para la detección de casos subclínicos, animales que excretan el agente patógeno y, posiblemente, portadores latentes.

Aunque las pruebas de anticuerpos de DSp alta a menudo son las de elección para el diagnóstico confirmativo de casos clínicos, es posible que las pruebas de anticuerpos no siempre sean las de elección, sobre todo si aparecen signos clínicos antes de que se genere una respuesta inmunitaria. Un claro ejemplo sería el de las infecciones por virus de la influenza aviar altamente patógeno, en que puede producirse mortalidad antes de que exista una respuesta inmunitaria detectable. Las pruebas de detección de antígeno y/o de ácido nucleico suelen ser una mejor opción para la confirmación de casos clínicos siempre que ofrezcan tiempos de espera de resultados cortos. En estos casos, el objetivo es maximizar la DSp y, por lo tanto, minimizar los posibles FP. En algunos casos clínicos, como por ejemplo enfermedades vesiculares de los animales terrestres, es posible que se requieran varias pruebas para descartar rápidamente ciertos agentes patógenos que dan lugar a signos clínicos similares. En este tipo de pruebas, la rapidez en la obtención de los resultados es extremadamente importante para identificar posibles brotes.

Para realizar estimaciones de la prevalencia de la infección y/o excreción con el fin de facilitar el análisis del riesgo, por ejemplo para estudios sanitarios, para determinar el estado sanitario de un rebaño o para realizar un seguimiento de las medidas de control de la enfermedad, las pruebas de detección de antígeno de DSe y DSp moderadas son las de elección. En general, esto compensaría tanto los porcentajes de FN como de FP y daría lugar a una estimación más exacta de la verdadera prevalencia de infección en la población estudiada. No obstante, si se han establecido estimaciones exactas tanto de la DSe como de la DSp, pueden emplearse enfoques estadísticos para minimizar el sesgo atribuible a los porcentajes de FN y de FP (véase la Directriz sobre Validación de la OIE 3.6.5 Enfoques estadísticos de la validación).

No es aplicable a las pruebas de detección de antígeno.

Las muestras a analizar mediante pruebas de detección de antígeno deben manipularse como se describe en el Capítulo 1.1.1 Recogida, presentación y almacenamiento de muestras para el diagnóstico del Manual Terrestre o en la introducción general a la Parte 2 del Manual Acuático.

Las matrices de las muestras para las pruebas de detección de antígeno pueden ser muy variadas (sangre, heces, leche, piel, semen, saliva, ampollas, vesículas o hisopos de tejidos afectados, como la orofaringe (Probang), la tráquea, los genitales, la cloaca, el esófago, etc.). La muestra ideal es la que se pueda obtener fácilmente y que contenga una alta concentración del analito. En muchos casos, la sangre o los hisopos son las muestras de elección, pero en función del agente patógeno, se precisarán otros tejidos o líquidos, como piel, órganos como el encéfalo (rabia, encefalopatías espongiformes transmisibles [EET]), órganos linfáticos, como el bazo y los ganglios linfáticos (peste porcina clásica), riñón, hígado, corazón, partes del tracto

respiratorio (influenza aviar), tracto digestivo (parvovirus), leche, heces, semen, saliva, material tumoral (leucosis bovina enzoótica), etc.

Como se ha indicado en el capítulo 1.1.1, las consideraciones habituales son también aplicables para limitar la contaminación bacteriana y fúngica de las muestras. El uso de conservantes y fijadores no suele recomendarse y las muestras deben enviarse cuanto antes y refrigeradas a un laboratorio de diagnóstico. Durante el transporte y el almacenamiento, es importante conocer los requisitos físicos y químicos del agente patógeno (por ejemplo, el virus de la fiebre aftosa [FA] es muy lábil a pH bajo y requiere cantidades iguales de glicerol que de tampón fosfato para mantener un pH superior 7).

