Manual de Micro de Alimentos

Universidad Autónoma del Estado de México

Facultad de Química

Programa Educativo Químico en Alimentos

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Quinto Semestre

M. en A.S.S. Bertha Jáuregui Rodríguez

M. en C.A. Laura Alejandra Sánchez Paz

Septiembre 2014

MANUAL DE LABORATORIO MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

QUINTO SEMESTRE

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ÍNDICE

Pág. INTRODUCCIÓN 3

PROPÓSITO GENERAL. 4

PROPOSITOS ESPECIFICOS 4

REGLAMENTO DEL LABORATORIO 5

EVALUACION 6

PRACTICA No. 1 Cuantificación de Microorganismos Viables 7

PRACTICA No. 2 Cuantificación de Hongos y Levaduras 13

PRACTICA No. 3 Recuento de Bacterias Osmofílicas y Proteolíticas 17

PRACTICA No. 4 Determinación de organismos coliformes fecales y totales por NMP y recuento en placa 21

PRACTICA No. 5 Aislamiento e Identificación de Salmonella 27

PRACTICA No. 6 Aislamiento y Cuantificación de S. aureus 32

PRACTICA No. 7 Recuento de Bacillus cereus 36

PRACTICA No. 8 Evaluación de la efectividad de un desinfectante 40

ANEXO I Preparación de diluciones decimales 44

ANEXO II Composición de los medios de cultivo 45

BIBLIOGRAFÍA 53


QUINTO SEMESTRE

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INTRODUCCIÓN

Los alimentos no solo tienen un valor nutricio para quienes los consumen, éstos además proporcionan el medio ideal para la supervivencia y el crecimiento microbiano.

La microbiología de los alimentos cubre una gama muy diversa de microrganismos que participan de manera determinante en la calidad e inocuidad de un alimento.

Los objetivos principales de la Microbiología de los Alimentos son la detección y el control de patógenos, así como de los microorganismos responsables de la descomposición de los mismos.

El presente manual de prácticas de laboratorio de Microbiología de Alimentos describe algunas técnicas de aislamiento e identificación de microrganismos principalmente patógenos, basadas en las normas oficiales mexicanas que se encuentran en los alimentos y son causantes de enfermedades gastrointestinales.

La determinación de coliformes por el método del NMP (Número más probable), es un método normalizado para determinar la inocuidad de un alimento, utilizando a las bacterias coliformes como indicadores de contaminación, determina la higiene con la cual han sido manipulados los mismos.

Mediante la repetición de las diferentes técnicas de aislamiento e identificación se pretende desarrollar la habilidad en el manejo de los diferentes instrumentos del laboratorio de microbiología, la cuantificación, capacidad de interpretación de los resultados y la identificación de los tipos específicos de microrganismos por sus características morfológicas coloniales y su identificación bioquímica.

Con las ocho prácticas propuestas se pretende dar un panorama general de los principales métodos de identificación, aislamiento y cuantificación de los microrganismos indicadores o patógenos comúnmente encontrados en los alimentos. Complementa de manera práctica y refuerza los diferentes temas comprendidos en la Unidad de Aprendizaje de Microbiología de Alimentos del programa educativo de la licenciatura de Químico en Alimentos para quinto semestre.

Cabe mencionar que en este manual no aplican ejercicios demostrativos y se incluye un cuestionario al final de cada práctica como evaluación.


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PROPOSITO GENERAL DEL CURSO

Aplicar técnicas microbiológicas tanto cualitativas como cuantitativas en el área de los alimentos, basadas en normas oficiales mexicanas, así como interpretar los resultados obtenidos para conocer la calidad microbiológica de los alimentos.

PROPOSITOS ESPECIFICOS

Aplicar las técnicas de vaciado en placa, extensión en superficie y Miles y Misra en la cuantificación de microorganismos viables en alimentos y conocer su importancia sanitaria.

Cuantificar hongos y levaduras en alimentos por la técnica de vaciado en placa; así como diferenciar cualitativamente los géneros anteriores y conocer sus condiciones de crecimiento.

Cuantificar bacterias proteolíticas y osmofílicas en muestras con alto contenido de proteínas y sales respectivamente; así como conocer su incidencia e importancia en el área de alimentos.

Cuantificar microrganismos coliformes mediante la técnica del NMP (Número más probable), interpretar su presencia sanitaria en los alimentos.

Aislar e identificar las diferentes especies de Salmonella y conocer su importancia sanitaria en al análisis microbiológico de alimentos.

Aislar y cuantificar Staphylococcus aureus, así como describir su importancia sanitaria en el área de alimentos.

Aislar y cuantificar Bacillus cereus en alimentos e interpretar su importancia sanitaria.

Evaluar la efectividad de un desinfectante sobre los microorganismos que contiene una muestra alimenticia (lechuga).


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REGLAMENTO DE LABORATORIO

No se permitirá la entrada al laboratorio al alumno que no tenga puesta la bata.

El alumno que no venga provisto de su material personal no podrá permanecer en la práctica (cubrebocas, guantes, material de laboratorio).

Todos los objetos personales, material y ropa deberán colocarse en los cajones de las mesas de trabajo.

Queda estrictamente prohibido comer, fumar o en general llevarse cosas a la boca dentro del laboratorio.

Se debe evitar gritar dentro del laboratorio.

Limpiar y desinfectar las mesas del laboratorio antes y después de usarlas con benzal, alcohol al 70% o hipoclorito de sodio a 30 ppm.

Todo el material no contaminado como: algodón, papel, cerillos, etc., deben depositarse en los cestos de basura. No tire basura en el suelo, en los vertederos, ni la guarde en los cajones.

En caso de romper o derramar material contaminado, vierta benzal y deje actuar por lo menos 10 minutos antes de limpiar y avise al profesor.

Todo material que va a incubarse o desecharse deberá ser colocado en el sitio indicado por el profesor.

Etiquete todo el material que va a incubar o guardar en el refrigerador (con el número de equipo).

No derrame medio de cultivo con agar en los vertederos, ni en las tarjas. Después de esterilizar para ser desechado depositarlo en los botes de basura en bolsas de plástico.

Si utiliza colorantes para hacer tinciones, deberá evaporarlos.

Lavarse las manos antes de salir del laboratorio con abundante agua y jabón desinfectante.

Al encender el mechero, asegurarse de que no haya disolventes flamables.

Para desechar cualquier medio de cultivo o material contaminado, primero se deberá esterilizar por calor húmedo en autoclave (15 libras de presión, durante 15 minutos a 121 °C), después si es agar colocarlo como se menciona en el No. 11, y si es líquido verterlo en la tarja.

NOTA: Los puntos citados anteriormente deberán aplicarse durante el desarrollo de todas las prácticas.


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EVALUACIÓN

La calificación del laboratorio de Microbiología de Alimentos se llevará a cabo de la siguiente manera:

Exámenes parciales 50%

Exámenes por sesión 30%

Reportes laboratorio 20%

El reporte de laboratorio deberá contener:

Datos: Título y nombre de la práctica / Nombre integrantes y equipo

Resultados 20%

Discusión Resultados 40%

Conclusiones 20%

Cuestionario y bibliografía 20%

El reporte se entregará en la siguiente sesión una vez concluída la práctica.

NOTA:

El alumno deberá asistir al 80 % de las prácticas y cumplir al 100 % con el reglamento del laboratorio.

El Manual de laboratorio será considerado como bitácora y deberán anotarse en él las observaciones y resultados obtenidos, es individual.

El desempeño dentro del laboratorio será evaluado en el rubro de Exámenes de laboratorio


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PRACTICA No. 1

“RECUENTO DE MICROORGANISMOS VIABLES”

I. PROPOSITO

Aplicar los diferentes métodos para aislar y cuantificar microorganismos viables en una muestra de alimento, así como interpretar los resultados para establecer las condiciones sanitarias de los alimentos.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Dentro de la evaluación de la calidad de los alimentos es importante conocer la carga microbiana, que de alguna manera es un índice de las condiciones sanitarias con que se ha elaborado y manejado un producto, refleja también la calidad de la materia prima que se ha empleado para su elaboración y es un indicativo de la probable vida útil que puede tener el alimento.

