MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE … Regional del Sureste Manual de Prácticas de Ecología...

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE

ECOLOGÍA

CICLO ESCOLAR 2017-2018.

Universidad Regional del Sureste

Manual de Prácticas de Ecología Ciclo Escolar 2017-2018

Facultad de Medicina y Cirugía

Codificación: CA/MPL/EC-09

Versión: “09”

Vigencia: 01 de Agosto 2017 -

30 de Junio 2018

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CONTENIDO

PÁGINA

CONTENIDO __________________________________________________________ 1

PRESENTACIÓN _______________________________________________________ 3

GENERALIDADES ______________________________________________________ 3

OBJETIVO ____________________________________________________________ 4

AMBITO DE APLICACIÓN ________________________________________________ 4

NORMATIVIDAD ______________________________________________________ 4

FILOSOFÍA DE LA FACULTAD _____________________________________________ 9

DESARROLLO DE LAS PRÁCTICAS ________________________________________ 11

MANEJO DE RESIDUOS PELIGROSOS BIOLÓGICOS INFECCIOSOS (RPBI) _______________ 11 PRÁCTICA No.1 __________________________________________________________________ 11

EL MICROSCOPIO __________________________________________________________ 14 PRÁCTICA No.2 __________________________________________________________________ 14

LA UBICUIDAD DE LOS MICROORGANISMOS. ___________________________________ 17 PRÁCTICA No.3 __________________________________________________________________ 17

EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS ___________________________________ 21 PRÁCTICA No.4 __________________________________________________________________ 21

TINCIÓN SIMPLE ___________________________________________________________ 24 PRÁCTICA No.5 __________________________________________________________________ 24

TINCIÓN DE GRAM _________________________________________________________ 28 PRÁCTICA No.6 __________________________________________________________________ 28

TINCIÓN ÁCIDO – ALCOHOL RESISTENTE _______________________________________ 34 PRÁCTICA No. 7 _________________________________________________________________ 34

MEDIOS DE CULTIVO _______________________________________________________ 39 PRÁCTICA No.8 __________________________________________________________________ 39

AISLAMIENTO DE BACTERIAS. ________________________________________________ 43 PRÁCTICA No.9 __________________________________________________________________ 43

MORFOLOGIA COLONIAL ____________________________________________________ 46 PRÁCTICA No. 10 ________________________________________________________________ 46

CULTIVO DE EXUDADO FARÍNGEO ____________________________________________ 48 PRÁCTICA No. 11 ________________________________________________________________ 48





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ANTIBIOGRAMA ___________________________________________________________ 53 PRÁCTICA No. 12 ________________________________________________________________ 53

UROCULTIVO _____________________________________________________________ 57 PRÁCTICA No. 13 ________________________________________________________________ 57

COPROCULTIVO ___________________________________________________________ 63 PRÁCTICA No. 14 ________________________________________________________________ 63

PRUEBA SEROLOGICA DEL DENGUE ___________________________________________ 68

PRÁCTICA No. 15 __________________________________________________________ 68

COPROPARASISTOCÓPICO DIRECTO ___________________________________________ 73 PRÁCTICA No. 16 ________________________________________________________________ 73

INVESTIGACION DE HEMATOZOARIOS _________________________________________ 79 PRÁCTICA No.17 ________________________________________________________________ 79

REACCIONES FEBRILES ______________________________________________________ 85 PRÁCTICA No. 18 ________________________________________________________________ 85

REACCION V.D.R.L _________________________________________________________ 89 PRÁCTICA No. 19 ________________________________________________________________ 89

ESTUDIO MORFOLÓGICO DE HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS ________________ 92 PRÁCTICA No. 20 ________________________________________________________________ 92

DIRECTORIO DE LA FACULTAD DE MEDICINA Y CIRUGÍA ___________________________ 96





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PRESENTACIÓN La Facultad de Medicina y Cirugía de la Universidad Regional del Sureste, cumpliendo con la responsabilidad que le implica su filosofía, tiene el compromiso de proporcionar a sus estudiantes la mejor formación, basada en las tres esferas que dignifican al médico: la excelencia, la ética y el humanitarismo Esto implica trabajar constantemente con amor a nuestra Universidad, dando siempre lo mejor de nosotros, pensando en la realización de nuestros alumnos. Éste es el motor que nos impulsa a ser mejores y a no escatimar esfuerzo alguno para bien de nuestros alumnos, de nuestro estado, de nuestra Universidad y de nuestra Facultad de Medicina y Cirugía.

GENERALIDADES La microbiología se ocupa del estudio de los microorganismos, así como de la interacción que ejercen con otros organismos y con el medio ambiente, de ahí que los estudiemos en la materia de ECOLOGÍA en la carrera de Médico Cirujano de nuestra Universidad. En nuestro país las enfermedades infecciosas ocupan importante lugar y no hay indicios de que su frecuencia tienda a disminuir, o solo en casos muy limitados, pero con frecuencia para volver a aumentar más tarde. Aunque es bueno mencionar también que no todos los microorganismos causan daño, sino solo algunos cuantos ya que la mayoría podemos afirmar producen efectos benéficos de diferentes formas. Por estas razones dentro de la formación del médico y durante toda su vida es muy importante que conozca y cada vez más las interacciones con los microorganismos que le permitan prevenir, diagnosticar, tratar las enfermedades producidas por los mismos. A los microorganismos tienen que conocerse no solo por sus efectos, también tienen que conocerse su morfología, su fisiología, sus mecanismos de patogenicidad etc., para poderse explicar el porqué de su acción. El futuro médico necesita comprender porque organismos tan pequeños son capaces de ofrecernos tan grandes beneficios, pero también graves daños. Por más esfuerzos que hagamos jamás podríamos eliminar a todos los microorganismos ni tendríamos porque hacerlo, lo que si podremos hacer es fijar límites con respecto a su acción y esta es una de las tareas del médico. Las prácticas de laboratorio nos aproximan a un conocimiento más íntimo con los microorganismos y nos hace más sensible a sus efectos, de tal manera que podamos





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saber de su presencia de una manera directa o indirecta haciendo uso de diferentes procedimientos mismos que cada vez van siendo más sensibles y específicos y su conocimiento es y será fundamental para el médico en la práctica profesional.

OBJETIVO Poner de manifiesto la presencia de diversos microorganismos por medio de diferentes técnicas de laboratorio, para conocerse su morfología, fisiología, y mecanismos de patogenicidad, que permitan al médico prevenir, diagnosticar, y tratar las enfermedades producidas por los mismos.

AMBITO DE APLICACIÓN Dirigido a los alumnos de segundo año que cursan la materia de Ecología.

NORMATIVIDAD

REGLAMENTO DEL LABORATORIO MULTIDISCIPLINARIO El Laboratorio Multidisciplinario y los anexos del mismo, así como el mobiliario, instrumentación, material y reactivos que en ellos se encuentran, son propiedad de la Universidad Regional del Sureste, A. C. y el presente reglamento tiene como finalidad el normar la eficiencia, el orden y la disciplina que deben prevalecer en el mismo, para un mejor cumplimiento de sus objetivos.

CAPÍTULO I

DE LOS ALUMNOS

ARTÍCULO 1. Todos los alumnos portarán su credencial en un lugar visible, a manera de gafete, para entrar y permanecer en el laboratorio. ARTÍCULO 2. Todos los alumnos tendrán igualdad de oportunidades para responsabilizarse y realizar su formación dentro de las prescripciones del presente reglamento, de acuerdo a los planes y programas de estudio establecidos. ARTÍCULO 3. Todos los alumnos tienen el derecho a qué el Laboratorio les facilite oportunidades y servicios, para que puedan conseguir su formación integral en condiciones de libertad responsable.





