MANUAL DE PARASITOLOGIAI. INTRODUCCIONLa Parasitologa es la disciplina que se encarga de estudiar el parasitismo producido por protozoarios, helmintos, y artrpodos. El diagnstico de los parsitos se fundamenta en la observacin y el reconocimiento de sus caractersticas morfolgicas, macroscpicas y microscpicas, obtenidas de muestras biolgicas que faciliten la identificacin del agente infeccioso mediante la utilizacin de exmenes directos.

La parasitsis, no solamente es un problema en Boliva sino es un problema mundial bastante preocupante, ya que son causa de enfermedades agudas y crnicas, y en ocasiones hasta mortales. Es por eso que es fundamental asegurar la calidad de los resultados de laboratorio, siendo indispensable por tanto, estandarizar los procedimientos de las tcnicas que se utilizan en el rea de parasitologa del laboratorio Debido a ello es necesaria la recopilacin de informacin disponible y validada para sistematizarlas y presentarlas en un Manual de Procedimientos que sirva como instrumento para este proceso.

II. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL Elaborar un manual de procedimientos para que funcione como gua de trabajo en el laboratorioOBJETIVOS ESPECFICOS. Conocer los procedimientos bsicos de parasitologa Comprender y analizar los conocimientos en Parasitologa Aplicar los mtodos descritos de parasitologa en el laboratorio

III. CRITERIOS BASICOS Regla de oro en Parasitologa - recobrar, identificar y demostrar el parsito, para poder determinar la etiologa del proceso de infeccin o enfermedad.

MTODOS DIRECTOS: Identificar parsitos o sus productos de reproduccin Baermann (extrae larvas). Flotacin de Sheather (concentra ooquistes de algunos apicomplexa) Raspado de lcera perineal (demuestra trofozotos de Entamoeba histolytica en amebiasis cuts) Raspado de lcera cutnea (evidencia amastigotes de Leishmania) Lavado bronquial (demuestra estadios de Pneumocystis carinii en algunas situaciones de inmunocompromiso)

MTODOS INDIRECTOS: Obtener con pruebas serolgicas y de otro tipo resultados que, unido a la clnica y a otras consideraciones, dan un diagnstico problable Inmunolgicos - hemaglutinacin indirecta para tripanosomiasis americana Inmunohistoqumicos microsporidiosis Rayos X - de abdomen para visualizar cambios en diagnostico de angiostrongilosis abdominal Resonancia magntica - absceso heptico amebiano Pptidos sintticos, otra tecnologa biomolecular-diferenciar Trypanosoma cruzi de T. rangeliIV. DESARROLLO DE LOS METODOS

SANGRE OCULTAEl examen qumico del pigmento hemtico tiene inters en las deposiciones en todos los casos en que se sospecha hemorragia digestiva, puede encontrarse positiva en caso de tumores digestivos sobre todo en: cncer, enteritis. colitis, en casos de cirrosis heptica y en algunas parasitosis como; uncinariasis, teniasis, entre otras.El fundamento de este mtodo se basa en el uso del cido actico que lisa los eritrocitos, del perxido de hidrgeno que acta como sustrato debido a la accin peroxidasa de la hemoglobina, liberando oxigeno. El Piramidn hace evidente la reaccin dando un cambio de color.