El control microbiano permite conservar las características organolépticas, nutrimentales, salubres etc. de los alimentos para que así puedan ser consumidos por el hombre con seguridad.

En la evaluación de la cuenta de microorganismos viables en un alimento, no se diferencia si los microorganismos aislados son patógenos o no, con esta determinación únicamente se pone de manifiesto a un grupo de microorganismos que comparten la característica de crecer a una temperatura media de incubación de 35ºC por lo que se les conoce como mesófilos aerobios, cuenta total, cuenta en placa, cuenta estándar, siendo el termino más apropiado el primero por lo que implica la definición.

El recuento total indica el control sanitario ejercido en la producción, transporte y almacenamiento de los alimentos; y entre otras razones para la determinación es que casi todos los microorganismos patógenos son mesófilos. Las técnicas más empleadas para obtener la cuenta viable son: vaciado en placa y siembra en superficie, aunque


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actualmente se ha empleado y desarrollado la técnica de microfiltración por membrana que tiene aplicaciones muy específicas.

El fundamento de estas técnicas es que cada colonia proviene de una célula viable, sin embargo la colonia desarrollada puede provenir tanto de una unidad, como de cualquier otro número de ellas en la muestra original, razón por la cual se emplea el término de “unidades formadoras de colonia” (UFC).

III. EQUIPO Y MATERIAL

Cuenta colonias

Incubadora 35 0,2 ºC

Autoclave

Mechero

1 pipeta pasteur estéril

2 tubos de 16x150 con tapón de rosca con 9 cm3 del diluyente (agua peptonada)

1 frasco de dilución con 90 cm3 del diluyente

1 pipeta de 10.0 cm3 y 3 de 1.0 cm

3 envueltas para esterilizar

5 cajas Petri estériles desechables

4 cajas Petri estériles desechables traer el día de la práctica

4 varillas de vidrio en L estériles

1 matraz de 250 ml con tapón y gorro para esterilizar

Gradilla, perilla microbiológica

Toallitas húmedas desinfectantes

Jabón toalla para manos, trapo limpio.

IV. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO

Agar cuenta estándar (PCA) atemperado a 45 ºC (ver anexo II)

Agua peptonada al 0,1% ( ver anexo II)


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V. PROCEDIMIENTO

Método de vaciado en placa

1. Marcar las cajas con el número de equipo, el medio de cultivo, la muestra y la dilución.

2. Si es muestra sólida deberán pesarse 10 g de muestra y licuarse por 15 seg con agua peptonada (90 ml)

3. Si es muestra líquida se toman 10 ml y se vacían directamente al frasco de dilución que contiene 90 ml de agua peptonada.

4. Agitar en arco el mismo número de veces que los tubos siguientes

5. Tomar 1.0 cm3 del frasco de dilución y transferir a un tubo con 9.0 cm

3 de agua

peptonada, agitar y repetir la operación para tener diluciones sucesivas (1:100, 1:1000).

6. Tomar una alícuota de 1.0 ml de cada una de las dos últimas diluciones y colocar en cajas Petri, realizar por duplicado.

7. Vaciar en las cajas el medio agar cuenta estándar a 45ºC e incorporarlo a la alícuota de la muestra, con 6 movimientos rotatorios y en las cuatro direcciones, teniendo cuidado de no derramar o salpicar la tapa de la caja, dejar que solidifique el medio

8. Incubar las placas invertidas a 35 ºC +/- 1°C durante 24 a 48 h.

9. Transcurrido el tiempo de incubación efectuar el recuento de las colonias desarrolladas, tomar en consideración las cajas que tengan una cuenta entre 25 y 250 colonias ( ver NOM-092-SSA1-1994).


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10. Calcular la cantidad total de la población presente en la muestra multiplicando el número de colonias desarrolladas en la caja por el inverso de la dilución correspondiente.

11. Reportar el número de la población encontrada en la muestra como: mesófilos aerobios, Unidades Formadoras de Colonias por centímetro cúbico o gramo de muestra (según el tipo de muestra):

No. Colonias x inverso dilución = UFC / g ó ml

UFC/cm3 ó g, incubadas a 35°C +/- 1°C por 48 h en ACE(Agar Cuenta Estandar)

Extensión en superficie

1. Vaciar 15 cm3

de agar cuenta estándar en cada una de las cuatro cajas Petri y dejar gelificar.

2. Preparar diluciones de la muestra hasta obtener una dilución 1:1000.

3. Inocular de las dos últimas diluciones 0,1 cm3 sobre la superficie de una placa

por duplicado.

4. Extender con la varilla el inóculo en toda la superficie de la placa, pasando la varilla repetidas veces, utilizar una varilla para cada dilución.

5. Incubar las cajas durante 40 h a 35ºC +/- 1°C.

6. Seleccionar las cajas que muestren un máximo de 100 colonias para el conteo.

7. Multiplicar la cuenta por 10 y por la inversa de la dilución correspondiente.

8. Reportar como en el caso anterior. Considerar la alícuota tomada:

No. Colonias x inverso dilución x 10 = UFC / g ó ml


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Técnica de Miles y Misra

1. Preparar diluciones de la muestra como en los casos anteriores.

2. Vaciar 15 cm3 de agar cuenta estándar en cada una de las dos cajas Petri y

dejar gelificar.

3. Utilizando una caja para cada dilución, dividir el fondo en tres segmentos iguales. Dejar caer cuidadosamente una gota de cada dilución por segmento a distancia suficiente para evitar su confluencia, utilizar una pipeta Pasteur por cada dilución.

4. Incubar a 35ºC durante 48 h.

5. Contar las colonias en aquellas que muestren 20 colonias ó menos.

6. Obtener la media del recuento y multiplicar por 50 y por el inverso de la dilución correspondiente.

7. Reportar como en los casos anteriores.

VI. OBSERVACIONES Y RESULTADOS


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VII. CUESTIONARIO

1. ¿Qué importancia tiene en el área de alimentos determinar microorganismos viables?

2. ¿Qué grupos de microorganismos incluyen los mesófilos aerobios?

3. ¿Cuáles son los microorganismos viables?

4. ¿Cuál es el fundamento de la Técnica de Miles Misra?

5. ¿Para qué otros grupos microbianos son aplicables las técnicas de recuento utilizadas en la práctica?

6. ¿Por qué los resultados se reportan como UFC y no como colonias?

7. ¿En qué casos es de escaso valor determinar microorganismos mesófilos?

VIII. ACTIVIDAD DE SÍNTESIS

Hacer un cuadro sinóptico mencionando ventajas y desventajas del método de siembra en superficie comparado con vaciado en placa.

IX. REFERENCIAS

NOM-092-SSA1-1994. Bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa.


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PRACTICA No. 2

“AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE HONGOS Y LEVADURAS”

I. PROPOSITO

Aislar y cuantificar hongos y levaduras en una muestra alimenticia.


Una variedad de hongos microscópicos pueden desarrollarse y contaminar los alimentos o simplemente permanecer en ellos y adquirir un especial significado desde el punto de vista económico o sanitario. Las consecuencias de su actividad en los alimentos se manifiestan desde tres perspectivas:

La producción en ciertos casos de sustancias tóxicas para el hombre y los animales.

La descomposición o aparición de alteraciones en el alimento.

Efecto de sus productos metabólicos para desarrollar alimentos agradables para el consumidor y que tienen un sabor, olor y color característico.

El grupo de hongos comparte características entre sus miembros que los distinguen muy notoriamente de las bacterias. Algunas especies exhiben una gran diversificación de capacidades metabólicas y de adaptación a numerosos sustratos. La importancia de su estudio esta ampliamente justificado, ya que su presencia es indicativo de prácticas higiénicas defectuosas durante el almacenamiento o la elaboración de productos como ocurre con la leche en polvo, la mantequilla, los purés de jitomate, jugos de frutas y otros. En jugos crudos y pasteurizados, por ejemplo, cuentas elevadas indican un pobre saneamiento del equipo.

Simultáneamente con el recuento de hongos puede realizarse el de levaduras, ya que el medio de cultivo les proporciona buenas condiciones para su multiplicación.


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Las colonias de levaduras pueden aparecer sobre la superficie o en el seno de la gelosa; en el primer caso son circulares y de diámetro mayor a las bacterias; en el segundo caso aparecen como colonias estrelladas y algo más pequeñas.