Si las muestras van a analizarse combinadas, debe demostrarse que la prueba es adecuada para el propósito en cuestión (por ejemplo, que la sensibilidad analítica es lo bastante alta como para detectar un animal infectado en una combinación de 5, 10, 50 o más muestras de animales no infectados).

Véanse las Directrices sobre Validación de la OIE 3.6.1 Desarrollo y optimización de las pruebas de detección de anticuerpos y 3.6.7 Elección y uso de tipos y grupos de muestras de referencia.

Estas muestras, que contienen concentraciones de antígeno que se sitúan en el intervalo de funcionamiento previsto para la prueba, deben utilizarse como controles a lo largo de todo el desarrollo y estandarización de la prueba.

Pueden obtenerse a partir de muestras de campo o producirse en el laboratorio a modo de muestras a las que se ha añadido el analito correspondiente (véase la Directriz sobre Validación 3.6.6 de la OIE Elección y uso de tipos y grupos de muestras de referencia). Las

muestras negativas deben obtenerse a partir de animales que se sepa que no están infectados, y cuando las muestras se produzcan en el laboratorio debe utilizarse la misma matriz.

En general, los antígenos que se vayan a utilizar para producir reactivos inmunológicos deben ser lo más naturales posibles en cuanto a conformación, para asegurarse de que la presentación de epítopos imita la orientación que tienen en el microorganismo vivo. Por lo tanto, los métodos de aislamiento y/o purificación que se utilicen deben conservar al máximo la integridad antigénica.

En el caso de agentes patógenos muy grandes, como los poxvirus, las bacterias y los parásitos protozoarios, los chips de ADN podrían ser útiles para identificar y seleccionar antígenos que desencadenen respuestas inmunitarias fuertes.

Los anticuerpos monoclonales aportan especificidades analíticas únicas y son muy útiles para la detección de epítopos específicos de agente a nivel de grupo, cepa o sub-cepa. Así pues, tienen que tenerse muy en cuenta, porque pueden aplicarse a pie de explotación y por la especificidad deseada de la prueba. Los anticuerpos policlonales, por naturaleza, tienden a aportar una mayor variedad de especificidades. Los anticuerpos policlonales purificados o semi-purificados a menudo son el reactivo de elección para atrapar antígenos complejos porque suelen tener afinidades más altas que sus equivalentes monoclonales.

Antes de proceder al diseño de una prueba, es necesario tener muy en cuenta distintas variables relativas a los requisitos de rendimiento diagnóstico.

Aspectos que influyen en la elección de la prueba ¿Va a utilizarse la prueba para cribado, para

confirmación, o para ambos fines?

¿Será una prueba de laboratorio o de campo?

¿Se utilizará para una o más especies? ¿Cuáles?

¿Se utilizará para tipificar los microorganismos a nivel de grupo, de serotipo o de cepa?

¿Se aplicará la prueba a nivel nacional o internacional?

La elección de la prueba dependerá de la aplicación prevista, que normalmente se basa en un consenso entre las personas encargadas de desarrollar la prueba, los estadísticos y otras partes interesadas, como los epidemiólogos y los organismos reguladores. Si el objetivo es desarrollar una prueba de cribado (por ejemplo, durante un periodo de vigilancia post-brote), se hará hincapié en que la prueba tenga una DSe alta, una capacidad alta de procesado de muestras por unidad de tiempo, un coste bajo, simplicidad técnica, facilidad de interpretación, etc. Si el objetivo es desarrollar una prueba confirmativa (por ejemplo, para confirmar casos clínicos o para corroborar los resultados positivos obtenidos en otra prueba), se hará hincapié en otras prioridades, como una DSp alta, tiempos de espera de resultados cortos, sofisticación técnica y habilidades de interpretación. Cada vez existen más pruebas de diagnóstico inmediato o que se realizan a pie de explotación que tienen sus propios requisitos de robustez dadas las variables condiciones del entorno en el que se utilizarán y el nivel de habilidad que se exige al operario que llevará a cabo la prueba y la interpretará.