OBJETIVO GENERAL:Realizar la deteccin de sangre en heces.A. METODO DE TEVENON ROLLANDREACTIVOS: Acido actico glacial puroReactivo de tevenonAgua oxigenada 10ccMATERIAL:papel filtroAplicador de maderaMuestra de heces (primera defecacion)PROCEDIMIENTO:1. Colocar sobre un pedazo de papel filtro con una varilla de vidrio una pequea cantidad de heces y tratar que esta sea homognea.2. Aadir 3 gotas de acido actico y mezclar.3. Agregar 3 gotas del reactivo Tevenon.4. Mezclar5. Aadir 3 gotas de agua oxigenada6. Esperar 30 segundos a 1 minutoRESULTADOPOSITIVO:La prueba ser positiva cuando la muestra cambie a color violeta.NEGATIVO:La prueba ser negativa cuando la muestra no cambie de color.B. PRUEBA DE PIRAMIDONEste mtodo detecta sangre que se encuentra en bastante cantidad en las heces.REACTIVOS:solucin de piramidonAgua oxigenadaPROCEDIMIENTO:1. Colocar una pequea cantidad de heces en un pedazo de papel filtro2. Aadir 3 gotas de piramidon y mezclar3. Agregar 3 gotas de agua oxigenada4. Mezclar y esperar de 2 a 5 minutosRESULTADOS:POSITIVO: cuando la mezcla cambia a color azul violetaNEGATIVO: cuando la mezcla no cambia de colorC. PRUEBA DEL HEMATESTPara realizar la prueba se debe usar un pedazo de papel filtro, sobre el cual se coloca un comprimido de hematest al mismo que se le aade 2 a 3 gotas de emulsionado de heces.Despus se deja transcurrir 1 a 2 minutosRESULTADOS:POSITVO: cuando el comprimido cambia a color azulNEGATIVO: cuando el comprimido no cambia de color H. PYLORILa Prueba Rpida de deteccin del antgeno de H. pylori (Heces) es un inmunoensayo cromatogrfico para la deteccin cualitativa del antgeno de H. pylori en muestras de heces humanas como ayuda en el diagnstico de infeccin de H. pylori. La Prueba Rpida de deteccin del antgeno de H. pylori (Heces) es un inmunoensayo cromatogrfico para la deteccin cualitativa del antgeno de H. pylori en muestras de heces humanas como ayuda en el diagnstico de infeccin de H. pylori.

MUESTRAS Y PREPARACIN Las muestras (no utilizar muestras acuosas o diarreicas) deben ser recogidas en un recipiente limpio y la prueba debe realizarse lo ms pronto posible despus de la recogida. Las muestras se deben conservar en fro (slo 1 2 das a 2-4 C) hasta el momento de utilizarlas. Para conservar las muestras durante un tiempo prolongado, como mximo 1 ao, deben mantenerse congeladas a 20C. La muestra debe descongelarse totalmente y alcanzar la temperatura ambiente para poder utilizarla en la prueba. Preparacin de la muestra: (1) Con ayuda del palito se toma una muestra de las heces recogidas. Para ello se pasa el palito por la muestra recogiendo una pequea cantidad de heces. Se introduce el palito en el tampn cerrando el tubo. (2) Agitar para facilitar la dispersin de la muestra.INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOSPOSITIVO:* Dos lneas coloreadas aparecen. Una lnea debe estar en la banda de regin de control(C) y otra lnea debe estar en la banda de la regin de la prueba (T).*NOTA: La intensidad del color de la banda de la regin de la prueba (T) puede variar dependiendo de la concentracin de la H. pylori presente en el espcimen. Por lo tanto cualquier tonalidad del color en la regin de la prueba (T) debe ser considerado positivo.NEGATIVO: Una lnea coloreada aparece en la banda de control de la regin (C). Ningn color aparente aparece en la banda de la regin de la prueba (T).NO VLIDO: La lnea de control no aparece. Volumen insuficiente del espcimen o tcnicas procesales incorrectas son las razones ms frecuentes para que el control de la lnea no aparezca.Revise el procedimiento y repita la prueba con un nuevo dispositivo, si el problema persiste, descontine el uso del kit inmediatamente y contacte a su distribuidor local.

MOCO FECALLa mucina, producto de las glndulas muciparas distribuidas en todo el epitelio de la mucosa del tubo digestivo cumple una funcin fisiolgica al protegerla por lubricacin. Con la saliva, el jugo gstrico, la bilis y las secreciones intestinales este prtido llega a formar parte del contenido intestinal. Sin embargo las heces fisiolgicas lo contienen en muy escasa cantidad. En su mayor parte es digerida o sufre las consecuencias de putrefaccin.

La presencia de moco en las heces significa la existencia de un proceso inflamatorio, de la mucosa del intestino y es un signo seguro del mismo. Los leucocitos estn presentes en las heces en enfermedades intestinales inflamatorias, esto puede ser el resultado de una enfermedad Diarreica Aguda bacteriana, parasitaria o viral en nios menores de 2 aos.