Balanza granataria

Licuadora

Cuenta colonias

Incubadora 25 0.2 ºC

Autoclave

Potenciómetro

4 cajas Petri para traer el día de la práctica

3 tubos de 16x150

1 matraz de 250 ml para esterilizar

4 pipetas de 1.0 cm3 y una de 10.0 cm

3 envueltas para esterilizar

1 frasco de dilución


Agar Papa Dextrosa atemperado a 45ºC ( ver anexo II)

Agua peptonada al 0,1% ( ver anexo II)

Ácido tartárico al 10%

Buffers de pH 4 y 7


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V. PROCEDIMIENTO

1. Marcar las cajas con el número de equipo, el medio de cultivo, la muestra y la dilución.

2. Si es muestra sólida deberán pesarse 10 g de muestra y licuarse por 15 seg con agua peptonada (90 ml). Regresando el homogenado al frasco de dilución.

3. Si es muestra líquida se toman 10 ml y se vacían directamente al frasco de dilución que contiene 90 ml de agua peptonada.

4. Agitar en arco el mismo número de veces que los tubos siguientes

5. Tomar 1.0 cm3 del frasco de dilución y transferir a un tubo con 9.0 cm

3 de agua

peptonada, agitar y repetir la operación para tener diluciones sucesivas (1:100, 1:1000).

6. Acidificar el medio de agar papa dextrosa fundido y enfriado con solución de ácido tartárico hasta pH 3.5 previo a su empleo. (aprox. 1.0 ml)

7. Colocar por duplicado en cajas petri 1 cm3 de las dos últimas diluciones y vaciar

de 12 a 15 cm3 de medio de cultivo atemperado.

8. Incorporar la dilución en el medio de cultivo realizando movimientos circulares y laterales evitando derrames y salpicaduras en la tapa.

9. Dejar solidificar e incubar a 25ºC, durante 5 días.

10. Sin destapar las cajas efectuar el examen de las placas a los 3 días y realizar un recuento, si no existiera un número apreciable de colonias, practicar nuevamente la cuenta a los 5 días.

11. Reportar el número de UFC/ml ó g consultando la norma correspondiente.



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VII. CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es la importancia de la determinación de hongos y levaduras en alimentos?

2. ¿Cómo se realiza la determinación cualitativa de hongos y levaduras?

3. ¿Qué condiciones favorecen el crecimiento de hongos y levaduras?

4. Mencione tres géneros de hongos que puedan causar alteraciones en los alimentos:

5. ¿Por qué es necesario acidificar el medio PDA en esta determinación?


Escribe 5 diferencias entre hongos y bacterias en cuanto a su crecimiento en los medios de cultivo.

IX. REFERENCIAS

NOM-111-SSA1-1994. Bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.


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PRACTICA No. 3

“RECUENTO DE BACTERIAS OSMOFÍLICAS Y PROTEOLÍTICAS”

I. PROPOSITO

Aislar y cuantificar bacterias osmofílicas y proteolíticas de diferentes alimentos con alto contenido de lípidos y proteínas.


Los alimentos que contienen cantidades significativas de azúcar son susceptibles a sufrir contaminación principalmente por levaduras.

Estos microorganismos osmofílicos pueden crecer a altas concentraciones de azúcar, son los causantes de la contaminación en miel, chocolates, jugos concentrados de frutas. Las bacterias osmodúricas toleran altas concentraciones de azúcar pero no crecen en ellas. Entre los microorganismos osmofílicos tenemos a Saccharomyces rouxii, S. rouxii variedad polymorphus y S. mellis.

Algunos microorganismos utilizan las proteínas como fuente de nitrógeno y carbono, por ejemplo las bacterias proteolíticas pueden crecer en caldo nutritivo, en este medio los carbohidratos se encuentran ausentes o en pequeña cantidad. Las bacterias que tienen enzimas proteolíticas rompen peptonas, aminoácidos, el orden que se sigue en la degradación es: proteína a proteosa a polipéptidos a péptidos y a aminoácidos, el grupo amino se elimina del aminoácido por desaminación.

Las bacterias proteolíticas degradan carnes rojas, pollo y pescado principalmente.

Los organismos proteolíticos constituyen un grupo muy heterogéneo en el cual se pueden encontrar bacterias de los géneros: Clostridium, Bacillus, Proteus, Pseudomonas, como proteolíticos activos. Los microorganismos que efectúan hidrólisis de proteínas y fermentación se les conoce como ácido-proteolíticos por ejemplo Staphylococcus faecalis var licuefaciens y Micrococcus caseolyticus.


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Entre los hongos proteolíticos activos encontramos: Aspergillus, Penicillium, Mucor, etc. que en algunos casos se utilizan en la industria alimenticia por su capacidad de formar proteasas.


Cuenta colonias

6 pipetas de 1 y 2 pipetas de 10 cm3

8 cajas Petri para entregar

8 varillas de vidrio en L

2 frascos de dilución

4 tubos de 16 x 150 con tapón de rosca

Frascos de dilución


Traer leche descremada en polvo por grupo (100 g)

Agar Papa dextrosa

Agar leche descremada

Agua peptonada al 0,1%

V. PROCEDIMIENTO

Bacterias osmofílicas

1. Pesar 10 g de muestra proveniente de un alimento que contenga azúcar en abundancia

2. Adicionar 90 cm3 de diluyente.

3. Licuar u homogeneizar durante 15 seg y regresar al frasco de dilución si es sólido ó mezclar con movimientos en arco si es líquida la muestra.

4. Efectuar diluciones

5. Inocular 0,1 cm3 de las diluciones por siembra en superficie en cajas que

contengan agar Papa Dextrosa.


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6. Incubar a 32ºC durante 24 a 48 h si se sospecha de bacterias y a 25ºC durante 72 h si se sospecha de presencia de hongos y levaduras.

7. Contar las colonias osmofílicas

8. Reportar UFC por gramo o cm3 de alimento, reportar morfología colonial y

microscópica.

Bacterias proteolíticas

1. Pesar 10 g de la muestra.

2. Adicionar 90 cm3 de diluyente.

3. Licuar u homogeneizar como en el caso anterior.

4. Efectuar diluciones decimales.

5. Inocular 0,1 cm3 de las diluciones sobre la superficie de las cajas que contienen

agar leche descremada (ALD).

6. Sembrar por extensión en superficie utilizando varillas de vidrio

7. Incubar una serie de cajas en refrigeración a 4-8 ºC durante 10 días y la otra serie a 30ºC durante 24 a 48 h.

8. Contar las colonias típicas que son aquellas con halo transparente.

9. Reportar UFC por gramo o cm3 de alimento.


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VII. CUESTIONARIO

1. ¿Por qué se utiliza el método de extensión en superficie para éstos recuentos?

2. ¿Cuál es la importancia de estas determinaciones en alimentos?

3. Dos ejemplos de bacterias proteolíticas y osmofílicas más comunes en alimentos

4. ¿Por qué en el medio de cultivo se observa un halo transparente en las colonias características?


Menciona las características morfológicas de las bacterias osmofílicas y proteolíticas en los medios de cultivo selectivos.

IX. REFERENCIAS

ICMSF. Microrganismos de los alimentos 1. Técnicas de Análisis Microbiológico. Acribia España.


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PRACTICA No.4

“ DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS COLIFORMES FECALES Y

TOTALES POR NMP Y RECUENTO EN PLACA”

I. PROPOSITO

Determinar cuantitativamente la cantidad coliformes en un alimento.


El grupo de los organismos coliformes es el más utilizado en la microbiología de los alimentos como indicador de contaminación fecal o de prácticas higiénicas inadecuadas; esta determinación se ha utilizado desde 1892.

Los organismos coliformes constituyen un grupo heterogéneo con hábitat primordial intestinal para la mayoría de las especies que involucra. A fin de simplificar el manejo en el laboratorio, se ha establecido una definición en base a las características más constantes que exhibe la especie del grupo, Escherichia coli. Los microorganismos coliformes son bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o facultativamente anaerobios, que fermentan la lactosa con producción de gas dentro de las 48 h de incubación a 35ºC.

