Manual de Prácticas de Laboratorio de Cultivos de...

Manual de Prácticas de Laboratorio de Cultivos de Apoyo

Dr. Enrique Valenzuela Espinoza

Responsable de la elaboración del manual de Cultivos de Apoyo

Universidad Autónoma de Baja California

Facultad de Ciencias Marinas

[Avalado, Validado] el [fecha] por Consejo Técnico

Directorio

Dr. Felipe Cuamea Velázquez Rector UABC

Dr. Oscar Roberto López Bonilla

Vicerrector, UABC Campus Ensenada

Dr. Juan Guillermo Vaca Rodríguez Director FCM

Dr. Victor Antonio Zavala Hamz

Subdirector, FCM

Universidad Autónoma de Baja California

Facultad de Ciencias Marinas

Índice

Introducción 5

Encuadre del sistema de prácticas 6

Introducción 6

Competencia a las que contribuye 7

Nivel de desempeño 7

Ubicación dentro del mapa curricular 8

Criterios de evaluación 9

Programa del sistema de prácticas 10

Contenido de Prácticas de Laboratorio de Cultivos de Apoyo 11

Práctica No. 1. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE NUTRIENTES 12

Práctica No. 2. TRATAMIENTO DEL AGUA DE MAR Y PREPARACIÓN DE MEDIO PARA EL

CULTIVO DE FITOFLAGELADOS Y DIATOMEAS MARINAS

16

Práctica No. 3. OBSERVACIÓN, RENOVACIÓN DE CULTIVOS PRIMARIOS Y TRANSFERENCIA DE

MICROALGAS MARINAS

20

Práctica No. 4. MANTENIMIENTO Y PRODUCCIÓN DE MICROALGAS MARINAS 24

Práctica No. 5. MANTENIMIENTO Y CUANTIFICACIÓN CELULAR DE MICROALGAS MARINAS MEDIANTE MICROSCOPIO ÓPTICO

27

Práctica No. 6. MEDIDA DE CRECIMIENTO BASADA EN EL PESO SECO DE MICROALGAS MARINAS 30

Práctica No. 7. ANÁLISIS DE PIGMENTOS (CLOROFILA A, B Y C) EN MICROALGAS MARINAS 32

Práctica No. 8. CULTIVO ESTÁTICO DEL ROTÍFERO MARINO BRACHIONUS PLICATILIS 35

Práctica No. 9. CULTIVO SEMI-CONTINUO DEL ROTÍFERO MARINO BRACHIONUS PLICATILIS 38

Práctica No. 10. MÉTODO DE DECAPSULACIÓN DE QUISTES DE ARTEMIA PARA SER INCUBADOS 41

Práctica No. 11. CULTIVO Y CUANTIFICACIÓN DE ARTEMIA 45

Práctica No. 12. HISTORIA DE VIDA E IDENTIFICACIÓN DE ESTADIOS DE DESARROLLO DE ARTEMIA 49

Anexos 53

Normas Generales de Seguridad e Higiene 53

Medidas generales en Caso de Accidente 54

Plan General de Emergencia 54

Fuego en el Laboratorio 55

Fuego en el Cuerpo 55

Quemaduras 55

Cortes 56

Derrame de Productos Químicos Sobre la Piel 56

Corrosiones en la Piel por Ácidos y Álcalis 56

Corrosiones en los Ojos 56

Ingestión de Productos Químicos 57

Manual de Prácticas de Laboratorio de Cultivos de Apoyo Encuadre del Sistema de Prácticas Página 5

Enrique Valenzuela Espinoza Facultad de Ciencias Marinas de la UABC

Introducción Este manual está diseñado para alumnos del curso de Cultivos de Apoyo que se imparte en

la carrera de Biotecnologo en Acuacultura en la Facultad de Ciencias Marinas de la Universidad

Autónoma de Baja California. También, es útil para el conocimiento práctico en el cultivo de

microalgas para docentes y alumnos de las carreras de Oceanología y Biología de la Facultad de

Ciencias Marinas y Facultad de Biología respectivamente.

En este manual se consideran tres especies de microalgas (Isochrysis aff. galbana,

Chaetoceros muelleri y Nannochloropsis sp), las cuales son comúnmente usadas en laboratorios

que se dedican a actividades de cultivo de moluscos, crustáceos, y peces marinos. En particular,

se han elegido las especies arriba mencionadas para su cultivo en este manual de laboratorio,

debido a su importancia en acuacultura y biotecnología. Sin embargo, las técnicas y

procedimientos presentados aquí, pueden ser usadas en el cultivo de cualquier especie de

microalga, lo cual facilita el conocimiento práctico para que el estudiante desarrolle experiencias

de cultivos con otras especies de microalgas de interés biotecnológico.

A través del presente documento, se dan a conocer referencias de metodologías descritas en

distintos textos y publicaciones científicas, así como también se incluyen experiencias de

investigación que han sido realizadas en la Universidad Autónoma de Baja California a través

del Instituto de Investigaciones Oceanológicas para el cultivo y producción de microalgas.

Finalmente, para fortalecer las competencias del alumno, se incluyen visitas a laboratorios

comerciales con el propósito de que el alumno identifique las principales diferencias entre las

técnicas de cultivo desarrolladas en el laboratorio docente y aquellas que se realizan en los

centros acuícolas.



Encuadre del Sistema de Prácticas

Introducción El estudiante de la carrera Biotecnologo en Acuacultura debe conocer que para la

producción de organismos acuáticos de importancia económica (larvas de moluscos, crustáceos,

equinodermos, juveniles de peces etc.), se requiere de cultivos de apoyo (microalgas, rotíferos,

copépodos, Artemia), los cuales constituyen el alimento principal durante el desarrollo

ontogénico de las distintas especies en los cultivos comerciales. En este contexto, para que el

estudiante egresado de la carrera Biotecnologo en Acuacultura sea competente, es necesario

facilitarle no solo el desarrollo de técnicas de cultivo especificas, sino también conocimiento

especializado para que lleve a cabo la producción intensiva y extensiva de cultivos de apoyo. En

consecuencia, se formaran recursos humanos cuya competencia le permitirá resolver problemas

que se presentan en los laboratorios y centros acuícolas de producción.

En la actualidad, para incrementar la producción de organismos marinos, es necesario

realizar cultivos intensivos de fitoplancton y zooplancton que reúnan los requerimientos

nutricionales del consumidor tanto en calidad como en cantidad. Esto se puede lograr mediante

el uso de tecnología moderna y la relación que existe en el ambiente donde se lleva a cabo el

cultivo de los organismos. En el presente manual se incluyen las principales técnicas de cultivo y

analíticas que son comúnmente usadas en acuacultura, como también su potencial uso en la

biotecnología. Por otra parte, debido a que en México todavía no existe una industria

desarrollada para la producción de insumos biológicos para la acuacultura, entonces es

recomendable formar recursos humanos con alta capacidad competitiva y que promueva la

sustentabilidad durante su ejercicio profesional en el área de cultivos de apoyo.



Competencias a las que contribuye

Niveles de Desempeño

El presente manual se ha elaborado en base al trabajo y la experiencia obtenida a través de la

investigación con diferentes especies de microalgas, rotíferos marinos y Artemia, con el

propósito de que el estudiante obtenga el máximo nivel de desempeño al realizar actividades de

cultivo de las especies que son comúnmente usadas como alimento vivo en acuacultura.

Las razones que justifican que el alumno obtendrá el máximo nivel de desempeño son:

Realizar prácticas diseñadas para adquirir habilidades y conocimientos sobre el cultivo de

fitoplancton y zooplancton marino.

Hacer reportes de laboratorio en formato científico, donde el alumno formule y evalué

hipótesis de trabajo, analice y evalué los resultados y consulte fuentes de información para la

redacción del manuscrito.

Ejercicios y tareas sobre temas relacionados a la producción de fitoplancton y zooplancton y

su importancia en la alimentación de distintos estadios de crecimiento de diferentes especies

en cultivo.

Investigar y exponer temas relacionados con la biotecnología micro-algal, con el propósito

de que el alumno recurra a fuentes de información y ejercitar nuevas formas de estudio.



Ubicación dentro del mapa curricular MAPA CURRICULAR BIOTECNOLOGÍA EN ACUACULTURA



CRITERIOS DE EVALUACIÓN

Para que el alumno tenga derecho a calificación ordinaria, debe tener un 80% de asistencia al curso práctico.

De cada una de las prácticas, el alumno deberá entregar un reporte escrito en formato word, el cual se entrega a la semana de haberse realizado y a la siguiente semana se le entrega la práctica calificada. Nota: Aquellos alumnos que no entreguen práctica a tiempo no tendrán calificación y no se recibirán prácticas atrasadas, salvo circunstancias justificadas.

La práctica se presentará en forma individual, formato científico, atendiendo los siguientes puntos: La calificación se asigna en base al cumplimento de los

puntos 1.- Introducción: Propósito, cuál es el objeto de estudio 10 % 1.1. Investigar: buscar información acerca del tema de estudio 15 % 2.- Objetivo (s), hipótesis: producir la respuesta al problema 15 % 3.- Experimento: realizar el procedimiento práctico para confirmar objetivo (s) o rechazar hipótesis

25 %

4.- Resultados y discusión: análisis y registro de datos durante el Experimento práctico

25 %

5.- Conclusión: con la metodología propuesta se dio respuesta al objetivo e hipótesis planteada

10 %

Para aprobar la asignatura, el alumno requiere presentar al menos el 80% de las prácticas realizadas. Sin embargo, para el cálculo de la calificación final se tomará en cuenta el total de las prácticas.