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ARTÍCULO 4. Los usuarios del Laboratorio tienen derecho a recibir orientación y asesoría en los problemas prácticos que se les presenten respetando su conciencia y dignidad personal. ARTÍCULO 5. Los alumnos podrán formular ante los Catedráticos o Instructores cuantas iniciativas y sugerencias estimen oportunas, siempre de manera respetuosa y para el bien común, siendo valoradas estas, con la objetividad del caso. ARTÍCULO 6. El Laboratorio Multidisciplinario está diseñando para los usos que designe la Dirección General de Asuntos Académicos de la Universidad Regional del Sureste, a las Direcciones de cada una de sus Escuelas. ARTÍCULO 7. Es obligación de las Direcciones de Escuela, impedir el acceso al uso de estas instalaciones a los alumnos, a los cuales no se les otorgue autorización. ARTÍCULO 8. Para poder hacer uso de las instalaciones el alumno deberá presentarse puntualmente de acuerdo con su horario de actividades teniendo un margen de retraso de 10 minutos como máximo, quedando a criterio del Catedrático y/o Instructor del Laboratorio, el permitirle la entrada después de este tiempo. ARTÍCULO 9. El alumno, al término de su práctica, está obligado a entregar el material asignado limpio, íntegro y revisado por el Instructor; así como el área de trabajo designada, antes de abandonar el Laboratorio. ARTÍCULO 10. El alumno que no cumpla con lo estipulado en el artículo anterior, será suspendido en la siguiente práctica, y si reincide en la misma falta, la sanción la dictará el Catedrático y/o Instructor, de común acuerdo con la Dirección de la Escuela. ARTÍCULO 11. El alumno que cause daño, deteriore o dé uso inadecuado a las instalaciones, instrumentación y material del Laboratorio se hará responsable del daño, independientemente de la sanción administrativa o legal que el Reglamento señale, la cual será aplicada por la Dirección de la Escuela, Dirección General de Asuntos Estudiantiles o autoridad correspondiente. ARTÍCULO 12. Queda estrictamente prohibido a todos los alumnos hacer uso del Laboratorio en ausencia del Catedrático y/o Instructor.





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ARTÍCULO 13. Siempre deberá permanecer el Instructor en el Laboratorio, los alumnos deberán colaborar con sus compañeros en el desarrollo de las prácticas, participando activamente en el trabajo escolar que sea formativo. ARTÍCULO 14. El alumno deberá respetar la dignidad y función de los Directivos, Catedráticos, Personal Administrativo y de Intendencia que integran esta sección de la comunidad.

CAPÍTULO II DE LOS CATEDRÁTICOS

ARTÍCULO 1. Es responsabilidad y obligación de los Catedráticos e Instructores, velar por el máximo aprovechamiento académico dentro del Laboratorio de la Escuela. ARTÍCULO 2. El Catedrático y el Instructor vigilarán y asesorarán el correcto desarrollo de las actividades prácticas de los alumnos. ARTÍCULO 3. El Instructor debe permanecer en el Laboratorio, hasta el momento en que el último alumno entrega a satisfacción el material y el área donde trabaja. ARTÍCULO 4. El Instructor debe presentarse puntualmente a sus prácticas, para que los alumnos inicien su desarrollo experimental. ARTÍCULO 5. Es obligación del Instructor ver que los alumnos se retiren del Laboratorio en forma oportuna, para no interferir en las siguientes prácticas programadas. ARTÍCULO 6. El Catedrático está facultado para sancionar dentro de su clase, al alumno que incurra en alguna irresponsabilidad en el Laboratorio notificándolo, en su caso, a la autoridad correspondiente. ARTÍCULO 7. El Catedrático deberá presentar oportunamente su programa de prácticas, anexando la relación de recursos necesarios para las mismas. ARTÍCULO 8. El Catedrático debe proponer las actividades prácticas que se desarrollarán y que éstas lleguen al término en el tiempo programado, para que no interfieran en ninguna otra actividad académica. ARTÍCULO 9. El Instructor del Laboratorio es responsable del equipo e Instalaciones del Laboratorio en forma permanente.





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ARTÍCULO 10. El Catedrático e Instructor deben cumplir y hacer cumplir el presente reglamento.

CAPÍTULO III DE LA SEGURIDAD E HIGIENE

ARTÍCULO 1. Al estar realizando cualquier práctica todos los participantes deberán adoptar un comportamiento que favorezca el trabajo escolar, y evite la probabilidad de riesgos y accidentes. ARTÍCULO 2. En todas las prácticas, los participantes deberán tener conciencia, que todos los recipientes se pueden encontrar potencialmente contaminados y que el material seco puede no ser visible, sin embargo, si estar presente, por lo cual, adoptará las medidas higiénicas pertinentes. ARTÍCULO 3. Queda estrictamente prohibido fumar, introducir alimentos y bebidas al Laboratorio. Así como acceder con goma de mascar. ARTÍCULO 4. Como medida de higiene todos los asistentes al Laboratorio utilizarán bata de manga larga, la cual portarán abotonada, por ningún motivo se permitirá el uso de bata de manga corta o filipina. ARTÍCULO 5. Como medida de seguridad todos los alumnos asistirán al Laboratorio con las uñas recortadas y evitarán la práctica de morderse las uñas, la goma o la cabeza de lápiz o la pluma. ARTÍCULO 6. Está prohibido presentarse al Laboratorio con sortijas y brazaletes, así como aplicarse cosméticos en el interior del mismo. ARTÍCULO 7. Se prohíbe sentarse en las mesas de trabajo. ARTÍCULO 8. Al término de cada práctica los alumnos deberán lavarse las manos escrupulosamente, por la posibilidad de haber manejado material potencialmente tóxico o infeccioso.





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CAPÍTULO IV GENERALES

ARTÍCULO 1. Queda prohibida la entrada al Laboratorio a toda persona ajena al mismo tales como vendedores, compañeros, amigos o visita de los alumnos. ARTÍCULO 2. El área de Laboratorio es de uso exclusivo para el desarrollo práctico, por lo tanto, no se debe impartir clases teóricas dentro del mismo. ARTÍCULO 3. El área de Laboratorio deberá permanecer cerrada cuando en él no se encuentre desarrollando ninguna actividad.

CAPÍTULO V

TRANSITORIO ARTÍCULO 1. Cualquier situación no prevista en el presente reglamento, será resuelta por la Dirección de la Facultad y, en su caso, por la Dirección General de Asuntos Académicos. RECOMENDACIONES:

1. La toma de muestras en seres humanos, deberán sujetarse a los principios de: ética, respeto, confidencialidad y privacidad.

2. En caso de toma de muestras a menores de edad, deberán estar acompañados de sus padres o responsables.





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FILOSOFÍA DE LA FACULTAD MISIÓN

“Formar médicos generales con una sólida preparación integral, académica y científica, líderes que ejerzan la profesión con vocación humanística y ética, que privilegien la promoción de la salud y la prevención de la enfermedad, en el individuo, en la comunidad y en su entorno, para que resuelvan la problemática de salud de la población dentro de su ámbito de competencia” VISIÓN “Ser la institución educativa formadora de profesionales de la salud con calidad y prestigio nacional e internacional” VALORES

x VOCACIÓN

x ÉTICA

x HUMANITARISMO PARA EL PACIENTE Solidaridad Servicio Prudencia OBJETIVOS A la luz del perfil que se ha descrito, los objetivos que debe alcanzar el profesional Médico-Cirujano al concluir el proceso enseñanza-aprendizaje, son los siguientes:

1. Tener el dominio de los elementos teóricos, metodológicos y técnicos de las

ciencias médicas, básicas, propedéuticas, médico-quirúrgicas y clínicas, que

constituyen el eje metodológico de la formación del médico cirujano.

2. Integrar sus valores profesionales y humanísticos a través del conocimiento

de las ciencias socio administrativas.





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3. Tener los conocimientos epidemiológicos que le permiten analizar las

determinantes y condiciones del proceso salud-enfermedad.

4. Contribuir al desarrollo de su profesión y ejercicio profesional mediante la

auto-enseñanza.

PERFIL DEL EGRESADO

Es el profesional que está dotado de conocimientos científicos, humanísticos,

administrativos y de investigación, que le permiten, dentro del marco legal en

materia de salud, actuar como gestor y agente de cambio en la prevención y

fomento de la salud, diagnosticar y tratar enfermedades y realizar

procedimientos quirúrgicos en el primer nivel de atención a la salud,

identificando situaciones que ameriten del segundo y tercer nivel; aplicando, en

su caso, medidas de sostén inmediatas mientras los refiere. Posee las bases

formativas para continuar con estudios de postgrado.





