Manual de prácticas de Bioquímica vegetal

Agronomía

Por:

MsC. Marcela Uribe Lastra

Corporación Universitaria Santa Rosa de cabal, UNISARC

2011

PRESENTACIÓN

La enseñanza de las ciencias naturales pretende dar unas bases científicas que le permitan a los estudiantes enlazar los conceptos teóricos con el quehacer diario, para lograr esto se requiere de herramientas metodológicas que permitan el acercamiento entre la teoría y la práctica.

El objetivo principal de este manual es describir los protocolos de las prácticas de laboratorio de Bioquímica vegetal, de una manera simple, para los estudiantes de Agronomía, con el fin de incentivarlos hacia el estudio de las ciencia básicas de un modo práctico y sencillo y que incentive en estos el interés natural que permita enlazar tanto la biología como la química, dos ciencias indispensables en el entendimiento de el funcionamiento de la vida.

Marcela Uribe Lastra

Químico MsC

REGLAS DE COMPORTAMIENTO Y SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

En esta introducción se pretende que los estudiantes tomen contacto con el laboratorio, para lo cual se indican las normas generales de comportamiento en el mismo, reglas de seguridad y normas generales para la realización de las prácticas.

Normas generales de comportamiento

1. El estudiante debe leer y estudiar con anticipación las experiencias que se realizaran en el laboratorio, para lograr esto es importante la elaboración del pre-informe.

2. Se deberá utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio y cabello recogido (bata preferentemente de algodón y de mangas largas, zapatos cerrados, evitando el uso de accesorios colgantes).

3. El estudiante debe tener la guía de la práctica y un cuaderno donde hacer las anotaciones.

4. Durante el desarrollo de las prácticas no se podrá salir del laboratorio sin consultarle al profesor.

5. No se deberán realizar pruebas diferentes a las indicadas en la guía, deben ceñirse a los procedimientos descritos en la misma

Reglas de seguridad

1. En el laboratorio no está permitido comer, beber o fumar.

2. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de la zona que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes.

3. No se permitirá pipetear con la boca

4. Se tomaran especiales precauciones la trabajar con ácidos, bases o sustancias peligrosas para evitar accidentes.

5. Si fuera necesario calentar el contenido de un tubo de ensayo a la llama, se hará con el tubo algo inclinado y con la boca del mismo dirigida hacia un lugar donde no se encuentre ninguna persona.

6. Los residuos líquidos se verterán en las pilas del fregadero y los sólidos se depositaran en los recipientes dispuestos para tal fin.

7. Si se produce algún accidente, avisar rápidamente al profesor.

ELABORACION DE UN INFORME DE LABORATORIO (TIPO ARTÍCULO

CIENTIFICO)

1. Titulo: Debe ser el mismo de la guía de laboratorio. 2. Autores: Nombres y apellidos de los integrantes del grupo de laboratorio, especificar en pie de página datos como la carrera que estudia, el semestre que cursa y el correo electrónico. Introducción: Consiste en una revisión sobre el tema tratado en el laboratorio y debe estar igualmente relacionada con los objetivos de la práctica. Debe ser breve, máximo de media página. No pude ser la misma que aparece en la guía. 4. Materiales y métodos: Consiste en contar en forma organizada el procedimiento que usted realizó durante la práctica, por lo tanto deben estar escritos en pasado. Los materiales (reactivos, instrumentos, muestras, entre otros) se van nombrando a medida que el método se describe, por lo tanto no se deben separar los materiales de los métodos. Absténgase de hacer comentarios como: la profesora nos entregó…… ó la monitora dijo…… 5. Resultados y discusión: Corresponde al reporte y análisis de las observaciones que usted hizo durante el laboratorio. Es la parte más importante del informe. Para ello usted deba apoyarse en la bibliografía tratando de dar una explicación lógica a lo observado en la práctica. La bibliografía utilizada debe ir reportada en el texto por ejemplo si usted extrae un párrafo del libro de Villee, al final de este usted debe poner entre paréntesis el autor y el año de la siguiente forma: (Villee, 2001). Solo deben ir aquí estos datos, el nombre de libro, la editorial, las páginas y la demás información van en la bibliografía. Cuando se trata de dos autores debe ir los dos por ejemplo (Jensen y Salisbury, 1994) cuando son más de dos autores la referencia se hace así: (Alberts et al., 1996) Se debe analizar cada uno de los resultados. Sus figuras y tablas deben estar enumeradas, por lo que usted debe citarlas a la hora de hacer el análisis. 6. Conclusiones: Son frases cortas que se refieren a sus resultados y discusión, por lo que deben ser redactadas con sus propias palabras. No se salga del contexto. 7. Bibliografía: Debe hacerse de la siguiente manera: Apellido de cada autor, seguido por las iniciales del nombre. Luego el título del libro ó del artículo, luego el año de publicación, la edición, la editorial, el lugar de publicación y las páginas consultadas. Ejemplo: Villee C.A. 2004. Biología, Octava edición. NOTA: Es importante que el formato del documento siga las norma ICONTEC y sea en dos columnas