PRINCIPIO DEL ANLISIS.La mucosa del colon secreta moco como respuesta al estimulo parasimptico. La presencia de moco en una muestra fecal es anormal y se debe reportar de inmediato. Los leucocitos en materia fecal generalmente se encuentran asociados a moco y se observan en diferentes enfermedades intestinales. La bsqueda de trofozoitos de amebas sus caractersticas de movilidad y morfologa nuclear que tienen, tambin se debe tener en cuanta la presencia de bacterias.

OBJETIVO GENERAL: Realizar la prueba de moco fecalEQUIPO Y MATERIAL NECESARIO: Microscopio. Cubreobjetos. Portaobjetos. Aplicadores.

REACTIVOS NECESARIOS: Solucin salina (suero fisiolgico) Solucin de Lugol

PROCEDIMIENTO:1. Se hara un extendido sobre el porta objeto con una varilla.2. Luego se dejara secar al medio ambiente3. Despus se efectuara la tincin Gram o Giemsa4. Observar al microscopio con aceite de inmersin5. Realizar el recuento de clulasEXPRESIN DEL RESULTADO:EXAMEN MICROSCPICOMOCO:AMEBAS:LEUCOCITOS:

Escasa cantidad. Moderada cantidad. Abundante cantidad.Presencia. Ausencia.

Numero por Campo. Abundantes leucocitos. Campos cubiertos.

Nota: Si se observan mas de 10 leucocitos por campo, en 40 X en al menos cinco campos, se hace una lmina y se colorea con wright para indicar el predominio de las clulas. Para ello se realiza un recuento diferencial donde se anota a los:

Polimorfonucleares (Neutrofilos). Mononucleares (Linfocitos).HEMATES: Numero por Campo. Abundantes Hemates. Campos cubiertos.BACTERIAS: Escasa cantidad. Moderada cantidad. Abundante cantidad.VALORES DE REFERENCIA:Moco: Negativo.Amebas: Negativo.Leucocitos: Negativo.Hemates: Negativo.ANOTACIONES SOBRE INTERFERENCIA TCNICA:Evitar que la muestra se contamine con agua o con orina, porque pueden destruir las estructuras celulares y de los parsitos.Algunas sustancias pueden interferir con el examen de las heces como los laxantes antibiticos y antiparasitarios.Materia fecal contaminada con aceites, aplicadores rctales (supositorios), demora en el transporte (> a 2 horas).METODOLOGA:EXAMEN MACROSCPICO:Observar la presencia de Moco, Sangre.EXAMEN MICROSCPICO:Se realiza un examen directo utilizando solucin salina y solucin de lugol.Con un lpiz de cera en un extremo del portaobjetos anotar la identificacin del paciente.Colquese una gota de solucin salina en el centro de la mitad izquierda del portaobjetos y una gota de solucin yodada en el centra de la mitad derecha.Con un aplicador tomar la parte que tenga flemas o sangre, y mezclar con la gota de solucin salina hasta obtener una emulsin homognea.Del mismo modo tomar otra muestra y mezclar con la solucin yodada. Descartar el aplicador en una solucin de hipoclorito de sodio.Cbrase la gota de solucin salina y solucin yodada con cubreobjetos. Se apoya el cubreobjetos sobre el portaobjetos en posicin inclinada, se toca con el borde de la gota y se hace descender lentamente hasta que quede sobre el portaobjetos.Con ello se reduce la formacin de burbujas de aire.Examinar toda la zona del cubreobjetos con el objetivo de 10X, enfocar el ngulo superior izquierdo y mover el portaobjetos con movimientos regulares en horizontal o vertical.Cuando se vean microorganismos sospechoso pasar al objetivo de 40X para observar la morfologa en detalle. La diferenciacin morfolgica se har siguiendo la clave de identificacin.

AMEBAS EN FRESCOEl mtodo en fresco se basa en la utilizacin de solucin salina fisiolgica para conservar condiciones semejantes a las del cuerpo humano y de esta manera observar los trofozoitos. Mientras que en el mtodo directo se puede utilizar una solucin de lugol, para la observacin quistes.