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DESARROLLO DE LAS PRÁCTICAS MANEJO DE RESIDUOS PELIGROSOS BIOLÓGICOS

INFECCIOSOS (RPBI)

PRÁCTICA No.1 INTRODUCCIÓN De acuerdo con la NOM-087-ECOL-SSA1-2002 sobre el manejo de RPBI, para que un residuo sea considerado RPBI debe de contener agentes biológicos infecciosos. La norma señala como agente biológico-infeccioso “cualquier organismo que sea capaz de producir enfermedad. Para ello se requiere que el microorganismo tenga capacidad de producir daño, esté en una concentración suficiente, en un ambiente propicio, tenga una vía de entrada y estar en contacto con una persona susceptible”. Se consideran residuos peligrosos biológico-infecciosos los siguientes:

x Sangre La sangre y los componentes de ésta, sólo en su forma líquida, así como los derivados no comerciales, incluyendo las células progenitoras, hematopoyéticas y las fracciones celulares o a celulares de la sangre resultante (hemoderivados).

x Cultivos y cepas de agentes biológico- infecciosos Cultivos generados en los procedimientos de diagnóstico e investigación, así como los generados en la producción y control de agentes biológico-infecciosos. Utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes biológico-infecciosos.

x Patológicos Tejidos, órganos y partes que se extirpan o remueven durante las necropsias, la cirugía o algún otro tipo de intervención quirúrgica, que no se encuentren en formol. Así como también muestras biológicas para análisis químico, microbiológico, citológico e histológico, excluyendo orina y excremento; cadáveres y partes de animales que fueron inoculados con agentes entero patógenos en centros de investigación y bioterios.





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x Residuos no anatómicos Recipientes desechables que contengan sangre líquida; materiales de curación, empapados, saturados, o goteando sangre o cualquiera de los siguientes fluidos corporales: líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido pleural, líquido céfalo-raquídeo o líquido peritoneal o materiales desechables que contengan esputo, secreciones pulmonares y cualquier material usado para contener éstos, de pacientes con sospecha o diagnóstico de tuberculosis o de otra enfermedad infecciosa; así como materiales desechables de pacientes con sospecha o diagnóstico de fiebres hemorrágicas.

x Objetos punzo cortantes Que han estado en contacto con humanos o animales o sus muestras biológicas durante el diagnóstico y tratamiento, únicamente: tubos capilares, navajas, lancetas, agujas de jeringas desechables, agujas hipodérmicas, de sutura, de acupuntura y para tatuaje, bisturíes y estiletes de catéter, excepto todo material de vidrio roto utilizado en el laboratorio, el cual se deberá desinfectar o esterilizar antes de ser dispuesto como residuo municipal. En la siguiente tabla se muestra cómo clasificar los residuos peligrosos biológicos infecciosos.





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ACTIVIDADES

1. Investigar cual es el símbolo internacional de Riesgo Biológico. 2. Investigar e imprimir la NOM-087-ECOL-SSA1-2002 3. Leer los procedimientos de las prácticas 6, 15, y 16 de su cuadernillo y

realizar una tabla similar a la anterior con los residuos que se generaran en la realización de estas prácticas.





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EL MICROSCOPIO

PRÁCTICA No.2 INTRODUCCIÓN La mayoría de los organismos unicelulares son invisibles para el ojo humano, por lo que el uso del microscopio resulta indispensable para observar a estos seres vivos, para lograr una buena observación microscópica; además del aumento de la imagen, también son importantes el contraste y la resolución. El microscopio óptico compuesto con iluminación en campo claro es el más utilizado en Microbiología. El microscopio compuesto es aquel cuyo sistema óptico dispone de dos o más lentes de aumento. Estructuralmente, el microscopio consta de un sistema mecánico y un sistema óptico. El sistema mecánico lo forman: El soporte (base, portafiltros, diafragma, brazo, platina, tornillos, macro y micrométrico), y el sistema óptico (condensador, objetivo, ocular). MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO

1. Compruebe que las lentes del ocular y de los objetivos estén limpios.

2. Coloque el portaobjetos con la muestra a observar sobre la platina, de manera que quede asegurado por el dispositivo de sujeción.

3. Disminuya la iluminación de la preparación bajando el condensador

(más contraste), y con el diafragma abierto.

4. Coloque en posición el objetivo de 10X y realice la operación de enfoque de la siguiente manera:

a) Mirando por el ocular gire el tornillo macrométrico y acerque al máximo la

lente del objetivo a la preparación.

b) Gire el tornillo micrométrico en sentido opuesto y aleje el objetivo de la preparación lentamente, hasta que obtenga un enfoque nítido. (No bajar platina)

5. Gire el revólver y coloque en posición el objetivo de 40X; suba ligeramente el condensador hasta obtener una iluminación suficiente





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para ese aumento, la imagen debería estar casi enfocada, pero puede ser necesario afinar el enfoque girando un poco el tornillo micrométrico. Si no consigue enfocar con facilidad, es preferible volver a enfocar con objetivo de 10X y repetir la operación. La distancia optima funcional del objetivo de 40X es de unos pocos milímetros por encima de la preparación, por lo que podría romperse si se descuidan las precauciones descritas.

6. Empleo del objetivo de inmersión 100X: a) Una vez que se haya enfocado con el objetivo de 40X, gire el revolver

hacia el objetivo de inmersión, sin llegar a colocarlo en posición, sino a la mitad entre los dos objetivos citados.

b) Coloque una gota de aceite de inmersión sobre la muestra en la zona de observación.

c) Gire con precaución el revolver hasta situar en posición el objetivo de inmersión y asegurarse que no toca la preparación, pero sí la gota de aceite. Tenga en cuenta que la distancia del objetivo de inmersión y la preparación es muy pequeño por lo que el riesgo de dañar dicho objetivo es ahora máximo.

d) Gire ligeramente el tornillo micrométrico hasta conseguir un enfoque nítido. La preparación debería estar prácticamente enfocada. Si se ha realizado un enfoque adecuado con el objetivo de 40X. De no ser así, es preferible volver a enfocar de nuevo un campo distinto, partiendo del objetivo de 10X; para ello, debe retirar el objetivo de inmersión, girando el revolver hacia el objetivo de menor aumento, pues de lo contrario correría el riesgo de manchar con aceite el objetivo de 40X. De hecho, este objetivo solo podrá ser empleado sobre una preparación nueva y, por tanto, libre de aceite de inmersión.

e) Finalizada la observación de una preparación y antes de retirarla de la platina, se colocará el objetivo de menor aumento. Nunca retire la preparación con el objetivo de inmersión en posición de observación.

f) Retire la preparación y limpie el objetivo de inmersión con cuidado empleando un pañuelo o papel especial para óptica.





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MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES

1. Si no se está utilizando el microscopio, este debe quedar guardado o bien cubierto por su funda, con el fin de evitar que se ensucien y dañen las lentes.

2. Evite tocar las lentes con los dedos. En caso de necesidad, limpie la lente cuidadosamente y con suavidad, empleando un pañuelo o papel especial para óptica.

3. No gire el revólver valiéndose de los objetivos. Para esa finalidad haga uso de la zona estriada que el propio revólver tiene en su periferia.

4. Después de utilizar el objetivo de inmersión, limpie los restos de aceite que queden en el objetivo, con un pañuelo o papel especiales para óptica. Si el aceite ha llegado a secarse sobre el objetivo, debe limpiarse con una mezcla de etanol-acetona o xilol. Hay que tener mucha precaución, porque una aplicación excesiva de estos disolventes puede dañar las lentes y su sujeción.

5. No fuerce nunca los dispositivos giratorios del microscopio (tornillos macro y Micrométrico, mecanismo de desplazamiento sobre la platina, revolver y condensador).

