Manual de Laboratorio de Técnicas Microbiológicas

INSTITUTO

POLITCNICO

NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA

ACADEMIA DE MICROBIOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS PARA LA ASIGNATURA:

LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS

PRIMERA EDICIN

AUTORAS:

Q.B.P. MIRIAM JUREZ JUREZ

Q.B.P. REFUGIA PREZ SNCHEZ

BIOL. L. PATRICIA RODRGUEZ PASCUAL

EDITORAS:


M. EN C. GLORIA LPEZ JIMNEZ

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA

ACADEMIA DE MICROBIOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS PARA LA ASIGNATURA: LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS PRIMERA EDICIN

AUTORAS:

Q.B.P. MIRIAM JUREZ JUREZ Q.B.P. REFUGIA PREZ SNCHEZBIOL. L. PATRICIA RODRGUEZ PASCUAL

EDITORAS:


Manual para el Laboratorio de tcnicas microbiolgicas. UPIBI-IPNM. EN C. GLORIA LPEZ JIMNEZ

Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P.1

PRCTICA No. 1: MICROSCOPA UNIDAD I: Normatividad en el laboratorio y microscopa1. OBJETIVOS:

1.1 Objetivo general

El alumno aprender a enfocar correctamente una preparacin para ser observada en el microscopio compuesto, as como la forma correcta de utilizarlo

1.2 Objetivos especficos

Utilizar correctamente el microscopio compuesto Realizar la tcnica de iluminacin de Khler Observar preparaciones temporales en el microscopio compuesto

2.- INTRODUCCINEl microscopio es un instrumento ptico que amplifica la imagen de un objeto pequeo. Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminacin se puede hacer visible un objeto microscpico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamao original. Los diversos elementos que existen en la naturaleza, presentan tamaos, formas y composiciones distintas, la mayora de ellas pueden verse, algunas a simple vista, y otras mediante instrumentos.Para poder observar a la clula es necesario recurrir a equipos como el microscopio, de este existen diversas variedades, los cuales estn diseados a lo que pretendemos observar y como ejemplo tenemos a:

Microscopio pticoEs un instrumento (de un lente o varios lentes), que amplifica una imagen y permite la observacin de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio ms simple es una lente de aumento o un par de anteojos. El poder de resolucin del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mnimo a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la informacin. La resolucin depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor de la muestra, la calidad de la fijacin y la intensidad de la coloracin. Tericamente la mxima resolucin que se puede alcanzar es de 0,2 m dada por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no puede aumentar la resolucin. Existen distintos microscopios pticos generales y de investigacin que se diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminacin, la alteracin fsica de la luz que incide en la muestra y procesos analticos que se aplican a la imagen final.El microscopio compuesto esta formado por tres sistemas: 1. Sistema de iluminacin; 2. Sistema ptico y 3. Sistema mecnico.

El sistema de iluminacin corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar eficazmente la preparacin y esta formado principalmente por la lmpara (6V), el diafragma de campo y el condensador (lente frontal, diafragma de iris y lente auxiliar)

El sistema ptico esta formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que permiten agrandar la imagen y esta formado por los objetivos, tubo y el ocular.

El sistema mecnico esta formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el movimiento y cambio de las lentes as como el enfoque de la preparacin y esta formado por la base, estativo, tornillos macromtrico y micromtrico, platina, revlver y portarevlver.

Funcin bsica de cada parte del microscopio:a.- Sistema mecnicoBase. Pieza metlica que sostiene a todo el aparatoEstativo. Lugar de donde se debe tomar para trasladar al microscopioPlatina. Es una plancha cuadrada y gruesa de metal con un orificio central en donde descansa la preparacin, la cual es fijada por dos pequeas pinzas, se puede mover hacia arriba y hacia abajo con los tornillos macromtrico y micromtrico por medio de un sistema de engranes. Posee escalas numricas que permiten ubicar fcilmente la posicin de lo que se observa y, al mismo tiempo, deslizar la preparacin en forma de cruz (ejes X y Y) para su localizacin.

Pinzas. Sirve para sujetar al portaobjetos.

Tornillo macromtrico. Permite el enfoque mayor. Tornillo micromtrico. Permite el enfoque con precisin. Tubo del ocular. Sostiene el lente del ocular.Revolver: Es un dispositivo giratorio en donde se atornillan las lentes de los objetivos de distinto aumento.

Tubo binocular. Cada uno de los tubos contiene en el interior un sistema de prismas y espejos que dividen el haz de luz en dos haces, cada uno de los cuales se enva por separado a cada tubo, estos tubos se deslizan hacia los lados para ajustar la distancia interpupilar ya que cada persona posee una diferente separacin entre sus ojos. Los microscopios binoculares tienen entre los tubos una escala grabada para poder ajustar la distancia y cada persona debe memorizar su valor de apertura interpupilar; uno de los tubos tiene el ocular fijo y el otro tiene un sistema mecnico que sube o baja. Para realizar el enfoque de cada ojo primero se enfoca con el tornillo micromtrico el tubo que tiene el ocular fijo y despus se enfoca el que tiene el ocular mvil, pero en este caso sin mover el tornillo micromtrico, girando el ocular mvil hasta encontrar el foco.

b.- Sistema de iluminacin

Lmpara. Es la encargada de proporcionar los haces de luz y tiene las siguientes caractersticas: 6V, 5-15 W 12 V, 50-100 W

Diafragma de campo. Esta situada en la base del microscopio y su funcin es la de regular el dimetro de la emisin de la luz a fin de que se ilumine solo el rea de campo visual, es decir controla la cantidad de luz que atraviesa la preparacin.

Condensador. Es un sistema de tres lentes convergentes que concentran los rayos luminosos sobre el objeto a observar, el condensador utilizado es capaz de agrupar todos los rayos que provienen del foco y permite aprovechar toda la luz posible que inciden sobre l y los dirige hacia el plano focal del objeto.

c. Sistema ptico

Oculares

El ocular es la parte ptica final externa, situados en el tubo a travs de los cuales se obtiene la imagen final, el ocular tiene aumento propio (los aumentos son denominados con la letra X), en nuestro caso es de 10X. El ocular consta de una lente cercana al ojo, collar, tubo del ocular y una lente cercana al objetivo.

TuboEl tubo es la parte ptica mecnica, situada en la parte superior del microscopio, este puede ser monocular o binocular, adems esta adaptada para poderle colocar una cmara fotogrfica una cmara de televisin. El tubo generalmente esta diseado para trabajar a una distancia mecnica fija entre ellos y este valor puede ser de 160 mm, el factor del tubo del microscopio a utilizar en el laboratorio es de 1,25X, dato que nos sirve para calcular el aumento total.

ObjetivosSon lentes que captan la imagen a observar, estn construidos de cristal o fluorita, poseen aumento propio, apertura numrica y esta diseada para trabajar con diferentes campos. Todos los objetivos tienen anillos de colores y nmeros grabados sobre el tubo metlico, que nos permite saber a detalle cuales son sus ventajas, la disposicin de estos caracteres es la siguiente:1.- El anillo de color superior indica los aumentos (Tabla 1)2.- El lado superior izquierdo indica el nmero de aumentos3.- El lado superior derecho la apertura numrica.4.- El lado inferior la distancia mecnica5.- El lado inferior derecho el espesor del cubreobjetos6.- El anillo de color inferior indica en qu medio se hace la inmersin del objetivo (Tabla 2) En ocasiones el objetivo puede traer en lugar de 0.17, el nmero 1, el cual indica que: Acepta cubreobjetos desde 0,17 a 0,22 mm de espesor,10= No requiere cubreobjetos 0,11 0,27 = Es ajustable a diferentes espesores de los cubreobjetos, desde 0,11 mm hasta 0,27 mm.

Anillo superiorLos anillos de color cerca del anillo moleteado facilitan el reconocimiento del coeficiente de aumento:

AumentosColor anillosuperior1.0XNegro2.5 XPardo4.0 XRojo6.3 XAnaranjado10 XAmarillo16 XVerde claro25 XVerde oscuro40 XAzul claro63 XAzul oscuro100XBlancoTabla 1. Correspondencia entre los aumentos y los anillos de colores grabados

Tabla 2. Colores para el anillo inferior que indican en qu medio se debe hacer la inmersin del objetivo

CarcterSustanciandice de refraccinColor del anillo

OilAceite1,515Negro

WAgua1,333Blanco

GlyzGlicerina1,455Anaranjado

MetilenoYoduro de metileno1,740Amarillo

Aumentos totales:El nmero total de aumentos que se puede lograr en un microscopio se obtiene multiplicando el nmero de aumentos que tiene el ocular por el nmero de aumentos que tiene el tubo y por el nmero de aumentos que tiene el objetivo con el que se esta observando.

Distancia mecnica:Se llama distancia mecnica a la distancia que recorre a luz por el interior del microscopio desde que penetra por el objetivo, pasando por los tubos y espejos, hasta llegar al ocular, la distancia mecnica se mide desde la superficie de la rosca del objetivo hasta la base del ocular, esta distancia en el caso de nuestro microscopio es de 160 mm.

Poder de resolucin:El poder de resolucin de una lente se define como la capacidad que tiene para discernir entre dos puntos muy cercanos entre s y que puedan verse separada.El poder de resolucin del ojo humano es de 0,2 mm, el microscopio ptico de 0,2 y el microscopio electrnicode 6 ngstrom.

Apertura numrica:Es una medida de la amplitud del cono luminoso que se forma por las lentes del microscopio, ya sea del condensador o del objetivo.

Microscopio de contraste de fasePermite observar clulas sin colorear y resulta especialmente til para clulas vivas.Este aprovecha las pequeas diferencias de los ndices de refraccin en las distintas partes de una clula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor ndice de refraccin experimenta una deflexin y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos pticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porcin fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste til sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espcimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar clulas vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.La resolucin de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partculas individuales ms pequeas en las imgenes de campo oscuro, debido al contraste creado. Es til para observar autorradiografas, cristales en la orina y para detectar espiroquetas en particular el Treponema pallidum microorganismo causante de la sfilis. Cada uno de los microscopios tiene una funcin determinada, en este y en este caso este tipo de microscopio utiliza un microscopio auxiliar y un filtro verde, adems en este tipo de microscopio tambin se realiza la tcnica de iluminacin de Khler.