Para la determinación de coliformes una de las técnicas más utilizadas es la del número más probable, esta técnica descansa en una base estadística, matemática inobjetable, para expresar cuantitativamente la densidad de microorganismos en un material. La prueba consiste en inocular una serie de tubos con un medio de cultivo y algún dispositivo o indicador que permita poner de manifiesto un microorganismo o un grupo particular de ellos. (Para el caso de coliformes el dispositivo utilizado es la campana Durham para observar la producción de gas). Un cierto número de tubos se inocula con volúmenes definidos de la muestra, después de la incubación el número de tubos positivos se consulta en las tablas estadísticas.


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Con frecuencia en la aplicación de la técnica de NMP para un grupo particular de microorganismos involucra dos etapas aunque para la determinación completa se llevan a cabo tres:

a) Prueba presuntiva: los tubos positivos pueden ser el resultado de la actividad de los microorganismos en cuestión, pero también de otros con comportamiento similar. Lo que viene a ser la prueba presuntiva en la investigación de organismos coliformes, consiste en inocular alícuotas de la muestra de tubos de fermentación con caldo lactosado. En ello estos microorganismos proliferan fácilmente fermentando la lactosa y liberando anhídrido carbónico que en gran cantidad se acumula en la campana o tubo de Durham. Un efecto semejante puede ocurrir en ausencia de organismos coliformes como resultado de la acción sinérgica de dos tipos de bacterias; una capaz de fermentar la lactosa hasta ácido láctico y pirúvico; y otra que metaboliza estos ácidos generando un gas aldehídico y algunos ácidos menores.

b) Prueba confirmativa: En la cual los organismos coliformes en caso de existir, proliferan activamente en tanto que los falsos positivos serán inhibidos por la presencia de substancias selectivas antibacterianas adicionadas al medio de confirmación.

c) Prueba completa: La finalidad de esta etapa es identificar el género de coliforme presente en la muestra; lo anterior es posible gracias al metabolismo bacteriano específico de cada cepa y se lleva a cabo inoculando en cajas Petri con medios como el EMB y otras pruebas como son movilidad, citrato, indol y Voges Proskauer (VP).


Incubadora 35-37 0.2 ºC

Baño María a 44.5 0.2 ºC

4 pipetas de 1 cm3 y 1 pipeta de 10 cm

3


3 tubos de 16x150 c/tapón rosca (agua peptonada)

9 tubos de 16x150 c/tapón rosca y campana Durham (caldo lactosado)

6 tubos de 16x150 c/tapón rosca y campana Durham (caldo bilis verde brillante)

5 tubos de 16x150 c/tapón rosca y campana Durham (caldo EC)



4 cajas Petri traer el día de la práctica


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8 tubos de 13x100 con tapón rosca (pruebas bioquímicas)



Caldo lactosado

Caldo bilis verde brillante

Caldo EC

Agar rojo bilis violeta (RVBA)

RM-VP, Agar SIM, Agar Citrato

V. PROCEDIMIENTO

Determinación cuantitativa de coliformes por NMP

Prueba presuntiva

1. Efectuar diluciones decimales de las muestras en agua peptonada utilizando 10 g de muestra y de manera que las diluciones sean secuenciales.

2. Pipetear un centímetro cúbico de cada una de las diluciones del homogenizado del alimento en tubos de caldo lactosado, utilizar tres tubos para cada dilución.

3. Incubar los tubos a 35 ºC +/- 1°C durante 24 y 48 h.

Prueba confirmativa

1. Inocular 1 cm3 de caldo de los tubos positivos de la prueba presuntiva en caldo

EC para coliformes fecales e incubar a 44.5 °C+/- 0,2°C; registrar tubos positivos a las 24 y 48 h.

2. Inocular 1 cm3 de caldo de los tubos positivos de la prueba presuntiva en caldo

Bilis Lactosa Verde Brillante (BLVE) para coliformes totales e incubar a 35 °C +/- 0,5°C, registrar tubos positivos a las 24 y 48 h.

3. Anotar el número de tubos confirmados como positivos de organismos coliformes totales y fecales en cada dilución.

4. Consultar en la NOM-112-SSA1-1994 las tablas de NMP y buscar las diluciones correspondientes a los tubos positivos, anotar el NMP que corresponde a dichos tubos.


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Determinación de coliformes por vaciado en placa doble capa

1. Colocar en cajas Petri por duplicado 1 cm3 de la muestra líquida directa o de la

dilución primaria, utilizando una pipeta estéril.

2. Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una pipeta estéril diferente para cada dilución.

3. Verter de 15 a 20 cm3 del medio RVBA fundido y mantenido a 45 °C en baño de

agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo no debe exceder de 20 minutos.

4. Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio. Permitir que la mezcla solidifique dejando las placas reposar sobre una superficie horizontal y fría.

5. Preparar una caja control con 15 cm3 de medio.

6. Después de que la mezcla gelificó, verter aproximadamente 4 cm3 de medio

RVBA a 45 °C en la superficie del medio. Dejar solidificar.

7. Incubar a 35 +/- 1 °C por 24 h.

8. Realizar el conteo y multiplicar por el inverso de la dilución. Las colonias típicas son de color rojo oscuro, generalmente rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfología es semejante a lentes biconvexos con diámetro de 0,5 a 2,0 mm.

9. Reportar los resultados como UFC por cm3 de muestra.

Prueba completa

Diferenciación de coliformes

1. Inocular las placas de agar EMB con los tubos positivos de la prueba confirmativa.

2. Incubar a 35 +/- 1 °C durante 24 h.


QUINTO SEMESTRE

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3. A partir de las colonias aisladas, preparar frotes y teñir por Gram, las colonias sospechosas de coliformes.

4. Inocular con las cepas de bacilos Gram negativos los tubos que contienen los medios de las pruebas del IMViC.

5. Leer las reacciones de cada prueba.

6. Revisar en las tablas y reportar las pruebas bioquímicas, de acuerdo a los siguientes tiempos.

Rojo de metilo

3-5 días / 35-37ºC

SIM

24 h. /35-37ºC

Citrato

5-7 días / 35-37ºC

V P 48h / 35-37ºC

Las reacciones típicas de los coliformes en las pruebas IMViC son las siguientes:

Microorganismo I M V C

Escherichia coli + + - -

Klebsiella - - + + Enterobacter - - + + Citrobacter - - + +


OBSERVACIONES RESULTADOS

CT- UFC/g ó ml en Agar rojo violeta bilis, incubados a 35 +/- 1

oC por 24 +/- 2h

CT- NMP/g ó ml en caldo verde brillante a 35 +/- 0,5oC por 48 h CF – NMP/g ó ml en caldo EC a 44,5 +/- 0,2oC por 48


QUINTO SEMESTRE

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VII. CUESTIONARIO

1. Mencione los cuatro géneros considerados como coliformes así como sus características principales.

2. ¿Por qué es importante realizar tanto la prueba presuntiva como la confirmativa en la determinación de coliformes?

3. Escriba algunos parámetros que controlarías en un proceso industrial para evitar la contaminación por coliformes.

4. ¿Por qué en la determinación de coliformes por vaciado en placa se utiliza doble capa?

5. ¿Porqué los coliformes fecales en la prueba confirmativa se incuban a 44,5 +/- 0,2 °C y los totales a 35 +/- 0,5°C?


Investiga algunas enfermedades provocadas por microorganismos coliformes en alimentos.

IX. REFERENCIAS

NOM-112-SSA1-1994. Bienes y servicios. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número más probable.

NOM-113-SSA1-1994. Bienes y servicios. Método para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.

NOM-180-SSA1-1998. Salud ambiental. Agua para uso y consumo humano. Equipos de tratamiento de tipo doméstico. Requisitos sanitarios. Apéndice informativo B. Determinación de bacterias coliformes totales y coliformes fecales-método de filtración por membrana.


QUINTO SEMESTRE

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PRACTICA No. 5

“AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE Salmonella”

I. PROPOSITO

Aislar e identificar Salmonella en diferentes muestras de alimentos.


Salmonella spp es un género bacteriano, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, integrado por gérmenes de forma bacilar, no esporulados, habitualmente móviles, Gram negativos, aerobios-anaerobios facultativos, fermentan la glucosa con producción de gas, no fermentan la lactosa, reducen nitratos a nitritos y son citocromo-oxidasa negativos.