El ELISA de detección de antígeno es conceptualmente el mismo método que el ELISA de detección de anticuerpos (Directriz sobre Validación 3.6.1 de la OIE), excepto por el hecho de que el antígeno es el analito que se pretende detectar, y los anticuerpos son los reactivos primarios que se usan para capturar y detectar antígenos. En función de si el antígeno se adsorbe directamente en la microplaca o es capturado por anticuerpos en una fase sólida, junto con posteriores pasos de detección, existen distintos formatos.

No siempre es vidente qué formato analítico se ajustará mejor al propósito previsto. La disponibilidad de reactivos y el límite de detección de la prueba para una aplicación determinada pueden ser factores importantes a tener en cuenta al realizar la elección. Dado que muchos de los sistemas actuales van destinados a detectar antígenos muy específicos, la elección del anticuerpo destinado a atrapar y/o detectar resulta crucial.

La preparación de la muestra problema también es un factor esencial que dependerá del formato analítico que se utilice. El uso de anticuerpos de atrapamiento o captura en pruebas de tipo sándwich mejora la selectividad y reduce los posibles efectos de la matriz. En el caso de pruebas que exigen una aplicación directa del analito a la fase sólida, pueden ser necesarios métodos preparativos de extracción, centrifugación o filtración para eliminar material extraño. Crowther (2001) ofrece una explicación más detallada de estos distintos formatos analíticos.

Es de importancia crucial el tamaño y la complejidad del antígeno y la disponibilidad de reactivos relevantes, como anticuerpos de captura (por ejemplo, los antígenos que se pretendan detectar en pruebas de tipo sándwich deben tener al menos dos epítopos sin trabas), lo cual reduce la aplicabilidad de este tipo de prueba a antígenos relativamente grandes o bien a agentes patógenos enteros. Las afinidades de los reactivos inmunológicos empiezan a influir cuando la estabilidad de los complejos anticuerpo-antígeno resultantes en la microplaca o en las perlas afecta a las características de rendimiento diagnóstico de la prueba.

Los problemas a nivel práctico son la disponibilidad y uso de patrones de antígeno para la garantía y el control de calidad, la repetibilidad, la reproducibilidad, la capacidad de procesado de muestras por unidad de tiempo, el tiempo de espera de los resultados, el coste, la sofisticación técnica y habilidades necesarias para la interpretación.

Trabajar con agentes exóticos y/o zoonóticos requiere prestar especial atención a la normativa relativa a la bioprotección y seguridad humana (véase también el Capítulo 1.1.3 Bioprotección y seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiología y en las instalaciones de los animales).

Para las pruebas de detección de antígeno se utilizan los mismos tipos de estudios que para las de detección de anticuerpos (véase la Directriz sobre Validación 3.6.1 de la OIE).

Es importante evaluar y realizar un seguimiento de la sensibilidad y la especificidad de la prueba durante el desarrollo y la validación. Ello se logra escogiendo varias muestras (4–5 son suficientes) entre negativas y con altos niveles de antígeno del analito en cuestión. Estas

muestras se utilizan en estudios diseñados para optimizar la prueba. Para lograr una continuidad de los datos, es necesario planificar con antelación la preparación y almacenamiento de las muestras. Se adquiere un gran volumen (por ejemplo, 10 ml) de cada muestra control y se divide en alícuotas de 10 ml para almacenarlas a –80°C o menos. Se descongela una alícuota de cada muestra, se utiliza en los estudios y, teóricamente, se desecha. Si la alícuota no puede desecharse, puede almacenarse a 4°C entre un estudio y otro hasta un máximo de 2 semanas; no obstante, en tales circunstancias existe la posibilidad de que la muestra se deteriore. A continuación, se descongela otra alícuota para seguir con el estudio. Mediante este método, se trabaja con muestras de la misma procedencia y con el mismo número de ciclos de congelación-descongelación en todos los estudios (la congelación y descongelación reiteradas de las muestras puede desnaturalizar el antígeno y/o facilitar el crecimiento de otros microorganismos indeseados y debe evitarse). Además, se reduce la variación cuando el investigador utiliza muestras de la misma procedencia para todos los estudios en lugar de cambiar de muestra entre ellos. Este enfoque tiene la ventaja añadida de generar un conjunto de datos correspondientes a las muestras que se analizan repetidamente. Tras terminar las fases iniciales de la validación de la prueba, una o más de las muestras pueden convertirse en reactive/s de referencia que serán la base para la expresión de los datos, y para las evaluaciones de la repetibilidad tanto de una misma ejecución como entre distintas ejecuciones de la prueba (Jacobson, 1998). También pueden servir como patrones de trabajo internos siempre que se haya determinado bien su actividad; estos patrones aportan la garantía de que la prueba está dando datos exactos (Wright, 1998).