6. No cambie nunca de objetivo mientras está observando a través del ocular. Por el contrario, vigile esta operación sin mirar por el ocular, para evitar un posible contacto del objetivo con la muestra.

7. Cuando finalice el trabajo coloque en posición el objetivo de menor aumento. De esta manera, disminuye la posibilidad de accidente y facilita la operación de enfoque inicial del siguiente usuario.

CUESTIONARIO

1. ¿Para qué sirve el microscopio?

2. ¿De cuántas partes consta el microscopio? Descríbalas

3. ¿Qué otros tipos de microscopios existen además del de campo claro?





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LA UBICUIDAD DE LOS MICROORGANISMOS.

PRÁCTICA No.3 INTRODUCCIÓN Debido a su enorme diversidad metabólica, los microorganismos pueden colonizar prácticamente cualquier hábitat: el suelo, el aire, cualquier superficie inerte o viva, nuestra piel, etc. Una de las características de los microorganismos es, por tanto su ubicuidad, los podemos encontrar en todas partes. Además, en muchas ocasiones interaccionan con otros seres vivos, bien como organismos comensales que no inducen daño alguno al huésped (microbiota normal), bien como organismos simbiontes que se benefician de dicha interacción, o incluso como patógenos causando enfermedades. OBJETIVOS

1. Comprobar la ubicuidad de los microorganismos ambientales, simbiontes o como parte de la microbiota normal.

2. Discutir el significado de la presencia de un tipo u otro de microorganismos en un determinado ambiente.

MATERIAL

- Placas de agar nutritivo. - Hisopos estériles. - Reactivos para tinción de Gram. - Portaobjetos limpios. - Tijeras y pinzas. - Mechero Bunsen. - Estufa bacteriológica. - Microscopio.





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- Aceite de inmersión. - Raíces de leguminosa (p. ej., trébol, alfalfa, etc.).

PROCEDIMIENTO

1. Sobre una placa de agar nutritivo siembre lo que desee (cabello, tierra, polvo, una moneda, etc., o dejar la placa abierta durante varios minutos); también con un hisopo humedecido puede tomar una muestra de alguna superficie y sembrarla, sobre la superficie de la placa de agar.

2. Incubar la placa a 37ºC ó a temperatura ambiente uno o más días. 3. Comprobar el crecimiento microbiano y sobre la superficie de las placas

(número y aspecto de las colonias). 4. Realizar una tinción de Gram de cada colonia diferente. 5. Separar los nódulos de la raíz de una planta leguminosa. Colocarlo sobre

un portaobjetos y triturarlos con la ayuda de pinzas y tijeras.

Nota: Los nódulos son pequeños abultamientos que aparecen en las raíces de las leguminosas, colonizados con bacterias del género Rhizobium. Gracias a esta simbiosis entre la leguminosa y Rhizobium, la planta es capaz de realizar la fijación de nitrógeno atmosférico.

6. Colocar una pequeña muestra del triturado en otro portaobjetos con una

gota de agua, secar, fijar y teñir al Gram. 7. Con la ayuda de un hisopo estéril frotar la parte interna de la boca y/o las

encías. Depositar la muestra sobre un portaobjetos, fijar y teñir al Gram. 8. Observe al microscopio todas los frotis teñidos con el objetivo de

inmersión y anote la forma y tinción de las bacterias que aparecen. Distinga las células epiteliales y compare la diferencia de tamaño entre estas y las bacterias.





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CUESTIONARIO

1. ¿Qué tipos bacterianos aparecen con más frecuencia en las muestras ambientales?

2. ¿Todos los microorganismos que se aíslan del ambiente son bacterias?

3. Discuta el sentido biológico por el que abundan tanto las formas esféricas (cocos) en las muestras de superficies, ¿Dónde esperaría encontrar formas bacilares?

4. En la simbiosis Rhizobium-leguminosa, ¿Qué beneficios obtienen la planta y la bacteria?

5. ¿Qué tipos bacterianos aparecen con más frecuencia como parte de la microbiota oral?





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EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS

PRÁCTICA No.4 INTRODUCCIÓN El examen en fresco de una suspensión microbiana, es la técnica de observación microscópica más fácil y rápida de realizar. Es, además, el método de elección cuando se desea evitar la alteración que sufren los microorganismos de una muestra, cuando ésta se somete a una fijación y a una posterior tinción. Dichas alteraciones ocasionan en la mayoría de los casos la rápida muerte de los microorganismos. Por ello, el examen en fresco posibilita la observación de los microorganismos vivos, y permite estudiar determinadas características, como su morfología y tamaños reales, su color natural o sus movimientos. Sin embargo, el examen en fresco de microorganismos que carecen de color natural, puede dar resultados deficientes, debido al reducido contraste entre la muestra y el medio circundante. OBJETIVOS

1. Observar microorganismos vivos (protozoarios y bacterias ) y poder estudiar su morfología y color en condiciones naturales.

2. Observar diferentes clases de movimientos microbianos. 3. Aprender a emplear correctamente el microscopio.

MATERIALES Y APARATOS

1. Muestra: agua estancada de charco y/o de florero de cinco días. 2. Mechero Bunsen. 3. Asa bacteriológica y/o pipetas Pasteur. 4. Porta objetos y cubre objetos limpios. 5. Microscopio de campo claro.





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PROCEDIMIENTO

1. Colocar una pequeña gota de la muestra sobre un portaobjetos limpio, utilizando un asa bacteriológica o una pipeta Pasteur.

2. Colocar el cubreobjetos sobre el portaobjetos. Para evitar que se formen

burbujas, depositar el cubreobjetos sobre la gota, primero una arista y luego lentamente, el resto.

3. Observar a través del microscopio.

Nota: Tenga en cuenta que el calor desprendido por el foco luminoso irá secando la preparación y, como consecuencia, los microorganismos detendrán su movimiento. Además, aparecerán corrientes de líquido que pueden dificultar la observación de la muestra y hacer creer que un microorganismo inmóvil es capaz de nadar. Cuando se observen estos defectos, hay que levantar el cubreobjetos y añadir más líquido. Trate de distinguir el movimiento activo de los microorganismos (por medio de cilios, flagelos o por deslizamiento) del movimiento “browniano”.

4. Dibuje detalladamente los diferentes tipos morfológicos y describa sus

movimientos.





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CUESTIONARIO

1. Señale las ventajas e inconvenientes del examen en fresco.

2. ¿Por qué se coloca un cubreobjetos sobre la muestra?

3. Enumere las diferencias de tamaño y de otro tipo (morfológica, estructurales) que haya observado entre los microorganismos procariotas y los eucariotas.

4. Si ha podido observar microorganismos móviles, explique qué tipo de estructuras cree que generan ese movimiento.

Euglenfitas Paramesium





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TINCIÓN SIMPLE

PRÁCTICA No.5 INTRODUCCIÓN La mayoría de las bacterias son transparentes, por lo que suele ser necesario recurrir al uso de tinciones, si se desea observar a estos seres vivos con un microscopio óptico convencional, de campo claro. Las tinciones aumentan artificialmente el contraste entre las células bacterianas y el medio circundante. La tinción que hace uso de un solo colorante se denomina tinción simple. Las tinciones más usadas en Bacteriología requieren previamente que la muestra en estudio se someta al proceso de fijación. Habitualmente, las muestras bacterianas se preparan para ser observadas en forma de frotis, lo que asegura una adecuada separación entre las células y facilita que la tinción posterior se distribuya de manera homogénea. OBJETIVOS

1. Preparar frotis bacterianos y realizar tinciones simples empleando dos tipos de colorantes.

2. Observar la morfología bacteriana y aprender a distinguir los distintos tipos de agrupaciones.

3. Practicar la observación con el microscopio al máximo aumento y familiarizarse con el correcto empleo del aceite de inmersión.

MATERIAL

Cultivo bacteriano. Mechero Bunsen. Asa bacteriológica Portaobjetos. Solución de cristal violeta.