Fig. Diafragma de iris de un microscopio de contraste de fases, microscopio auxiliar y filtro verde

3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO

3.1 MATERIAL POR EQUIPO Microscopio compuesto Preparaciones fijas de bacterias Preparaciones en fresco de mohos Preparaciones en fresco de agua estancada

Frasco con benzal Esponja Papel seda Lmpara de alcohol

3.2 REACTIVOS Aceite de inmersin Atomizador con benzal

3.3 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO Una muestra de agua estancada Comida con mohos Colores

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL4.1 Cuidado y limpieza del microscopioUn proceso de limpieza debe considerar los siguientes aspectos:a.- Para limpiar la parte ptica, se elimina primero las partculas de polvo, ya sea con un bulbo inyector de aire, un pincel o soplando fuertemente sobre la lente.b.- Algunos solventes como la acetona disuelven los revestimientos de barniz, la pintura y an el cemento de lasmolduras y los objetivos compuestos, por lo que no se deben usar. c.- Las guas mecnicas deben mantenerse lubricadas.Se enlistan algunos compuestos recomendados slo para ciertas partes del microscopio. a.- Espuma de jabn suave.- Solo para remover lo sucio de la superficie de instrumentosb.- Agua destilada con algn detergente sin aditivos alcalinos.- para un prelimpiado de la ptica.c.- Solucin para limpiar la ptica.- etanol al 40 %, ter al 20 %, para limpiar superficies de la ptica o remover residuos de aceite de inmersin.

4.2 TCNICA DE ILUMINACIN MTODO KHLERA fin de evitar toda serie de inconvenientes y poder utilizar lmparas de filamento espirilado, Khler propone un mtodo que actualmente es utilizado. Su iluminacin comporta dos diafragmas: un diafragma denominado de campo, situado generalmente a nivel de la lmpara colectora y un diafragma llamado de abertura, situado generalmente debajo del condensador.

Pasos a seguir para la iluminacin de Khler en un microscopio1.- Luz amarilla (bajo voltaje)

2.- Ajustar la distancia interpupilar3.- Ajustar las dioptras4.- Abrir el diafragma de campo e iris

4.3 Observacin de una preparacin temporala.- Tomar un portaobjetos limpio y desengrasado con una torunda que contenga alcohol b.- Colocar una gota pequea del agua estancada con una pipeta Pasteurd.- Cubrir la preparacin con el cubreobjetose.- Observar al microscopio de contraste de fases a 10 y 40 Xf.- Observar la preparacin temporal realizada en el microscopio compuesto y comparar los resultados obtenidos g.- Realizar esquemas de las preparaciones observadas.

4.4 Observaciones de preparaciones fijasa.- Tomar una preparacin fija y enfocarla a 10 y 40 X. b.- Adicionarle aceite de inmersin y observarlo a 100 Xc.- Observar la preparacin que contiene una gran cantidad de muestra y realizar el esquema biolgico d.- Ahora mover la preparacin para enfocar la preparacin con poca cantidad de muestra.e.- Comparar ambas muestra y concluir

5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO5.1.- Imagen a color de la preparacin en fresco de agua estancada con el microscopio ptico a 10X y 40X.5.2.- Imagen a color de la preparacin fija a 40X y 100X, Nombre del microorganismo, Forma y agrupacin5.3 Consulta la bibliografa y llena la siguiente tabla:

Tipo de microscopio Poder de resolucin AplicacionesCompuesto Contraste de fase Electrnico Estereoscpico Fluorescencia InterferenciaPolarizacin

5.4 En la siguiente tabla resume la funcin de cada una de las siguientes partes:Parte del microscopio Funcin Sistema al que pertenece: (mecnico, ptico, iluminacin)Condensador Diafragma de campo Diafragma de iris Filtro azulLmpara Objetivo Ocular Platina RevlverTornillo macromtricoTornillo micromtrico

6.- ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS6.1 Ventajas y desventajas de utilizar la iluminacin de Khler.6.2 Ventajas y desventajas de un microscopio compuesto, con respecto a su uso, Tipo de preparacin y cantidad de muestra utilizada6.3 Tamao de las imgenes observadas en cada aumento

7.- CONCLUSIONESElabora tus conclusiones tomando en consideracin los objetivos de la prctica, los resultados obtenidos y la bibliografa consultada.

8.- REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS8.1 Barrera Escorcia Hctor El Microscopio ptico 1 edicin. 1997. Editores Plaza y Valdez, S.A. de C.V.8.2. Freifelder, D. Tcnicas de Bioqumica y Biologa Molecular. Revert Mexicana, S.A. de C.V. 1991. 139.8.3 Locquin Marcel, Manual de Microscopa I 1 edicin, 1985. Ed. Labor S.A.8.4 Rincn-Snchez A.R.y ReyesOrtiz N. Manual de Microscopa ptica 1 edicin. 1991. Editado por laAsociacin de Qumicos del Instituto Nacional de Nutricin, Secretara de Salud., Mxico..

PRACTICA No. 2PREPARACIONES FIJAS Y EN FRESCO

UNIDAD I: Normatividad en el laboratorio y microscopa.TEMA: 1.3 Preparacin de un frotis microbiano.1.3.1 Preparaciones fijas1.3.2 Preparaciones en fresco

1. OBJETIVOS1.1 Objetivo generalEl alumno realizar preparaciones en fresco y fijas para ser observadas en el microscopio ptico por medio de tinciones.I.2 Objetivo especficos1.2.1 Realizar preparaciones en fresco y fijas de bacterias y mohos1.2.2 Realizar tinciones simples, diferenciales y especficas.1.2.3. Realizar esquemas coloridos de las observaciones a 40X y 100X

2. INTRODUCCINLa gran mayora de los microorganismos son invisibles para el ojo humano, por lo que el uso del microscopio resulta indispensable para observar a estos seres vivos. Para lograr una buena observacin microscpica es necesario tomar en cuenta la preparacin de la muestra, debido a que los objetos deben tener un cierto grado de contraste con el medio circundante para poder ser percibidos a travs del microscopio, adems de que los microorganismos carecen de una coloracin natural, hay que teirlos previamente para hacerlos resaltar de manera artificial del fondo de la imagen. Una forma de conseguir este contraste consiste en realizar tinciones simples con un colorante o tincin diferencial.Tincin simple: En las tinciones simples se utiliza un solo colorante, que siempre es de tipo bsico, se utiliza solamente para incrementar el contraste de la clula que absorber el colorante y quedar teido del mismo color.Tincin diferencial: Se utilizan una combinacin de colorantes para dar diversos complejos coloridos y como ejemplo tenemos la tincin de Gram y la tincin de Ziehl-Neelsen.Tinciones especficas: Incrementan el contraste en las clulas microbianas y revelan estructuras particulares,entre las que se incluyen las endosporas, los flagelos y la cpsula. Estas tcnicas se basan en la estructura que se desea poner de manifiesto tiene un grado de afinidad por los colores utilizados mayor que el resto de la clula.Las bacterias no teidas muestran pocos detalles morfolgicos, el diagnstico bacteriolgico generalmente se basa en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias para identificarlos ms adecuadamente, Sin embargo, tambin resultan tiles las preparaciones no teidas en la determinacin de la movilidad.Las preparaciones fijas y teidas son de uso casi universal, tanto a partir de especimenes recibidos como de colonias cultivadas. En general una muestra del espcimen original puede ser colocada directamente sobre el portaobjetos o bien ser recogida con una asa, recordando siempre tener una preparacin delgada y homognea. Una colonia puede ser examinada haciendo con ella una suspensin tenue en una gota de solucin salina, y luego extendindola con una asa sobre un portaobjetos. Las pelculas secadas al aire son fijadas con calor suave sobre la flama de un mechero y luego pasadas a travs de ella. Debe tenerse cuidado para evitar el calor excesivo, que puede alterar la forma bacteriana. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea apenas caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.

LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS. UPIBI-IPNAunque cuando tenemos la necesidad de observar preparaciones en fresco podemos utilizar el microscopio de contraste de fases, en donde la caracterstica ms importante de este tipo de microscopio es que nos permite ver a los microorganismos sin la necesidad de teirlos.

10Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P.

3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO3.1 EQUIPO Microscopio ptico3.2 MATERIAL Portaobjetos Cubreobjetos Pipeta pasteur Gradilla 1 tubo de ensaye de 13 X 100 mm Asa bacteriolgica Frasco gotero con solucin de cristal violeta Frasco gotero con solucin de lugol Frasco gotero con solucin de alcohol acetona Frasco gotero con solucin de safranina Frasco gotero con solucin de fucsina fenicada Frasco gotero con solucin de alcohol cido Frasco gotero con solucin de azul de metileno Frasco gotero con solucin de verde de malaquita Solucin salina o agua de la llave Mechero Asa y porta asa Puente de coloracin Gradilla metlica Lmpara de alcohol

3.3 CEPAS MICROBIANAS Staphylococus aureus Escherichia coli Sacharomyces cerevisiae Mohos que se encuentren disponibles

3.4 REACTIVOS Atomizador con benzal

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL4.1 Preparacin de Frotis: Mtodo A4.1.1 Limpiar el portaobjetos con una torunda de algodn y que contenga alcohol.a.- Etiquetar la preparacin, solo sobre la superficie superior del portaobjetos, la etiqueta ser preferentemente pegada a la izquierda de la preparacin, si con una etiqueta no basta colocar otra del lado derecho, la etiqueta llevar el nombre del microorganismos, el nombre de la tincin, el equipo, el grupo y la fecha.

b) En la gradilla se tiene un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 2 ml de agua, de ah tomar con el asa una pequea gota de agua y colocarla en el centro de la superficie de un portaobjetos.c) En el mechero, flamear el asa al rojo vivo y en un radio de 20 cm de la flama del mechero, abrir el tubo deensaye y flamearlo, tomar la muestra con el asa, volver a flamear la boca del tubo y taparlo. Dejar el tubo sobre la gradilla y con la mano izquierda tomar el portaobjetos y con la mano derecha en la que tenemos el asa extender el inoculo aproximadamente un cm2 para obtener una pelcula delgada de microorganismos. Flamear el asa para esterilizarla.

d) Dejar secar el frotis a temperatura ambiente.d) Fijar el frotis con calor, es decir pasarlo rpidamente por la flama del mechero, luego colocarlo en el dorso de la mano, si soportamos el calor pasarlo nuevamente.. El calor deseable es aquel que soportamos en el dorso de la mano. Realizar esta operacin una vez ms Dejar enfriar el portaobjetos antes de teir.