Programa del Sistema de Prácticas NÚMERO DE PRÁCTICA

TITULO DE LA PRÁCTICA, ÁMBITO DE DESARROLLO Y DURACIÓN PÁGINA

1 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE NUTRIENTES-

LABORATORIO- 3 HORAS

12

2 TRATAMIENTO DEL AGUA DE MAR Y PREPARACIÓN DE

MEDIO PARA EL CULTIVO DE FITOFLAGELADOS Y

DIATOMEAS MARINAS- LABORATORIO- 3 HORAS

16

3 OBSERVACIÓN, RENOVACIÓN DE CULTIVOS PRIMARIOS Y

TRANSFERENCIA DE MICROALGAS MARINAS- 3 HORAS

20

4 MANTENIMIENTO Y PRODUCCIÓN DE MICROALGAS

MARINAS- LABORATORIO- 3 HORAS

24

5 MANTENIMIENTO Y CUANTIFICACIÓN CELULAR DE

MICROALGAS MARINAS MEDIANTE MICROSCOPIO ÓPTICO

27

6 MEDIDA DE CRECIMIENTO BASADA EN EL PESO SECO DE

MICROALGAS MARINAS- LABORATORIO- 3 HORAS

30

7 ANÁLISIS DE PIGMENTOS (CLOROFILA A, B Y C) EN

MICROALGAS MARINAS- LABORATORIO- 3 HORAS

32

8 CULTIVO ESTÁTICO DEL ROTÍFERO MARINO BRACHIONUS

PLICATILIS- LABORATORIO- 3 HORAS

35

9 CULTIVO SEMI-CONTINUO DEL ROTÍFERO MARINO

BRACHIONUS PLICATILIS- LABORATORIO- 3 HORAS

38

10 MÉTODO DE DECAPSULACIÓN DE QUISTES DE ARTEMIA PARA

SER INCUBADOS- LABORATORIO- 3 HORAS

41

11 CULTIVO Y CUANTIFICACIÓN DE ARTEMIA- LABORATORIO- 3

HORAS

45

12 HISTORIA DE VIDA E IDENTIFICACIÓN DE ESTADIOS DE

DESARROLLO DE ARTEMIA- LABORATORIO- 3 HORAS

49

Contenido de Prácticas de Laboratorio de Cultivos de Apoyo

Dr. Enrique Valenzuela Espinoza

Responsable de la elaboración del manual de Cultivos de Apoyo

Manual de Prácticas de Laboratorio de Cultivos de Apoyo Página 12


PRÁCTICA No. 1

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE NUTRIENTES

1.1.1. Introducción

Para el crecimiento y bioquímica normal de micro-algas, se requiere de la disponibilidad de un número variable de elementos minerales, probablemente de 15 a 20, con la posibilidad de que otros elementos puedan ser agregados a la lista. El requerimiento elemental de nutrientes es considerado en dos grupos: Los macro-nutrientes, los cuales son usados directamente o indirectamente para la construcción de bloques celulares (C, H, O, N, P, S, K, Mg), y los micro-nutrientes, que son necesitados en una menor concentración como catalizadores o para funciones únicas como material estructural o reguladores osmóticos (Fe, Mn, Cu, Zn, Mo, V, B, Cl, Co, Ca, Si, Na). Los compuestos usados para suministrar la mayoría de los minerales y los intervalos de concentración en los cuales ellos son generalmente requeridos por la micro-algas marinas se muestran en la tabla 1 (Guillard, 1975).

Los nutrientes utilizados por el fitoplancton autótrofo son sustancias químicas que se agregan al agua de mar y la demanda por estos nutrientes frecuentemente exceden el suministro que en la práctica común se usan para la preparación de medios de cultivo. Es decir, el nutriente se suministra en menor cantidad a las necesidades del fitoplancton, lo cual llega a limitar la producción de fitoplancton en sistemas de cultivo. La tabla I describe la cantidad de sales inorgánicas y orgánicas usadas para el cultivo de fitoplancton en laboratorio. Algunos nutrientes son componentes únicos de una solución primaria, otros son combinados en una solución primaria y de esta solución se derivan otras soluciones. Estas soluciones de nutrientes son mezcladas en el agua de mar en la cual el fitoplancton es cultivado.

1.1.2. Objetivo

Preparar soluciones de nutrientes mayores (nitrato de sodio, fosfato de sodio y silicato de

sodio), micronutrientes y vitaminas, mediante los procedimientos de laboratorio que consideren

la cantidad del nutriente que es usado por litro de agua de mar y el requerimiento establecido

para fitoflagelados y diatomeas, para diseñar medios de cultivos apropiados, con una actitud

crítica y propositiva

1.1.3. Material

Planchas de agitación, agitadores magnéticos, espátulas, navecillas para pesar, matraces volumétricos de 250 mL, matraces volumétricos de 100 mL, picetas, frascos de 250 mL, frascos de 100 mL.



1.1.3.1. Instrumental Balanza analítica

1.1.3.2. Reactivos Agua destilada, cloro comercial al 6%, acido clorhídrico, reactivos químicos especificados en la tabla 1, tiosulfato de sodio.

Tabla I: Concentración de los nutrientes en 1 litro de agua de mar.

1.1.4. Desarrollo

1.- Asegúrese de que todos los recipientes y materiales que se usen para la preparación de las soluciones de nutrientes estén perfectamente limpios y secos.

2.- Los nutrientes enlistados en la tabla II, son componentes de una solución primaria. Pese en una balanza analítica la cantidad requerida de cada uno para hacer una solución primaria de 250 mL. Disuelva el reactivo en agua destilada y afore en un matraz volumétrico de 250 mL. Una vez preparadas las soluciones almacenar en recipientes de vidrio o de plástico y mantenerlos en refrigeración.



3.- Para la preparación de soluciones stock primario de metales traza, es conveniente hacer soluciones individuales de metales traza. Los componentes químicos requeridos para la preparación se especifican en la tabla III. Pesar en una balanza analítica la cantidad requerida de cada sustancia química para hacer una solución primaria de 100 mL. Disuelva cada sustancia química en agua destilada y afore en un matraz volumétrico de 100 mL. Una vez preparadas las soluciones almacenar en recipientes de vidrio o de plástico y en mantenerlos en refrigeración.

4.- Solución stock de metales traza, usando cloruro férrico y EDTA-di-sódico (Na2EDTA).

Disolver 3.15 g de FeCl.6H2O y 4.36 g Na2EDTA en aproximadamente 900 mL de agua destilada; Añada 1 mL de cada una de las soluciones stock primaria de metales traza (ver tabla III) y afore a un litro con agua destilada.

5.- Las soluciones stock primarias de vitaminas son hechas pesando en una balanza analítica las cantidades que se describen en la tabla IV-A.



Tabla IV-A. Cantidad de vitamina que se utiliza para preparar un litro de medio de cultivo.

Vitamina Formula Cantidad de vitamina por cada

litro de agua de mar de cultivo

Tiamina hidroclorhidrica C12H17CIN4OS.HCl 0.1 mg

Biotina C10H16N2O3S 0.5 µg

Cianocobalamina B12 C63H88CoN14P 0.5 µg

6.- Para preparar el tris-buffer, se pesan 200 g y disolver en 1000 ml de agua destilada. Ajuste el pH a 7.2-7.5, con ~30-35 ml de HCl concentrado. Use 1 ml de tris por cada litro de agua de mar, solo para cultivos de volumen pequeño.

1.1.5. Método de Evaluación

Reporte de laboratorio en formato científico, donde el alumno formule y evalué hipótesis de trabajo, analice y evalué los resultados y consulte fuentes de información para la redacción del manuscrito.

1.1.6. Bibliografía

Guillard, R.R.L. 1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. In:

Smith, W.L. and M.H. Chanley (ed.). Culture of marine invertebrates animals.

Plenum Publishing Corp. New York., pp.29-60.

Lavens, P; Sorgeloos, P. 1996. Manual on the Production and Use of Live Food for

Aquaculture. FAO Fisheries Technical Paper. No. 361. Rome, FAO. 295 pp.



PRÁCTICA No. 2

TRATAMIENTO DEL AGUA DE MAR Y PREPARACIÓN DE MEDIO PARA EL CULTIVO DE FITOFLAGELADOS Y DIATOMEAS MARINAS.


El agua de mar natural es un medio complejo que contiene más de 50 elementos

conocidos y una gran cantidad de compuestos orgánicos. Para el cultivo de micro-algas, el

uso directo del agua es poco aceptable, debido a que, el agua de mar presenta variaciones en

su calidad y concentración de nutrientes a través del año, dando como resultado una baja

producción de micro-algas. Entonces, uno de los procedimientos que comúnmente se lleva a

cabo, es tener un control de concentración de nutrientes disponibles para el crecimiento de

micro-algas. Esto se logra mediante la adición de nutrientes inorgánicos mayores (NO3-,

PO43-, y silicatos), metales traza quelados, y vitaminas. Entre los medios más utilizados esta

el f/2 de Guillard (1975), el cual tiene una proporción de nitrógeno:fósforo >16 : 1, indicando

que el fitoplancton podría estar limitado de fosforo en fase de envejecimiento del cultivo

(Berges et al. 2001). La mayoría de los medios de cultivo se usan para mantenimiento de

cepas de micro-algas como para producción de biomasa micro-algal, por este motivo, el

enriquecimiento es comúnmente requerido.

Por otra parte, el personal que se dedica al cultivo de micro-algas y aquel que labora

en los centros de producción acuícola usualmente ponen poca atención a la proporción

nitrógeno:fósforo o nitrógeno: sílice que se usa en la preparación de medios de cultivo para la

producción de micro-algas, lo cual finalmente determinará cual nutriente limitará el

crecimiento e influirá en la composición bioquímica y razón fisiológica cuando las células

lleguen a la fase de envejecimiento del cultivo. Por lo tanto, la concentración y formas de

macro nutrientes en ( f, f/2, and f/50) en los medios comúnmente varia. Típicamente los

macro nutrientes están en exceso en comparación con concentraciones naturales,

particularmente en el caso de medios usados en acuicultura.



1.1.8. Objetivo

Tratamiento del agua de mar, mediante su filtración, tratamiento por radiación ultravioleta y método químico de desinfección del agua, así como el análisis de la apertura del filtro que se usa y los protocolos establecidos para preparar las soluciones requeridas, para su uso en la preparación de medio para el cultivo de fitoflagelados y diatomeas marinas, con una actitud crítica y proactiva.

1.1.9. Material

Frascos Erlenmeyer, frascos Fernbach, algodón, gasa, tijeras, pipetas graduadas, probeta graduada, área para transferir cultivos (equipada con mesa, suministro de gas, mecheros de alta temperatura).