Los procedimientos de normalización que se utilizan en las pruebas de detección de anticuerpos son también aplicables a las pruebas de detección de antígeno (véase la Directriz sobre Validación 3.6.1 de la OIE para más información).

El objetivo de esta etapa es terminar de definir los parámetros analíticos relativos a los reactivos, los consumibles y el equipo, obteniendo así un protocolo fijo que se podrá utilizar durante la fase de validación de la prueba, descrita en la Parte B. Véase la Directriz sobre Validación 3.6.1 de la OIE para más información.

Debido a la mayor variedad y complejidad de las muestras, las pruebas de detección de antígeno pueden resultar más influidas por factores de la matriz que las pruebas de detección de anticuerpos, con las que los anticuerpos suelen detectarse casi siempre en muestras de suero. Es frecuente hallar sustancias inhibitorias en matrices complejas como el pus, el semen o los hisopos traqueales/nasales/cloacales, y pueden influir en el resultado de la prueba. Los sistemas de detección de antígeno mediante ELISA son bastante resistentes a los factores inhibitorios; por favor, consúltese la Norma de Validación de la OIE, Sección A.2.4, y Greiner et al. (1997) para conocer las descripciones del tipo de inhibidores que podrían afectar a la prueba. Estas referencias deben revisarse minuciosamente para asegurarse de que todos los factores inhibitorios están justificados y controlados.

En la Directriz sobre Validación 3.6.1 de la OIE se ofrece información relevante sobre este procedimiento.

Optimización y estandarización

¿Es la prueba capaz de distinguir entre muestras con y sin el analito (cuál es el límite de detección = sensibilidad analítica)?

¿Reacciona la prueba de forma cruza con antígenos que no se pretende detectar y que están en la muestra o en la matriz de la muestra (especificidad analítica)?

¿Cuál es la actividad de ruido de fondo en una muestra negativa?

¿Se ha evaluado la repetibilidad en un intervalo de muestras control a lo largo de varios días?

¿Hay suficientes muestras positivas y negativas a mano para llevar a cabo los estudios de optimización y validación?

En tal caso, ¿Se suministran y almacenan las muestras de referencia y control adecuadamente para evitar la introducción de sesgo relacionado con la muestra (deterioro de la muestra)?

¿Han sido todos los reactivos críticos analizados respecto a los demás en titulaciones en tablero de ajedrez?

¿Se ha hallado una concentración/dilución óptima para cada reactivo?

¿Se han incluido reactivos de referencia y patrones/controles de trabajo y se han normalizado los datos de OD para lograr los mejores resultados comparativos posibles?

Directriz sobre Validación 3.6.1 de la OIE.