1. RECONOCIMIENTO DE LOS CARBOHIDRATOS

INTRODUCCION

Los carbohidratos constituyen la mayor parte de la materia orgánica de la Tierra a causa de sus variadas funciones en todos los seres vivos. En primer lugar, los carbohidratos sirven como almacén o transferencia de energía, son combustibles e intermediarios metabólicos, en general, son sustancias de reserva y estructurales. El almidón en las plantas y el glucógeno en los animales son dos polisacáridos que rápidamente pueden movilizarse para liberar glucosa, el combustible primordial para generar energía. En segundo lugar, los azúcares ribosa y desoxirribosa forman parte de la estructura del ARN y del ADN. En tercer lugar, los polisacáridos son los elementos estructurales de las paredes celulares de bacterias y plantas, y del exoesqueleto de los artrópodos y de crustáceos. De hecho, la celulosa, el principal componente de las paredes celulares de las plantas, es el compuesto orgánico más abundante de la biosfera. En cuarto lugar, los carbohidratos están unidos a muchas proteínas, lípidos y metabolitos secundarios. Unidades de azúcar se encuentran unidas a las anticianidinas para poder translocarse a través del floema de los vegetales y proporcionar la coloración a flores y algunos frutos.

Clasificación de los carbohidratos

Monosacáridos Oligosacáridos Polisacáridos

Pentosas:

xilosa, arabinosa, ribosa

Disacáridos:

lactosa, sacarosa, maltosa

Homopolisacáridos: almidón,

glucógeno, celulosa

Hexosas:

aldohexosas:

Glucosa, galactosa

Cetohexosas: fructosa

Trisacáridos: rafinosa

Heteropolisacáridos:

hemicelulosa, pectinas

Clasificación en función de la distribución de los carbohidratos en la naturaleza En animales En plantas

Reserva energética: glucógeno

En ácidos nucleicos: D-ribosa

Azúcar de la sangre: D-glucosa

Azúcar de la leche: lactosa

Azúcares de los antígenos de los

grupos sanguíneos: A, B, O

Reserva energética: almidón, inulina y hemicelulosa

Producto de la fotosíntesis: D-glucosa

Productos de degradación: gomas y mucílagos.

Productos varios: glucósidos de metabolitos secundarios

En ácidos nucleicos: D-ribosa

Elicitores procedentes de patógenos o célula huésped:

oligosacarinas

OBJETIVOS

Caracterizar cualitativamente los carbohidratos de acuerdo con su reactividad en presencia de reactivos específicos

MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de ensayo Pinzas para tubo de ensayo Gradillas Vasos de precipitados Mechero, trípode y malla Pipetas graduadas Reactivo de Fehling

Reactivo de Tollens Reactivo de Benedict Lugol Solución de glucosa 0,1 M Solución de fructosa 0,1 M Solución de sacarosa 0,1 M Solución de almidón 0,1 M

PROCEDIMIENTO Pruebas para azúcares reductores: Prueba de Fehling

Mezcle en un beaker 4 ml de reactivo de Fehling A con 4 ml de reactivo de Fehling B, agite, en 4 tubos de ensayo ponga 1 ml de las soluciones de carbohidratos a evaluar y añada a cada uno 2 ml de la mezcla de Fehling A y B, caliente los tubos de ensayo en baño maría durante cinco minutos y observe.

Prueba de Tollens

Ponga en diferentes tubos de ensayo 2 ml de las soluciones de los carbohidratos a

evaluar, añada 1 ml de reactivo de Tollens, agite y caliente en baño maría durante 10

minutos, observe cambios de color.

Prueba de Benedict

Ponga en los tubos de ensayo 2 ml del reactivo de Benedict, luego agregue las soluciones

de los carbohidratos a evaluar, agite y ponga en baño maría durante 5 minutos y observe

cambios de color.