1.1.9.1. Instrumental Autoclave

1.1.9.2. Reactivos Agua de mar filtrada a 1µm, soluciones stock de NO3

-, PO43-, SiO3

2-, secuestrante, vitaminas, tris buffer.

1.1.10. Desarrollo

El Agua de mar se obtiene de la zona costera adyacente mediante bombeo y se almacena

en reservorios de concreto o de plástico. Esta agua de mar no filtrada se hace pasar por filtros

rápidos de arena para separar material partículado el cual es retenido en la cama de arena y el

agua filtrada es almacenada en otro reservorio.

Después el agua filtrada es bombeada al laboratorio de micro-algas, donde de nuevo es

tratada con filtros tipo cuno hasta obtener agua filtrada a 1 micra. Subsecuentemente es

pasada a través de una unidad equipada con luz ultravioleta para descodificar genéticamente

los micro-organismos y/o atenuar la mayoría que no fueron retenidos por el filtro. El agua

puede de aquí en adelante ser almacenada para su uso en cultivo de micro-algas.

La técnica de cultivo estático usa recipientes de cultivo de diferente tamaño y el volumen

de cultivo puede variar considerablemente en diferentes laboratorios.

Antes de iniciar la preparación de medios de cultivo, asegúrese de que los recipientes y

materiales que se usen para la preparación estén perfectamente limpios y secos.

Con la ayuda de una probeta graduada, mida un volumen de 1000 mL y vierta este en el

frasco donde se preparará el medio.



De cada solución stock de nutrientes mayores (NO3-, PO4

3-, SiO32-) y secuestrante, añada

un mililitro por cada litro de agua de mar. También use Tris a razón de 1 mL L-1 de agua de

mar antes de esterilizar. El Tris es solo para cultivos de pequeño volumen (150 y 2000 mL),

no para cultivos de mayor volumen

Una vez preparado el medio, se recomienda preparar volúmenes de acuerdo al número de

Erlenmeyer’s que se necesiten. Por ejemplo, en matraces Erlenmeyer’s de 125 y 250 mL de

capacidad, se pondrá un volumen de cultivo de 100 y 150 mL respectivamente. El matraz se

cubre con una “torunada” hecha de algodón y gasa, la cual se coloca en la boca del matraz

un poco ajustada para que cubra efectivamente.

Esterilice el medio en autoclave a 121 ºC, 15 libras de presión por pulgada cuadrada

durante 15 minutos (121 ºC, 1.05 Kg cm-2 de presión por 15 minutos).

Deje enfriar los medios de cultivo a temperatura ambiente. Luego añada las vitaminas

asépticamente (previamente esterilizadas) a razón de 1 mL L-1. Si el volumen de cultivo

preparado en Erlenmeyer es de 100 o 150 mL entonces adicione 100 o 150 µL.

Transferir con pipetas estériles 1 mL de cepa inicial unialgal de cada especie (Isochrysis

aff. galbana, Nannochlropsis sp, Chaetoceros muelleri).

Los cultivos se colocan en un cuarto de temperatura controlada (19±1ºC), bajo irradianza

fotosintéticamente activa de 150 µmol quanta m-2 s-1. Esta irradianza, provee la energía para

el crecimiento de las microalgas.

Después de algunos días las células se han multiplicado, tomaran un color característico

debido a la densidad. Este rápido incremento en el número de células es conocido como

“bloom”. Al cabo de una semana los cultivos deben renovarse para mantener las cepas y/o

usarse como inoculo para volúmenes mayores de cultivo.






Berges, J.A., Franklin, D. J., and Harrison, P. J. 2001. Evolution of an artificial seawater

medium: Improvements in enriched seawater, artificial water over the last two

decades. J. Phycol. 37:1138-45.

Guillard, R.R.L. 1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. In:

Smith, W.L. and M.H. Chanley (ed.). Culture of marine invertebrates animals.

Plenum Publishing Corp. New York., pp. 29-60.





PRÁCTICA No. 3

OBSERVACIÓN, RENOVACIÓN DE CULTIVOS PRIMARIOS Y TRANSFERENCIA DE MICROALGAS MARINAS


Una de las principales actividades de un laboratorio de cultivo de micro-algas marinas es el mantenimiento, renovación y transferencia de cultivos de diferentes especies que son utilizadas para la alimentación de distintos estadios de crecimiento de organismos acuáticos.

Comúnmente para iniciar la actividad del cultivo de micro-algas, un inoculo primario es obtenido de laboratorios biológicos como por ejemplo, el Centro para el Cultivo de Fitoplancton Marino, Utex (Universidad de Texas), Milford, Connecticut, son algunos de los disponibles en Estados Unidos de América y en México Instituto de Investigaciones Oceanológicas de la UABC y el Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada. El inoculo requerido es unialgal, esto es que exista solo una especie de micro-alga en el recipiente y que el inoculo esté libre de bacterias. Una vez que el inoculo primario es obtenido, la micro-alga es transferida para su crecimiento en tubos de ensayo o frascos Erlenmeyer, los cuales son usualmente llamados inoculos primario (stock). Estos cultivos deberán ser siempre mantenidos como unialgal y si es posible libre de bacterias. Por consiguiente, al menos que se cometa algún error en el cultivo, por ejemplo que este muera, se contamine con otras especies de microalgas, un nuevo cultivo tiene que ser adquirido para iniciar cultivos primarios (stocks), los cuales son perpetuados en frascos Erlenmeyer.

Para prevenir contaminación por bacterias durante el tiempo de transferencia, esta debe ser hecha con pipetas estériles. Este procedimiento asegura el cultivo, pero esto no previene la entrada de bacterias del aire al contenedor durante el tiempo de inoculación. La contaminación por bacterias puede ser reducida si los cultivos son abiertos tan solo por un breve momento durante la transferencia. Otra manera de evitar contaminación es trabajar bajo una campana en la cual el aire ha sido irradiado con lámparas germicidas (UV), y/o flameando el área con mecheros de alta temperatura.

Los cultivos, después de ser inoculados, son colocados bajo iluminación. La luz proporciona la energía para el crecimiento de las micro-algas. Los cultivos en este nivel no son aireados; por lo tanto, es necesario agitarlos manualmente una vez al día para prevenir la acumulación de células en el fondo. Después de 4 a 5 días de crecimiento, las células se han multiplicado, entonces ellas tomaran un color característico debido al incremento en número de células, lo cual es conocido como “bloom”. Bajo condiciones óptimas las especies flageladas pueden dividirse una vez en 24 horas, y las diatomeas pueden dividirse de 2 a 3 veces por día. Dentro de una semana, los cultivos tendrán un número suficiente de células para ser usados como inoculos para otros cultivos primarios (stock) o escalar el cultivo a un volumen mayor.



1.1.14. Objetivo

Preparar medios de cultivo y transferir células de microalgas a partir de cultivos primarios a medios frescos recién preparados, mediante los procedimientos de laboratorio establecidos en manuales, para promover el crecimiento y mantenimiento de cepas en laboratorio, con una actitud crítica, proactiva y responsable.

1.1.15. Material

Mechero(s), cámara de neubauer de 0.1 mm de profundidad y cubre objeto, pipetas

Pasteur, muestras de cultivos de microalgas, bulbos para pipetas, pipetas graduadas, probetas

graduadas, guantes para sujetar material caliente.

1.1.15.1. Instrumental Microscopio compuesto, autoclave

1.1.15.2. Reactivos Alcohol o etanol al 90%, solución de lugol

1.1.16. Desarrollo

Tomar 1 L de agua de mar filtrada y añadir 1 mL de cada una de las soluciones de macro

nutrientes y micro nutrientes quelados. Para evitar formación de precipitados durante la

esterilización, añada tris-buffer a razón de 1 mL por litro de agua de mar. Las vitaminas, se

incorporan asépticamente después de la esterilización.

Adicionar el volumen de cultivo correspondiente en recipientes (pueden ser 15 mL en

tubos, 100 mL o 150 en frascos Erlenmeyer) y esterilizar en autoclave a 121 ºC, 15 libras de

presión por 15 minutos.

Deje enfriar los medios de cultivo.

Asegúrese de que la superficie de trabajo este limpia y seca. Puede usar alcohol o etanol

al 70% para tal propósito.

Coloque las pipetas estériles o puntillas para micro pipeta del lado izquierdo del área de

trabajo y también un recipiente para colocar las pipetas o puntillas después de su uso.



Después de organizar el material encienda el mechero, ajuste la flama y colóquelo en el

centro del área de trabajo, mantenga un radio de trabajo de 40 cm alejado del mechero. Si se

trabaja con dos mecheros, sepárelos, coloque el material en el centro y mantenga los

mecheros a una distancia de 40 cm en ambos lados del material.

Evite circulación de aire, manteniendo puertas y ventanas cerradas.

Coloque los tubos o frascos Erlenmeyer en orden cronológico para su uso y asegúrese

que todo el material este debidamente etiquetado. Ahora la manipulación de la muestra puede

iniciar.

Añadir las vitaminas estériles en proporción al volumen de cultivo, es decir si el volumen

de cultivo es de 100 o 150 mL se añadirá 100 o 150 microlitros por muestra.

Después con la mano izquierda levante el recipiente que contiene las pipetas, abrir este

dentro del área de trabajo (40 cm), remover la tapa con la mano derecha y con el dedo índice

y pulgar extraer la pipeta. Si el recipiente es demasiado largo, coloque la tapa en la base del

mechero para extraer la pipeta. Si la manipulación no es muy frecuente, se recomienda que el

recipiente permanezca cerrado durante el proceso de trabajo.

Una vez extraída la pipeta, sostenga esta con la mano izquierda y coloque el bulbo. En

caso de usar puntillas sostenga la micro pipeta con la mano derecha y coloque la puntilla

estéril con la mano izquierda.

Durante repetidos procesos de transferencia es conveniente mantener los contenedores de

pipetas y/o puntillas abiertos, pero que permanezcan en un radio de 40 cm respecto a los

mecheros.

La muestra de alga puede ser ahora transferida a un medio fresco para mantenimiento de

cultivos primarios (stock).

Realizadas todas las transferencias, apagar los mecheros, cerrar las líneas de gas,

remover todos los materiales de la mesa de trabajo, limpiarla y salir del cuarto de trabajo.