La especificidad analítica (ASp) se define como el punto hasta el cual la prueba distingue entre el analito que se pretende detectar y otros componentes que podrían detectarse en la misma matriz de muestra (véase la Directriz sobre Validación 3.6.1 de la OIE, Sección 2.1). Cuando más alta es la ASp, menor es el número de falsos positivos. La ASp debe determinarse analizando muestras bien caracterizadas de agentes patógenos similares o relacionados, que produzcan lesiones similares al agente patógeno que se pretende detectar o que se encuentren a menudo en muestras que lo contengan. Por ejemplo, para evaluar la ASp de un ELISA de detección de antígeno de la fiebre aftosa para un serotipo específico (por ejemplo, el serotipo O), es necesario evaluar la reactividad de todas las sub-cepas de este serotipo (por ejemplo, O Campos, O Manisa, etc.) con el fin de determinar la inclusividad. Al mismo tiempo, es necesario comprobar que la prueba no reacciona de forma cruzada con otros serotipos como A, Asia 1, C, SAT 1, 2 y 3. Por último, también es necesario comprobar si la prueba reacciona de forma cruzada con agentes de enfermedades que pueden producir signos similares, como por ejemplo la estomatitis vesicular, la enfermedad vesicular porcina y el exantema vesicular porcino. Otro ejemplo es un ELISA diseñado para detectar el virus de la influenza aviar: como prueba de cribado, debe detectar las nucleoproteínas o los antígenos de la matriz correspondientes a todos los subtipos, por ejemplo, H1-H6 y N1-N9. No obstante, no debe presentar reacción cruzada con virus que causen signos clínicos similares, como el de la enfermedad de Newcastle o el de la bursitis infecciosa (especificidad diagnóstica) ni con otros componentes inespecíficos presentes en la matriz o en la fase sólida. Algunos ELISA puede dar falsos positivos atribuibles a factores inespecíficos, como la unión inespecífica de conjugados de anticuerpos a la superficie plástica, que pueden requerir el uso de agentes bloqueantes. Debe procederse con cuidado para eliminar estos tipos de error.

La sensibilidad analítica (ASe) es sinónimo del límite inferior de detección (LOD) de la concentración de antígeno en una muestra. Los LOD suelen determinarse mediante dilución a punto final en la cual se analizan mediante la prueba réplicas (preferiblemente 10) de cada dilución de una serie de diluciones a log2.Cuanto mayor es el número de réplicas, más precisa es la determinación de la

dilución a la cual el antígeno deja de ser detectable. En la Norma de Validación de la OIE y en la Directriz sobre Validación 3.6.5 de la OIE se ofrece más información sobre los LOD y la ASe.

Las pruebas de cribado o aquellas que están diseñadas para detectar infecciones subclínicas o portadores deben tener una ASe muy alta. En estos casos, puede ser difícil obtener muestras adecuadas y determinar la ASe comparativa analizando un grupo de muestras con la prueba candidata y otra prueba independiente. Si se dispone de ellas, unas muestras seriadas de animales infectados experimentalmente podrían aportar información temporal sobre la capacidad de la prueba de detectar antígeno a lo largo del curso de la infección.

Directriz sobre Validación 3.6.1 de la OIE.

Véase también la Directriz sobre Validación 3.6.1 de la OIE.

Características de rendimiento analítico

¿Se ha establecido la repetibilidad en un intervalo de muestras positivas y negativas para una misma ejecución y entre distintas ejecuciones?

¿Se han establecido los límites superior e inferior del control de la prueba?

¿Se ha definido la ASe y la ASp para esta prueba?

Según criterios cuantitativos y cualitativos objetivos ¿Es la prueba candidata mejor que un método analítico de referencia?

En todas las pruebas de detección de antígeno, incluido el ELISA, debe prestarse especial atención al momento en que se obtiene la muestra, porque la probabilidad de detectar el antígeno o el agente patógeno en sí está directamente vinculada al estadio de la infección. La ventana diagnóstica probablemente será mucho más pequeña en las pruebas de detección de antígeno/agente patógeno que en las pruebas de detección de anticuerpos, porque las respuestas inmunitarias normalmente se pueden medir a lo largo de grandes periodos de tiempo. La dinámica de la infección, es decir, el hecho de que sea aguda, persistente, subaguda, crónica o en estado de portador es un factor importante a tener en cuenta para las recomendaciones relativas al muestreo. Por ejemplo, durante una infección vírica aguda, la muestra debe tomarse cuanto antes tras el inicio de los signos clínicos. En las infecciones persistentes, subagudas y crónicas, así como en los animales portadores, existe una relación equilibrada entre el agente patógeno y el hospedador, y el agente puede estar presente en concentraciones extremadamente bajas que pueden ser muy difíciles de detectar. A lo largo de la patogenia, pueden resultar afectados otros sistemas orgánicos, y es posible que a medida que la enfermedad avanza sea más apropiado muestrear otros tejidos o líquidos.