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Solución de safranina. Microscopio. Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO

1. Coloque sobre dos portaobjetos limpios una pequeña gota de agua con el asa bacteriológica.

2. Transfiera una pequeña cantidad de la colonia elegida y extienda bien hasta formar una película delgada.

3. Caliente el frotis sobre el mechero, haciendo rápidos pases sobre la llama y recuerde que demasiado calor dañará la integridad estructural de las células. (si utiliza pinza no presione demasiado la laminilla para no quebrarla)

4. Cubra un frotis con cristal violeta y el otro con safranina, de manera que no quede ninguna porción sin teñir. Permita actuar a los colorantes durante un minuto.

5. Lavar las preparaciones con agua para eliminar el exceso de colorante. Para ello, incline el portaobjetos y aplique agua corriente del grifo en su parte superior, de manera que resbale poco a poco sobre el frotis.

6. Sacudir los frotis y dejar secar, colocándolos en forma inclinada sobre un papel absorbente.

7. Cuando se han secado, colocarlos uno a uno en el microscopio y añadir una pequeña gota de aceite de inmersión y observar con el objetivo de inmersión (100X).





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CUESTIONARIO

1. ¿Qué tipo de morfología y de agrupación ha podido observar en cada frotis?

2. ¿De qué color se tiñeron las bacterias en cada frotis?

3. ¿Qué finalidad tiene fijar las muestras cuando se realiza un frotis bacteriano?

4. Señale las ventajas y desventajas de la tinción simple respecto del examen en fresco.

Tinción simple con safranina





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TINCIÓN DE GRAM

PRÁCTICA No.6 INTRODUCCIÓN Las tinciones diferenciales se denominan así, porque son capaces de diferenciar estructuras o incluso microorganismos que poseen características superficiales distintas. Este tipo de tinciones requieren el empleo de más de un colorante. La tinción diferencial más empleada en Bacteriología es la tinción de Gram. Esta tinción se llama así en honor de Christian Gram, Patólogo danés que la describió por primera vez en 1884, y se sigue usando sin apenas modificaciones y constituye la primera etapa de cualquier proceso de identificación bacteriana. La aplicación de esta tinción permite clasificar las bacterias en dos grandes grupos: las Gram positivas y las Gram negativas. Estos dos grupos poseen características estructurales superficialmente y notablemente distintas. FUNDAMENTO La tinción de Gram requiere la utilización de cuatro soluciones en el siguiente orden:

1. Primer colorante. Es de naturaleza básica y tiene, por tanto, afinidad por estructuras cargadas negativamente, como es el caso de la pared celular de la mayoría de las bacterias. El colorante penetra en la pared celular y la tiñe. El compuesto de este tipo más utilizado es el cristal violeta. Como consecuencia de este tratamiento, tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas aparecerán teñidas de violeta.

2. Solución mordiente. Se combina con el primer colorante y forma un

complejo, que es insoluble en el caso de los Gram positivos. Los mordientes empleados suelen ser sales metálicas, ácidos o bases, como por ejemplo, una solución diluida de Yodo. Este tratamiento no altera la coloración que la muestra adquirió en el primer tratamiento.





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3. Agente decolorante. Es un disolvente orgánico o una mezcla de disolventes, como por ejemplo, etanol-acetona (1:1). Mientras que este tratamiento decolora a las bacterias Gram negativas, no tiene capacidad para disolver el complejo formado en la pared celular de las bacterias Gram positivas, que por tanto, no pierden la coloración en este paso.

4. Colorante de contraste. Es un colorante básico de distinto color que el

primer colorante. El colorante de contraste más utilizado es la safranina, que tiñe de color rojo. Este tratamiento teñirá solo a las bacterias que han perdido previamente el primer colorante, es decir, a las Gram negativas.

OBJETIVO

1. Ser capaz de diferenciar entre bacterias Gram positiva y Gram negativas. 2. Comprobar las limitaciones que existen en la tinción cuando se utilizan

cultivos bacterianos en fase estacionaria. MATERIAL Cultivos bacterianos. Colorante de cristal violeta al 1 % Solución de lugol. Colorante de Safranina 0.5 %. Alcohol acetona (1:1). Aceite de inmersión. Portaobjetos. Asa bacteriológica. Mechero Bunsen. Microscopio.





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PROCEDIMIENTO Nota: se usará cultivos en fase exponencial de bacterias Gram positiva y Gram negativas y además otro en fase estacionaria, se hará una suspensión de cada una y se identificará claramente. (A, B y C).

1. Preparar cuatro portaobjetos limpios y secos, identificarlos como 1, 2,3 y 4.

2. Con lápiz graso, marcar una división a la mitad en cada portaobjetos de los identificados como 1, 2 y 3; en una mitad de cada uno poner una gota de la suspensión A y en la otra de la suspensión B, en el portaobjetos marcado como 4, poner una gota de la suspensión C.

3. Hacer frotis y fijar como lo realizado en la tinción simple. 4. Colocar en forma adecuada sobre el lavabo y cubrirlos con cristal violeta

(1 minuto). 5. Lavar con agua corriente y separar el frotis 1; colocar en posición

inclinada y dejar secar. 6. Continuar con los frotis restantes (2, 3 y 4), cubriéndolos con solución de

lugol (1 minuto). 7. Lavar con agua corriente y cubrir con alcohol acetona hasta

decoloración (30 segundos.). 8. Lavar con agua para eliminar el exceso de disolvente, separar el frotis 2,

colocar en posición inclinada y dejar secar. 9. Los frotis 3 y 4 cubrirlos con colorante de safranina (1 minuto), lavar y

dejar secar. 10. Observar al microscopio uno a uno todos los frotis y anotar las

características de cada uno de ellos.





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Nota: Con otro frotis de sangre se hará la tinción de Giemsa esta tinción será utilizada en otras prácticas posteriores.

CUESTIONARIO

1. ¿De qué color se teñirán las bacterias Gram positivas y de qué color las Gram negativas?

2. ¿Describa cuál es la razón por la cual unas bacterias se tiñen de un color

y otras de otro color?

3. ¿Cuáles son las características estructurales de una bacteria Gram positiva y otra Gram negativa?

4. Describa la morfología bacteriana observada.

5. Comente lo observado en el frotis No.4.





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TINCIÓN ÁCIDO – ALCOHOL RESISTENTE

PRÁCTICA No. 7 INTRODUCCIÓN La mayoría de la bacterias se pueden clasificar como Gram positivas y Gram negativas. Sin embargo, para teñir algunas bacterias del grupo de los actinomicetos, como las del género Mycobacterium, se necesitan procedimientos más invasivos. El microbiólogo alemán Robert Koch ideó una técnica capaz de teñir a la bacteria Mycobacterium tuberculosis. Esta técnica se basa en el hecho de que, una vez teñidas con colorantes especiales y a alta temperatura, las células de M. tuberculosis resisten el efecto decolorante de una mezcla de ácido y alcohol. Por ello, este tipo de tinción se llama ácido alcohol resistente y a los microorganismos que comparten estas propiedades tintoriales se les conoce como bacterias ácido alcohol resistente. En la actualidad, se utiliza una modificación de la original que recibe el nombre de los microbiólogos que la describieron: tinción de Ziehl-Neelsen. FUNDAMENTO El ácido alcohol resistencia se correlaciona con el alto contenido en lípidos de la pared celular y con la presencia de un tipo específico de ácidos grasos llamados ácidos micólicos. Esta peculiar composición confiere a la célula una alta hidrofobicidad. Para poner de manifiesto el ácido alcohol resistencia en la tinción de Ziehl-Neelsen, se requiere el empleo de las siguientes soluciones: Fucsina-fenol (carbol fucsina), que cuando se aplica en caliente es capaz de teñir todo tipo de de células bacterianas, incluidas las de Mycobacterium. El fenol facilita la penetración de la fucsina en la pared celular. Agente decolorante: Es una solución de ácido clorhídrico (0.36N) en etanol, con un elevado poder de decoloración que, no obstante, es insuficiente para arrastrar la fucsina asociada a la pared celular del Mycobacterium. Colorante de contraste: azul de metileno, que cumple el mismo papel que la safranina en la tinción de Gram. Tras el tratamiento con fucsina y fenol, todas las bacterias se tiñen de rosa-rojo. Sin embargo, mientras las bacterias ácido-alcohol resistentes no cambian de