Por último, no agitar los cultivos en las primeras 24 horas y colocar los recipientes que

contienen las microalgas en condiciones de luz y temperatura apropiada para su crecimiento.

Cuando se trate de inspección de muestras realice lo siguiente:

Colocar una o dos gotas del medio en un portaobjetos limpio.



Inspeccione las células bajo el microscopio, revise tamaño, forma, color y actividad de

las células. Observe posible contaminación, esto se verá en forma de basura o células

extrañas que presentan un movimiento diferente a la especie en cuestión.






Andersen, R.A. 2005. Algal Culturing Techniques. Phycological Society of America.

Elsevier Academic Press. 565 pp.


PRÁCTICA No. 4

MANTENIMIENTO Y PRODUCCIÓN DE MICROALGAS MARINAS


La manera más común para conservar cultivos de microalgas es mantener estos

continuamente bajo condiciones ambientales controladas. Rutinas de subcultivos en serie es

llevado a cabo usando técnicas asépticas, que consiste en transferir un inoculo de la fase

exponencial final dentro de medio fresco esterilizado. Esto origina cultivos metabólicamente

activos que pueden ser usados en tiempos cortos. El propósito de esta actividad es retener una

población, fisiológicamente, morfológicamente, y genéticamente saludable. Un factor clave a

considerar es que diferentes edades de subcultivos pueden proveer diferentes estadios del

ciclo de vida (por ejemplo, células móviles y dividiéndose en las primeras fases del cultivo).

Las principales limitaciones de perpetuar las células es la selectividad, naturaleza

artificial del medio y régimen de incubación con respecto a condiciones naturales.

Condiciones de laboratorio pueden, en casos extremos, conducir a la perdida de

características morfológicas y fisiológicas importantes. Ejemplos de inestabilidad incluyen la

reducción en tamaño de las frustulas de diatomeas (Jaworski et al. 1988), perdida de

composición pigmentaria normal en diversas algas (Warren et al. 2002). Otras limitaciones

incluyen la posibilidad de contaminación de cultivos axenicos por manejo inapropiado de

estos durante la transferencia a volúmenes mayores de producción. Rutinas de subcultivos en

transferencias sucesivas para la producción de microalgas es una labor intensiva y

ciertamente limita la capacidad del cultivador para mantener gran número de especies en

líneas de producción para la alimentación de invertebrados acuáticos. Para evadir esta

desventaja de rutina de mantenimiento, métodos alternativos de preservación han sido

desarrollados, especialmente la crio-preservación. Esta práctica se enfoca en técnicas de

transferencia, condiciones de mantenimiento y condiciones que aseguren el mejor

crecimiento de cultivos de microalgas.


1.1.20. Objetivo

Mantener diferentes especies de microalgas, mediante los procedimientos de laboratorio

de transferencia de cultivos líquidos de nivel Erlenmeyer a nivel Fernbach, para aumentar la

cantidad y densidad de alimento vivo para las especies de importancia en la acuacultura, con

una actitud crítica y responsable.

1.1.21. Material

Matraces Fernbach, algodón, gasa, tijeras, probeta graduada, pipetas, área para transferir

cultivos (equipada con mesa, suministro de gas, mecheros de alta temperatura). Área con

temperatura controlada provista de iluminación con lámparas de luz de día de 40 y 75 W.

1.1.21.1. Instrumental Autoclave

1.1.21.2. Reactivos Agua de mar filtrada, soluciones de nitrato de sodio, fosfato de sodio, silicatos,

secuestrante, tris, vitamina B12, tiamina y biotina.

1.1.22. Desarrollo

1.- Obtener agua de buena calidad con salinidad entre 32 y 34 parte por mil.

2.- Filtrar tan pronto como sea posible a través de filtros tipo cuno de 1 micrometro. Pasar el

agua filtrada por radiación ultravioleta.

3.- Si el agua no se va usar inmediatamente, se recomienda almacenarla en la oscuridad y en

refrigeración a 4ºC.

4.- Para la preparación de medio de cultivo en Fernbach, tomar 1.8 L de agua de mar filtrada.

5.- Añadir nitrato, fosfato, secuestrante férrico y silicato en caso de cultivos de diatomeas.

También use Tris a razón de 1 mL L-1 de agua de mar antes de esterilizar.

6.- Mezclar exhaustivamente después de la adición de cada solución de nutriente.

7.- Tapar con torunda de algodón el matraz Fernbach que contiene el medio de cultivo.

8.- Esterilizar el medio de cultivo en autoclave, o cuando sea necesario por filtración (0.2

micras), tratamiento con luz ultravioleta, o pasterización.


9.- Si la esterilización es en autoclave, llevar a cabo este procedimiento a 121 ºC, 1.05 Kg

cm-2 de presión por 15 minutos.

10.- Completada la esterilización, retirar el medio de cultivo usando guantes para manejo de

objetos calientes fuera de la autoclave.

11.- Después dejar enfriar el medio de cultivo en un cuarto a temperatura controlada.

12.- Una vez frio, destape el matraz Fernbach por un breve tiempo y añada las vitaminas

asépticamente (previamente esterilizadas) a razón de 1 mL L-1. Si el volumen de cultivo

preparado en Fernbach es de 1.8 L entonces adicione 1.8 mL de cada una de las vitaminas.

13.- Realizado lo anterior, transfiera 150 mL de inoculo unialgal obtenido en matraz

Erlenmeyer a un matraz Fernbach.

14.- Colocar los cultivos en un cuarto de temperatura controlada (19±1ºC), bajo irradianza

fotosintéticamente activa de 150-300 µmol quanta m-2 s-1. Esta irradianza, provee la energía

para el crecimiento de las microalgas.

15.- Después de 4-7 días, las células sirven como inoculo para cultivos en garrafón


Reporte de laboratorio en formato científico, donde el alumno formule y evalué hipótesis

de trabajo, analice y evalué los resultados y consulte fuentes de información para la



Jaworski, G. H. M., Wiseman, S. W., and Reynolds, C. S. 1988. Variability in sinking

rate of the freshwater diatom Asterionella Formosa: the influence of colony

morphology. Br. Phycology. F. 23: 167-76.



Warren, A., Day, J. G., and Brown, S. 2002. Cultivation of protozoa and algae. In Hurst,

C. J., Crawford, R. L., Knudsen, G. R., McInerney, M. J., and Stezenbach, L. D., Eds,

Manual of Environmental Microbiology, ed. 2. ASM Press, Washington, D.C., pp 7-

83.



PRÁCTICA No. 5

MANTENIMIENTO Y CUANTIFICACIÓN CELULAR DE MICROALGAS MARINAS MEDIANTE MICROSCOPIO ÓPTICO


El conteo de células bajo un microscopio en un hematocimetro es uno de los métodos

más comúnmente usados para la enumeración celular y con base a esta determinación se

calcula el volumen de alimento requerido en la alimentación de larvas de organismos

acuáticos. Esta técnica es de suficiente precisión para cumplir los requerimientos de alimento

de un laboratorio que se dedique al cultivo de larvas y postlarvas de invertebrados marinos.

Además, el uso de esta técnica de enumeración celular proporciona información adicional a

cerca de la condición del cultivo de microalgas y que no es determinada por centrifugación o

por peso celular. Por ejemplo, observaciones bajo el microscopio proporcionan información

sobre la contaminación de los cultivos, y da una garantía de la condición de los cultivos con

respecto al movimiento de la célula, su tamaño y pigmentación. Una de las aplicaciones de

esta técnica, es conocer el número de células presentes en una población cultivada, la cual

comúnmente se expresa como el número total de células por unidad de volumen de cultivo.

También, existen otros métodos para conocer la población de microalgas, la cual puede ser

por biomasa, peso húmedo, peso seco, contenido de clorofila, contenido de nitrógeno

orgánico. Un aspecto fundamental de estos métodos de evaluación de la biomasa microalgal,

es que tanto las poblaciones de microalgas en el ambiente natural como en sistemas de

cultivo, se encuentran de forma individual y el concepto de la cuota celular, significa que el

contenido celular promedio de algún constituyente celular (nitrógeno, fósforo, hierro,

vitamina B12), requieren tanto de conteos celulares y determinaciones químicas del

constituyente.

Otra aplicación del conteo celular es para conocer la razón de aumento en el cultivo,

equivalente a la tasa de incremento de la población; frecuentemente esta es expresada como

la tasa de división celular, porque el proceso de incremento es por la división de una célula

individual en dos (ocasionalmente más) de manera regular. En laboratorios de producción

comercial, el conteo de microalgas, permite realizar los cálculos necesarios para decidir en

que volumen de cultivo se llevará el proceso de producción de microalgas; así como también,



facilita el cálculo del volumen de algas que se necesita suministrar como alimento para

diferentes estadios de crecimiento de larvas de moluscos y crustáceos en contenedores de

cultivos larvarios.

1.1.26. Objetivo

Cuantificar células de diferentes especies de microalgas, mediante los procedimientos

que consideran la cantidad de muestra (volumen) y el factor de dilución empleado, para

establecer las tasas de crecimiento de cada especie, con una actitud crítica y responsable,

aplicando un rigor matemático y ordenado.

1.1.27. Material

Mechero(s), hematocimetro y cubre objeto, pipetas pasteur, bulbos para pipetas, pipetas

graduadas, probetas graduadas, , muestras de cultivos de microalgas: Isochrysis galbana,

Chaetoceros muelleri y Nannochloropsis sp.

1.1.27.1. Instrumental Microscopio compuesto binocular

1.1.27.2. Reactivos Alcohol o etanol al 90%, solución de lugol

1.1.28. Desarrollo

La primera consideración práctica es elegir la cámara de conteo apropiada de acuerdo a la

forma, tamaño y densidad de cultivo.

A continuación se enlistan diferentes cámaras de conteo junto con sugerencias de

aplicación bajo su uso en diferentes circunstancias de trabajo.