Prueba para polisacáridos

Prueba de yodo

Ponga en diferentes tubos de ensayo 2 ml de las soluciones de los carbohidratos a

evaluar, añada a cada uno 5 gotas de solución de lugol, agite y observe cambios de color.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué son los azúcares reductores y no reductores mencione 3 de cada uno? 2. Defina y dibuje las estructuras químicas de la glucosa, la fructosa, la sacarosa y la

celulosa 3. Investigue los componentes de los reactivos a utilizar en la práctica: Fehling A ,

Fehling B, Tollens y Benedict 4. Investigue los mecanismos de reacción de las pruebas de Fehling, Tollens,

benedict y la prueba de yodo. 5. ¿Qué aplicaciones prácticas tienen estas pruebas? 6. ¿Cuál es la importancia energética del almidon? 7. Elabore una tabla resumen donde serán registrados los resultados obtenidos en

cada una de las pruebas para su posterior análisis.

BIBLIOGRAFIA

Plummer, D. 1985. Bioquímica Práctica. 5ª Edición. Editorial McGraw Hill Latinoamericana S.A.. Bogotá. 225. VARGAS, W.1985 Fundamento de Ciencia Alimentaria. 2ª edición. Universidad Nacional de Colombia. VERA J.A. 1990. Guía para el laboratorio de Química de Alimentos. Unidad universitaria del Sur de Bogotá.

2. PROPIEDADES DE LOS LÍPIDOS

INTRODUCCIÓN

Los lípidos constituyen un grupo químicamente diverso de compuestos cuya característica común y definitoria es su insolubilidad en agua. Las funciones biológicas de los lípidos son igualmente diversas. En muchos organismos las grasas y los aceites son las formas principales de almacenamiento energético, mientras que los fosfolípidos y los esteroles constituyen la masa de las membranas biológicas. Otros lípidos, aún estando presentes en cantidades relativamente pequeñas, juegan papeles cruciales como agentes emulsionantes, mensajeros intracelulares y transportadores.

Las grasas reaccionan en caliente con el hidróxido sódico o potásico descomponiéndose en los dos elementos que la forman: glicerina y los ácidos grasos. Estos se combinan con los iones sodio o potasio del hidróxido para dar jabones, que son en definitiva las sales sódicas o potásicas de los ácidos grasos. A este proceso se le conoce como saponificación y puede representarse mediante la siguiente reacción:

A parte de la saponificación, otra característica de las grasas es que son insolubles en

agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en pequeñísimas gotitas formando

una "emulsión" de aspecto lechoso, que es transitoria, pues desaparece en reposo, por

reagrupación de las gotitas de grasa en una capa que por su menor densidad se sitúa

sobre la de agua. Por el contrario, las grasas son solubles en los llamados disolventes

orgánicos como el éter, benceno, xilol, cloroformo, etc.

Las moléculas de agua se unen entre sí gracias a las cargas positivas y negativas de

oxígenos e hidrógenos respectivamente que se atraen formando grupos OH. En los lípidos

no existen estos grupos, pues están formados básicamente por C y H, y por esto mismo

no son miscibles en agua.

Por otro lado, es pertinente definir una molécula tensoactiva. Esta se caracteriza por tener

una cabeza hidrofílica y una cola hidrofóbica. En el caso de los jabones y detergentes, las

moléculas tensoactivas son sus iones carboxilados RCCOˉ. Por otro lado, las fuerzas de

tensión superficial son aquellas que tienden a disminuir la superficie libre del líquido que

se forma entre el agua y el aire. Durante el lavado de grasas, los jabones y detergentes

disminuyen esta tensión superficial rodeando la grasa, orientando su extremo hidrofílico

hacia el agua.

OBJETIVOS

Determinar la solubilidad de los lípidos en diferentes en solventes polares y

apolares.

Analizar evaluar las diferentes variables correlacionadas con el proceso de

saponificación.

MATERIALES Y REACTIVOS

Acetona Cloroformo Etanol Éter de petróleo Hidróxido de sodio al 30% Metanol NaCl

Vasos de precipitado de 250 ml Varilla de agitación Plancha de calentamiento Pipetas graduadas de 5 y 10 ml Tubos de ensayo Gradilla Aceite vegetal

PROCEDIMIENTO

Prueba de solubilidad de lípidos

Enumere 5 tubos de ensayo y adicióneles lo siguiente:

- Tubo 1: 1ml de agua destilada - Tubo 2: 1ml de acetona - Tubo 3: 1ml de etanol - Tubo 4: 1ml de cloroformo - Tubo 5: 1ml de éter

A continuación agréguele a cada uno de ellos una gota de aceite vegetal agite vigorosamente y anote sus observaciones.