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color cuando se tratan con agentes decolorantes, el resto de bacterias se decoloran y podrán tomar posteriormente el colorante de contraste. En consecuencia, las células de Mycobacterium quedarán teñidas de rosa-rojo y las bacterias ácido alcohol sensibles aparecerán de color azul. OBJETIVOS

1. Estudiar la morfología y las propiedades tintoriales de las bacterias ácido alcohol resistente.

2. Comprobar la capacidad para diferenciar este tipo de bacterias en población mixta con otras bacterias.

MATERIAL Material biológico (Mycobacterium smegmatis o expectoración, orina, etc.). Portaobjetos limpios. Pinzas de disección. Asa bacteriológica. Mechero bunsen o de alcohol. Microscopio. Carbol fucsina. Ácido clorhídrico (0.36 N) en etanol. Azul de metileno (0.3 %) Aceite de inmersión. PROCEDIMIENTO

1. Preparar un frotis delgado con la muestra correspondiente, secar y fijar con calor.

2. Cubrir completamente con carbol fucsina.





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3. Calentar con el mechero mediante pases cortos sobre el mismo, durante 5 minutos, sin permitir que hierva la muestra.

Nota: Añadir más carbol fucsina conforme esta se evapora; la preparación no debe quedarse seca en ningún momento.

4. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. 5. Decolorar con la solución de ácido-alcohol hasta que la muestra

adquiera un color rosa claro (unos 30 segundos). 6. Lavar con agua para eliminar los restos de disolvente. 7. Teñir con azul de metileno (1 minuto). 8. Lavar con agua el exceso de colorante. 9. Secar la preparación. 10. Observar al microscopio con objetivo de inmersión. (utilizando aceite de

inmersión).





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CUESTIONARIO

1. ¿Cuál cree que sería el resultado de la tinción de Ziehl-Neelsen si no se aplicara calor a la muestra?

2. Los microorganismos ácido-alcohol resistentes, ¿son Gram positivos o Gram negativos?

3. ¿Cómo aparece teñido el Mycobacterium en una tinción de Gram?

Micobacterium tuberculosis Micobacterium tuberculosis





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MEDIOS DE CULTIVO

PRÁCTICA No.8 INTRODUCCIÓN Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de microorganismos. La diversidad metabólica de estos es enorme. Por ello, la variedad de medios de cultivo es también amplia, y no existe un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. Los constituyentes habituales de los medios de cultivo, son entre otros: fuente de carbono y sales, agar, extractos, peptonas, fluidos corporales, sistemas amortiguadores, indicadores de pH, agentes reductores, agentes selectivos, etc. además, habrá que agregar los factores físicos indispensables para el crecimiento de los microorganismos, como presión osmótica temperatura, luz, pH., concentración de Oxígeno, entre otros. Los medios de cultivo se clasifican por su estado físico y por su utilidad; según su estado físico, estos pueden ser líquidos, sólidos y semi sólidos y por su utilidad, básicos, enriquecidos, diferenciales, de transporte, específicos. OBJETIVO Aprender la forma de preparar los medios de cultivo a partir de las formulas deshidratadas, así como la utilidad de los mismos. MATERIAL Medios de cultivo deshidratados (base para sangre, Muller-Hinton, E.M.B, Stuart, otros). Agua destilada. Sangre desfibrinada. Matraces de Erlen-Mayer. Probetas graduadas. Tubos de cristal con tapón de rosca.





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Cajas de Petri. APARATOS Balanza granataria. Autoclave. Estufa bacteriológica. Mechero Bunsen. Refrigerador. PROCEDIMIENTO

1. Preparar 100 ml. de cada medio de cultivo, pesando la cantidad correspondiente de cada medio deshidratado, según las especificaciones del fabricante.

2. Calentar en la llama del mechero hasta disolver completamente y

enseguida esterilizar en autoclave a 121ºC, 15 lb. de presión, durante 15 minutos.

3. Dejar enfriar a 45ºC aproximadamente y vaciar en caja de Petri o tubos

según corresponda, cerca de la llama del mechero, evitando hablar, toser, reír, estornudar, etc., o bien con cubrebocas, así como evitar las corrientes de aire para evitar la contaminación de los medios. En el caso especial del agar sangre, después de esterilizar, dejar enfriar a 45ºC y añadir sangre desfibrinada en condiciones de esterilidad y vaciar en caja de Petri.

4. Dejar enfriar y solidificar, y guardar en el refrigerador entre 4 y 8 ºC., en

posición invertida, conservar así hasta su utilización. Anote sus observaciones.





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CUESTIONARIO 1.- ¿Qué es un medio de cultivo? 2.- ¿Cómo se clasifican los medios de cultivo? 3.- ¿Cuál es la utilidad de los medios de cultivo en general? 4.- ¿Cuál es la principal utilidad del medio de agar sangre? 5.- ¿Qué características tienen los medios de E? M.B ó Mc. Conkey? 6.- ¿Por qué al medio de Stuart se le llama de transporte?





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AISLAMIENTO DE BACTERIAS.

PRÁCTICA No.9 INTRODUCCIÓN En la naturaleza, los microorganismos se encuentran en comunidades más o menos complejas. Por ello, una técnica esencial en Microbiología es la que permite la obtención de cultivos puros o axénicos, a partir de los cuales son posibles estudios sobre las propiedades de un microorganismo concreto, ya que un cultivo puro es aquel que tiene un solo tipo de microorganismo. Aunque existen numerosas técnicas de aislamiento, las más utilizadas emplean un medio de cultivo sólido, sobre el que se desarrollarán colonias macroscópicas, como resultado del crecimiento y división de los microorganismos. OBJETIVO Adquirir habilidad y destreza para el aislamiento de bacterias de diversos especímenes. MATERIAL Placas de agar (medios de cultivos diversos). Hisopos. Portaobjetos. Asa bacteriológica. Mechero Bunsen. Espécimen. PROCEDIMIENTO

1. Coloque frente al manipulador el mechero y la preparación o muestra que contiene los microorganismos, así como el resto del material portaobjetos, tubos, placas, etc.). Todo ello ha de ser alcanzado con facilidad.





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2. Tome el asa de siembra y flamee el filamento hasta que alcance un rojo incandescente. Enfríelo en la proximidad de la llama (10 cm.). Recuerde que las llamas “frías” son anaranjadas y aunque se ven bien no esterilizan. Las llamas muy “calientes” son de un azul casi invisible, lo cual supone un riesgo si no se trabaja con cuidado, pero esterilizan.

3. Tome con la otra mano el recipiente (tubo, placa, etc.) que contiene la muestra. Si la muestra está en un tubo, quite el tapón con los dedos meñique y anular, flamee la boca del tubo. Si la muestra está en una placa de Petri, coloque la placa invertida sobre la mesa de trabajo y levante la parte que contiene el medio de cultivo con los microorganismos. Llévela a la proximidad de la llama del mechero.

4. Trabajando en todo momento en la proximidad de la llama, introduzca el

asa de siembra y tome una pequeña muestra del cultivo. Si el medio es líquido, agite ligeramente el tubo y tome una muestra que quedará adherida por tensión superficial en el extremo del filamento del asa de siembra. Si los microorganismos están en forma de colonias sobre un medio sólido, tome una pequeña porción de una de las colonias mediante un ligero roce con el asa de siembra. Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar, hunda el filamento dentro del medio, hasta tomar una pequeña porción de la misma.

5. Transfiera el inóculo a otros medios de cultivo estéril, tomando las

mismas precauciones de esterilidad en su manejo.

6. Deposite el inóculo en la placa y siembre en zig-zag o en estrías por agotamiento.

7. Proceda a preparar uno o varios frotis para tinción.

8. Con un marcador fino identifique las muestras y coloque en la estufa

bacteriológica en posición invertida, para evitar que el agua de condensación se deposite en la superficie del agar.