Cámara de conteo Tamaño de la célula

(µm)

Densidad del cultivo

(cél mL-1)

Sedgwick-Rafter 50-500 30-104



Cámara de conteo Tamaño de la célula

(µm)

Densidad del cultivo

(cél mL-1)

Palmer-Maloney 5-150 102-105

Speirs-Levy (0.2 mm de profundidad) 5-75 104-106

Hemacitometro de (0.2 mm de profundidad) 5-75 104-106

Hemacitometro (0.1 mm de profundidad) 2-30 104-107

Petrff-Hausser < 1-5 106-108

Referencia: Robert A. Anderson. Algal culturing techniques, 2005.








Andersen, R.A. 2005. Algal Culturing Techniques. Phycological Society of America.

Elsevier Academic Press. 565 pp.



PRÁCTICA No. 6

MEDIDA DE CRECIMIENTO BASADA EN EL PESO SECO DE MICROALGAS

MARINAS


En los trabajos de laboratorio con cultivos de microalgas, el número de células se utiliza

como base para reportar datos, ya que es relativamente fácil de medir, especialmente con

cámaras de conteo o contadores electrónicos de partículas. La biomasa cuantificada de los

cultivos se expresa como peso seco, peso húmedo, o peso seco libre de cenizas. Cualquiera

de estos valores se obtiene de forma fácil de un cultivo de microalgas, ya que el organismo

que se estudia es el único presente en el cultivo.

Una de las condiciones para la medición confiable del peso seco de células es el tomado

de las muestras, la cual debe ser representativa del cultivo algal. Un adecuado agitamiento de

la suspensión algal y rápido pipeteo, previenen el asentamiento de células durante el proceso

de muestreo. Cada medición de peso seco es usualmente hecha al menos por duplicado. El

tamaño de la muestra generalmente depende de la densidad del cultivo. Después de tomar la

muestra, las células son separadas comúnmente del medio de cultivo por centrifugación o

filtración. La masa celular separada puede ser entonces expresada como peso seco de células

en una unidad de volumen de cultivo.

1.1.32. Objetivo

Determinar el peso seco de muestras de microalgas, mediante los procedimientos de

lavado, secado, calcinado, pesado descritos en los manuales, para establecer el peso de

cenizas, así como los factores que afectan la precisión del método y el protocolo de muestreo,

con una actitud crítica, analítica y responsable, y con disposición al trabajo en equipo.

1.1.33. Material

Equipo de filtración completo, filtros de fibra de vidrio GF/F y GF/C, desecador, bomba

manual para hacer vacio, probetas graduadas, jeringas desechables.



1.1.33.1. Instrumental Balanza analítica, estufa, mufla.

1.1.33.2. Reactivos Formato de amonio al 2.25%, agua destilada

1.1.34. Desarrollo






Stein, J.R. (ed). 1973. Handbook of phycological methods. Culture methods and growth

measurement. Cambridge University Press, Cambridge, 448 pp.



PRÁCTICA No. 7

ANÁLISIS DE PIGMENTOS (clorofila a, b y c) EN MICROALGAS MARINAS


Uno de los métodos para determinar la cantidad total de microalgas en un cultivo es

medir el contenido de clorofila (comúnmente clorofila a). Para medir este pigmento en

microalgas existen diferentes métodos: El más usado es el espectrofotométrico, sin embargo,

existen otros como los fluorométricos y los cromatográficos como cromatografía en capa fina

de alta resolución y cromatografía liquida de alta resolución (HPLC). Otros índices de

crecimiento, tales como acumulación de carbón, nitrógeno, o algunos productos del

metabolismo celular también son usados en medidas de crecimiento.

1.1.38. Objetivo

Determinar clorofilas a, b, y c de muestras de microalgas, mediante el uso del método

espectrofotométrico, considerando las condiciones ambientales durante el muestreo, y el

protocolo de preservación de las muestras, para cuantificar la muestra de microalgas del

cultivo, con una actitud crítica, analítica y responsable.

1.1.39. Material

Equipo de filtración completo, filtros de fibra de vidrio GF/F y GF/C, desecador, bomba manual para hacer vacio, probetas graduadas, jeringas desechables, tubos tipo falcón de 15 mL para, celdas para, refrigerador, matraz volumétrico de 1 L o 500 mL, agua destilada, acetona grado reactivo o analítico.

1.1.39.1. Instrumental

Centrifuga, espectrofotómetro, balanza analítica, vortex

1.1.39.2. Reactivos

Acetona al 90% grado analítico, agua destilada.



1.1.40. Desarrollo

CUANTIFICACIÓN DE CLOROFILAS POR MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO

Cuando se trate de cultivos de microalgas, se recomienda que la cuantificación de clorofilas se lleve a cabo utilizando biomasa fresca.

1.- Cuantificar la muestra de microalgas que se desea analizar

2.- Instale el equipo de filtración y coloque un filtro de fibra de vidrio GF/F de 0.7 µm y 25 mm de diámetro.

3.- Medir un volumen conocido de muestra (5-10 mL) y vacié esta sobre el filtro instalado en el equipo de filtración.

4.- Inicie la filtración con la ayuda de una bomba manual para hacer vacio.

5.- Colocar el filtro que contienen la muestra en tubos de centrifuga de 15 mL y agregue 8 mL de acetona al 90% y sonicar por 5 cinco minutos.

4.- Extraer el contenido pigmentario de las microalgas por 12 horas en oscuridad a 4 °C, agitando después de las primeras 8 horas para asegurar una mejor extracción.

5.- Aforar a 10 mL los tubos que contienen el extracto y centrifugar a 1190 x g por 10 minutos.

6.- Decantar el sobrenadante de cada muestra en celdas de 10 cm y medir la absorbancia a las siguientes longitudes de onda: 664, 647 y 630 en celdas de vidrio en un espectrofotómetro.

7.- Corregir cada lectura restando el blanco de turbidez (750) de las absorbancias a 664, 647 y 630.

8.- Para calcular la cantidad de pigmentos en la muestra se utilizan las siguientes ecuaciones descritas por Jeffrey y Humphrey (1975).

Clorofila a = 11.85 · E664 – 1.54 · E647 – 0.08 · E630

Clorofila b = – 5.43 · E664 +21.03 · E647 – 2.66 · E630

Clorofila c = – 1.67 · E664 – 7.60 · E647 +24.52 · E630

Donde E es la absorbancia corregida a esa longitud de onda.

La concentración de pigmentos se expresa en unidades de µg mL-1 si se usan celdas de 1 cm, por tanto:



Mg clorofila • m-3 = C • ν / ν • 10

Donde ν es el volumen de acetona en mL (10 mL), ν es el volumen de agua de mar en litros y C es la cantidad de clorofila por mL. (nota: µL • L-1 = mg • m-3).

1.1.41. Método de evaluación




1.1.42. Bibliografia

Jeffrey, S.W. and Humphrey, G.F. 1975. New spectrophotometric equations for

determining chlorophylls a, b, c1 and c2 in higher plants, algae and natural

phytoplankton. Biochem. Physiol. Pflanzen, 167: 191-194.

Parson, T.R., Y. Maita and C.M. Lalli. 1985. A manual of chemical and biological

methods for seawater analysis. First edition. Ed. Pergamon press. Inc. New York. 173

pp.



PRÁCTICA No. 8

CULTIVO ESTÁTICO DEL ROTIFERO MARINO Brachionus plicatilis


Los rotíferos son animales filtro-alimentadores microscópicos que se reproducen

sexualmente o asexualmente dependiendo de su ambiente. Bajo buenas condiciones

ambientales, las hembras producen huevos diploides los cuales se desarrollan en las hembras.

Cuando las condiciones son menos favorables, las hembras producen huevos haploides. Los

huevos los cuales no son fertilizados se convierten en machos. La reproducción sexual

entonces ocurre produciendo huevos de resistencia diploides que son análogos a los quistes

de Artemia. Dado que estos huevos no eclosionan inmediatamente, el cultivo usualmente

muere dentro de un cortó tiempo.

Existen diferentes especies de rotíferos también como diferentes líneas de las mismas

especies. Brachionus plicatilis es ampliamente usado debido a que este es plantónico y nada

lentamente, por lo tanto, es fácilmente capturado por larvas. Este también es tolerante a ser

cultivado en altas densidades (Tamaru et al. 1991b).

Diversos sistemas de cultivo han sido empleados para el cultivo de rotíferos marinos

incluyendo el cultivo estático. Este es un método en el cual un cultivo es inoculado con

rotíferos y se permite un periodo de crecimiento, después del cual el volumen total es

cosechado. Este método ha sido el más confiable debido a su simplicidad técnica. Sin

embargo, sin tener en cuenta el método, se requieren de cuidados diarios en el mantenimiento

del cultivo para asegurar condiciones óptimas de cultivo.

1.1.44. Objetivo

Realizar cultivos separados de Brachionus plicatilis y Nannochloropsis sp., mediante la

aplicación de los procedimientos de cuantificación a los cultivos y la consideración de las

variables ambientales del cultivo en un sistema estático, para conocer el número de

organismos por unidad de volumen, con una actitud crítica, analítica y responsable.



1.1.45. Material

Frascos Erlenmeyer de 150 mL, frascos de 1 Litro, pipetas graduadas de 10 mL, papel

secante, tamiz de 70 micras, contador manual, cámara de conteo neubauer de 0.1 mm de

profundidad, cámara de conteo Sedgwick-Rafter, agua de mar filtrada a 1 micra, solución de

lugol.

1.1.45.1. Instrumental

Microscopio compuesto, potenciómetro, refractómetro, termómetro

1.1.45.2. Reactivos

Solución de lugol, formaldehido al 4%

1.1.46. Desarrollo



Mantenimiento diario:

Factores abióticos, incluyendo temperatura, oxigeno disuelto, pH, concentración de NH4+ y

demanda química de oxigeno son factores que se monitorear diario para mantener condiciones optimas de cultivo.

Condiciones sugeridas para el cultivo:

Temperatura entre 25- 30 °C pH 7 - 8

Salinidad 20 - 26 partes por mil Cloro 6 - 10 partes por mil








Tamaru, C. S., C.S. Lee, y H. Ako. 1991. Improving the larval rearing of stied mullet

(Mugil cephalus) by manipulating quantity and quality of the rotifer, Brachionus

plicatilis. In W. Fulks and L. Main (Eds.). Rotifer and microalgae system.

Proceedings of a U.S.-Asia Workshop, Juanary 28-31. Honolulu, Hawaii. pp. 89-104.