Reacción de saponificación: Transfiera 12ml de aceite de origen vegetal (girasol, oliva, soya,) a un beaker de 150 ml y adicione 15 ml de una solución de NaOH al 30% y 5 ml de metanol. Agite la mezcla y caliente con llama moderada. Continúe el calentamiento de la mezcla, hasta cuando esta ebulla. Mantenga el volumen de la solución constante mediante la adición, cuando sea necesario, de una mezcla de agua metanol (1:1).

La muestra NO debe ebullir hasta la sequedad. Agite continuamente para evitar que el material se adhiera a las paredes del recipiente. Si el material se adhiere a las paredes del beaker, debe devolverse a la solución con ayuda del agitador. Mientras la saponificación continua, prepare una solución salina concentrada (100gr de NaCl en 300 ml de agua, filtrar el exceso de NaCl). Una vez la saponificación se ha completado (después de 1 hora aproximadamente) transfiera la mezcla caliente, con agitación, al beaker que contiene la solución de NaCl concentrada. Agite la mezcla vigorosamente por unos minutos y deje reposar toda la noche.

CUESTIONARIO

1. Diseñe una tabla para registrar los datos de la prueba de solubilidad, teniendo en cuenta que el aceite puede ser soluble, parcialmente soluble ó insoluble en los diferentes solventes probados.

2. Mediante un diagrama explique de que depende la solubilidad de los lípidos 3. ¿Qué es el índice de saponificación, qué importancia tiene y como se determina? 4. ¿Porque la temperatura de reacción de la saponificación debe ser baja? 5. ¿Qué es el efecto de salado? ¿Por qué se separa el jabón mediante éste proceso? 6. A que se debe la acción limpiadora de los jabones y detergentes

BIBLIOGRAFÍA

Hart H., Hart D.J, Craine L.E. Química Orgánica. Novena edición. Editorial Mc Graw Hill.

México. 1995.

Kent V. Jabones y detergentes Revista de divulgación de I.E.S. N17, 2002, Madrid.

Vargas, W.1985. Fundamento de Ciencia Alimentaria. 2ª edición. Universidad Nacional de Colombia. Bogotá White A. Principios de Bioquímica. Segunda edición. Editorial Mac Graw Hill. 1983. España.

3. ACTIVIDAD ENZIMATICA

INTRODUCCION

Las enzimas son catalizadores biológicos que aceleran las reacciones metabólicas de los seres vivos. Resulta, por lo menos en lo que concierne su parte proteica, de una síntesis proteica a nivel celular. Existe al menos una enzima diferente por reacción catalizada, lo que representa miles de enzimas en un mismo organismo. Las hay extracelulares e intracelulares.

En cuanto a la catálisis enzimática, esta se da por la formación de un sitio activo. Este sitio es una región privilegiada que interactúa con substratos que a su vez se transforman en productos. El sitio activo está constituido por aminoácidos de 4 tipos: de contacto, auxiliares, colaboradores y no colaboradores. Son los grupos funcionales radicales de los aminoácidos los que intervienen directamente en la catálisis. Su participación se debe a su capacidad para transferir electrones (carácter nucleofílico) y protones (carácter ácido-básico).

La estructura terciaria es primordial para la catálisis. Permite la formación del sitio activo ya que aproxima los aminoácidos que lo constituyen. Esta conformación juega a la vez un rol importante en la protección del sitio activo, y se adapta con exactitud al substrato.

La mayoría de las enzimas son de naturaleza proteica y están sujetas a el fenómeno de la desnaturalización, si la forma de la enzima es alterada por algún factor externo (por ejemplo, aplicándole calor, ácidos o álcalis), no es capaz de cumplir su función celular.

La reacción enzimática in vivo o in Vitro puede inhibirse utilizando inhibidores que pueden ser o no ser análogos estructurales de los verdaderos substratos de la enzima. De acuerdo a la complejidad de los complejos que forman en presencia de la enzima y/o del substrato, y de la modificación cinética que generen, los inhibidores son calificados como competitivos, incompetitivos, no competitivos o mixtos. En presencia de una enzima (E) y su sustrato (S), un inhibidor (I) puede formar complejos binarios complejos EI o ternarios ESI. Solo el complejo ES es productivo.

Cuando el inhibidor se fija a la enzima libre formando el complejo EI se habla de inhibición competitiva. Cuando se fija sobre el complejo ES es incompetitivo. Cuando se fija con afinidades diferentes a E y a ES es mixto y cuando lo hace con la misma afinidad por ambos es no competitivo.

OBJETIVOS

Conocer la actividad de la catalasa en tejidos vegetales y animales Evidenciar la hidrólisis del almidón por acción de la amilasa presente en la saliva Evidenciar la hidrólisis de la sacarosa por acción de la glucosidasa de las levaduras Demostrar la presencia y definir el modo de acción de otros sistemas enzimáticos

tales como polifenoloxidasas.

MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos de ensayo Vasos de precipitado de 250 ml

Gradilla Plancha de calentamiento Pinzas para tubo de ensayo Pipetas graduadas de 2, 5 y 10 ml Caja de petri Balanza Solución de almidón Reactivos de Fehling A y B

Lugol Metabisulfito de sodio 1%

Zanahoria Hígado Manzana Rábano Levadura Acido clorhídrico

PROCEDIMIENTO

Presencia de catalasa en tejidos animales y vegetales Corte dos trozos de zanahoria y dos trozos de hígado introduzca cada muestra en un tubo de ensayo, ponga 3 ml de agua destilada y ponga a hervir un tubo con zanahoria y otro tubo con hígado en un baño maría durante 15 minutos, pasado este tiempo deje enfriar el tubo, retire el agua y adicione 10 gotas de peróxido de hidrógeno (H2O2) a cada tubo, observe y registre lo observado en la siguiente tabla: Tabla 1.Acción de la catalasa

Reacción con el H2O2

Hígado hervido

Hígado sin hervir

Zanahoria hervida

Zanahoria sin hervir

Hidrólisis del almidón por acción de la amilasa Marque 6 tubos de ensayo y realice las siguientes preparaciones:

- Tubos 1 y 2: 2 ml de solución de almidón

- Tubos 3 y 4: 2 ml se solución de almidón y 1 ml de saliva

- Tubos 5 y 6: 2 ml de solución de almidón y 1,5 ml de HCl Deje los tubos en reposo durante 30 minutos y adicione a los tubos 1,3 y 5 reactivo de Fehling A y B previamente mezclados y a los tubos 2,4 y 6 lugol. Reporte las observaciones en la siguiente tabla: Tabla 2. Hidrólisis del almidón

Lugol Felhing

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubo 5

Tubo 6

Hidrólisis de la sacarosa por la glucosidasa de las levaduras Disuelva 2 gr de levadura en 20 ml de agua destilada, deje reposar esta mezcla durante 15 minutos, filtre la mezcla y el liquido resultante es el extracto de lavadura. Prepare los siguientes tubos: Tubo A: 1 gr de sacarosa más 5 ml de agua y agitar Tubo B: 1 r de sacarosa mas 5 ml de agua mas 3 ml de extracto de levadura y agitar Adicione a cada tubo una reacción de Fehling y anote los resultados. Acción de las polifenol-oxidasas

Corte 12 tiras delgadas de manzana y rábano de aproximadamente 5cm, raspando los bordes para destruir células del tejido. A continuación, hierva en un baño maría la mitad de los trozos de manzana y rábano.

Sobre una caja de Petri ponga 2 trozos de manzana y rábano sin hervir, y sobre otra ponga 2 trozos de cada uno pero hervidos.

Enseguida, sumerja 2 trozos de manzana y rábano sin hervir en un tubo de ensayo con solución de metabisulfito sódico. Haga lo mismo con 2 trozos de manzana y rábano hervidos.

CUESTIONARIO

1. Investigue las enzimas encontradas normalmente en los vegetales y en los tejidos animales

2. ¿Qué tiene que ver la desnaturalización de las proteínas con esta práctica? En que pruebas se puede evidenciar la desnaturalización de las enzimas

3. Mediante un diagrama explique cómo actúa la glucosidasa de las levaduras sobre la sacarosa

4. Investigue que es el pardeamiento enzimático 5. Químicamente qué es el metabisulfito de sodio y que efecto tiene sobre las polifenol

oxidasas? ¿Qué aplicaciones industriales tiene este compuesto?

BIBLIOGRAFIA

Fersht, A. 1998. Structure and Mechanism in Protein Science: A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding. W. H. Freeman. ISBN 0-7167-3268-8

Athel C. 2004.Fundamentals of Enzyme Kinetics. (3rd edition), Portland Press (), ISBN 1-85578-158-1.

4. FOTOSINTESIS

INTRODUCCION La fotosíntesis es un proceso metabólico que realizan las plantas, las cianobacterias y algunos

protistas. En los organismos eucariotes se realiza en los cloroplastos. La reacción general de la

fotosíntesis es la siguiente:

Energía solar + 6 H2O + 6 CO2 → C6H12O6 + 6 O2 + Energía

La fotosíntesis no es un proceso simple y consta de múltiples etapas. Las primeras etapas se

conocen como reacciones lumínicas y se encargan de convertir la energía solar en energía

química produciendo oxígeno como producto de desecho, se dan en las membranas de los

tilacoides. Las segundas reacciones se conocen como Ciclo de Calvin (o reacciones de

oscuridad) y producen moléculas de azúcar utilizando el CO2 y los productos de alto contenido

energético de las reacciones luminosas, estas se llevan a cabo en el estroma.