9. Antes de dejar el asa de siembra sobre la mesa, flaméela de nuevo para

esterilizarla.





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CUESTIONARIO 1.- ¿Cuál es la finalidad de este método? 2.- ¿Investigue otros métodos de aislamiento de microorganismos? 3.- ¿Cuál es la finalidad de esterilizar el asa bacteriológica en cada procedimiento? 4.- ¿Qué función tiene el mechero Bunsen en el procedimiento? 5.- ¿A qué se llama unidad formadora de colonias?





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MORFOLOGIA COLONIAL

PRÁCTICA No. 10 INTRODUCCIÓN Los especímenes cultivados en los medios adecuados y bajo condiciones ambientales óptimas crecerán, como agregados macroscópicos de muchas e idénticas células, formando colonias en la superficie de un medio sólido; por tanto, es importante relacionar las diferentes morfologías de estas colonias para la identificación del germen. OBJETIVO Aprender a describir correctamente la morfología de las colonias bacterianas. MATERIAL Placas de agar con crecimiento bacteriano. Regla graduada en mm. Lupa. Asa bacteriológica. PROCEDIMIENTO

1. Observe con atención las características de cada colonia, abriendo la caja de Petri si es necesario, siempre y cuando se tengan las medidas de bioseguridad y anota sus características:





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Tamaño: En milímetros.

Forma: Puntiforme, irregular, circular, filamentosa, rizoide, fusiforme

Elevación:

Aplanada, convexa, umbilicada, acuminada, papilada, y planoconvexa

Superficie:

Lisa, rugosa, filamentosa, granular, arenosa, pulverulenta.

Consistencia:

Dura, blanda y cremosa.

Aspecto:

Húmedo, seco y mucoso.

Bordes:

Redondeados, espiculados, filamentosos, ondulados, lobulados, rizoides.

Luz reflejada:

Brillante, mate.

Luz transmitida: Color:

Traslúcida, opaca y transparente. Describir el color o si toma el color del medio.

Cambios alrededor de la colonia:

Halos claros, pigmentaciones y desgaste del agar bajo la Colonia.

ACTIVIDADES

1. Realizar esquemas de las colonias observadas

2. Anote sus conclusiones.





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CULTIVO DE EXUDADO FARÍNGEO

PRÁCTICA No. 11 INTRODUCCIÓN La mayoría de las infecciones agudas de las vías respiratorias altas, como la rinitis, faringitis, epiglotitis y traqueo bronquitis, suelen estar causadas por virus y son benignas y auto limitadas, por lo que no requieren diagnóstico ni tratamiento específico, excepto la faringitis estreptocócica, por sus posibles complicaciones tardías (como fiebre reumática y la glomérulo nefritis post estreptocócica), y la epiglotitis por Haemophilus influenzae, que produce un cuadro grave de asfixia. La flora de la nasofaringe es sumamente variada y abundante, por lo que resulta importante reconocer los microorganismos de la microbiota normal de la patógena. Para que este examen sea confiable, es conveniente se realice cuando el paciente no esté bajo tratamiento con antimicrobianos. OBJETIVOS

1. Comprender la importancia de la Microbiología clínica como auxiliar en el diagnóstico.

2. Aprender a tomar correctamente las muestras del exudado faríngeo. 3. Relacionar el cuadro clínico con el agente etiológico en las patologías del

aparato respiratorio alto. MATERIAL

Muestra biológica. Medios de cultivo: Agar sangre, Sal y manitol, E.M.B ó Mc. Conkey) Hisopos estériles.





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Abatelenguas estériles. Asa bacteriológica. Portaobjetos. Mechero Bunsen. Microscopio. Aceite de inmersión. Estufa bacteriológica a 37ºC. Colorantes para Gram.

PROCEDIMIENTO

1. Contando con buena iluminación, se solicita al paciente que abra la boca; con el abatelenguas se deprime la lengua y se hace una inspección rápida para localizar membranas, puntos blancos o hemorrágicos, úlceras etc. y sobre ellos frotar con dos hisopos.

2. Con un hisopo hacer un frotis para su posterior fijación y tinción al Gram. 3. Con el segundo hisopo, depositar el inóculo en un extremo de caja medio

de cultivo, suavemente sin perforar el agar. 4. Distribuir en toda la superficie de los medios, en forma de estrías, por

agotamiento, utilizando para ello el asa bacteriológica previamente esterilizada.

5. Incubar las placas en posición invertida en la estufa bacteriológica a 37ºC, durante 24 a 48 hrs.; posteriormente, examinar las placas y anotar las características coloniales.

6. Hacer frotis de cada una de las colonias diferentes, fijar y teñir al Gram. 7. En el medio de agar sangre buscar hemólisis y el tipo de la misma. 8. Con ayuda del instructor procure identificar a los microorganismos

encontrados.





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CUESTIONARIO

1. Enliste los microorganismos de la microbiota normal de la faringe. 2. Enliste a los microorganismos potencialmente patógenos en la faringe. 3. ¿Cuál es la principal función del agar sangre? 4. ¿Por qué utilizar el medio de sal y manitol? 5. Investiga para qué sirven las siguientes pruebas: Coagulasa, catalasa,

optoquina, bacitracina.





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ANTIBIOGRAMA

PRÁCTICA No. 12 INTRODUCCIÓN Las bacterias son naturalmente sensibles a algunos antimicrobianos y resistentes a otros (resistencia natural); sin embargo, entre los microorganismos sensibles han aparecido cepas resistentes a los antibióticos que eran activos (resistencia adquirida); por lo que, al aislar a un microorganismo, no puede saberse a priori si es sensible a un determinado antibiótico o si ha adquirido resistencia frente a él. Por tanto, para orientar al tratamiento debe estudiarse la sensibilidad de las bacterias a los antimicrobianos. Es necesario tener en mente que las condiciones bajo las que se efectúa este examen, no son las mismas que prevalecen en el organismo humano, como son: los antagonismos con otras bacterias, el pH, los mecanismos defensivos de parte del huésped, la temperatura, etc. Existen varios métodos para la elaboración del antibiograma, los más conocidos son, el método de dilución y el de difusión en agar, siendo este último el más utilizado, por su sencillez. OBJETIVO Conocer uno de los procedimientos para efectuar el antibiograma, así como la utilidad y la aplicación del mismo. MATERIAL

Cultivo de bacterias. Medio de cultivo (agar Muller-Hinton). Tubos con solución salina fisiológica estéril. Mechero Bunsen. Asas bacteriológicas. Hisopos estériles. Pinza de disección. Sensidiscos de varios antimicrobianos.





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PROCEDIMIENTO 1. Del cultivo de bacterias procedente de un exudado faríngeo, tome una o

más colonias que sean idénticas con un asa bacteriológica estéril y descárguelas en un tubo que contiene solución Fisiológica estéril y haga una suspensión.

2. Trabajando siempre junto al mechero, sin hablar y con precaución,

humedezca un hisopo con la suspensión de bacterias, abra la caja de Petri con medio de Muller-Hinton y distribuya el contenido del hisopo en toda la placa, con movimientos suaves y sin perforar el medio de cultivo.

3. Con una pinza de disección estéril, tome uno a uno los sensidiscos de

antimicrobianos y colóquelos sobre la superficie del medio ya inoculado y presione ligeramente, para asegurar su contacto con la superficie del medio, procurando que los discos queden separados uno de otro y de las paredes de la caja (si se utilizan sensidisco individuales).

4. Incube a 37ºC por 24 horas e interprete los resultados, midiendo el halo de

inhibición con una regla graduada en mm.





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CUESTIONARIO

1. ¿Qué antimicrobianos contenidos en el antibiograma actúan sobre las bacterias Gram positivas y cuales sobre las Gram negativas?





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2. Explique cómo actúa el sensidisco.

3. ¿Cuáles son los mecanismos de acción de los antimicrobianos sobre las bacterias?

4. Explique cómo un microorganismo obtiene resistencia a un antibiótico.

5. ¿Cuál es la diferencia entre un antibiótico y un bacteriostático?