Anexo 1

Forma utilizada para el control de la producción práctica del cultivo estático de Brachionus plicatilis Nombre Fecha Hora Recipiente No Densidad

inicial de rotíferos

(#/mL)

Producción diaria de rotíferos

#/día/mL

Cantidad de huevos presentes por hembra

Cantidad de machos presentes

Temperatura Salinidad pH



PRÁCTICA No. 9

CULTIVO SEMI-CONTINUO DEL ROTÍFERO MARINO Brachionus plicatilis


Para el cultivo de rotíferos marinos, existen diferentes técnicas reconocidas. Uno de los

primeros métodos de cultivo fue el nombrado método de transferencia diaria en tanques por

su creador Hachiro Hirata (1979), donde el crecimiento de rotíferos en tanques con Chlorella

es continuamente transferido a tanques del mismo tamaño con agua nueva después de que la

mayoría de las algas del tanque original era consumida. De acuerdo a Lubzens (1987), el

cultivo semi-continuo de rotíferos emplea recipientes que varían de pocos cientos de litros a

200 m3. Por su parte Coves et al. (1990) describe el cultivo semi-continuo de Brachionus

plicatilis en tanques cilíndricos de 0.5 a 2 m3. Comúnmente la producción de rotíferos, en

sistemas semi-continuos es cosechada en un 30 % del volumen total del tanque. Sin embargo,

este sistema de cultivo es mucho más susceptible a caerse que el método de cultivo estático

debido a que el periodo de cultivo es más largo, y la calidad del agua disminuye con el

tiempo. Este requerimiento necesita ser monitoreado con mayor frecuencia para prevenir la

perdida de los cultivos. Asimismo, análisis de la calidad del agua, densidad y tasa de

fertilidad son examinadas diario ya que el uso de levaduras para complementar la

alimentación de los rotíferos, provoca acumulación de productos de desecho y contaminación

bacteriana, los cuales son los principales problemas en este tipo de sistemas semi-continuos,

y por tanto los hacen menos confiables que los cultivos estáticos. A pesar de estos problemas,

la producción diaria de rotíferos de manera semi-continua reúne los requerimientos de

laboratorios comerciales que se dedican al cultivo de organismos acuáticos.

1.1.50. Objetivo

Cultivar Brachionus plicatilis de manera semi-continuo, mediante los procedimientos

especificados en manuales para el cultivo semi-continuo de rotíferos, y considerando los

factores abióticos críticos (pH, Temperatura), para asegurar la producción del alimento



vivo para especies de importancia en la acuacultura, con una actitud crítica, propositiva y

responsable.

1.1.51. Material

Frascos Erlenmeyer de 1 L, pipetas graduadas de 10 mL, papel secante, tamiz de 70

micras, contador manual, cámara de conteo neubauer de 0.1 mm de profundidad, cámara

de conteo Sedgwick-Rafter, , agua de mar filtrada a 1 micra, solución de lugol.

1.1.51.1 Instrumental

Microscopio compuesto, potenciómetro, refractómetro, termómetro

1.1.51.2. Reactivos

Solución de lugol, solución de formaldehido al 4%.

1.1.52. Desarrollo

El sistema de cultivo semi-continuo se basa en el principio de que los rotíferos se duplican en número cada 24 horas y la cantidad de alimento óptimo (dependiendo de la temperatura) usando Nannochloropsis sp es de 100 a 150 x 103 células/rotífero/día (Fushimi, 1989).

1.- Cuantificar la muestra de rotíferos en una cámara de conteo Sedgwick-Rafter.

2.- Llenar el matraz Erlenmeyer a un cuarto de su volumen con agua de mar filtrada a 1 micra y pasada por radiación ultravioleta.

3.- Añadir los rotíferos en una densidad de 100 mL-1, añadir Nannochloropsis sp a razón de 100 a 150 x 103 células/rotífero/día e introducir aireación.

4.- A las 24 horas (día 1) la población de rotíferos se habrá duplicado. Como resultado, el volumen del agua es duplicado para diluir la densidad de rotíferos y regresar a su densidad original. Usar agua de mar filtrada a 1 micra y pasada por UV y ajustar el alimento a la concentración antes especificada

5.- En el día 2, llenar hasta un litro con agua de mar filtrada a 1 micra y pasada por UV y microalgas (Nannochloropsis sp) como se indico previamente.

6.- En el día 3 y 4, la mitad del volumen es cosechado a través de tamiz de 70 micras. El matraz es entonces rellenado hasta 1 L con agua de mar y alimento.



7.- En el día 5, los matraces son completamente cosechados y la población total de

rotíferos es cuantificada. De nuevo, los matraces son limpiados y llenados a un cuarto de

volumen e inoculados con 100 rotíferos mL-1 para repetir el ciclo.






Coves, D., P. Audineau and J. L. Nicolas. 1990. Rotifers – rearing technology. In: G.

Barnabe (Ed.). Aquaculture. Volume 1. Ellis Horwood, New York. Pp. 232-245.

Fushimi, T. 1989. Systematizing large-scale culture methods. In: K. Fukusho and K.

Hirayama (Eds.). A live feed-the rotifer, Brachionus plicatilis. Koseisha-Koseikaku,

Tokio. pp. 118-134.

Hirata, H. 1979. Rotifer culture in Japan, Spec. Publ. Eur. Maricult. Soc. 4: 361-365.



Lubzens, E. 1987. Raising rotifers for use in aquaculture. Hidrobiology. 147: 245-255.



PRÁCTICA No. 10

MÉTODO DE DECAPSULACIÓN DE QUISTES DE Artemia PARA SER INCUBADOS


El valor de Artemia en aquacultura es debido a su reproducción, desarrollo y fisiología. La Artemia tiene dos modos de reproducción: 1) ovovivíparo, cuando los nauplios son incubados en el ovisaco y estos nacen vivos, y 2) ovíparos, cuando los embriones en el estado gástrula de desarrollo son cubiertos por una capsula dura o quiste.

Los quistes deshidratados pueden ser almacenados por meses o años sin pérdida de su capacidad de incubación. El quiste es de 200 a 300 micrones en diámetro, dependiendo de la línea. Su capa externa está compuesta de corteza dura, color café oscuro, y lipoproteinica. La pérdida osmótica de agua, deshidratación por aire, o por causa de anoxia, el embrión se enquista para entrar a un estado de diapausa o criptobiosis, durante el cual el organismo muestra poco o ningún signo de vida. El estado criptobiotico del quiste es extraordinario en su capacidad para resistir las condiciones ambientales extremas como completa desecación, temperaturas sobre 100 °C y cerca del cero absoluto, alta radiación de energía y una variedad de solventes orgánicos (Cleeg, 1974). Este durable, incubación en estado de diapausa hacen a los quistes de Artemia una conveniente, fuente accesible constante de animales vivos para los laboratorios que se dediquen al cultivo de peces y camarones penaeidos.

Hoy, existen distintas líneas geográficas de Artemia. Más de 50 han sido registradas de diferentes países en todo el mundo. Existen diversos comercializadores y distribuidores, vendiendo marcas de diferente calidad. El costo de quistes de buena calidad puede variar de 26 a 66 dólares americanos o inclusive más de este precio. Cada gramo de quiste podría producir de 200 a 300 x 103 nauplios. Es importante que los nauplios de Artemia sean cosechados y destinados como alimento para larvas de camarones penaeidos tan pronto como sea posible, después de que hayan salido del quiste.

1.1.56. Objetivo

Obtener nauplios de Artemia, mediante el proceso de desenquistamiento, el cual

inicia con la hidratación, desinfección e incubación. Después de 16 horas el alumno

identificará bajo el microscopio el primer estadio larval (instar I) con una actitud crítica,

proactiva y propositiva, con responsabilidad y orden.



1.1.57. Material

Quistes de Artemia (6 g), tamiz de 100-120 micras, frascos de 250 mL, frascos de 1.5

litros, pipetas de 10 mL, papel secante, agitadores magnéticos, pizetas, agua destilada,

agua de mar filtrada a 1 micra, cloro al 5-6 %, cámara de conteo Sedgwick-Rafter.


Microscopio compuesto, planchas de agitación, balanza.

1.1.58.2. Reactivos

Hidróxido de sodio, ácido clorhídrico 0.1 N, solución de formaldehido al 4%.

1.1.59. Desarrollo

El método de decapsulación con lleva los siguientes pasos: hidratación de los quistes;

tratamiento con la solución decapsulante; lavado y desactivación de los restos de cloro

activo.

Hidratación de los quistes

Una eliminación completa del corion se puede lograr únicamente cuando los quistes

son esféricos; en la mayoría de las cepas, la hidratación completa en 1-2 horas en agua

dulce o salada a 25°C (el tiempo de hidratación se incrementa cuando disminuye la

temperatura y aumenta la salinidad). Se recomienda el uso de recipientes con fondo en

forma de embudo para la eclosión con el fin de conseguir un hinchamiento homogéneo de

los quistes por medio de un burbujeo de aire desde el fondo del recipiente.

Tan pronto como los quistes estén hidratados, transferirlos a la solución de

hipoclorito, ej. recoger los quistes sobre un tamiz de 125 micras, lavar eventualmente

para eliminar las impurezas y escurrir el exceso de agua. Una hidratación excesivamente

prolongada antes de someter los quistes al tratamiento de hipoclorito parece afectar

drásticamente la tasa y la eficiencia de eclosión de los quistes. Los quistes hidratados que



no puedan ser tratados inmediatamente podrían ser conservados durante algunas horas en

el refrigerador (0–4°C).

El método de decapsulación es como sigue: Para 15 gramos de quistes

(preferentemente de la línea San Francisco) la solución decapsuladora que se necesita es:

71 ml de cloro comercial 2.25 g de Hidróxido de sodio

137 ml de agua de mar Ácido clorhídrico 0.1 N

1.- Pesar los quiste cuidadosamente.

2.- Poner hidróxido de sodio en 137 mL de agua de mar- permitir que se disuelva

3.- Hidratar los quistes en agua dulce en frascos de 1 litro por 1-2 horas.

4.- Poner los quistes hidratados en un tamiz de 120 micrones, lavar los quistes con agua

dulce por un tiempo de 1 minuto y dejar que se escurra el agua.