En función del perfil de las muestras de referencia positivas y negativas, la misma prueba puede tener distintas estimaciones de la DSe y la DSp. Teóricamente, el perfil de las muestras y animales de referencia debe coincidir al máximo con el de las muestras que se espera obtener de la población de destino para la cual se ha desarrollado la prueba. Es importante tener una definición clara de caso: es un conjunto de criterios que se utiliza para decidir cuándo un animal o grupo de animales está infectado o no. El perfil de las muestras de referencia estará relacionado con el propósito de la prueba. Por ejemplo, si el propósito de la prueba es un cribado para detectar la infección temprana por fiebre aftosa (por ejemplo, en ganado vacuno de pastoreo que presenta vesículas), entonces más de la mitad de las muestras destinadas a determinar la DSe y la DSp deben obtenerse de esta población de destino. Debe obtenerse y resumirse información relevante relativa todos los animales involucrados en esta fase de validación (por ejemplo, la especie, la edad, el sexo y la raza), e información sobre otros factores que se sepa que influyen en la DSe y la DSp (por ejemplo, la fecha y lugar de muestreo, el estado inmunitario, el historial de vacunaciones y enfermedades, las pruebas patognomónicas y sustitutivas utilizadas para definir el estado de los animales respecto a la enfermedad, la prevalencia en la población y una descripción del modo en que se ha establecido el perfil de las muestras de referencia).

Una muestra de un animal negativo de referencia indica una ausencia de exposición al agente patógeno en cuestión, o bien una ausencia de infección por el mismo. Por ejemplo, una población negativa a la peste porcina clásica podría definirse como una región con piaras sin casos clínicos confirmados de la enfermedad en los últimos años, según resultados negativos obtenidos en pruebas serológicas y virológicas realizadas en los casos sospechosos. Las muestras de estos animales cumplen el perfil de muestra de referencia negativa. La población negativa de referencia debe escogerse con cuidado de garantizar que es representativa y paralela a la población positiva de referencia (por ejemplo, en cuanto a la raza y exposición ambiental al agente patógeno).

Si se lleva a cabo una vacunación, puede interferir con la detección de antígeno (por ejemplo, la vacuna con vacunas antivíricas vivas modificadas). Las muestras de estos animales no pueden calificarse como muestras de referencia negativas.

Los tipos y limitaciones de los patrones de referencia habitualmente utilizados para la evaluación de las características de rendimiento de una prueba nueva se indican aquí. En la Directriz sobre Validación 3.6.1 de la OIE, Sección B.2.2.1 y en Jacobson (1998) se ofrece una exhaustiva descripción de cada patrón de referencia. Las fuerzas y limitaciones de estos patrones de referencia deben tenerse muy en cuenta al utilizar como medio de establecimiento de la DSe y la DSp de una prueba candidata muestras procedentes de animales que se clasifiquen en cualquiera de los cuatro grupos siguientes (Jacobson, 1998).

Características de rendimiento diagnóstico

¿Están validados los criterios que se utilizan para determinar las poblaciones positiva y negativa de referencia?

¿Representan totalmente las muestras de referencia a la población de destino de la prueba?