Con esta práctica se pretende un acercamiento al complejo e importante proceso de la

fotosíntesis, para ello se realizaran diferentes procedimientos, empezando por la identificación

de los cloroplastos en células vegetales vivas mediante el uso del microscopio, seguida de una

identificación de los pigmentos fotosintéticos mediante una técnica de separación llamada

cromatografía y terminando con la medición de la tasa fotosintética mediante un ensayo de

discos flotantes cuyo principio se explica a continuación.

Los discos de hoja normalmente flotan. Cuando los espacios de aire se infiltran con una

solución, la densidad de la hoja se incrementa y los discos se precipitan. La solución de

infiltración incluye una pequeña cantidad de bicarbonato de sodio. Los iones del bicarbonato

sirven como fuente de carbono para la fotosíntesis (Figura 1). Durante el proceso de la

fotosíntesis se libera oxígeno del interior de la hoja, cambiando así, que el disco flote. La

respiración celular por su parte consume oxígeno y se da al mismo tiempo que la fotosíntesis, la

velocidad que se demoran los discos precipitados en flotar es una medida indirecta de la tasa

neta de fotosíntesis.

Figura 1. Esquema general del experimento de discos flotantes

OBJETIVOS

Identificar los cloroplastos en una célula vegetal Comprobar la presencia de clorofila mediante cromatografía en papel Reconocer y comprobar el fenómeno de la fotosíntesis Medir la tasa fotosintética

MATERIALES Y REACTIVOS

Microscopio Porta objetos y cubre objetos Vasos de precipitados de 250 ml Mortero con pistilo Pipetas graduadas de 2, 5 y 10 ml

Gotero Papel filtro Plancha de calentamiento Tubo capilar Regla Elodea Solución de bicarbonato de sodio 2%

Etanol 95% Acetona Cloroformo Jeringa plástica nueva desechable de

10 ml (sin aguja) Jabón líquido Hojas de espinaca frescas Perforadora de un hoyo 3 vasos de precipitado de 250 ml Cronómetro Fuente de luz

PROCEDIMIENTO Identificación de cloroplastos Corte una hoja de elodea póngala en el portaobjetos y agregue una gota de agua, luego cúbrala con el cubre objetos y observe en el microscopio con los objetivos de 10 y 40X, dibuje lo observado, exponga la hoja a una fuente de luz artificial o natural y observe la ciclosis de los cloroplastos al interior de la célula. Identificación de clorofila por cromatografía 1. En un vaso de precipitado de 250ml ponga etanol hasta alcanzar un centímetro de

profundidad y cúbralo con un vidrio reloj para crear una atmosfera alcohólica en el interior.

2. Corte hojas de espinaca y póngalas en el mortero adicione 5 ml de acetona y macere hasta tener una mezcla homogénea.

3. Filtre la mezcla anterior usando una gasa o muselina para obtener el líquido. 4. Recorte un pedazo de papel filtro de 2 cm de ancho por 10 cm de largo, marque con

un lápiz dos líneas paralelas a cada borde 5. Con un tubo capilar ponga la muestra en una de las líneas marcadas (Figura 2) 6. Introduzca el papel filtro con la muestra hacia abajo dentro del vaso de precipitado

con alcohol, evitando tocar las paredes del vaso y procurando que la muestra no entre en contacto con el solvente.

7. Haga que el papel quede en forma vertical 8. Deje correr por absorción el solvente sobre el papel filtro hasta que alcance la línea

superior 9. Retire el papel y deje secar a temperatura ambiente 10. Calcule el Rf para cada pigmento separado

Figura 2. Montaje para cromatografía en papel

Ensayo del disco flotante para comprobar la fotosíntesis

1. Disponga en un vaso de precipitado 20 ml de una solución de bicarbonato de sodio al 0.2 %. En otro vaso de precipitado disponga 20 ml de agua destilada, este vaso será utilizado como CONTROL del experimento.

2. Adicione 5 ml de jabón líquido al vaso con la solución de bicarbonato. El jabón líquido humedecerá la superficie hidrofóbica de la hoja de espinaca, permitiendo que las soluciones penetren el interior de los tejidos.

3. Corte con un sacabocados 10 o más discos uniformes de hoja de espinaca fresca para cada ensayo (10 para el vaso con bicarbonato) 10 o más para el Vaso CONTROL (Evite discos con venas centrales) (Figura 3A).