REACTIVOSNUM. NOMBRE DEL REACTIVO CONC. CANTIDAD1 Solucin salina 0.9% 25 ml.2 Solucin de lugol Parasitolgico 25 ml.MATERIALNUM. NOMBRE DEL MATERIAL CANTIDAD1 Portaobjetos 2 Cubreobjetos3 Guantes 4 Aplicadores de madera PROCEDIMIENTOPara las muestras obtenidas con cucharilla rectal hisopo, se depositan en un tubo con sol. Salina, del cual se toma una muestra con una pipeta Pasteur y se deposita entre portaobjetos y cubreobjeto para su observacin al microscopio (10X, 40X)De las muestras recolectadas en recipiente, con un aplicador, se toma un pequeo fragmento aproximadamente 1 mm de dimetro.En un portaobjeto el cual contiene una gota de sol. Salina al 0.9%, se emulsiona perfectamente. Se coloca un cubreobjeto, para su observacin al microscopio.Examinar toda la preparacin de manera sistemtica, con 10 X y 40X.Se puede realizar una preparacin con sol. Salina (para la observacin detrofozoitos) y otra con lugol (los ncleos de los quistes se tien)

RESULTADOSe emitir la hoja de reporte correspondiente, sealando; fase, gnero y especie del parsito.

COPROPARASITOLOGICO SERIADO

Se sabe que los protozoarios se eliminan en forma intermitente a travs de las heces fecales,por otra parte los huevos de algunos helmintos pueden no ser detectados en todas lasdeposiciones, sea porque no se eliminan en gran numero como es el caso de la Fasciolaheptica, porque la infestacin es ligera, o como en el caso de las tenias porque losproglotides terminales pueden no desprenderse en forma diaria, en consecuencia unresultado negativo de un examen coproparasitolgico simple es decir de una sola muestraexaminada, no descarta la posibilidad de una infestacin parasitaria.Nota: El estudio coproparasitolgico seriado aumenta considerablemente la posibilidad deencontrar parsitos, razn por la que resulta aconsejable en el examen de un mnimo de tresmuestras obtenidas en forma diaria o interdiaria, evacuadas espontneamente. COPROPARASITOLOGICO SIMPLEEste examen es uno de los mas importantes para el diagnostico clnico de las parasitosis intestinales. Esta tcnica permite encontrar las mayora de los parsitos ya que se basa en el diagnostico morfolgico de los distintos estados de los parsitos. Tiene como objetivo pesquisar e identificar distintas formas de protozoos (trofozoitos, quistes, ooquistes).Adems nos permite estudiar los caracteres de movilidad de las formas vegetativas de los protozoarios. Los helmintos aparecen habitualmente en forma de huevos y larvas aunque tambin pueden observarse gusanos adultos enteros o en segmento. Por lo general las tenias adultas o en segmentos pueden observarse a simple vista pero los huevos, las larvas, los trofozoitos y los quistes solo pueden observarse al microscopio.Su sensibilidad depende de la carga infectante, de la biologa de los parsitos, del transporte y experiencia de los oberservadores.Esta tcnica emplea dos soluciones: Solucin fisiolgica, que es la que permite mantener a los trofozoitos de protozoarios en pleno movimiento. La mayor parte de las heces es mediante el movimiento peculiar de cada trofozoito que se consigue identificar a cada especie de protozoario.La segunda solucin es la solucin de Lugol que tie los ncleos, cromatina nuclear, vacuolas, citoplasma y otros elementos de los quistes de protozoarios, facilitando as su identificacin.Se emplea para buscar, principalmente en muestras frescas, la presencia de formas evolutivas mviles de parsitos de tamao microscpico (trofozoitos, quistes de protozoos:Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, balantidium coli, etc...; as como larvas o huevos de helmintos: Strongyloides stercolaris, Ancylostoma duodenale, Necator americanus,Trichostrongylus sp. , Fasciola, etc.).Los huevos y larvas de helmintos pueden ser identificados indistintamente en cualquiera de las dos soluciones.EQUIPO Y MATERIAL NECESARIO: Microscopio. Cubre