¿Ha habido dificultades para obtener un número suficiente de muestras? En tal caso, ¿cómo se ha resuelto el problema?

i) Un patrón de referencia inequívoco

Un patrón de referencia inequívoco: presencia del agente en el hospedador o evidencia de signos histopatológicos definitivos (patognomónicos.

ii) Un patrón de referencia compuesto

Un patrón de referencia compuesto: verificación de animales no infectados o no expuestos.

iii) Un patrón de referencia relativo

Un patrón de referencia relativo: animales de referencia que se han clasificado en función de su estado respecto a la infección por comparación con los resultados analíticos de otra prueba de detección de antígeno o de ácido nucleico ejecutada con las mismas muestras. Como ocurre con las pruebas de detección de anticuerpos, las estimaciones resultantes de la DSe y de la DSp serán útiles solo si la prueba de referencia dispone de características de rendimiento documentables, establecidas y aceptables. Una deficiencia de los patrones de referencia relativos es que tienen establecidos sus propios niveles de FP y FN, que son fuentes de error que se agravarán en las estimaciones de la DSe y la DSp de la prueba nueva. No obstante, en general el uso de otros métodos analíticos bien descritos se considera una buena práctica para determinar el estado de los animales de referencia respecto a la infección, pero solo si el sesgo inherente introducido por el patrón de referencia relativo está justificado (Organización Mundial de Sanidad Animal [OIE], 2008).

iv) Un patrón de referencia adjunto: infección experimental o vacunación

(Véase la Norma de Validación de la OIE, Sección B.2.3 para conocer las limitaciones principales de este tipo de patrón). Nota: En el contexto de la detección de antígeno, las pruebas “comparativas” deben incluir la detección del agente patógeno por aislamiento, cultivo, pruebas de NAD y/o histopatología u otras técnicas in situ.

En la Norma de Validación de la OIE, Sección B.2.5, y en la Directriz sobre Validación 3.6 de la OIE se ofrece una explicación de este enfoque a la elección de muestras.

Es importante describir claramente el método y las muestras que se utilizan para escoger un valor umbral. Se recomienda enfáticamente llevar a cabo un análisis de la característica operativa del receptor (ROC) para comprobar el posible rendimiento diagnóstico de la prueba en otros contextos epidemiológicos.

Las evaluaciones de la reproducibilidad en pruebas de detección de antígeno no son particularmente distintas de evaluaciones similares realizadas en cualquier otro tipo de prueba. Por lo tanto, se recomienda al lector que consulte en la Norma de Validación de la OIE, Sección 3, los detalles sobre los análisis de reproducibilidad, y en el Capítulo3.6.6 los tipos y grupos de muestras de referencia. La OIE aporta directrices sobre las pruebas para evaluar la competencia de los laboratorios (http://www.oie.int/en/our-scientific-expertise/reference-laboratories/proficiency-testing/).

Véase la Directriz sobre Validación 3.6.1 de la OIE, Sección B.4.1.

Una vez establecidas las características de rendimiento diagnóstico de la nueva prueba, es necesario un seguimiento, mantenimiento y mejora continuos. Es importante continuar con el seguimiento de la

repetibilidad y de la reproducibilidad de la prueba a lo largo del tiempo; en este sentido, las muestras de control de calidad que se incluyan en cada ejecución deben dar resultados que se encuentren en el intervalo pre-establecido. De no ser así, el resultado de la prueba no será válido y deberá repetirse. El seguimiento del rendimiento diagnóstico de los controles de la prueba a lo largo del tiempo es una forma importante de detectar variaciones o tendencias en la prueba. El análisis simple de los resultados, como una evaluación estadística de los valore medios, de la desviación estándar y del coeficiente de variación son útiles en este proceso, y los resultados pueden representarse en un gráfico control. Participar en programas de comprobación externa del control de calidad y de la eficiencia es útil para identificar errores aleatorios y sistemáticos y aporta credibilidad en los resultados de la prueba. Pueden obtenerse más información sobre este tema en Crowther et al. (2006) y en la Directriz sobre Validación 3.6.1 de la OIE, Sección B.5.1.