4. Seleccione los discos de hojas remueva el pistón de la jeringa y coloque los discos de hoja dentro de la jeringa, deberá incorporar nuevamente el pistón cuidando de no dañar los discos de hoja. Empuje suavemente el pistón hasta dejar solo un pequeño volumen de aire para los discos de hoja (< 10%) entre el extremo de la jeringa y la barrera de goma del pistón (Figura 3B).

5. Succione un pequeño volumen de bicarbonato de sodio y resuspenda allí los discos de hoja (Figura 3C).

6. Ponga su dedo índice en la abertura de la jeringa y hale el pistón, de esta forma creará vacío el cual deberá conservar por 10 segundos. Así pues, el bicarbonato de sodio se infiltrará en los espacios de aire de la hoja. Repita este procedimiento unas 2 ó 3 veces. (Figura 3D)

7. Coloque los discos y la solución dentro de un vaso precipitado, y adicione 10 ml en el fondo del vaso de una solución de bicarbonato de sodio.

8. Para el tratamiento control infiltre los discos solo con agua y jabón líquido. NO adicione bicarbonato.

9. Coloque ambos tratamientos, previamente marcados, con una fuente de luz y empiece a contabilizar el tiempo. Después de cada minuto cuente el número de discos que flotan. Continúe el conteo hasta que todos los discos floten.

10. Diligencie la tabla 1

Papel filtro

Muestra Líneas de lápiz

Solvente

Figura 3. Procedimiento discos flotantes de hojas

Tabla 1. Colección de datos y análisis

Minutos Discos que han flotado Observaciones

Con estos datos es muy importante identificar, el punto donde el 50% de los discos flotan, este término se denomina ET50 (Steucek, et. al., 1985) realice una gráfica, donde en el eje de X disponga tiempo en minutos y en el eje de la Y número de discos que flotan (Ver Figura 4).

A

B

B

C

E

A

D

CUESTIONARIO 1. Dibuje un cloroplasto con sus partes 2. ¿Cuál es el principio de la cromatografía? 3. ¿Qué es el Rf y como se calcula? 4. ¿Qué tipo de pigmentos fotosintéticos se encuentran en los tejidos vegetales y que

colores los representan en la cromatografía en papel? 5. Qué relación existe entre el ET50 y el tiempo? 6. Qué factores podrían influir en la tasa fotosintética? Explique. 7. Por qué es importante establecer un experimento control? 8. Por qué es importante estudiar la tasa fotosintética en vegetales? BIBLIOGRAFIA Steucek, Guy L. Robert J. Hill and Class/Summer 1982. 1985. Photosynthesis I: An Assay Utilizing Leaf Disks. The American Biology Teacher, 47(2):96-99. Rukes, Kari L. and Timothy J.Mulkey. 1994. Measurement on the Effects of Light Quality and Other Factors on the Rate of Photosynthesis. Bioscene, 20(3): 7-11. http://www.acube.org/volume_20/v20-3p7-11.pdf. Greenler, John. 1990. Exploring Photosynthesis with Fast Plants. WisconsinFast Plant Notes, 4(1): 4-5. http://www.fastplants.org/pdf/activities/exploring_photosynthesis.pdf Richard, David S. Measure of Photosynthetic Rate In Spinach Leaf Disks http://www.susqu.edu/FacStaff/r/richard/photosynthlab.html

5. RESPIRACION CELULAR

INTRODUCCIÓN La respiración celular se asocia siempre a la toma de O2 y la degradación de glucosa para formar CO2, H2O y energía, pero en realidad este proceso solo corresponde al tipo de respiración aerobia que bien no poseen algunas bacterias y levaduras. Podríamos dividir la respiración aerobia en tres pasos principales:

1. La glucólisis, que degrada la glucosa en ácido pirúvico y que permite formar ATP. 2. El ciclo de Krebs, del cual se desprende CO2 y unas moléculas altamente

energéticas como son el ATP, el NADH y el FADH2. 3. La cadena transportadora de electrones, en la cual el O2 se comporta como aceptor

final y se asiste a la formación de H2O y de ATP. Este tipo de respiración es un proceso altamente energético y mucho más complejo que la respiración anaerobia. Dentro de la diversa gama de seres vivos existentes, algunos tienen respiración aerobia, otros son estrictamente anaerobios y otros tienen la facultad de realizar ambos tipos de respiración, razón por la cual reciben el nombre de facultativos. Estos últimos, ante la ausencia de oxígeno pasan de tener respiración aerobia y anaerobia mediante el proceso de fermentación. La fermentación puede ser de dos tipos: láctica o alcohólica. En la primera el ácido pirúvico es transformado en ácido láctico, mientras que en la segunda es transformado en etanol. Cabe anotar también que durante la fermentación alcohólica se forma CO2 como producto de desecho.