5.- Colocar los quistes en un frasco limpio y adicionar el cloro. Cuando se adiciona el

cloro la reacción de decapsulación inicia.

6.- Agitar lentamente al principio en una plancha magnética y aumente la velocidad de

agitación tanto como sea posible evitando que salpique la solución.

7.- Observe la solución. Una capa blanca de espuma se desarrollará. La solución

cambiará de café a naranja. Esto tomará aproximadamente 6 minutos. Cuando no se

observe más cambio de color, el proceso de decapsulación ha sido completado.

8.- Colocar los quiste en el tamiz de 120 micrones

9.- Lavar de manera excesiva con agua dulce por 10 minutos. Esto es tedioso pero muy

importante, hasta que el olor a cloro no se detecte.

10.- Colocar los quistes dentro de un recipiente y ponerlos en suficiente acido clorhídrico

0.1 N para lavar los quiste, por no más de 30 segundos. Esto neutraliza cualquier resto de

cloro.

11.- Poner los quistes en el tamiz de nuevo y lavar con agua dulce por 3 minutos.

12.- Los quiste están ahora listos para incubación en agua de mar agua.

13.- Incube los quistes durante toda la noche y coseche al siguiente día.










Støttrup, J.G. and Lesley A. McEvoy. 2003. Live feeds in marine aquaculture. Blackwell

publishing. 313 pp.

Treece, G.D. and M.E. Yates. 1988. Laboratory manual for the culture of Penaeid

Shrimp. Larvae. TAMU-SG-88-202. 95 pp.



PRÁCTICA No. 11

CULTIVO Y CUANTIFICACIÓN DE Artemia


A diferencia de otros crustáceos, Artemia puede ser cultivada en altas o muy altas

densidades sin que su supervivencia se vea afectada. Dependiendo de la técnica de cultivo

empleada, densidades de inoculo de hasta 5 x 103 larvas por litro son usadas en cultivos

estáticos, 10 x 103 para cultivos con flujo cerrado y 18 x 103 para cultivos con flujo abierto

pueden ser mantenidos sin afectar el crecimiento y supervivencia. Densidades superiores a

las antes indicadas, las condiciones llegan a ser sub-óptimas (deterioro de la calidad del agua,

menor disponibilidad de alimento por individuo), y disminuye el crecimiento y

supervivencia. Además, el costo del cultivo se incrementa con el aumento de la densidad de

Artemia. En un sistema de flujo abierto las densidades máximas estarán limitadas por la tasa

de alimentación, mientras que, en sistemas de recirculación y estático, la preservación de la

calidad de agua determinará un nivel de alimentación seguro, lo cual a su vez determina la

densidad de organismos en el cual la cantidad de alimento por individuo todavía permite una

tasa de crecimiento satisfactoria. Después de realizar algunos ensayos con altas densidades

de animales, la densidad máxima puede ser identificada como la más alta densidad posible

donde no ocurra inhibición del crecimiento de Artemia.

1.1.63. Objetivo

Realizar cultivos estáticos de Artemia, Isochrysis aff. galbana y Chaetoceros muelleri

mediante los procedimientos especificados en las practicas 1-4 de este manual, aplicando

los procedimientos de cuantificación a los cultivos, y evaluar el efecto de variables

ambientales del cultivo de Artemia, para conocer la sobrevivencia de organismos por

unidad de volumen, con una actitud crítica, analítica y responsable.



1.1.64. Material

Nauplios de Artemia (de preferencia en Estadio II), tamiz de 100, 200, 300, 400 y 500

micras, frascos de 3 L, pipetas de 10 mL, papel secante, pizetas, cámara de conteo

Sedgwick-Rafter, contadores manuales, cámara de conteo Neubauer de 0.1 mm de

profundidad,


Microscopio compuesto, balanza.

1.1.65.2. Reactivos

Solución de formaldehido al 4%, solución de lugol, alcohol etilico 96°, agua destilada,

agua de mar filtrada a 1 micra.

1.1.66. Desarrollo

Procedimiento para el cultivo:

Los nauplios obtenidos del proceso de dacapsulación (apartado 1.1.59; práctica 10)

concentrarlos en un tamiz con apertura de malla de 100 micras y pasarlos a un recipiente

con un volumen de agua de mar de 3 L.

Cuantificar 1 mL de muestra tanto de cultivos de microalgas como de nauplios de

Artemia en cámaras de conteo Neubauer de 0.1 mm de profundidad y Sedgwick-Rafter

respectivamente bajo el microscopio compuesto

Recoger los nauplios y transferirlos a un recipiente de cultivo a razón de 15-20 X 103

nauplios por litro de cultivo.

Asegurarse de que la temperatura del agua para el cultivo esté entre 25-30 °C

Añadir el alimento a una densidad celular de 4.5 X 104 células mL-1 e introducir aireación

suave



A las 24 horas (día 1), la población de Artemia habrá agotado el alimento, por lo cual se

requiere ajustar la concentración de alimento.

De acuerdo al crecimiento que registran los organismos, se tienen que hacer ajustes

diarias incrementando la cantidad y frecuencia de alimento. El incremento se hará en

función del estadio de crecimiento de los nauplios.

Se recomienda remover diario los desechos de alimento del recipiente de cultivo y lavar

líneas de aireación antes de incorporar el nuevo suministro de alimento.

A partir del 4 día renovar totalmente el agua de cultivo y usar un tamiz con malla de 200

micras.

Conforme los organismos van creciendo, es necesario el uso de mallas de mayor micraje

(250, 300, 400 Y 500 µm respectivamente). Una manera de verificar el uso de diferentes

tamices con distinta apertura de malla es verificando el tamaño de la Artemia, o

introducir el tamiz, en el medio de cultivo hasta la altura de la malla y verificar si pasan

las larvas.

Controlar diario los niveles de oxígeno disuelto para verificar la necesidad de incrementar

las tasas de aireación en el recipiente de cultivo.

• Verificar la salud de los animales por su actividad natatoria. Tomar unos cuantos

animales y colocarlos en un recipiente de vidrio y ponerlo cerca de la luz, los animales se

concentrarán en un punto (el efecto conocido como “crowding”). También es

recomendable hacer observaciones microscópicas del tracto digestivo (que deberá estar

siempre lleno de alimento), los toracópodos y la zona de la boca deberán estar limpios, si

aparecen cubiertos por aglomerados de alimento, los animales estarán pasando hambre:

ello puede ser debido a la naturaleza del alimento o al estado fisiológico de los animales.

cuantificar la biomasa, y cosechar el cultivo.










Støttrup, J.G. and Lesley A. McEvoy. 2003. Live feeds in marine aquaculture. Blackwell

publishing. 313 pp.





PRÁCTICA No. 12

HISTORIA DE VIDA E IDENTIFICACIÓN DE ESTADIOS DE DESARROLLO DE Artemia


La historia de vida y características reproductivas de líneas de Artemia son factores

importantes que deben ser tomados en cuenta cuando se introduce un nuevo organismo a una

nueva localidad geográfica., especialmente cuando se espera que exista una competencia con

las líneas locales. Estas capacidades competitivas están relacionadas a factores tales como la

duración de periodo reproductivo, pre-reproductivo y post-reproductivo, tiempo de vida,

número de crías por camada , animales por hembra, etc. En general nuevas poblaciones

citogenéticas tienen un gran número de crías por camada, un gran número de crías por

hembra por día y un rápido desarrollo para madurez sexual. Estas son todas las características

favorables comparadas con aquellas poblaciones citogenéticas y Artemia partenogenéticas.

Por otra parte, la edad en la primera reproducción también es un factor clave que determina

la tasa de crecimiento poblacional, y la tasa de colonización de un nuevo ambiente con fuente

de nutrientes limitados. En consecuencia, si factores ambientales y nutricionales no

interfieren, un nuevo mundo de especies citogenéticas generalmente desplazaran líneas

partenogenéticas. Entonces, experimentos de introducción de nuevas líneas en hábitats

naturales requiere por lo tanto de un control previo de líneas y de poblaciones locales nativas,

como también el estudio de condiciones ambientales prevalecientes.

1.1.70. Objetivo

Realizar un cultivo estático de Artemia para observar los diferentes estadios de la historia

de vida de estos organismos, con el propósito de que alumno identifique la diferenciación

estructural, tiempo entre estadios y el tiempo de primera madurez sexual Artemia, fertilidad,

y su uso como alimento vivo para distintas especies en la industria de la acuacultura, con una

actitud crítica, analítica y responsable.



1.1.71. Material

Nauplios de Artemia (de preferencia en Estadio II), tamiz de 100, 200, 300, 400 y 500

micras, frascos de 3 L, pipetas de 10 mL, papel secante, pizetas, cámara de conteo

Sedgwick-Rafter, contadores manuales, cámara de conteo Neubauer de 0.1 mm de

profundidad,


Microscopio compuesto.

1.1.72.2. Reactivos

Solución de formaldehido al 4%, solución de lugol, alcohol etílico 96°, agua destilada,

agua de mar filtrada a 1 micra.

1.1.73. Desarrollo

Desarrollo larval:

Observar y documentar el inicio del desarrollo larval desde el momento en que organismo

rompe el corión para iniciar su vida libre.

Observar y documentar el desarrollo larval para identificar las etapas de emergencia E-1,

E-2 y H:

E-1, es el primer estadio de emergencia, en el que la región de la cabeza emerge del

corión, el organismo permanece dentro de una doble membrana.

E-2, es el segundo estadio de emergencia, en el que el nauplio ha emergido totalmente

del corión, pero todavía permanece dentro de una sola membrana.

H, es cuando la larva se libera de la membrana y el nauplio inicia su nado libre. Este

proceso se conoce como desenquistamiento.



A partir de este momento el alumno realizará observaciones y registros que describan el

desarrollo de Artemia.

Fase I (Instar I).- Nauplio recién eclosionado mide entre 450-550 µm de acuerdo a la línea u origen. Esta fase tiene una duración de 20 horas a temperatura de 20 °C y termina con la primera muda.

Fase II.- La longitud de la Artemia continua en aumento y su coloración anaranjada cambia. Esta fase tiene una duración de 10 horas y termina con la segunda muda.