Nota: Procurar no tomar una gran cantidad del inculo de lo contrario quedar un frotis grueso, la luz no pasar y no observaremos; en caso de haber ocurrido esto entonces, observa en la periferia del frotis

Mtodo Ba) Si se proporciona un tubo con una suspensin bacteriana, entonces encender el mechero.b) En un radio de 20 cm abrir el tubo, flamearlo y con el asa tomar un inculo de la suspensin. c) Flamear la boca del tubo de ensaye, cerrar el tubo y colocarlo en la gradillad) Colocar el inculo en el centro de un portaobjetos limpio. Extender el inculo por lo menos 1 cm2, y flamear elasa. Dejar secar el frotis y fijarlo al calor.

4.2 Examen en fresco de una muestra agua estancada4.2.1 De la muestra de agua estancada que se ha trado al laboratorio, colocar una gota en un portaobjetos limpio4.2.2 Con la ayuda de una pipeta Pasteur colocar en el centro una gota de la muestra y cubrirla con un cubreobjetos.4.2.3 Al colocarle el cubreobjetos dejarlo caer con un movimiento rpido para evitar que se formen burbujas.4.2.4 Observar al microscopio ptico o de contraste de fases con el objetivo de 10 X y 40 X.

4.3 Preparacin en fresco de un moho4.3.1 Colocar una gota del colorante azul de algodn lactofenol4.3.2 Colocar el inoculo y hacer una pequea extensin4.3.3 Colocarle el cubreobjetos sin realizar burbujas4.3.4. Observar la preparacin al microscopio con el objetivo 10X y 40X. Si se requiere que la preparacin dure un poco ms se sellar los bordes del cubreobjetos con barniz de uas transparentes.

4.4 Tincin simplea) Tomar la preparacin fija de Staphylococcus aureus y colocarla el colorante que previamente les ha tocado b) Tomar el tiempo por 1 minutoc) Enjuagar el portaobjetos en el recipiente que contiene el aguad) Dejar secar la preparacin y observarla al microscopio con el objetivo de 40 y 100 X.

4.5 Tinciones diferenciales4.5.1 Tincin de Gram completa:a) Colocar los frotis correspondiente de cada uno de los microorganismos Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus en el puente de coloracin.b) Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.c) Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante. d) Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.e) Lavar los frotis con agua de la llave.f) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 15 segundos. g) Lavar inmediatamente con agua de la llave.h) Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos i) Lavar los frotis con agua de la llave.j) Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersin y observarlos al microscopio con el objetivo de100X. (Previamente realizar la tcnica de iluminacin de Khler y enfocar a 10 y 40X)

4.6 Tincin de Gram decolorada:a) Colocar un frotis fijado de Bacillus subtilis y de Escherichia coli en el puente de coloracin. b) Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.c) Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante. d) Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.e) Lavar los frotis con agua de la llave.f) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 90 segundos. g) Lavar inmediatamente con agua de la llave.

h) Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos i) Lavar los frotis con agua de la llave.j) Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersin y observarlos al microscopio con el objetivo de100 X.

4.7 Tincin de Gram completa aplicada a una suspensin de microorganismos: a) Colocar un frotis fijado de una mezcla de Escherichia coli y Staphylococcus aureus. b) Cubrir el frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.c) Lavar el frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante. d) Cubrir el frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.e) Lavar el frotis con agua de la llave.f) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 30 segundos. g) Lavar inmediatamente con agua de la llave.h) Cubrir el frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos i) Lavar el frotis con agua de la llave.j) Dejar secar el frotis, colocar una gota de aceite de inmersin y observarlos al microscopio con el objetivo de100 X.

4.8 Tincin de Ziehl-Neelsen.a) Colocar el frotis correspondiente en el puente de coloracinb) Cubrir los frotis con fucsina-fenicada y calentar con una lmpara de alcohol, hasta que emita vapores, aplicar calor peridicamente durante cinco minutos sin que se seque la preparacin y esperar a que se enfre.c) Enjuagar con agua de la llave.d) Cubrir los frotis con alcohol cido por un minuto. e) Enjuagar con agua de la llave.f) Cubrir los frotis con azul de metileno por un minutog) Enjuagar y dejar secar los frotis y observarlos con el microscopio utilizando lente de inmersin

4.9 Tincin especfica4.9.1 Tincin de ShaefferFultona) Cubrir el frotis correspondiente con verde de malaquita y calentar con una lmpara de alcohol, hasta que emita vapores, aplicar calor peridicamente durante cinco minutos, sin que se seque la preparacin.b) Dejar que el frotis se enfre. c) Lavar con agua de la llave.d) Cubrir el frotis con safranina por un minuto.e) Enjuagar, dejar secar y observar con el microscopio utilizando lente de inmersin.

5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO5.1 Realiza el esquema de la preparacin en fresco del moho observado.5.2 Realiza un esquema de lo observado en el microscopio en la siguiente tabla

AumentoAgua estancadaTincinSimpleTincin diferencial: Gram completaTincin de Gram: decoloracinTincin deZiehl-NeelsenTincin especfica Shaeffer y Fulton

40X

100X

5.3 Cuales son los inconvenientes al realizar un frotis con una gran carga microbiana?5.4 Cual es la finalidad de observar una muestra en fresco?5.5 Por qu se coloca un cubreobjetos sobre la muestra?5.6 Cul es el propsito de fijar los frotis?5.7 Cmo afecta la edad del cultivo en la tcnica de Gram?5.8 Por qu la tincin de Gram no se emplea para teir mohos?5.9 Cuando es recomendable utilizar una tincin simple y que colorante utilizaras?5.10 Cul es la finalidad de utilizar el barniz de uas en las preparaciones en fresco?

6. ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS6.1 Discutir las ventajas y desventajas de las preparaciones en fresco, preparaciones fijas y tipos de tinciones adecuadas para cada una de ellas.

7. CONCLUSIONES7.1 Elaborar las conclusiones con base al anlisis y discusin de las ventajas y desventajas en la realizacin de preparaciones en fresco y fijas, el fundamento de las tinciones diferenciales, comparando con la bibliografa consultada y los objetivos de la prctica.

8 BIBLIOGRAFA8.1 Lymch, M.J.; S.S. Raphael: L. D. Mellor; D.D. Spare, M. J., Inwood. Mtodos de Laboratorio. 2 Edicin. Interamericana. Mxico. 1140 pags.

PRACTICA No. 3ESTERILIZACIN

UNIDAD II: EsterilizacinTEMA: Agentes fsicos. Calor hmedo, calor secoFiltracin a travs de membranaPrueba de esterilidad (Mtodo de la tira de papel impregnada con esporas)1. OBJETIVOS1.1 Objetivo generalEl alumno preparar material de uso en microbiologa para su esterilizacinUtilizar el mtodo adecuado de esterilizacin de acuerdo al tipo de material

I.2 Objetivo especficosLavar el material a esterilizar para uso en el rea microbiolgicaPreparar el material de vidrio e instrumental para ser esterilizado por calor seco Preparar el material de vidrio e instrumental para ser esterilizado por calor hmedo Esterilizar el material previamente preparado, por calor seco y calor hmedo. Realizar el proceso de filtracin a travs de membrana

2. INTRODUCCINLa esterilizacin es un proceso que destruye o elimina los microorganismos. La esterilizacin se puede realizar a travs de mtodos fsicos y qumicos. Para seleccionar el ms adecuado es necesario conocer la naturaleza del material, aunque algunos pueden tener varias formas de esterilizacin.

Mtodos fsicosCalor hmedo:La aplicacin de calor es el mtodo ms simple para esterilizar un material, a condicin de que no sufra dao en s mismo. Una temperatura de 100 C matar a todas las formas vegetativas de Eubacterias, pero no las esporas ni a las Arqueobacterias extremfilas, para matar a estas es necesario una temperatura de 121 C, 15 minutos y 15 libras de presin. La muerte microbiana se produce por la desnaturalizacin de las protenas, generalmente se utiliza vapor, tanto porque las bacterias se mueren ms rpidamente cuando se encuentran hmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas las partes del recipiente.Calor seco:Para esterilizar materiales que deben permanecer secos se dispone de hornos elctricos por los que circula aire caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se aplica una temperatura de 160 170C durante una h.Para ambos tipos de calor aplicadas en los tiempos ya mencionados el calor acta desnaturalizando las protenas y los cidos nucleicos de la clula y fragmentando las membranas celulares.Incineracin:La llama es un agente esterilizador eficaz, y el ms simple de todos. Es frecuentemente utilizado para esterilizar el asa bacteriolgica para sembrar o resembrar un cultivo. Al flamear el asa, debe evitarse de ser posible, que dicha asa lleve grandes cantidades de material biolgico, pues ste podra saltar diseminndose partculas infectantes.

LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS.UPIBI-IPNA veces para instrumentos como tijeras, hojas de bistur o pinzas, se puede esterilizar el material mojndolo con alcohol y encendindolo ste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilizacin completa. El mtodo es rpido pero produce carbonizacin y prdida del filo.


Radiaciones ionizante y no ionizante:La radiacin ultravioleta provoca dao en el DNA, la luz ultravioleta induce el entrecruzamiento entre pirimidinas adyacentes en una u otra de las dos tiras de polinucletidos, formando dmeros pirimidnicos, las radiaciones ionizantes producen roturas en las tiras sencillas y en las dobles.Pueden emplearse tambin ondas supersnicas o ultrasnicas para romper o desintegrar a la clula.Filtracin a travs de MembranasAlgunas sustancias no pueden ser esterilizadas por calor hmedo o seco pues son termolbiles, es decir que se desnaturalizan o que pierden alguna propiedad deseable, en tal caso se utilizan sistemas de filtracin de membranas para retener a los microorganismos. Aqu debemos de conocer las dimensiones del microorganismo a eliminar para poder utilizar el filtro adecuado (dimetro).Los filtros utilizados son fabricados con porcelana, cuarzo, tierra de diatomeas, vidrio pulverizado, asbesto o steres de celulosa, para la filtracin a travs de membrana, se utiliza como bioindicador a Pseudomonasdiminuta para filtros con porosidad de 0.22 m, como mnimo.