Todas las Salmonella pueden ser consideradas como potencialmente patógenas para el hombre. La única vía de entrada de estos microorganismos en el cuerpo humano es la oral, por lo que es de suma importancia el análisis de los alimentos para detectar su presencia. A pesar de todos los estudios realizados por diferentes investigadores, aún no ha sido posible desarrollar ningún método que pueda garantizar la recuperación de todos los serotipos de Salmonella a partir de los diferentes productos alimenticios sometidos a las variadas condiciones de preparación y conservación.

Los métodos para el aislamiento e identificación de Salmonella a partir de los alimentos pueden considerarse divididos en cinco etapas sucesivas:

1. Enriquecimiento no selectivo o pre-enriquecimiento.

2. Enriquecimiento selectivo.

3. Siembra en placa de medios sólidos selectivos y diferenciales.

4. Estudio de las características bioquímicas de las colonias sospechosas en los medios adecuados.

5. Análisis antigénico, somático y flagelar.


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Existen factores que favorecen la salmonelosis como son: alto consumo de alimentos preparados principalmente en las calles, inadecuado almacenamiento de los alimentos, ingesta de alimentos crudos o mal cocidos como carnes y huevo principalmente.

Los medios de cultivo selectivos para Salmonella pueden ser ligeramente selectivos (EMB), moderadamente selectivos (Agar Salmonella-Shigella) o fuertemente selectivos (Agar sulfito de bismuto).


1 Pipeta de 1.0 cm3


2 tubos de 16x150 (caldo Selenito Rappaport)


8 tubos de 13x100 etiquetados con MIO, TSI, LIA, Malonato (por duplicado)


Medio de pre-enriquecimiento: Caldo lactosado

Medios de enriquecimiento: Caldo Rappaport Vasiliadis

Caldo tetrationato

Medio de aislamiento: Agar Sulfito de Bismuto

Agar entérico Hecktoen

Agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD)

Pruebas bioquímicas Agar triple azúcar hierro (TSI) Lactosa, Sacarosa y glucosa

Agar lisina hierro (LIA)

Agar MIO (Movilidad, indol, ornitina)

Caldo malonato


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V. PROCEDIMIENTO

Pre-enriquecimiento

1. Homogenizar 25 g de muestra con 225 cm3 de caldo lactosado.

2. Incubar de 18-24 h a 35-37ºC.

Enriquecimiento

1. Pipetear 1 cm3 del cultivo de pre-enriquecimiento en 10 cm

3 de caldo Rappaport

Vasiliadis y 1 cm3 en 10 cm

3 de caldo tetrationato.

2. Incubar 18-24 horas a 35 +/- 1ºC, ó para alimentos fuertemente contaminados a 42°C

Siembra en placa en medios selectivos y diferenciales

1. Sembrar con una asa de los medios enriquecidos (Rappaport Vasiliadis y tetrationato) sobre la superficie de las diferentes placas de medios selectivos y diferenciales (XLD, Agar sulfito de bismuto y Agar entérico Hecktoen), con el fin de obtener colonias aisladas.

2. Incubar las placas de 35-37 ºC durante 24-48h

3. Observar las placas y escoger dos colonias sospechosas de cada medio.

Salmonella en Hektoen Salmonella en XLD Salmonella en Sulfito Bismuto

Identificación bioquímica para Salmonelas.

1. Sembrar las colonias sospechosas de Salmonella en los medios para la identificación bioquímica: TSI, LIA, MIO y Caldo Malonato.

2. Incubar a 35-37 ºC


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3. Leer las reacciones bioquímicas.

Los cultivos sospechosos de Salmonella presentan las siguientes reacciones típicas:

TSI: En el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no fermentación de la lactosa ni de la sacarosa; puede existir o no producción de H2S que da lugar al ennegrecimiento del agar.

LIA: Se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por descarboxilación de la lisina. Son negativos aquellos tubos que produzcan color amarillo en el fondo del tubo. Al igual que en el caso anterior puede existir o no producción de ácido sulfhídrico.

La reacción en caldo Malonato es negativa, es decir sin cambio de color. Una prueba positiva presenta un color azul.

En MIO la reacción de indol es negativa (sin cambio de color al agregar el reactivo de Kovacs) y la descarboxilación de la ornitina es positiva.


Informar presencia o ausencia de Salmonella por g ó ml de muestra.

VII. CUESTIONARIO

1. Escribe la clasificación de Salmonella según su adaptación a huéspedes.

2. ¿Cuántos serotipos diferentes de Salmonella se conocen? Menciona algunos.

3. ¿Por qué es importante determinar los serotipos de Salmonella?

4. Crees que puede haber presencia de Salmonella en una muestra de carne con baja cantidad de mesófilos y ausencia de coliformes fecales, SI - NO, por qué?

5. Menciona algunas características particulares del género Salmonella que las diferencia de los demás microorganismos.


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Investiga otros medios de cultivo que pueden utilizarse como medios de enriquecimiento y de aislamiento para Salmonella

IX. REFERENCIAS

NOM-114-SSA1-1994. Bienes y servicios. Aislamiento e identificación de Salmonella


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PRACTICA No. 6

“AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE Staphylococcus aureus”

I. PROPOSITO

Evaluar diferentes medios selectivos y diferenciales para el aislamiento y la cuantificación de Staphylococcus aureus en diferentes alimentos.


Para el recuento de S. aureus se han propuesto diversos medios específicos. Estos medios difieren principalmente en los agentes selectivos que contienen, entre los que destacan el telurito de potasio, el cloruro de litio, la azida sódica, la glicina y la polimixina B. También se utilizan concentraciones elevadas de cloruro de sodio, pero diversos investigadores han puesto de manifiesto que en medios conteniendo este agente se recupera un número bajo de S. aureus, especialmente si las células han sufrido algún tipo de stress tal como congelación, calentamiento o desecación.

En la actualidad gozan de gran aceptación los medios que contienen yema de huevo junto a uno o más de los agentes selectivos antes mencionados. En estos medios la mayoría de las cepas de S. aureus utilizan la lipoproteínas de la yema de huevo conocida como lipovitelina lo que da lugar a que, en torno y debajo de las colonias, aparezcan áreas de aclaramiento. Otro carácter propio de las reacciones en yema de huevo es la aparición de un precipitado blanco en las áreas total o parcialmente aclaradas que es debido a la formación de sales de calcio y magnesio de los ácidos grasos liberados. La mayoría de las cepas de S. aureus son coagulasa y termonucleasa positivos; pero a pesar de que estas reacciones son características de S. aureus hay cepas de estafilococos coagulasa positivos que no las presentan.


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1 matraz 250 ml para esterilizar

2 tubos de 16x150 tapón rosca



1 pipeta de 10 cm3 y 3 pipetas de 1,0 cm

3

2 tubos de 13x100 con tapón rosca envueltos para esterilizar

Traer 2 huevos por grupo


Agar Baird Parker

Agar Chapman o Estafiloco 110

Agar Sal y Manitol

Agar DNAsa

Plasma de conejo


V. PROCEDIMIENTO

1. Pesar 15 g de muestra y mezclarla con 135 cm3 de agua peptonada. Realizar

diluciones decimales y colocar 0.1 cm3 de cada dilución sobre una de las placas

de cada uno de los medios Baird Parker, sal y manitol y Chapman y extenderla con la varilla de vidrio sobre la superficie. (Usar una varilla para cada dilución).

2. Incubar las placas invertidas a 35 ºC durante 45-48 h

3. Después de 24 h seleccionar las placas que muestren entre 50 y 150 colonias aisladas, contar y marcar aquellas con características diferenciales del Staphylococcus aureus. Las colonias típicas en Baird Parker y Chapman son negras con un halo transparente y uno blanco después del área de transparencia.


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S. aureus en Chapman S aureus en Baird Parker

4. Incubar las placas 24 h más e incluir en el cómputo las colonias nuevas que reúnan las características de S. aureus.

5. Seleccionar la caja que contenga entre 50 y 150 colonias típicas, efectuar un frote y teñir por Gram las colonias escogidas (según siguiente tabla) y practicar las pruebas de coagulasa y termonucleasa.