El etanol resultante de una fermentación alcohólica se emplea en la elaboración de algunas bebidas alcohólicas, tales como el vino, la cerveza, etc…, Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar también etanol mediante la fermentación a nivel industrial a gran escala para ser empleado como biocombustible.

Para separar el etanol del resto de la mezcla de fermentación se emplea la destilación, la cual es el proceso de separar, mediante evaporización y condensación, los diferentes componentes líquidos ó sólidos disueltos en líquidos o gases licuados de una mezcla, aprovechando los diferentes puntos de ebullición de cada una de las sustancias ya que el punto de ebullición es una propiedad intensiva de cada sustancia, es decir, no varía en función de la masa o el volumen. OBJETIVOS

Verificar el desarrollo de la fermentación en vino Aprender el manejo de equipo y las técnicas de laboratorio empleadas para

purificar compuestos orgánicos mediante la destilación simple.

Entender los aspectos teóricos acerca de la destilación simple y la obtención de alcohol etílico por fermentación.

MATERIALES

Zumo de fruta 2 botellas de vidrio con tapa Estufa

Erlenmeyer de 100 mL

Frasco lavador

Perlas de ebullición

Balón de destilación

Condensador recto

Termómetro

Plancha de calentamiento

Balanza

Soporte universal

Pinza para condensador y balón

de destilación

Pinza de madera

Probeta de 250 mL

Picnómetro

PROCEDIMIENTO Fabricación del vino Extraiga el zumo de aproximadamente un kilo de uvas, puede ser en licuadora o manualmente, retire las cascaras y las semillas, filtrando con un colador, divida la cantidad de zumo obtenido en dos, una mitad hiérvala durante 5 minutos y la otra déjela cruda, embáselas en dos recipientes de vidrio bien marcarlos y ciérrelos bien. Déjelos reposar una semana. Pasado este periodo completar la siguiente tabla:

Zumo hervido Zumo no hervido

Presencia de burbujas

Grado de turbidez

Olor

Presencia de bacterias

Destilación simple:

Transcurr ido el t iempo recomendado para la fermentación, decante cuidadosamente el l íquido a un balón de desti lación de 1 L; de manera que no pase el residuo de levadura. Deje resbalar al fondo del balón 2 ó 3 esferas pequeñas de vidrio o trozos de porcelana para evitar sobrecalentamientos y así regular la ebul l ición.

Monte el conjunto ilustrado en la figura No. 1, tomando las siguientes precauciones: El conjunto no debe quedar tensionado para evitar rupturas, la parte superior del bulbo del termómetro debe quedar a la altura del desprendimiento del tubo lateral del balón de destilación (ver parte superior derecha de la figura 1); el agua debe circular en el refrigerante de manera que entre por la parte inferior y salga por la superior.

A continuación caliente el balón de desti lación hasta que l legue al punto de ebul l ición del agua (aprox. 94º C). Anote la temperatura a la cual ocurrió la desti lación.

Recoja una fracción de destilado, con ayuda de una probeta y determine su densidad con ayuda de un picnómetro. Consulte los contenidos alcohólicos en peso y volumen según la densidad en el AOAC Oficial Methods of Análisis.

Figura 1. Montaje de destilación simple Una vez realizado el montaje y cuando se hayan destilado aproximadamente 30 ml de etanol proceda a determinar el porcentaje de etanol de la siguiente manera: Primero halle la densidad del alcohol destilado usando un picnómetro

Densidad del alcohol = peso del alcohol Volumen de alcohol

Luego

Hallar el % de etanol, según la densidad en la tabla del

CUESTIONARIO 1. ¿En cuál de los dos zumos se presentara fermentación y por qué?

2. ¿Por qué razón los recipientes del experimento deben permanecer cerrados todo el tiempo?

3. ¿Qué tipo de fermentación se espera que ocurra en esta práctica? Sustente su respuesta

4. Escriba la reacción de fermentación de glucosa por levaduras 5. ¿Cuál es el propósito de destilar el producto de la fermentación? 6. ¿Qué tipo de levadura es utilizada para fabricar cerveza? BIBLIOGRAFIA

DE LA TORRE, G., MORENO, P. 1.995.Química Orgánica. Vol 2. Unisur. Santa Fé de

Bogotá.

GÓMEZ, M.J.1985. Química Orgánica. 1ª Edición. Universidad Nacional de Colombia.

Bogotá.