Jeringas y portamembranas

Mtodos qumicosGases (oxido de etileno) y lquidos (formaldehdo y propiolactona)Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrgeno lbiles como los que tiene grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos e hidroxilos. Es utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en la industria farmacutica, sirve para esterilizar material termosensible como el plstico, equipos electrnicos, bombas cardiorrespiratorias. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo y adems cancerigeno, por lo que se suministra normalmente con una concentracin entre el 10 y el 20 % de CO2. La concentracin de xido de etileno, la humedad y la temperatura influyen sobre la velocidad de esterilizacin. Un objeto limpio puede esterilizarse si se trata de 5 a 8 h a 38 C o de 3 a 4 h a 54C, cuando la humedad relativa se mantiene entre el40 y el 50 % y la concentracin de xido de etileno es de 700 mg/L. Una vez esterilizado el material es necesario airear para eliminar el xido de etileno residual porque es muy txico.La -propiolactona se emplea para esterilizar vacunas y suero, se degrada hasta una forma inactiva despus de varias h y, por ello, no es tan difcil de eliminar. Destruye a los microorganismos ms rpidamente que el xido de etileno, pero no penetra tan bien en los materiales y puede ser cancergena.

Indicadores biolgicos para el proceso de esterilizacinEn todo lugar en donde se realice esterilizacin se debe de contar con indicadores de calidad que manifiesten que la esterilizacin se ha llevado correctamente y que dicho material se encuentra estril, para ello existen en el mercado varios indicadores que se introducen con el material a esterilizar y posteriormente se verifica un cambio de color o turbidez de la ampolleta.

Mtodo de la tira de papelLas esporas de Geobacillus stearothermophilus.- En un proceso de esterilizacin por calor hmedo, se utilizan tres tiras impregnadas con las esporas del microorganismo, colocando una que se esteriliza previamente y servir como control negativo; una tira sin esterilizar que fungir como control positivo y una tira ms se coloca en la muestra que se va a esterilizar. Una vez concluido el proceso de esterilizacin, cada tira se transfiere, bajo condiciones aspticas, a tubos con caldo de un medio enriquecido estril y se incuban a 55 C durante 7 das. Al trmino de la incubacin, se observa si hay crecimiento en cada uno de los tubos. Si la tira control positivo no presenta crecimiento o si la tira control negativo presenta crecimiento, se invalida el proceso. Si hay crecimiento solamente en la tira que corresponde al seguimiento del proceso, este se realiz en condiciones incorrectas y no hubo esterilizacin. Si no hay crecimiento solamente en la tira control negativo y en la tira de la muestra, el proceso se realiz correctamente.Mtodo de la ampolleta:Son ampolletas que contienen una suspensin de Geobacillus stearothermophilus en medio de cultivo con prpura de bromocresol como indicador. Las ampolletas indicadoras se colocan entre el material que se va a esterilizar por calor hmedo. Al trmino del proceso de esterilizacin, las ampolletas (sin abrir) se incuban entre55 y 65 C durante 24 h, la turbidez y la aparicin de un color amarillo indica un proceso de esterilizacin incorrecto. Al mismo tiempo se incuba una ampolleta sin esterilizar como control positivo, la cual debe mostrar desarrollo bacteriano y el medio se vuelve amarillo.

OTROS AGENTES ESTERILIZANTES:Para instrumentos como hojas de bistur, tijeras o pinzas, se esteriliza el material, impregnando con alcohol y ponindolo a la flama hasta que se apague solo repitiendo el procedimiento tres veces. El mtodo tiene la ventaja de ser rpido pero se produce carbonizacin y prdida de filo.Pueden emplearse ondas supersnicas o ultrasnicas de 9000 ciclos / s, para romper y desintegrar las clulas. Se cree que las bacterias se daan y destruyen por la formacin de pequeas burbujas de gas en la suspensin a consecuencia de las ondas sonoras.

NOTAS:-Los tubos o frascos con tapa de baquelita, nunca deben cerrarse completamente.-Si existe material que ha estado en contacto con cultivo de microorganismos, ste debe ser esterilizado en autoclave a 121 oC, 1,05 atm de presin durante 15 minutos- Recolectar los desechos del material esterilizado en recipientes adecuados para darle una disposicin final ambientalmente responsable.

3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO3.1 EQUIPO Autoclave a 121 C Autoclave a 110 C Horno a 170 C Incubadora a 35 C

Bao Mara a 55CMembranas con porosidad de 0,45 m de dimetro. Termmetros de 150 Termmetro de 200 C

Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P.213.2 MATERIAL Papel aluminio Papel Kraft Algodn 2 cajas de Petri 2 matraces de 125 ml 3 pipetas de 2, 5 y 10 mL Una pinza de diseccin Una tijera Una gradilla Un cilindro pipetero Un cilindro para cajas de Petri

Un mechero Fisher Un vaso de precipitados de 100 ml 8 tiras de papel filtro Ligas Un sistema MillexHA Un portamembranas de filtracin Membranas de 0.45 micrones de porosidad Escobillones de diferentes tamaos Una esponjaUn tubo de ensaye 13 X 100 estril con caldo nutritivo3.3 MEDIOS DE CULTIVO 4 tubos de 16 x 150 mm con 3 ml de caldo nutritivo 2 matraces con 20 ml de caldo nutritivo estril 2 tubos de 113 X 100 con 3 ml de caldo nutritivo sin esterilizar

3.4 CEPAS MICROBIANAS Tiras controles de esporas Suspensin microbiana de Escherichia coli

3.5 REACTIVOS Agua destilada Caldo nutritivo

4. DESARROLLO EXPERIMENTALPREPARACIN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIN4.1 Lavado de material de vidrio e instrumentala).Utilizando escobillones para pipetas, tubos y matraces y una fibra suave para las cajas de Petri, el material plano y el instrumental metlico lavar el material que se va a esterilizar, utilizando detergentes aninicos que no dejan residuosb) Enjuagar suficientemente con agua de la llavec) Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente.

4.2 PREPARACIN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO4.2.1 TUBOS DE ENSAYOa) Tapar 2 tubos de 16 x 150 mm con tapones de algodn siguiendo las indicaciones del profesorb) Colocar los tubos en un bote de lmina, taparlos con papel Kraft y asegurarlos con una liga, anotar fecha, equipo, grupo, medida de los tubos y cantidad preparada.

4.2.2 CAJAS DE PETRIa) Envolver 8 cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor. Anotar en el papel, la cantidad de cajas envueltas, fecha, equipo, nmero de equipo de laboratorio y grupo.

4.2.3 PIPETASa) Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapn de algodn cuidando que no quede muy compactado, utilizar para ello una aguja de diseccin o un clipb) Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de algodnc) Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo con masking-tape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el nmero de equipo de laboratorio. Con una fecha indicar el sentido de la punta de la pipeta.

4.2.4 MATRACESa) Colocar en la boca de cada matraz un tapn compacto de algodn, envuelto con gasa, siguiendo las instrucciones del profesor.b) Con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente ms grande que el tapn de algodn.c) En una tira de Masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo, adherir el Masking-tape al matraz. No anotar los datos sobre el gorro de papel.

4.2.5 PINZAS Y TIJERASa) Envolver con papel Kraft una pinza o tijera y con lpiz sealar con una flecha la punta. b) Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo.

4.2.6 PORTAMEMBRANAS Y MEMBRANAS DE 0.45 MICRONES DE POROSIDADa) Abrir el portamembranas, revisar que contenga el empaque y con la ayuda de pinzas, colocar una membrana de 0.45 micrones de porosidad, del dimetro adecuado al tamao del portamembrana, cerrar adecuadamente, envolver en papel Kraft, siguiendo las instrucciones del profesor.

4.3 PREPARACIN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIN POR CALOR SECO4.3.1 TUBOS DE ENSAYEa) Colocar en 2 tubos de ensaye, una cubierta de papel aluminio y colocarlos en una canastilla metlica. b) Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, grupo y equipo, sujetar el papel con masking-tape.4.3.2 CAJAS DE PETRIa) Colocar en el interior de un cilindro de acero inoxidable para cajas de Petri dos cajas en posicin invertida perfectamente secas. (NUNCA ESTERILIZAR POR ESTE MTODO MATERIAL CONTAMINADO)b) Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, el nmero de cajas que contiene el cilindro, el grupo y la fecha. Colocar la tira de papel entre la tapa del cilindro.

4.3.3 PIPETASa) Poner en la boquilla de cada una de las pipetas un tapn de algodn cuidando que no quede muy compactado.b) Flamear las boquillas en la flama del mechero a fin de eliminar el exceso de algodn, antes colocar en el interior un poco de papel aluminio para evitar que las pipetas se despunten en el momento de introducirlas.c) Colocar en el interior de un cilindro pipetero, las pipetas preparadas.d) Anotar en una tira de papel Kraft la cantidad de pipetas, su capacidad, fecha, grupo y equipo. Fijar la tira entre la tapa del cilindro pipetero.4.3.4 MATRACESa) Colocar en la boca de un matraz de 125 ml una tapa de papel aluminio.b) En una tira de papel Kraft anotar fecha, grupo y equipo. Fijar la tira al cuello del matraz sujetndolo con masking-tape o etiquetar con un marcador indeleble.4.3.5 PINZAS Y TIJERASa) Envolver en papel aluminio una pinza o una tijera.b) En una tira de masking-tape, anotar fecha, grupo y equipo. Fijar el masking-tape a la envoltura.

PRUEBAS DE ESTERILIDAD POR CALOR SECO Y CALOR HMEDO4.4. REDUCCIN DE LA CARGA MICROBIANAa) Preparar 2 tubos de ensaye de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo sin esterilizar y etiquetar cada uno de ellos como tubo 1 y 2. (Etiqueta con la siguiente informacin, grupo, equipo, temperatura efectuada y fecha)b) Colocar en el tubo 1, una tira de esporas de Geobacillus stearothermophilus, mantener el tubo nmero 1 sin esterilizar. (Testigo positivo)c) En el segundo tubo de ensaye sin esterilizar y que contiene el caldo nutritivo, colocarle una tira de esporas deGeobacillus stearothermophilus, tapar el tubo con un tapn de algodn, y someterlo a una temperatura de 110C durante 10 minutos y una presin de 10 lb/pulgd) Un tercer tubo con 3 ml de caldo nutritivo estril ser nuestro testigo negativo en toda la prcticae) Incubar los tres tubos a 55 oC 2C durante 5 das en bao mara y observar diariamente durante el tiempo sealado. Anotar en la bitcora de laboratorio cualquier cambio en cuanto a la aparicin de turbidez.