No. de colonias

sospechosas

No. de colonias

a probar

0-50 3

51-100 5

101-150 7

Prueba de coagulasa

1. Sembrar las colonias a aprobar en 0,5 cm3 de caldo BHI, e incubar a 35°C por

24h

2. A una serie de tubos agregar 0,5 cm3 de plasma de conejo.

3. Inocular los tubos de plasma con una asada del caldo BHI.

4. Incubar en baño de agua a 35ºC y observar la formación de coágulo a las 2 y 4 horas, los tubos negativos descartarlos hasta las 24 h

5. Reportar positiva la prueba si hay formación de coágulo pequeño pero bien constituido o una coagulación total de la mezcla.


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Prueba de DNAsa

1. Sembrar las colonias sospechosas en las placas de Agar DNAsa.

2. Incubar a 35ºC durante 24 h

3. Observar un halo transparente alrededor de las colonias positivas al agregar HCl 0,1N


Calculo para reportar:

No. Colonias en placa x No. Colonias positivas x dilución x 10

No. Colonias probadas

VII. CUESTIONARIO

1. ¿Qué tipos de alimentos son susceptibles a contaminación por S. aureus?

2. Si tiene menos de 50 colonias sospechosas de S. aureus, ¿Cuántas debe probar?

3. ¿Por qué es importante el recuento de S. aureus en alimentos?


Escriba las características que presentan las colonias de S. aureus en cada medio de cultivo utilizado en la práctica, así mismo mencione si el medio de cultivo es selectivo o diferencial y que compuesto lo hace ser del tipo que elegiste.

IX. REFERENCIAS

NOM-115-SSA1-1994. Bienes y servicios. Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.


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PRACTICA No. 7

“RECUENTO DE Bacillus cereus”

I. PROPOSITO

Aislar y cuantificar B. cereus en una muestra de alimentos.


Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo formador de esporas, es móvil, aerobio, aunque también es capaz de crecer anaeróbicamente en medios complejos, la temperatura mínima de crecimiento es de 10 a 20 º C, la óptima de 30º a 35 ºC y la máxima de 35º- 45 ºC. Crece en un intervalo de pH de 4,9 a 9,3 y en una actividad acuosa mínima de 0,95.

Este microorganismo está ampliamente distribuido en la naturaleza, se encuentra en el suelo y en el polvo, se ha aislado de frutas, cereales, verduras, harinas, almidones, productos para pastelería, sopas, especias, leche cruda, pasteurizada y en polvo, cremas y budines, papas, salsas, entre otros. En la primera mitad del siglo diferentes informes en la literatura europea, mencionan a bacilos formadores de esporas en enfermedades trasmitidas por alimentos, sin embargo a partir de 1950 ha existido un incremento en el número de informes, en los cuales se establece a B. cereus como responsable de enfermedades trasmitidas por alimentos. En Europa es uno de los principales microorganismos causantes de gastroenteritis, en Estados Unidos se han reportado pocos brotes y en nuestro País se carece de datos en cuanto a la frecuencia con que se aísla de los alimentos, así como si ha causado o no brotes de gastroenteritis.

La gastroenteritis se manifiesta por un cuadro emético severo o un cuadro diarreico. El cuatro típico emético se presenta de 1 a 5 horas después de ingerir el alimento y se caracteriza por un ataque agudo de náuseas y vómito, dolor abdominal, diarrea ocasionalmente y no hay fiebre. El cuadro típico diarreico se presenta después de 6 a 12 horas de la ingestión del alimento y se caracteriza por la presencia de dolor


QUINTO SEMESTRE

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abdominal, diarrea profusa acuosa, tenesmo rectal, nauseas moderadas, con rara sensación de vómito, la fiebre no es común teniendo una duración de 12 a 18 h.

Las esporas de B. cereus sobreviven al procedimiento de cocción de los alimentos y sus células vegetativas pueden desarrollar rápidamente.

Se ha visto que se requiere un número elevado de microorganismos viables para causar la enfermedad (de 1010) lo cual se favorece en sitios donde se preparan alimentos en grandes cantidades (como guarderías, restaurantes, hospitales, centros de trabajo etc.) y se cocinan en recipientes muy grandes que dificultan la refrigeración, además de calentarse y recalentarse inadecuadamente. Cuando se encuentra presente el microorganismo en los alimentos y éste se encuentra en condiciones óptimas para su desarrollo en 10 h puede llegar a alcanzar el número adecuado para causar la enfermedad.



4 cajas de Petri


3 pipetas de 1,0 cm3 y 1 pipeta de 10 cm3

8 tubos de 13x 100 con tapón de rosca etiquetados como dice abajo *

2 tubos de 16x150 con tapón de rosca



Agar glucosa peptona de caseína

*Rojo de fenol más glucosa

*Rojo de fenol más sacarosa

*Rojo de fenol más glicerol

*Rojo de fenol más manitol

*Rojo de fenol más salicina

*Caldo nitratos

*Gelatina nutritiva

*Voges Proskauer


QUINTO SEMESTRE

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V. PROCEDIMIENTO

1. Pesar 10 gramos de muestra y colocarlos en un frasco con 90 cm3 de agua

peptonada al 0.1%

2. Preparar las diluciones decimales hasta 10-5 en tubos con 9 cm3 de agua

peptonada.

3. Inocular 0,1 cm3 de cada dilución sobre la superficie del medio de cultivo agar

glucosa peptona de caseína , y extender con varilla de vidrio.

4. Incubar a 30-32 ºC durante 24 h

5. Seleccionar para el recuento las placas que contengan un número de colonias que permitan observar con claridad las colonias características de este microrganismo.

6. Seleccionar algunas de las colonias características y sembrar en agar nutritivo.

7. Confirmar la presencia de éste microorganismo con pruebas bioquímicas.



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VII. CUESTIONARIO

1. Mencione otros dos medios de cultivo en los cuales es posible el aislamiento de Bacillus cereus.

2. Escriba las principales pruebas bioquímicas para la identificación de B. cereus, indicando como las presenta dicho microorganismo.

3. ¿Porqué B. cereus puede resistir los tratamientos térmicos?

4. En qué alimentos podemos encontrar B. cereus.


Describa la importancia toxicológica de la determinación de de B. cereus en alimentos

IX. REFERENCIAS

NOM-115-SSA1-1994. Bienes y servicios. Método para la determinación de B. cereus en alimentos.


QUINTO SEMESTRE

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PRACTICA No. 8

“EVALUACION DE LA EFECTIVIDAD DE UN DESINFECTANTE”

I. PROPOSITO

Determinar la eficacia de un desinfectante sobre los microorganismos en una muestra de lechuga.


La higiene de los alimentos implica una variedad de acciones, entre las cuales, el evitar la contaminación ocupa un lugar relevante. Cada fuente de contaminación que puede actuar sobre los alimentos presenta sus propias peculiaridades y por ello requiere de métodos especiales para lograr su control. Así ocurre con el agua, la tierra, la fauna, con los manipuladores o con el equipo y envase que finalmente habrán de contenerlos.

Existen procesos de lavado y desinfección, que utilizan sustancias y condiciones de tratamiento propio para cada necesidad en las distintas ramas de la industria de alimentos. Cuando las normas o recomendaciones para su aplicación se siguen con acierto, los resultados son claramente satisfactorios.

La desinfección consiste en la reducción en número de microorganismos y se requiere en las operaciones de la planta de alimentos en las cuales las superficies reúnen condiciones favorables para el crecimiento de microorganismos, los cuales a niveles significativos pueden ocasionar enfermedades y/o alteraciones de los productos.

Un desinfectante es el agente físico o químico capaz de reducir el número de microorganismos presentes en una superficie o alimento a un nivel que no de lugar a contaminación nociva.


QUINTO SEMESTRE

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Es importante que todo saneamiento sea precedido por una buena limpieza; de no ser así se limita la acción y eficacia de los desinfectantes. Se entiende por limpieza la eliminación de los residuos de alimentos, suciedad, grasa y otros materiales objetables, utilizando detergentes limpiadores y medios mecánicos apropiados para su eliminación.

Para que una desinfección sea efectiva la superficie a desinfectar debe estar limpia, el desinfectante debe entrar en contacto directo con la superficie, debe utilizarse la concentración adecuada de desinfectante y se debe proporcionar el tiempo suficiente para que actúe el desinfectante.