objetos. Portaobjetos. Aplicadores. Lpiz vidriogrfico.REACTIVOS NECESARIOS: Solucin salina (suero fisiolgico). Solucin de Lugol Solucin de Hipoclorito de Sodio MTODO DE CALIBRACIN Y ESTANDARIZACIN:Mezclar y homogenizar bien la muestra de materia fecal.PROCEDIMIENTOS Y CRITERIOS DE CONTROL QUE DEFINENRESULTADOS INACEPTABLES:Un montaje demasiado grueso o muy delgado pueden llevar a negativos.Debe tenerse cuidado cuando se ajusta la luz al microscopio, demasiada luz es un errorfrecuente, ya que impide el contraste apropiado.EXPRESIN DEL RESULTADO:EXAMEN MACROSCPICO:COLOR: Normal. Negro. Acolicas.CONSISTENCIA:ASPECTO: Liquida. Semilquida. Pastosa.Los resultados indicaran el (los) mtodos (s) empleado (s), el genero o la especie del parasito observado y su estadio evolutivo.Todo formato de respuesta de resultados debe obtener los datos de identificacin: Nombre, edad, sexo, fecha, las caractersticas organolpticas de las heces, datos de la observacin microscpica (presencia de leucocitos, eritrocitos, levaduras); los agentes observados y su estadio o forma evolutiva: quistes, ooquistes, trofozoitos, esporas, huevos o larvas, ya que esta informacin facilitara un mejor diagnostico clnico.En caso de no encontrar ninguna fase parasitaria, lo correcto ser informar: No se observan huevos, larvas, trofozoitos ni quistes de parsitos o No se observan parsitos.No es correcto informar Muestra Negativa o No existen parsitos, como se indico, No en todas las muestras se expulsan los parsitos.METODOLOGA:EXAMEN MACROSCPICO:Observar su consistencia (grado de humedad) anotar: liquida, semilquida, pastosa; segn el caso. Tener en cuenta la presencia de moco o sangre.Anotar color: Normalmente es pardo o claro en adultos: en nios es amarillo claro.Observar la presencia de sangre, moco o algn parasito macroscpico como adultos de nematodos o proglotides de cestodos.EXAMEN MICROSCPICO:Se realiza un examen directo utilizando solucin salina y lugol.Con un lpiz de cera en un extremo del portaobjetos anotar la identificacin del paciente.Colquese una gota de solucin salina en el centro de la mitad izquierda del portaobjetos y una gota de solucin yodada en el centro de la mitad derecha.Con un aplicador homogenizar la muestra, tomar una pequea porcin de la muestra y mezclar con la gotas de solucin salina hasta obtener una emulsin homognea.Del mismo modo tomar una pequea cantidad de muestra y mezclar con la solucin yodada. Descartar el aplicador en una solucin de hipoclorito de sodio.Cbrase la gota de solucin salina y solucin yodada con cubreobjetos. Se apoya el cubreobjetos sobre el portaobjetos en posicin inclinada, se toca con el borde de la gota y se hace descender lentamente hasta que quede sobre el portaobjetos.Con ello se reduce la formacin de burbujas de aire.Examinar toda la zona del cubreobjetos con el objetivo de 10 X, enfocar el ngulo superior izquierdo y mover el portaobjetos con movimientos regulares en horizontal o vertical.Cuando se vean microorganismos sospechosos pasar al objetivo de 40 X para observar la morfologa en detalle. La diferenciacin morfolgica se har siguiendo la claveNota: El examen microscpico directo hace posible la deteccin de huevos y larvas de helmintos as como de las formas vegetativas o trofozoitos y quistes de protozoarios y tambin la observacin de pequeos parsitos adultos.

V. REFERENCIASAsh L y Orihel TC. Parasites: aguide laboratory procedures and identification. ASCP PRESS, AmericanHaro Arteaga I., Salazar Schettino P.,Cabrera Bravo M., Diagnostico morfolgico de las parasitosis. Mndez editores. 1995. Mxico D. F.

Atas A., Parasitologa Mdica, Editorial Mediterrneo, 1999, Santiago deChile.

Biagi F., Enfermedades parasitarias, Editorial la Prensa Medica Mexicana,17 reimpresin, 2000, Mxico D.F.

PARASITOLOGA DEL LABORATORIO CENTRAL DEL HOSPITAL DEL NIO Dr. OVIDIO ALIAGA URA, DURANTE LA GESTIN 2005