4.5 ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDOa) Preparar un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo estril y etiquetarlo.b) Colocar en el tubo una tira de esporas de Geobacillus sthearothermophilus, tapar el tubo con un tapn de algodn y esterilizarlo a 121 C, 15 min y 15 lb.c) Los tubos del punto 4.4 inciso b y d son los testigos positivo y negativo respectivamente.e) Incubar el tubo a 55 oC 2C durante 5 das en bao mara y observar diariamente. Anotar en la bitcora de laboratorio cualquier cambio en cuanto a la aparicin de turbidez.NOTAS: Consideraciones importantes para llevar a cabo el proceso de esterilizacin adecuado:-Tener cuidado de eliminar todo el aire del autoclave.-Colocar agua suficiente hasta el nivel de la rejilla o en la marca de la autoclave vertical-Cuando se caliente la olla observar que no salga vapor por la tapa, en caso de suceder cambiar el empaque.-Si se esta utilizando la autoclave vertical utilizar agua destilada.-Observar que el manmetro registre la presin


4.6 ESTERILIZACIN POR CALOR SECOa) Precalentar el horno a 170C, colocar el material preparado para esterilizar y esperar que la temperatura se vuelva a ajustar a 170 oC, en este momento empezar a contar el tiempo de 1 h.b) En un tubo de ensaye sin esterilizar y vaco, colocar una tira de papel filtro que contenga esporas de Bacillus subtilis var. niger, cubrir la boca del tubo con papel aluminio y colocarlo junto con el material indicado en el inciso a. Esterilizar a 170 oC durante 1 h. En caso de que no se te proporcione la tira impregnada con esporas introduce una ampolleta que ya contenga el papel filtro impregnada con esporas, etiqueta el tubo con los datos correspondientes de preferencia con un marcador indeleble.c) Los tubos del punto 4.4 inciso b y d son los testigosd) Despus de transcurrido el tiempo de esterilizacin, apagar el horno y esperar a que el termmetro indique la temperatura ambiente. Abrir, retirar el material y el tubo de ensaye con la tira de esporas.e) Con ayuda de la pinza estril (flamear con alcohol) y bajo condiciones aspticas, colocar la tira de papel filtro conteniendo las esporas de Bacillus subtilis a un tubo de ensaye que contenga 3 mL de caldo nutritivo estril y etiquetado. Incubar a 55 2 oC durante 24 48 h. Observar diario y anotar cualquier cambio en cuanto a la aparicin de turbidez. (esto se har extraclase)

NOTA:-Registrar en su cuaderno de notas la temperatura y el tiempo de esterilizacin

Caractersticas de las tiras impregnadas con esporas (uso a nivel industrial).1.- Colocar estratgicamente las ampolletas No. 1 (12 por m3) y operar el sistema de esterilizacin.2.- Una vez concluido el proceso de esterilizacin, transferir bajo condiciones aspticas,la tira con esporas a la ampolleta No. 2, cortndole en la parte cintada.3.- Incubar las ampolletas No. 2 de 35 a 37 oC durante 24 48 h.Testigo positivo.- Sin haber sido esterilizada incubar una tira de esporas con las condiciones anterioresInterpretacinAmpolletas con desarrollo.-Proceso de esterilizacin inadecuado Ampolletas sin desarrollo.- Proceso de esterilizacin adecuado Testigo positivo.- Deber mostrar desarrolloLa ampolleta tiene un disco con esporas de Bacillus subtilis (niger) con no menos de 5 X 105 esporas.

4.7 PROCESO DE FILTRACIN A TRAVS DE MEMBRANAa) Colocar 1 ml de la sustancia a filtrar en una jeringa desechableb) Bajo condiciones aspticas, ensamblar la jeringa al portamembrana con la membrana previamente esterilizadac) Filtrar gota a gota y recibir el filtrado en un tubo de ensaye estril.d) Transferir la membrana con la ayuda de una pinza estril, a un tubo que contiene 3 mL de caldo nutritivo estrild) Incubar el filtrado y el tubo que contiene la membrana, a 35 2 oC de 48 a 72 h. e) Colocar la jeringa en un bote de lmina para su esterilizacin.d) Observar diariamente y anotar en el cuaderno de notas del laboratorio cualquier cambio en cuanto a laaparicin de turbidez durante 3 das.

NOTAS:-El bioindicador utilizado en los procesos por filtracin a travs de membrana es Pseudomonas diminuta, para membranas con un dimetro de poro de 0,22 m5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO5.1 Completa el siguiente cuadro indicando presencia o ausencia de turbidez.

MtodoReduccin de la cargamicrobiana (110C/10/10lb)Calor seco170C/2 hCalor hmedo121C/15/15lbFiltracin a travsde membrana

Testigo -

Testigo +

Resultado

5.2 Cul es la finalidad de utilizar agua destilada en el enjuagado del material?5.3 Explicar porqu utilizamos un tapn de algodn en las pipetas, en matraces y tubos de ensaye5.4. Porque utilizamos el papel Kraft para envolver el material?5.5 Anota 3 ejemplos de materiales que se esterilicen por calor seco, hmedo y por filtracin5.6 Qu concluyes si al trmino de la incubacin: se observa que la tira control positivo no presenta crecimiento, la tira control negativo presenta crecimiento y en la tira de la muestra, no hay crecimiento.

6. ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS6.1 Discutir cuales son los inconvenientes o riesgos de preparar el material con papel aluminio y papel Kraf para su esterilizacin por calor seco y hmedo.

7. CONCLUSIONES7.1 Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al anlisis y discusin de estos, as como a la bibliografa consultada y los objetivos de la prctica.

8. BIBLIOGRAFA

PRACTICA No.4NUTRICIN Y CULTIVO MICROBIANO

UNIDAD: III. Nutricin y Cultivo MicrobianoTEMA: 3.1 Formulacin de medios de cultivo3.2 Agar, fuentes de carbono y nitrgeno3.3 Preparacin de medios de cultivo3.4 Cultivo de microorganismos

1.- OBJETIVOS1.1 Objetivo General. El alumno cultivar microorganismos en los diferentes medios de cultivo, previa preparacin y clasificacin con base a sus componentes, uso y consistencia.

Objetivos especficos Determinar las especificaciones mnimas que deben tener los medios de cultivo para microorganismos en general de acuerdo a la NOM-065-SSA1-1993 Preparar y clasificar diversos medios de cultivo en base a sus componentes, complejidad, uso y consistencia. Cultivar bacterias y hongos en placa y tubo e identificar los requerimientos nutricionales de estos microorganismos.

2.- INTRODUCCINLas clulas estn formadas por grandes cantidades de pequeas molculas como agua, iones inorgnicos, carbohidratos y aminocidos y contienen un nmero todava ms pequeo de molculas grandes, los polmeros de las clulas, siendo los ms importantes las protenas y los cidos nucleicos. La clula puede obtener la mayora de las molculas pequeas de su medio ambiente de manera preformada, mientras que las grandes molculas son sintetizadas dentro de ellas. Existen complejas interrelaciones entre los compuestos incorporados por la clula y los que son sintetizados.Nutricin.A las sustancias en el medio ambiente utilizadas por los organismos para el catabolismo y el anabolismo se les llamanutrientes, y pueden dividirse en dos clases:(1) nutrientes necesarios, sin los cuales la clula no podra crecer, y

LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS. UPIBI-IPN(2) nutrientes tiles pero no indispensables, que se emplean si estn presentes pero no son esenciales. Algunos nutrientes son los ladrillos a partir de los cuales las clulas forman las macromolculas y otras estructuras, mientras que otros nutrientes sirven solo para la obtencin de energa sin ser incorporados directamente en las sustancias celulares, aunque en ocasiones un nutriente puede desempear ambas funciones. Las sustancias pueden dividirse en dos grupos: macronutrientes y micronutrientes, dependiendo de si son necesarios en cantidades grandes o pequeas respectivamente y factores de crecimiento como compuestos orgnicos, vitaminas, cidos orgnicos etc. Es fcil detectar cuando se requiere un macronutriente, simplemente porque se necesita en gran proporcin. Frecuentemente los micronutrientes son necesarios en cantidades tan pequeas que es imposible determinar cunto se requiere; muchas veces ni siquiera se sospecha que un micronutriente est presente en el medio en que un microorganismo est creciendo, debido a que los componentes del medio pueden contener tales micronutrientes en pequea cantidad como contaminantes.


Los microorganismos se desarrollan a partir de sustancias nutritivas que se obtienen del medio que las rodea. En el laboratorio los microorganismos se desarrollan en medios de cultivo que contienen los nutrimentos adecuados para cada uno y requeridos para la sntesis de sus constituyentes celulares, adems estos medios proporcionan las condiciones de pH, osmolaridad y humedad que le permiten un buen crecimiento.Existe una gran diversidad de sustancias que pueden utilizarse en la preparacin de medios de cultivo, formulado con un fin especfico, y el cual deber contener: Fuente de carbono Fuente de nitrgeno Fuente de azufre Factores de crecimiento (que actan como cofactores, oligoelementos como aminocidos o vitaminas que no pueden sintetizar) Fuente de enriquecimiento para microorganismos exigentes (huevo, sangre, suero etc). Inhibidores de crecimiento microbiano como los colorantes, sales biliares, detergentes, antibiticos o metales pesados. Indicadores de potencial oxido-reduccin. Agar como el agente gelificante o soporte.