Los métodos de desinfección normalmente se encuentran dentro de los siguientes grupos:

Físicos: Vapor, agua caliente, UV, aire caliente.

Químicos: Cloro, yodo, peróxidos, compuestos cuaternarios de amonio.

El laboratorio proporciona un valioso recurso que permite evaluar satisfactoriamente la eficacia de la desinfección.


12 cajas Petri

3 frascos de dilución

2 matraces 250 ml para esterilizar

6 tubos 16x150

10 pipetas 1.0 cm3

Recipiente grande de plástico

Lechuga picada sin lavar

Desinfectante diferente por cada equipo


Agar cuenta estandar

Agar rojo violeta bilis



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V. PROCEDIMIENTO

1. Se pica una lechuga sin lavar y se pesan 10 g en un frasco de dilución con 90 cm

3 de agua peptonada (dilución 1:10), realizar diluciones hasta 1:100000 en

tubos con 9 cm3 de agua peptonada.

2. A la misma lechuga se le enjuagará con agua estéril, escurriendo el agua y se le agrega 90 cm

3 de agua peptonada (dilución 1:10) ; se harán diluciones hasta

1:1 000. Se adicionará un desinfectante comercial en cantidad y tiempo de acuerdo con las indicaciones del fabricante del producto.

3. Se escurre la solución y se le adicionan nuevamente 90 cm3 de agua peptonada

(dilución 1:10).

4. En cada uno de los casos se utilizarán las diluciones siguientes:

Mesófilos Organismos

Coliformes

Lechuga sucia 1:10 1:1000 1:100000

1:10 1:1 000 1:100 000

Lechuga lavada 1:10 1:1000

1:10 1:1 000

Lechuga desinfectada 1:10 1:10

8. 5.- Inocular 1 cm3 de cada dilución de las tres muestras en cajas Petri y agregar

de 12 a 15 cm3 de medio de cultivo Agar Cuenta Estándar. Dejar solidificar e

incubar a 35 °C 48 h.



QUINTO SEMESTRE

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VII. CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es la importancia de evaluar la actividad de un desinfectante?

2. Piensas que éste método se puede aplicar para evaluar el desinfectante sobre una superficie, ¿porqué?

3. ¿Cuál es la diferencia entre un sanitizante y un desinfectante?

4. ¿Qué factores se deben tomar en cuenta para la elección de un desinfectante?

5. ¿De qué manera influye la composición de los alimentos en la desinfección?


Escribe la clasificación de los desinfectantes.

Define los siguientes términos brevemente: limpieza, desinfección, detergente, surfactante, sanitización.

IX. REFERENCIAS

Brook. 2003. Microbiología de los microrganismos. Mc Graw Hill.


QUINTO SEMESTRE

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ANEXO I

Preparación de diluciones decimales: tiene como objeto efectuar diluciones progresivas que permitan realizar recuentos microbianos posteriores.

Técnica

Pesar asépticamente una porción representativa de la muestra, multiplicar los gramos obtenidos por 9 y el resultado dará los centímetros cúbicos de diluyente que tenemos que añadir. Esta corresponde a la solución madre (SM, 1:10, 10 –1).

Para realizar las diluciones decimales, tomamos con pipeta estéril 1 cm3 de la SM y la

trasferimos a un tubo de ensayo que contiene 9 cm3

del mismo diluyente que hemos utilizado para la preparación de la SM, obtenemos así la dilución 1:100, (10 –2).

Con una pipeta nueva tomamos 1 cm3 de la dilución 1:100 y lo trasferimos a otro tubo

con 9 cm3 de diluyente, obtenemos así la dilución 1:1 000 (10 -3) así sucesivamente hasta obtener las diluciones deseadas.

De esta forma se obtiene la serie de diluciones decimales que servirán para las determinaciones en las que es necesario obtener recuentos y para los cuales existen cantidades apreciables de microorganismos.


QUINTO SEMESTRE

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ANEXO II

“Composición de los medios de cultivo”

1. Caldo selenito cistina

INGREDIENTES CANTIDADES (g)

Polipeptona peptona 5

Lactosa 4

Na3PO4 10

Seleniato ácido de sodio 4

L-cistina 0,01

Agua destilada 1 000 cm3

Ajustar pH final a 7.

Suspender 23 g de medio deshidratado en 1000 cm3 de agua destilada y disolver.

Esterilizar por exposición del medio a flujo de vapores por 15 minutos.

2. Agar sulfito de bismuto


Polipeptona peptona 10

Extracto de carne 5

Dextrosa 5

Na2HPO4 4

FeSO4 0,3

BiSO4 (indicador) 8

Verde brillante 0,025

Agar 20

Agua destilada 100 cm3

pH final de 7,5. Disolver 52 g del polvo en 1 L de agua destilada. Cuando se haya obtenido una suspensión uniforme calentar con agitación frecuente por 1 minuto, enfriar a 45ºC.

3. Agua peptonada 0.1%


Peptona 1

Cloruro de sodio 8,5

Agua 1 000 cm3

Disolver los componentes en 1 L de agua. Ajustar pH con NaOH 1N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 cm

3 o en cualquier múltiplo de 9 según se requiera, esterilizar

por 15 minutos a 121 ºC.

NOTA: Para las soluciones de 1 y 10 % se agregará 1 y 10 gramos respectivamente de la solución de ácido tartárico y se aforará a 100 cm

3.


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4. Caldo lactosado


SIMPLE CONCENTRACION

DOBLE CONCENTRACION

Extracto de carne 3 6

Peptona de gelatina 5 10

Lactosa 5 10

Agua destilada 1 000 cm3 1 000 cm

3

Disolver los ingredientes en 1 L de agua, calentar si es necesario. Ajustar pH final, de tal manera que después de la esterilización sea de 6,9 a 25 ºC, distribuir en tubos, cada uno de los cuales debe tener una campana de fermentación. Esterilizar.

5. Caldo lactosa bilis verde brillante


Peptona 10

Lactosa 10

Sales biliares 20

Verde brillante 0,0133

Agua 1 000 cm3

Disolver los componentes en el agua, calentar si es necesario, ajustar el pH de tal manera que después de la esterilización sea de 7,2 a 25 ºC, distribuir el medio en cantidades de 10 cm3, conteniendo una campana de fermentación, esterilizar.

6. Agar triptona-extracto de levadura (Agar para Cuenta Estandar)


Extracto de levadura 2,5

Triptona 5,0

Agar 1,0

Agua 1 000 cm3

Suspender los componentes del medio deshidratado en 1 L de agua. Hervir hasta total disolución. Distribuir en recipientes y esterilizar.

7. Agar papa-dextrosa


Infusión de papa 200

Dextrosa 20

Agar 15

Agua 1 000 cm3

Suspender 39 g del medio deshidratado en 1000 cm3 de agua y calentar hasta

ebullición; distribuir en recipientes adecuados y esterilizar. Enfriar a 40-45 ºC y acidificar a pH de 3,5 con una disolución de ácido tartárico al 10 % (aproximadamente 1,4 cm

3 de

ácido por cada 100 cm3 de medio).


QUINTO SEMESTRE

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8. Caldo tetrationato


Proteosa peptona o triptona 5

Sales biliares 1

Carbonato de calcio 10

Tiosulfato de sodio pentahidratado

30


pH final: 7,0 ± 0,1. Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril.. Distribuir, agitando constantemente, en porciones de 10 cm

3, en recipientes estériles.

Guardar en refrigeración. Antes de usar el medio, agregar 20 cm3 de una solución

yodo-yoduro por 1000 cm3 de caldo y si se desea 10 cm3 de una solución al 1% de

verde brillante por 1000 cm3 de caldo. El medio una vez adicionado de yodo no debe

calentarse y debe usarse el mismo día de su preparación.

9. Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)


Xilosa 3,75

L-lisina 5

Lactosa 7,5

Sacarosa 7,5

Cloruro de sodio 5

Extracto de levadura 3

Rojo de fenol 0,08

Agar 15

Desoxicolato de sodio 2,5

Citrato férrico-amónico 0,8

Tiosulfato de sodio 0,8


pH final: 6,9 ± 0,2. Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada, y calentar en baño de agua a 55ºC, agitando frecuentemente, hasta disolución completa. Ajustar el pH. Enfriar a 50ºC y verter en cajas de Petri estériles. No se esterilice. El sobrecalentamiento produce una precipitación; la reactividad del medio puede ser satisfactoria, pero las colonias suelen ser muy pequeñas. El aspecto del medio es claro y de color rojo brillante.