A lo largo del tiempo tal vez sea necesario aplicar cambios en el protocolo de la prueba, debido a una mejora de los reactivos o a una reducción de su coste, o bien por un cambio en el analito que se pretende detectar. Las variaciones en los reactivos biológicos entre lotes se consideran un factor importante de variación en la prueba. Cuando deben reponerse reactivos como anticuerpos o antígeno, deben producirse u obtenerse aplicando los protocolos o criterios que se han empleado para los reactivos originales. Debe comprobarse la comparabilidad de los reactivos biológicos nuevos (como muestras control, antígeno, anticuerpos de captura o de detección, conjugado, sustancias

químicas o consumibles). La Directriz sobre Validación 3.6.82 de la OIE Comparabilidad entre pruebas tras pequeños cambios en un método analítico validado ofrece una visión general de estudios de comparabilidad aceptables. Por norma general, nunca se cambia más de un reactivo a la vez, para evitar el problema de tener que evaluar más de una variable al mismo tiempo (véase también la Directriz sobre Validación 3.6.1 de la OIE, Sección B.5.2).

Uno de los retos importantes en el diagnóstico de laboratorio es estar al día de la evolución de los agentes patógenos infecciosos. Con el tiempo, los agentes patógenos pueden cambiar sus características antigénicas y es posible que emerjan nuevas cepas, como por ejemplo, la aparición del serotipo 8 del virus de la lengua azul en el norte de Europa en 2009. Este cambio precisa un estudio completo del desarrollo y validación de la prueba. Otro cambio importante es el uso de una prueba en una especie distinta de aquella para la cual se validó inicialmente; así, por ejemplo, es posible que un ELISA de detección de Ag de la fiebre aftosa, validado para el ganado vacuno, tenga que utilizarse para analizar camélidos o búfalos en zonas geográficas y climáticas distintas. La evaluación de muestras de referencia que representen las poblaciones indicadas en la Figura 1 de la Fase 2 de la Norma de Validación de la OIE deberán cumplir este requisito (véase también la Directriz sobre Validación 3.6.1 de la OIE, Sección B.5.3).

Debido a la gran cantidad de variables que influyen en el rendimiento de las pruebas de detección de antígeno, es útil ampliar el número de sueros de referencia siempre que se pueda, debido al principio de que el error se reduce al aumentar el tamaño muestral (véase también la Directriz sobre Validación 3.6.1, Sección B.5.4).

CROWTHER J.R. (2001). The ELISA guidebook. In: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, USA, 1–421.

CROWTHER J.R., UNGER H. & VILJOEN G.J. (2006). Aspects of kit validation for tests used for the diagnosis and surveillance of livestock diseases: producer and end-user responsibilities. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 25, 913–

935.

GREINER M., BHAT T.S., PATZELT R.J., KAKAIRE D., SCHARES G., DIETZ E., BÖHNING D., ZESSIN K.H. & MEHLITZ D. (1997). Impact of biological factors on the interpretation of bovine trypanosomosis serology. Prev. Vet. Med., 30,

61–73.

2 Nota para el lector: Una vez finalizada la Directriz sobre Validación 3.6.8 de la OIE Comparabilidad entre pruebas tras

pequeños cambios en un método analítico validado se publicará en la página web de la OIE

JACOBSON R.H. (1998). Validation of serological assays for diagnosis of infectious diseases. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17, 469–486.

WORLD ORGANISATION FOR ANIMAL HEALTH (OIE) (2008). OIE Standard for Management and Technical Requirements for Laboratories Conducting Tests for Infectious Diseases. In: OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. OIE, Paris, France, 1–31.

WORLD ORGANISATION FOR ANIMAL HEALTH (OIE) (2013). Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assays for Infectious Diseases In: Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, seventh edition. OIE, Paris, France. http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/1.01.05_VALIDATION.pdf

WRIGHT P.F. (1998). International standards for test methods and reference sera for diagnostic tests for antibody detection. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17, 527–533.

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