Medios de cultivo: Segn la NOM-065-SSA-1993. Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo.Generalidades.Medios selectivos.Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperacin del germen o grupo de grmenes de inters.Medios selectivos de enriquecimiento.Son medios lquidos que estimulan la multiplicacin de algn germen determinado e impiden o inhiben la reproduccin de otros.Medios diferenciales.Son aquellos que contienen indicadores de cido base, redox o sustancias que detectan cambios en el medio o en las caractersticas tpicas de las colonias.Medios para cultivar grmenes anaerbicos.Son medios de cultivo para aquellos grmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de microaerofilia.Medios de transporte.Sirven para transportar los especmenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio.Estos medios impiden que se altere la proporcin original de la flora microbiana en los especmenes.Medios para filtracin a travs de membrana.Pueden ser lquidos o slidos. En el primer caso, se preparan a la concentracin usual y permiten el crecimiento de microorganismos presentes en la membrana.Los medios slidos tienen un contenido mnimo de agar para favorecer la difusin de nutrientes del medio de la membrana.Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras.En el caso de los hongos, el medio de cultivo descrito por Sabouraud es el que ms se utiliza, ya que tiene un pH de5.6 lo que inhibe el crecimiento de la mayora de las bacterias. Este medio puede ser ms selectivo al adicionarle ciertos antibiticos tales como: cloranfenicol, eritromicina o gentamicina; para eliminar los hongos filamentosos de rpido crecimiento se adiciona cicloheximida (este medio se llama mycosel o micobitico). Se emplea tambin el medio de agar papa y dextrosa para promover la esporulacin de hongos filamentos y para recuento, se acidifica con

cido tartrico al 0.1 M hasta un pH de 4.5 El agar rosa de bengala se emplea para inhibir el crecimiento radial de hongos con micelio cenoctico.Otros medios de cultivo que pueden ser utilizados son los siguientes:Medios especiales para cultivo de protozoarios.Medios de cultivo para medir la potencia de los antibiticos.En la formulacin de un medio de cultivo deben considerarse, no slo el tipo de microorganismo, sino tambin el tipo de muestra que se va a analizar, y el objetivo final que se persiga: aislamiento, recuento o identificacin.Por otro lado, es de suma importancia los cuidados que deben observarse en la preparacin de los medios de cultivo como son:a. La calidad del agua utilizada (que se prefiere libre de sales)b. Los materiales y utensilios que deben encontrase en condiciones de limpieza (libres de otras sustancias o reactivos que interfieran en la formulacin original)c. Si se debe aadir calor y cunto para no incurrir en problemas de homogeneidad, desnaturalizacin, caramelizacin o prdida de actividad nutricional.d) pH final del medio que deber ajustarse segn indicaciones del fabricante o frmula estandarizada.e) Esterilidad del medio de cultivo de acuerdo a indicaciones del fabricante si es una formulacin comercial, o en otras condiciones si los componentes lo requieren.Cultivo microbiano.Los microorganismos obtenidos a partir de suelo, aire, alimentos, etctera se encuentran asociados, y en raras ocasiones se encontrar un solo tipo de microorganismo. A partir del cultivo inicial de una muestra, se encontrar una variedad de tipos de colonias y posteriormente se pretender lograr un cultivo puro. Un cultivo puro es aquel que est constituido por microorganismos de la misma especie. El cultivo de microorganismos se puede realizar en medio slido, en medio semislido y en medio lquido.Se conoce como cultivo en medio slido al que se hace en una caja Petri con el medio de cultivo gelificado (agar). Las variantes del cultivo en caja son diversas pero todas se centran en la formacin de estras sobre la superficie del medio de cultivo con el asa en el caso de bacterias y por punto si se trata de hongos filamentosos.Las siembras en tubos con medio slido, por lo general se emplean para la conservacin de un cultivo provenientede una placa.Existen dos variedades de cultivo en tubo:a) Por estras: se utilizan los medios de cultivo inclinados, se toma una muestra de alguna colonia inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se arrastra el asa en forma zigzagueante en el medio por la superficie inclinada del agar.b) Por picadura: se utilizan los medios de cultivo en un tubo solidificado semislido en forma inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se introduce en el medio picndolo longitudinalmente.La siembra en tubos de cultivo en medio lquido se realiza tomado el inculo con el asa y se introduce en el medio lquido agitando suavemente el asa.a) Desarrollo en medio slido inclinado. Se siembran los microorganismos por estra en tubos con agarinclinadob) Desarrollo en medio lquido. Las caractersticas que se observan en el cultivo son:turbidez, un sedimento, una pelcula superficial, o combinados.c) Desarrollo en medio semislido por picadura hasta partes del tuboCabe sealar que la identificacin de microorganismos por el estudio de sus caractersticas de cultivo es solo parcial ya que se requiere otras pruebas bioqumicas, fiosiolgicas e inmunolgicas.Mediante la evaluacin de las caractersticas de las colonias descritas y la accin en el medio, se puede hacer una identificacin preliminar de los diferentes microorganismos aislados en un cultivo primario. Estas caractersticas son

tiles para seleccionar otros medios y pruebas diferenciales apropiadas para completar la identificacin de los microorganismos.

3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1 MATERIAL POR GRUPO Sesin IBalanza granataria Autoclave Horno 170 C Potencimetro

Algodn Gasa Papel Kraft Refrigerador

Sesin II Incubadora a 28 C Incubadora a 37 C

3.2 MATERIAL POR EQUIPO Sesin I1 mechero Fisher 1 esptula 6 matraz Erlenmeyer de 250 mL 7 tubos de ensaye de 16 x 150 mm 2 matraces de 125 mL 6 cajas PetriSesin II 3 tubos con 3 ml de medio SIM 3 cajas con agar EMB 3 tubos con agar PDA 3 tubos con agar nutritivo

5 tubos de ensaye de 13 x 100 mm 1 gradilla metlica 1 probeta de 100 mL 1 termmetro 1 pipeta de 10 mL

3 cajas con agar nutritivo 1 matraz con 150 ml de caldo glucosa sales 1 matraz con 150 ml de caldo nutritivo

3.3 REACTIVOS150 mL de caldo glucosa sales 100 mL de agar nutritivo 75 mL de agar EMB 25 mL de PDA 25 mL de medio SIM Glucosa

(NH4) 2SO4 K2HPO4 MgSO4 7H2O MnSO4 4H2O 6 g de agar bacteriolgico Agua destilada

3.4 CEPAS Escherichia coli Bacillus sp.

Penicillum sp. Aspergillus sp.

4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL SESIN I Recomendaciones generales para la preparacin de los medios de cultivo. Preparar los volmenes de cada medio que se han de utilizar en el perodo recomendado para su empleo. Utilizar agua destilada y material de vidrio libre de detergentes. Pesar la cantidad del medio que marca el fabricante (en la etiqueta) En el caso de medios deshidratados, el medio debe de guardarse en su frasco y en lugares frescos.Emplear recipientes con el doble de capacidad al volumen que se va a preparar para evitar la proyeccin en el momento de la ebullicin.Aadir un pequeo volumen de agua para permitir la disolucin completa y despus completar el volumen total.En general los medios se mezclan hasta disolucin completa para aclararse, pero debe evitarse que se derramen. Nunca deben calentarse a la flama directa del mechero para evitar que se proyecten. El pH de los medios debe ajustarse antes de la esterilizacin y con el medio a una temperatura de 25 C.Es conveniente evitar el sobrecalentamiento durante la esterilizacin por calor para evitar la prdida de materiales nutritivos y agua que puedan cambiar la consistencia del medio.Antes de inocular un medio debe comprobarse la esterilidad de cada lote, incubando un 3-4% del total durante 3 das a 37 C.Los medios de cultivo ya preparados y esterilizados deben mantenerse en refrigeracin (4 C) y protegidos de la luz. Antes de emplearlos verificar que no exista contaminacin, precipitacin, cambio de color o de consistencia etc. Un medio contenido en un matraz no puede ser esterilizado una segunda ocasin.

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO4.2 MEDIO SINTTICO (glucosa-sales) Preparar la cantidad de caldo o agar en tubo o en matraz segn lo que el profesor indique. Pesar cuidadosamente los componentes del medio de acuerdo a la siguiente formulacin:

Formulacin g/L

Glucosa5.0 g

(NH4) 2SO42.0 g

KH2PO40.05 g

K2HPO40.05 g

MgSO4 7H2O0.25 g

MnSO4 4H2O0.001 g

Agua destilada1000 mL

Nota: Para el medio slido adicionar 1.5 g de agar bacteriolgico/ 100mL de medio. Disolver los componentes en un matraz de 250 mL, calentar si es necesario y ajustar el pH a 7.0 - 0.2.Una vez disueltos los componentes transferir 30 mL a cada uno de los dos matraces Erlenmeyer de 125 mL limpios y taparlos con un tapn de algodn-gasa y gorro de papel Kraft. Etiquetar los matraces perfectamente. Si es necesario agregarle agar bacteriolgico tal que la concentracin sea de 1.5 % Calentar a ebullicin hasta disolucin en el caso de haber preparado agar.

Si se requiere preparar tubos con agar una vez que se haya disuelto el agar agregar 3 mL a cada uno de los tubos, agregar el agar rpidamente antes de que solidifique, una vez agregado el agar tapar los tubos con tapo de algodn y colocarlos en un bote de lmina para su esterilizacin.Para el caso de matraz tapar el matraz con un tapn de algodn- gasa y gorro de papel Kraft. Etiquetar el matraz. Esterilizar los tubos, el matraz con caldo glucosa y el matraz de agar glucosa en autoclave a 121 Cdurante 15 minutos a 15 libras de presin.Una vez que se ha llevado a cabo la esterilizacin dejar a temperatura ambiente los matraces y tubos durante 24 horas como prueba de esterilidad.En condiciones de esterilidad transferir de 15 a 20 mL de cada medio a las cajas de Petri estriles y dejar que se solidifiquen a temperatura ambiente.Tomar una muestra representativa de las cajas y dejarlas a temperatura ambiente colocndolas en posicin invertida durante 24 horas para prueba de esterilidad.

4.3 MEDIO COMPLEJO ( agar nutritivo )Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de medio indicada por el profesor (a) ya sea para tubos de ensaye o cajas petri. Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria. Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.Vaciar 3 mL de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios, taparlos con un tapn de algodn-gasa y gorro de papel Kraft. Tapar el matraz que contiene el medio restante con un tapn de algodn-gasa y gorro de papel Kraft. Etiquetar los tubos y el matraz. Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase (en este caso es de121 C durante 15 minutos y 15 libras de presin). Enfriar el matraz hasta 45 C, por debajo de esta temperatura el agar solidificar.En condiciones aspticas, transferir del matraz de 15 a 20 mL de cada medio en cajas de Petri estriles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape o con marcador indeleble.Colocar los tubos con agar nutritivo en una superficie inclinada y permitir que solidifiquen Incubar una placa y un tubo a 37 C durante 24 horas como prueba de esterilidad.