10. Agar entérico Hektoen


Proteosa peptona 12


Lactosa 12

Sacarosa 12

Salicina 2

Sales biliares 9


QUINTO SEMESTRE

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Cloruro de sodio 5

Tiosulfato de sodio 5

Citrato amónico férrico 1,5

Azul de bromotimol 0,064

Fuscina ácida 0,1

Agar 13,5

Agua 1 000 cm3

pH final: 7,5 ± 0,2. Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir con agitación hasta completa disolución del agar. No sobrecalentar. Dejar enfriar a 55-60ºC y distribuir en cajas de Petri estériles en condiciones asépticas.

11. Agar de tres azúcares y hierro (TSI)


Peptona de carne 1

Peptona de caseína 1

Cloruro de sodio 0,5

Lactosa 1

Sacarosa 1

Glucosa 0,1

Agar 1,3

Rojo de fenol 2,5 mg

Sulfato ferroso amónico pentahidratado

20 mg

Tiosulfato de sodio 20 mg


pH final: 7,3 ± 0,2. Suspender los ingredientes en 100 ml de agua destilada. Calentar a ebullición, agitando ocasionalmente, hasta disolución completa. .Enfriar a 60ºC y ajustar el pH. Distribuir en volúmenes de 3 cm

3 en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar a

121ºC ± 1ºC durante 15 min. Inclinar los tubos de manera que el medio de cultivo en el fondo alcance una altura de 3 cm y una profundidad de 4 cm. El medio es de color rojo.

12. Agar de hierro y lisina (LIA)


Peptona de gelatina 0,5

Extracto de levadura 0,3

Glucosa 0,1

L-lisina 1

Citrato férrico-amónico 50 mg

Tiosulfato de sodio anhidro 4 mg

Púrpura de bromocresol 2 mg

Agar 1,5



QUINTO SEMESTRE

49

pH final: 6,7 ± 0,2. Suspender los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien, calentar hasta ebullición con agitación frecuente hasta conseguir la disolución completa. Ajustar el pH. Distribuir en volúmenes de 3 cm

3 en tubos de 13 x 100 mm,

con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante 12 min. Dejar que los tubos se enfríen en posición inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 4 cm y una superficie inclinada de 2 cm. El medio ya preparado es de color púrpura.

13. Caldo MR-VP (Rojo de Metilo-Voges Proskauer)


Peptona 7

Dextrosa 5

Difosfato de potasio 5


pH final: 6,9 ± 0,2.

Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta lograr una disolución completa. Ajustar el pH. Distribuir el medio en volúmenes de 3 cm

3 en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121ºC ±

1ºC durante 15 minutos.

14. Caldo Malonato



Sulfato de amonio 2

Fosfato dipotásico 0,6

Fosfato monopotásico 0,4

Cloruro de sodio 2

Malonato 3

Glucosa 0,250

Azul de bromotimol 0,250

Agua 1 000 cm3

pH final: 6,7 ± 0,2

Suspender los ingredientes en agua, mezclar y ajustar el pH. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm en cantidades de 3 cm

3. Esterilizar en autoclave a 121ºC ± 1ºC durante 15

minutos.

15. Agar-Rojo- Violeta-Bilis-Lactosa (RVBA)


Peptona 7


Lactosa 10

Sales biliares 1,5

Cloruro de sodio 5


QUINTO SEMESTRE

50

Rojo neutro 0,03

Cristal violeta 0,002

Agar 15

Agua 1 000 cm3

Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos. Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7,4 con ácido clorhídrico 0,1N o con hidróxido de sodio 0,1N a 25° C, de forma que después del calentamiento se mantenga en este valor. Calentar con agitación constante y hervir durante 2 minutos. Enfriar inmediatamente el medio en un baño de agua hasta que llegue a 45°C. Evitar el sobrecalentamiento del medio No debe esterilizarse en autoclave. Usar el medio dentro de las tres primeras horas después de su preparación.

16. Medio base de Baird-Parker


Triptona 10


Extracto de carne 5

Glicina 12

Cloruro de litio 5

Piruvato de sodio 10

Agar 20

Agua 1 000 cm3

pH final 10

Disolver los ingredientes o el agar base en agua y calentar con agitación constante y hervir durante 1 min. Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 minutos. Enfriar y mantener el medio a 45ºC.

17. Solución de Telurito


Telurito de potasio 1

Agua 100 cm3

Disolver el telurito de potasio en agua y esterilizar. La solución puede ser almacenada por varios meses a temperatura de 0 a 5ºC.

18. Plasma de conejo

Emplear plasma de conejo deshidratado o rehidratado siguiendo las instrucciones del fabricante y agregar ácido etilendiaminotetracético (EDTA) en solución al 0,1% en plasma rehidratado. Si se utiliza plasma deshidratado diluir con agua estéril en proporción de 1:3.


QUINTO SEMESTRE

51

Puede emplearse plasma de conejo liofilizado adicionado de EDTA. No debe emplearse sangre citratada.

19. Agar DNAsa


ADN 2

Peptona tripticase 15

Peptona Phytona 5

Cloruro de sodio 5

Agar 15


pH final 7.3 .

Mezclar, calentar agitando con frecuencia y hervir durante un minuto. Distribuir y esterilizar.

20. Agar de Sal y Manitol


Extracto de carne de res 1

Peptona Polipeptona 10

Cloruro de sodio 75

D-Manitol 10

Agar 15

Rojo de fenol 0.025


pH final 7.4. Mezclar los ingredientes; calentar agitando frecuentemente, hervir durante un minuto, distribuir y esterilizar.

21. Agar Chapman Stone



Peptona tripticase 10

Gelatina 30

D-Manitol 10

Cloruro de sodio 55

Sulfato de amonio 75

Fosfato dipotàsico 5

Agar 15


pH final 7.


QUINTO SEMESTRE

52

22. Caldo EC


Peptona Tripticase 20

Lactosa 5

Mezcla de sales biliares 1,5

Fosfato dipotàsico 4

Fosfato monopotàsico 1,5

Cloruro de sodio 5


23. Base de Caldo Rojo de Fenol


Peptona Tripticase 10

Cloruro de sodio 5

Rojo de fenol 0,018


NOTA: Los ingredientes se mezclan y para pruebas específicas se le puede agregar de 5 a 10 g de algún carbohidrato.

24. Gelatina Nutritiva


Peptona Gelysate 5

Extracto de carne de res 3

Gelatina 120


25. Caldo de Nitrato Trypticase (Indol Nitrito)


Peptona trypticase 20

Fosfato disódico 2

Dextrosa 1

Agar 1

Nitrato de potasio 1

Agua 1 000 cm3


QUINTO SEMESTRE

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BIBLIOGRAFÍA

1. Manual de laboratorio de Microbiología Sanitaria. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. IPN. 2ª Edición 2000.

2. ICMSF. Microorganisms in foods. Backie Academic Profesional. 1999.

3. ICMSF. Ecología microbiana de los alimentos Vol. I. Editorial Acribia. 1980.

4. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis microbiológicos. Vol. Editorial Acribia 2ª edición, 1982.

5. Torres Vitela Ma. Refugio. Agentes patógenos transmitidos por alimentos. Vol. I. y II Universidad de Guadalajara. 1999.

6. Hans-Jürgen Sinell. Introducción a la higiene de los alimentos. Editorial Acribia. 1981.

7. Fernández Escartin Eduardo. Microbiología Sanitaria. Vol. I Universidad de Guadalajara. 1981.

8. Normas Oficiales Mexicanas indicadas en cada practica.

9. Microbiology Manual, Merck, 2000.

10. Mac Faddin, Pruebas Bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica, Editorial Médica Panamericana, 1984.

11. Versión para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD). Fac. Química UNAM

12. Camacho A. , M Giles, et. al. Técnicas para el análisis microbiológico de alimentos. 2ª ed. Fac. Química UNAM. 2009.

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