Fase III (Instar II).- El organismo registra una longitud aproximada de 0.6 mm. Inicia su alimentación exógena y este estadio de crecimiento dura 40 horas y termina con la tercera muda.

Instar III.- El organismo registra una longitud aproximada de 0.9 mm, con una marcada elongación del apéndice en forma de abanico.

Instar IV.- La longitud promedio en este estadio es de 1.2 mm y aparace el falbelum en los site pares de toracópodos y en los cinco primeros.

Instar V.- La longitud promedio en este estadio es de 1.4 mm. Los ojos compuestos aparacen completamente pigmentados.

Instar VI.- La longitud promedio en este estadio es de 1.6 mm. En esta fase aparecen definidos todos los apendices natatorios.

Instar VII.- Inicia el desarrollo de las papilas genitales en las hembra y machos. La talla promedio en esta fase es de 2.0 mm.

Instar VIII.- El tamaño promedio de esta fase es de 2.4 mm y en ambos sexos las antenas dejan de formar un ángulo recto con el eje longitudinal del cuerpo.

Instar IX.- Se observa un aumento de tamaño en las antenas del macho. Las hembras permanecen sin cambio notables. La longitud promedio es de 3.4 mm.

Instar X.- La longitud promedio es esta fase es de 4.7 mm, con un aumento en el tamaño de las antenas.

Instar XI.- La longitud promedio es esta fase es de 5.2 mm. La protuberancias frontales se han desarrollado al máximo.

Instar XII.- Inicia la formación de parejas y el tamaño promedio es de 6.4 mm.

En las fases subsecuentes, el único cambio notable de los organismos es el aumento en el tamaño hasta registrar tallas de 9.5 a 10 mm y la diferenciación sexual de caracteres externos es bastante notable









Aquaculture. FAO Fisheries Technical Paper. No. 361. Rome, FAO. 295 pp

. Støttrup, J.G. and Lesley A. McEvoy. 2003. Live feeds in marine aquaculture.

Blackwell publishing. 313 pp.



Universidad Autónoma de Baja California. Facultad de Ciencias Marinas. 1987.

Memorias del curso de titulación "Cultivo de Artemia". Ensenada, Baja California.

290 pp.

Manual de Prácticas de Laboratorio de Cultivos de Apoyo Anexos Página 53


Anexos

Normas Generales de Seguridad e Higiene 1. El uso de bata es obligatorio.

2. Antes de empezar el trabajo en el laboratorio tienes que familiarizarte con los elementos de seguridad disponibles.

3. Es necesario localizar las salidas principales y de emergencia por si se diese el caso de una evacuación por fuego o por cualquier otro incidente, así como conocer la localización exacta de extintores, duchas de seguridad y duchas de ojos.

4. Es obligatorio usar gafas de seguridad siempre que se esté en el laboratorio.

5. No usar lentes de contacto en el laboratorio, ya que en caso de accidente las salpicaduras de productos químicos o sus vapores pueden pasar detrás de las lentes y provocar lesiones en los ojos antes de poder retirar las lentes. En estos casos es recomendable el uso de gafas graduadas o de gafas de seguridad cerradas.

6. Sí un producto químico te salpica los ojos, utiliza inmediatamente una ducha de ojos y lava completamente el ojo afectado durante 15 minutos sin interrupción. Actúa siempre con urgencia, en menos de 10 segundos. No dirijas una corriente de alta presión de agua de un grifo directamente al ojo porque podrías lesionarlo. Informa al encargado del laboratorio de lo que ha sucedido y si es necesario pide asistencia médica.

7. 7. El uso de bata (preferentemente de algodón) es obligatorio, ya que por mucho cuidado que se tenga al trabajar, las salpicaduras de productos químicos son inevitables.

8. 8. Así mismo se recomienda llevar zapatos cerrados y no sandalias.

9. 9. No comer ni beber en el laboratorio, ya que hay la posibilidad de que los alimentos o bebidas se hayan contaminado con productos químicos.

10. Los recipientes del laboratorio nunca deben utilizarse para el consumo y conservación de alimentos y bebidas; tampoco las neveras u otras instalaciones destinadas al empleo en los laboratorios.

11. Lavarse siempre las manos después de hacer cualquier análisis y antes de salir del laboratorio.

12. Procure quitarse la bata hasta que salga del laboratorio.

13. Está prohibido fumar en el laboratorio por razones higiénicas y de seguridad.



14. No inhales, pruebes o huelas productos químicos si no estás debidamente informado.

15. Cerrar herméticamente los frascos de productos químicos después de utilizarlos.

16. Para pipetear los líquidos utilice siempre una bombilla pipeteadora, no absorber directamente con la boca.

17. Cuando caliente tubos de ensaye hágalo siempre en la parte superior del líquido y con agitación suave, nunca por el fondo del tubo, y debe estar inclinado y no apuntar hacia ninguna persona.

18. No deben transportarse innecesariamente los reactivos de un sitio para otro del laboratorio. Sí tuviese que hacerlo, tenga cuidado con las botellas, las cuales deben ser siempre transportadas cogiéndolas por el fondo, nunca por la boca de la botella.

19. El área de trabajo tiene que mantenerse siempre limpia y ordenada, sin libros, abrigos, bolsas, productos químicos vertidos.

20. La conducta en el laboratorio debe ser seria, sin bromas, sin correr, jugar, empujar, gritar, etc.

21. No se puede hacer ningún experimento no autorizado.

22. No utilices nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento.

23. No utilices material de cristal en mal estado ya que aumenta el riesgo de accidentes.

24. El material y los aparatos utilizados tienen que dejarse siempre limpios y en perfecto estado de uso.

25. Todos los productos químicos tienen que ser manejados con mucho cuidado de acuerdo con las Hojas de Seguridad de cada una de las sustancias.

26. No inhales los vapores de productos químicos y trabaja siempre en vitrinas extractoras, especialmente cuando manipules productos tóxicos, irritantes, corrosivos o lacrimógenos.

Medidas Generales en Caso de Accidente

Plan general de emergencia • Dar la alarma.

• Ponerse a salvo.

• Ayudar a las personas.

• Luchar contra el fuego.



• Avisar al responsable del departamento.

• Evacuación del edificio en caso necesario.

• Avisar a ambulancias, bomberos.

Fuego en el laboratorio • Evacuar el laboratorio, por pequeño que sea el fuego, por la salida principal o por la salida de

emergencia, sí la principal está bloqueada.

• Avisar a todos los compañeros de trabajo sin que se extienda el pánico y conservando siempre la calma.

• Sí el fuego es pequeño y localizado, apagarlo utilizando un extintor adecuado, arena cubriendo el fuego con un recipiente de tamaño adecuado que lo ahogue.

• Retirar los productos químicos inflamables que estén cerca del fuego. No utilices nunca agua para extinguir un fuego provocado por la inflamación de un disolvente.

• Para fuegos grandes aislar el fuego, utilizar los extintores adecuados, sí el fuego no se puede controlar rápidamente accionar la alarma de fuego, avisar al servicio de extinción de incendios y evacuar el edificio.

Fuego en el cuerpo • Sí se te incendia la ropa, pide inmediatamente ayuda.

• Estírate en el suelo y rueda sobre ti mismo para apagar las llamas.

• No corras ni intentes llegar a la ducha de seguridad si no es que está muy cerca de ti.

• Es tu responsabilidad ayudar a alguien que se está quemando, cúbrele con una manta antifuego, condúcele hasta la ducha de seguridad, si está cerca, hazle rodar por el suelo, no utilices nunca un extintor sobre una persona.

• Una vez apagado el fuego, mantén a la persona tendida, procurando que no coja frío y proporciónale asistencia médica.

Quemaduras • Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas, etc., se tratarán

lavando la zona afectada con agua fría durante 10-15 minutos.

• Las quemaduras más graves requieren atención médica inmediata.

• No utilices cremas y pomadas grasas en las quemaduras graves.



Cortes • Los cortes producidos por la rotura de material de cristal son un riesgo común en el

laboratorio.

• Las cortadas se tienen que lavar bien, con abundante agua corriente, durante 10 minutos como mínimo.

• Sí la cortada es pequeña y deja de sangrar en poco tiempo, lávala con agua y jabón y tápala con una venda.

• Sí la cortada es grande y no deja de sangrar, requiere de asistencia médica inmediata.

Derrame de productos químicos sobre la piel • Los productos químicos que se hayan vertido sobre la piel han de ser lavados inmediatamente

con agua corriente abundantemente, como mínimo durante 15 minutos.

• Las duchas de seguridad instaladas en los laboratorios serán utilizadas en aquellos casos en que la zona afectada del cuerpo sea grande y no sea suficiente el lavado en una pila.

• Es necesario sacar toda la ropa contaminada de la persona afectada lo antes posible mientras esté bajo la ducha.

• Recuerda que la rapidez en el lavado es muy importante para reducir la gravedad y la extensión de la herida.

• Proporcionar asistencia médica a la persona afectada.

Corrosiones en la piel por ácidos y álcalis • Cuando ocurre una corrosión por ácidos, corta lo más rápidamente posible la ropa, lave con

agua abundantemente la zona afectada, neutralice la acidez con bicarbonato de sodio durante 15-20 minutos, sacar el exceso de pasta formada, seca y cubra la parte afectada con linimento óleo-calcáreo o parecido.

• Cuando se produce una corrosión por álcalis, lave la zona afectada abundantemente con agua corriente y aclárala con una disolución de ácido acético al 1%, seca y cubre la zona afectada con una pomada de ácido tánico.

Corrosiones en los ojos • En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos), cuanto antes se lave el ojo,

menos grave será el daño producido.

• Lava los dos ojos con agua corriente abundantemente durante 15 minutos como mínimo en una ducha de ojos, y, si no hay, con un frasco de lavar los ojos.



• Es necesario mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavado debajo de los párpados.

• Es necesario recibir asistencia médica, por pequeña que parezca la lesión.

Ingestión de productos químicos • Antes de cualquier actuación pide asistencia médica.

• Sí el paciente está inconsciente, ponerlo en posición lateral de seguridad, con la cabeza de lado, y estirarle la lengua hacia fuera.

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