4.4 MEDIO DIFERENCIAL Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica del envase para preparar la cantidad que indique el profesor. Colocar el medio en un matraz con el doble del volumen y adicionarle el agua necesaria. Calentar suavemente hasta disolucin completa. Tapar el matraz con un tapn de algodn-gasa y gorro de papel Kraft. Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase (en este caso a 121 Cdurante 15 min). Enfriar hasta 45 C.En condiciones aspticas transferir de 15 a 20 mL de cada medio en cajas de Petri estriles y dejar que solidifiquen a la temperatura ambiente. Etiquetar en la base de la caja. Dejar una placa a 35 C durante 24 horas para prueba de esterilidad, incubar en posicin invertida.

4.5 MEDIO SELECTIVO ( Agar Papa y Dextrosa )Pesar cuidadosamente la cantidad que se indica en la etiqueta del envase para preparar la cantidad que indique el profesor. Colocar el medio en un matraz de y adicionarle agua necesaria. Calentar suavemente hasta disolverlo completamente. Tapar el matraz con tapn de algodn y papel Kraft.Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase (121 C durante 15 minutos).Al medio de cultivo preparado enfriarlo hasta una temperatura de aproximadamente 45C y agregarle 1.8 mL de cido tartrico al 10% estril por cada 100 mL de medio preparado y homogeneizar.Vaciar el medio de cultivo antes que solidifique en placas de Petri estriles, dejar solidificar y etiquetar en la base de las cajas. Dejar una placa a 35C durante 3 a 5 das para prueba de esterilidad, incubar en posicin invertida

4.6 MEDIO INDICADOR medio SIM (Sulfur Indol Motility).Pesar con cuidado la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad que indique el profesor. Colocar el medio en un matraz del doble de capacidad y adicionarle agua necesaria. Calentar suavemente hasta disolucin completa vaciar en tubos de ensaye de 13 x 100 mm 3 mL del medio.Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase (121 C durante 15 minutos). Colocar los tubos en una gradilla y dejar que estos solidifiquen a temperatura ambiente en posicin vertical. NOTA: ESTOS MEDIOS SE UTILIZARAN PARA LA SIGUIENTE SESIN (II) QUE ES CULTIVO DE MICROORGANISMOS, POR CONSIGUIENTE DEBERN MANTENERSE EN REFRIGERACIN Y BIEN ETIQUETADOS.

SESIN II4.7 CULTIVO EN MEDIO SLIDO EN PLACA Se utilizarn cajas con agar nutritivo EMB. Tomar el asa de platino acero y quemarla al rojo vivo en la flama del mechero para esterilizarla. Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama del mechero. Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el inculo. Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapn.Destapar la caja Petri con agar nutritivo o EMB y sembrar al microorganismo por estra cruzada como se indica en el esquema 1 Quemar el asa cada vez que se realiza una estra. Una vez sembrado el microorganismo incubar la caja sembrada a 37 C, durante 24 horas.Observar el crecimiento a las 24 horas y anotar las caractersticas del crecimiento en el medio cultivo ya sea agar nutritivo o EMB

NOTA: Se recomienda practicar en papel con lpiz o pluma en su cuaderno.

Esquema 1. Aislamiento por estra cruzada4.8 CULTIVO EN MEDIO SEMISLIDOSe utilizarn tubos con agar nutritivo y agar papa dextrosa inclinados. (Un tubo por alumno de c/u de los medios)Tomar una asada de la bacteria previamente aislada y sembrar por estra en S la superficie del medio inclinado de agar nutritivo.Para hongos tomar el inculo (micelio y esporas) con el asa micolgica y sembrar por punto en la parte central. Quemar el asa una vez realizada la siembra.Incubar los tubos sembrados a 37 C para bacterias y a 28 C para hongos, durante 24 y 48 horas respectivamente. Observar los cultivos a las 24 y 48 horas y anotar las caractersticas del cultivo.

4.8 CULTIVO EN MEDIO LQUIDOSe emplearn tubos y matraz con caldo nutritivo y glucosa sales.Tomar el inculo de bacterias con el asa y disgregar ste agitndolo en las paredes del tubo con caldo nutritivo y glucosa sales a fin de evitar la formacin de grumosTomar el inculo de hongos con el asa en forma de L y sembrarlo en el matraz o en tubo segn sea el caso con caldo nutritivo y glucosa sales, procurando tomar esporas y micelio para disgregarlo en el medio de cultivo. Quemar el asa una vez realizada la siembra.Incubar los tubos con bacterias a 35 C, durante 24 horas y el matraz con hongos a 28 C durante 48 horas en agitacin (se sugiere 120 rpm). Observar los cultivos a las 24 y 48 horas y anotar las caractersticas observadas. Los equipos designados por el profesor dejarn su matraz inoculado con un moho sin agitacin.

4.9 CULTIVO EN MEDIO SEMISLIDO Se emplearn tubos con medio SIM Tomar un inculo de bacterias con el asa recta.


Sembrar por picadura, sumergiendo el asa hasta partes del medio SIM sin tocar el fondo y sacar el asa verticalmente. (El crecimiento debe de darse en la lnea de trazo en el caso de que la bacteria sea no mvil, cuando es mvil el crecimiento se difunde a travs del medio). Quemar el asa una vez realizada la siembra. Incubar los tubos a 37 C durante 24 horas. Observar los cultivos a las 24 horas y anotar las caractersticas del cultivo.

5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO5.1 En un cuadro anota los medios de cultivo que se prepararon, sus condiciones de esterilizacin, el aspecto final del medio y cual es su clasificacin en base a su consistencia y composicin.

Medio de cultivoCondiciones de esterilizacinAspecto final del medioClasificacin por su consistenciaClasificacin por su composicin

Caldo Glucosa sales

Agar Glucosa sales

Agar Nutritivo

EMB

PDA

5.2 Qu precauciones deben tomarse en cuenta para la preparacin de medios de cultivo?5.3 Qu cuidados deben tenerse al preparar un medio de cultivo slido en caja de petri?5.4- Clasificar los siguientes medios de acuerdo a su composicin, selectividad y complejidad. Mencionar que componentes les confieren la capacidad diferencial o selectiva y qu tipos de microorganismos crecen en ellos.a) Agar Nutritivob) Agar Rosa de Bengala c) Agar Papa Dextrosad) Agar Soya y Tripticasena5.5 Cul es la funcin de los colorantes e indicadores en los medios de cultivo?5.6 Cul es la fuente de carbono de cada uno de los medios utilizados?5.7 Por qu es recomendable llenar los tubos con medio lquido y luego esterilizarlos. Por qu en las cajas dePetri, primero se esteriliza el medio y posteriormente se transfiere a cajas de Petri estriles?

5.8 De los medios utilizados indica cules son especficos para hongos y cules para bacterias y por qu?5.9 Los medios de cultivo tienen fecha de caducidad? Qu pasa si la fecha esta vencida?5.10 Cuando se siembran hongos filamentosos (mohos) en medio lquido, describa cmo es el crecimiento con y sin agitacin.5.11 En qu casos se siembra en medio semislido y cules son las precauciones que se deben tomar?5.12 Realiza un esquema indicando la forma correcta de sembrar a bacterias y mohos en medio slido inclinado.

6.- ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOSEl anlisis y la discusin se basarn en relacin a:La clasificacin de los medios segn la Norma Oficial Mexicana.Las caractersticas de la morfologa colonial ( macroscpica ) para cada especie microbiana segn los medios utilizados.El crecimiento en placa con el crecimiento en agar inclinadoLa componentes de los medios de cultivo, fuente de Carbono, fuente de Nitrgeno, fuente de Azufre, etc. .

7.- CONCLUSIONESElabora tus conclusiones utilizando los resultados obtenidos, al anlisis y discusin de stos, la bibliografa consultada y al objetivo de la prctica.

8.- BIBLIOGRAFAEnlistar la bibliografa que utilizaste para el informe de esta prctica.

9.-BIBLIOGRAFA RECOMENDADA8.1 Manual de medios de cultivo Bioxn8.2 Norma Oficial Mexicana Nom-065-SSA1-1993, Bienes y Servicios.

PRACTICA No 5AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

UNIDAD IV : Ubicuidad y aislamiento de microorganismos

TEMA: 4.2. Aislamiento4.2.1 Por estra cruzada4.2.2 Diluciones4.2.3 Vaciado en placa4.2.4 Extensin con varilla

1. OBJETIVO GENERAL:El alumno aplicar las tcnicas de aislamiento y cuantificacin de microorganismos.

1.2 OBJETIVOS ESPECFICOS:Aplicar las tcnicas de aislamiento de microorganismos por estra cruzada, extensin con varilla, vaciado en placa, dilucin en tubo. Correlacionar las normas oficiales mexicanas con las tcnicas de aislamiento.

2. INTRODUCCINSe entiende por aislamiento, al proceso que permite separar uno o ms microorganismos presentes en una muestra. No todos los microorganismos pueden cultivarse en medios de cultivo, es el caso de los organismos biotrficos (parsitos obligados), slo se desarrollan sobre tejido vivo de su hospedante (viroides, virus, rickettsias, hongos).

Las tcnicas de aislamiento ms frecuente usadas son:Estra cruzada en placa:Esta tcnica consiste en establecer un gradiente de diluciones por medio de las estras cruzadas sobre la superficie de un medio slido, para separar a los microorganismos, dando origen a colonias separadas que generalmente corresponden a un *cultivo puro. En el estudio microbiolgico, el primer paso es la separacin de la poblacin mixta a un cultivo puro y luego su posterior identificacin (familia, gnero, especie).

*Cultivo puro: es aquel que contiene una sola especie o tipo de microorganismo y que presumiblemente se ha obtenido a partir de una sola clula (clona). En un cultivo puro, no necesariamente todas las clulas que lo componen tienen que ser exactamente iguales, ya que es factible que algunas de ellas sufran mutaciones y se diferencien de las restantes. Cada uno de los cultivos puros que componen una especie se denominan cepas.

Diluciones

LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS- UPIBI.IPNLa dilucin primaria tiene por objeto obtener una distribucin lo ms uniforme posible de los microorganismos contenidos en la muestra destinada para el anlisis.


La preparacin de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el nmero de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, despus de la incubacin, la observacin de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas.Dilucin primaria, es la solucin, suspensin o emulsin obtenida despus de pesar o medir una cantidad delproducto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporcin de diluyente.Diluciones decimales adicionales, las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado volumen de la dilucin primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por repeticin de esta operacin con cada dilucin as preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas para la inoculacin de medios de cultivo.

Vaciado en placa:El fundamento de la tcnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de eleccin despus de un cierto tiempo y temperatura de incubacin, presuponiendo que cada colonia proviene de un microorganismo de la muestra bajo estudio. El mtodo admite numerosas fuentes de variacin, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.Despus de inocular las diluciones de las muestras en las cajas Petri estriles y vacas, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado que esta a una temperatura aproximada de 45C, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrs a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar.Incubar las cajas en posicin invertida (la tapa hacia abajo) durante el tiempo y la temperatura que se requieran, segn el tipo de alimento y microorganismo de que se trate.En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el error en la cuenta y en la interpretacin. Si hay mas colonias que las indicadas, en la ltima dilucin realizada, hacer ms diluciones hasta que se tenga este rango del nmero de colonias.Unidades Formadoras de Colonias (UFC), trmino que debe utilizarse para reportar la cuenta de colonias en placa, las cuales pueden surgir de una clula o de un cmulo de clulas.

Extensin con varillaUtilizando diferentes pipetas de 1 ml para cada dilucin, depositar 0,1 mL sobre la superficie de las placas de agar cuenta estndar o el agar que se vaya a utilizar.Distribuir el inculo sobre la superficie del agar con varillas estriles de vidrio en ngulo recto, utilizando una para cada dilucin.Mantener las placas en su posicin hasta que el inculo sea absorbido por el agar. Invertir las placas e incubar de 45 a 48 h a 35C.Si el inculo esta bien distribuido con la varilla de vidrio se podrn contar las colonias que hay crecido sobre la superficie del medio.

3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS3.1 MATERIAL POR EQUIPO4 Cajas de Petri esteriles3 Cajas de Petri con ACS3 Cajas de Petri con EMB3 Cajas de Petri con Agar Nutritivo

Matraz con 100 mL de Agar Cuenta Estandar4 Tubos de 16 X 150 con 9 mL de solucin salina al 0.85% Asa bacteriolgica1 Frasco con Benzal1 EsponjaCilindro con pipetas de 1 mL estrilesBalanza granataria

3.2 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNOMuestra de queso, jugo natural, etc.

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL Realizar diluciones de la muestra como lo indique el profesor ( figura 1)

4.1DilucionesA partir de muestras lquidas:a) Para muestras lquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribucin de microorganismos es homognea o fcilmente homogeneizable por medios mecnicos (agitacin, etc.).b) Para muestras congeladas de un alimento originalmente lquido o licuable, fundir por completo en bao de agua de 40 a 45C un tiempo mximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente.c) Para la parte lquida de una muestra heterognea la cual sea considerada suficientemente representativa de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).d) Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 mL de la muestra si es muestra lquida y /o 1 g si es muestra slida y diluir con 9 mL del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a sta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente (todo en condiciones aspticas). (Ver figura 1).e) Utilizar pipetas diferentes para cada dilucin inoculando simultneamente las cajas que se hayan seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta.

1g o 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

9 mL de diluyente sol. Salina al0.85% oagua peptonada al 0.1%

10 1 10-2 10-3 10-4

Figura 1

f) La seleccin de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen del nmero esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de anlisis previos y de la informacin que se obtenga del personal de inspeccin que la haya colectado. En ausencia total de informacin, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.

4.2 tcnica de vaciado en placa.a) Una vez realizadas las diluciones se procede a inocular las placas para la tcnica de vaciado en placa.b) Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin; la adicin de medio de cultivo y homogenizacin, se puedan realizar cmoda y libremente. Marcar las cajas en la base de la misma con los datos pertinentes previamente a su inoculacin y correr por duplicado.c) Se inocula 1 mL de las dos ltimas diluciones segn las diluciones que se hayan realizado en las cajas Petri, estriles, agregar de 12 a 15 mL del medio preparado que es agar cuenta estndar, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrs a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporacin del inculo en el medio; ([Fig.2), cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar.

Figura 2

d) Incluir una caja sin inculo por cada lote del medio preparado como testigo de esterilidad.e) El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.f) Incubar las cajas en posicin invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, segn el tipo de alimento y microorganismo de que se trate.g) Para mohos 27C por 48 a 72 horas para bacterias y levaduras 37C 24 a 48 horas. h) Contar todas las colonias en aquellas cajas que tengan entre 25 y 250 coloniasi) Si se cuenta la ltima dilucin y no tiene entre 25 y 250 sino ms, se sigue lo siguiente:j) Entre 250 y 450 colonias contar la mitad de la cajak) Entre 451 y 750 colonias contar un cuarto de la cajal) Si es mayor de 750 colonias, contar 9 cuadros al azar, hacer un promedio y multiplicar por 65, cuando se utilizan cajas que en su base mide 91 mm de dimetro, si se usan cajas con dimetro diferente, obtener el rea para saber el factor por multiplicar.

4.3 Tcnica de extensin en placaa) Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin; la adicin de medio de cultivo y homogenizacin, se puedan realizar cmoda y libremente.

b) Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a su inoculacin y correr por duplicado.c) Se inocula 0.1 mL de las dos ultimas diluciones de las muestras preparadas sobre la superficie del medio de cultivo a utilizar.d) Humedecer una varilla de vidrio en forma de L con alcohol y pasarla por la flama del mechero.e) Enfriar la varilla, una vez fra extender el inoculo por toda la superficie del medio de cultivo Agar nutritivo. (Fig. 3). f) Incluir una caja sin inculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad.g) El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.h) Incubar las cajas en posicin invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, segn el tipo de alimento y microorganismo de que se trate.i) Para bacterias 37C 24 a 48 horas.j) Se procede a contar el nmero de bacterias haciendo los clculos como en la tcnica de vaciado en placa.

0.1 mL

Varilla en forma de L

Figura 3

4.4 Aislamiento por estra cruzadaa) Este sistema de siembra en estra en placas de Petri con medios slidos es el procedimiento habitual para aislar bacterias en cultivos puros.b) Se extiende el inculo sobre una pequea zona de la placa de Petri.c) Se esteriliza el asa para trazar dos estras a partir del inculo depositado. Una de ellas se hace slo hasta el centro de la placa de Petri.d) Se vuelve a esterilizar el asa y se realizan una serie de estras paralelas a las dos primeras.e) Luego de esterilizar el asa nuevamente, se hacen una serie de estras perpendiculares a las dos primeras, pero comenzando desde el lado opuesto al depsito y sin llegar a tocarlo (ver figura 4).f) Cuando el medio no es selectivo y la carga microbiana es alta el asa se quema entre estra y estra.g) Incubar las cajas en posicin invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, segn el tipo de alimento y/o microorganismo de que se trate.h) Para mohos 27C por 48 a 72 horas.i) Para bacterias y levaduras 37C 24 a 48 horas.

Figura 4

5. RESULTADOS5.1 Informe de resultados de la tcnica de Vaciado en placa:5.1.1 Reportar como: Unidades formadoras de colonias, UFC/g o mL de bacterias aerobias en placa en agar cuenta estndar, incubadas: horas a _C5.2 Informe de resultados de la tcnica de Extensin en placa:5.2.1 Reportar como: Unidades formadoras de colonias, UFC/g o mL de bacterias aerobias en placa en agar cuenta estandar, incubadas: horas a _C.

6 CUESTIONARIO:6.1 En que casos aplicaras la tcnica de estra cruzada?6.2 La tcnica de estra cruzada permite contar el nmero de colonias?6.3 Cul es el fundamento de la tcnica de vaciado en placa?6.4 Cul es el fundamento de la tcnica de extensin en placa?6.5 Escribe 3 ventajas y 3 desventajas de la tcnica de vaciado en placa y de la tcnica de extensin en placa6.6 En que casos aplicaras utilizar diluciones?6.7 De los medios utilizados clasifcalos de acuerdo a su uso y composicin

7 . ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS.7.1 Discutir las ventajas y desventajas de cada una de las tcnicas de aislamiento.7.2 Analizar los resultados obtenidos en cada una de las tcnicas.

8. CONCLUSIONES8.1 Elabora tus conclusiones tomando en consideracin si se cumplieron los objetivos de la prctica y los resultados obtenidos.

9. BIBLIOGRAFA-NOM-092-SSA-1994 Bienes y Servicios. Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa.-Mac Faddin, Pruebas Bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica, Edit. MedicaPanamericana, 2002.-Koneman, Diagnstico Microbiolgico 3ra. Edicin, Edit. Panamericana 2003

PRCTICA No 6CONSERVACIN DE MICROORGANISMOS UNIDAD: III Nutricin y cultivo microbianoTEMA: 3.5 Mtodos de conservacin de microorganismos3.6 Resiembra en arena, glicerol, congelacin y liofilizacin

1.- Objetivo GeneralEl alumno aplicar algunos mtodos para la conservacin de microorganismos.

1.1 Objetivos especficos:Aplicar mtodos de conservacin para bacterias y hongos a corto plazoComprobar la viabilidad de los microorganismos a los que se les aplic algn mtodo de conservacin .

2.- INTRODUCCIN

Los microorganismos que son seleccionados por producir algn metabolito importante industrialmente no deben de sufrir cambios metablicos, por lo que es importante conservarlos, el mtodo elegido debe ser el adecuado para que no varen sus caractersticas genticas.

Existen varios mtodos para la conservacin de microorganismos donde la eleccin del mtodo estar encaminada a retener las caractersticas de la cepa, estas tcnicas se mencionan a continuacin as como algunas diferencias entre ellas. (Cada uno de estos mtodos presenta dos o ms variaciones):Durante un programa de aislamiento y seleccin han demostrado tener y mantener las caractersticas requeridas por la industria, se deben someter a un estudio estricto acerca de los cambios que pueden sufrir cuando se someten a algn procedimiento de conservacin; as pues, el mtodo de conservacin elegido juega un papel importante en la industria de fermentacin.

Parmetros para observar el funcionamiento del microorganismo. Criterios generales para seleccionar el medio:- Tiempo.- Tipo de microorganismo- Forma de reproduccin del microorganismo

Conservacin a Corto plazo

Resiembra en serie en t

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