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UROCULTIVO

PRÁCTICA No. 13 INTRODUCCIÓN La finalidad del urocultivo es detectar y cuantificar los microorganismos causantes de infección de vías urinarias. Normalmente al hablar de infección se emplea el término “bacteriuria”, que significa presencia de bacterias en la orina. Sin embargo, las bacterias pueden estar presentes en la orina como contaminantes de origen fecal o vaginal. Por ello, para distinguir de una infección de una posible contaminación, se habla de bacteriuria significativa, que implica un recuento igual o superior a 100.000 UFC/ml. La mayoría de las infecciones urinarias están producidas por algunas bacterias de la especie Enterobacteriaceae y de ellas, con más frecuencia, Escherichia coli, siguiéndole en frecuencia los géneros Proteus, Klebsiella y Enterobacter, pseudomona, Staphylococcus y Enterococcus y ocasionalmente Cándida albicans y otros oportunistas. Para la realización de este estudio es importante obtener la muestra de manera adecuada, para ello se consideran principalmente tres procedimientos: El chorro medio, el sondeo vesical y la punción supra púbica. Siendo más recomendable el primero por su nula invasividad bacteriana siempre y cuando se haga asepsia escrupulosa antes de la obtención de la muestra. OBJETIVOS

1. Comprobar la presencia de microorganismos causantes de infección de vías urinarias y diferenciar una posible contaminación.

2. Identificar adecuadamente cada microorganismo. 3. Aprender a interpretar los resultados.





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MATERIAL

Muestra de orina obtenida de manera adecuada. Asas bacteriológicas calibradas (0.01 ml, 0.001 ml) ò pipeta automática con puntas estériles. Medios de cultivo (Agar sangre, E.M.B o Mc. Conkey, Agar CLED ò Muller-Hinton). Medios de cultivo para aislamiento Portaobjetos y cubreobjetos. Microscopio. Aceite de inmersión. Mechero. Estufa bacteriológica a 37ºC. Centrífuga clínica

PROCEDIMIENTO:

1. Saque del refrigerador los medios de cultivo a utilizar con anticipación, de

tal manera que en el momento de su uso se encuentren a la temperatura ambiente.

2. Con el asa calibrada o la pipeta automática, tomar directamente de la orina reciente, previamente mezclada y depositar en un extremo de la placa 0.01 ml. de la misma y distribuir con el asa bacteriológica, haciendo estrías cerradas. Hacer esto junto al mechero para evitar la contaminación.

3. Incubar las placas en la estufa bacteriológica a 37ºC durante 24 Hrs. 4. Contar el número de colonias desarrolladas en cada placa por separado y

multiplicar X 100 (por la cantidad de orina utilizada), para obtener el número de UFC/ml.; el recuento es significativo si el número de UFC/ml. es igual o mayor a 100,000 en promedio, De ser así, proceder a la identificación del microorganismo con la ayuda del instructor.

5. Centrifugar 10 ml. de orina a 3,000 r.p.m, durante 15 minutos; decantar el sobrenadante y colocar una gota del sedimento en un portaobjeto,





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cubrirlo con un cubreobjetos y observar directamente al microscopio con objetivo de 10X y 40X.

Nota: La observación de leucocitos en la orina (piuria) se relaciona, aunque no siempre, con un proceso infeccioso.

6. Si al mismo frotis se retira el cubreobjetos, se seca y se fija, se le puede

teñir al Gram para precisar el tipo de bacterias presentes.





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CUESTIONARIO: 1. ¿Por qué se utiliza un asa calibrada o una pipeta automática para realizar el urocultivo? 2. ¿Por qué son importantes las medidas de asepsia en la recogida de la muestra? 3. Investigue las técnicas de sondeo vesical y punción supra púbica. 4. Investigue otras técnicas para efectuar el urocultivo. 5. ¿Cuál es la razón de que predominen las bacterias coliformes en las infecciones de vías urinarias, y porqué estas son más frecuentes en el sexo femenino?





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Cultivos

Proteus vulgaris en Agar EMB Proteus vulgaris en agar Agar Mac

Conkey

Enterobacter en Agar EMB Salmonella en Agar EMB

Klebsiella en Agar EMB E. coli en Agar EMB





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Sedimento





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COPROCULTIVO

PRÁCTICA No. 14 INTRODUCCIÓN Microorganismos como protozoos, bacterias y virus, pueden ser responsables de cuadros gastrointestinales, caracterizados por diarrea, acompañada en ocasiones de vómitos, dolor abdominal y fiebre. Este cuadro suele ser de corta duración y autolimitado. Ante la sospecha de una gastroenteritis bacteriana, es necesario realizar el coprocultivo para aislar e identificar el microorganismo responsable del proceso diarreico. El tubo digestivo contiene una abundante microbiota intestinal (microbiota entérica normal) que desempeña, en condiciones fisiológicas, una función beneficiosa para el humano. Aproximadamente el 99.9 % de la microbiota entérica está constituida por anaerobios (Bacteroides, Clostridium, Peptostreptococcus, Peptococcus y otros) y, en menor proporción, bacilos coliformes (Escherichia coli, Klebsiella, Proteus), Enterococcus y otras especies. Por otra parte, existe una serie de agentes bacterianos infecciosos que pueden afectar el tracto digestivo, invadiendo la mucosa y provocando una diarrea sanguinolenta (mecanismo invasor). Dentro de este grupo destacan Salmonella, Shigella, Yersinia enterocolítica, Campylobacter y Escherichia coli (serotipos enteroinvasivos). Otras bacterias lesionan el tracto digestivo por la acción de toxinas bacterianas (entero toxinas), que actúan sobre la mucosa intestinal (mecanismo toxigénico). El cuadro se caracteriza por la ausencia de fiebre y ligero dolor abdominal. MATERIAL

Muestra de heces fecales recientes recogidas en recipiente estéril. Agar sangre, agar Mc. Conkey, agar Salmonella-Shigella, agar Hektoen. Caldo de tetrationato. Estufa bacteriológica a 37ºC. Mechero Bunsen. Asa bacteriológica.





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PROCEDIMIENTO

1. Tomar una pequeña cantidad de muestra con un hisopo y extender, desde un borde hasta la mitad de la placa. A continuación, con el asa bacteriológica estéril, hacer estrías por agotamiento en el resto de la placa. Por último introducir el hisopo en un tubo con caldo de Tetrationato, agitándolo ligeramente (enriquecimiento).

2. Incubar las placas y el caldo a 37ºC durante 24 Hrs. 3. Al día siguiente, realizar una resiembra del caldo de tetrationato en agar S-

S; para ello, con un asa estéril tomar una cantidad del caldo y sembrar por agotamiento por estrías.

4. Después de 24 hrs. observar las placas, para detectar los microorganismos patógenos entre la abundante microbiota fecal e identificarlos con la ayuda del instructor.

Nota: Es importante diferenciar los microorganismos fermentadores de los no fermentadores de lactosa en el medio de Mc. Conkey o E.M.B. Considerar también algunos datos importantes para la interpretación:

x Colonias transparentes en agar Mc Conkey y con un precipitado de color negro en agar S- S y agar HK: Altamente indicativo de Salmonella.

x Colonias grandes, planas, transparentes en los medios selectivos: Indicativo de Shigella.

x Colonias puntiformes y transparentes en los medios selectivos: Indicativa de Yersinia.

x A partir de cualquier colonia sospechosa lactosa negativa realizar identificación bioquímica.





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CUESTIONARIO

1. ¿Cuándo está indicada la realización de un coprocultivo?

2. ¿Por qué es importante utilizar varios medios selectivos?

3. ¿Por qué se recomienda utilizar un caldo de enriquecimiento?





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PRUEBA SEROLOGICA DEL DENGUE

PRÁCTICA No. 15 INTRODUCCIÓN Los virus del dengue han sido agrupados dentro de cuatro serotipos estrechamente relacionados DEN-1, DEN-2, DEN-3, Den-4. La infección con uno de los serotipos no proporciona inmunidad protectora contra los demás serotipos y una infección secundaria tiene más probabilidad de resultar en fiebre hemorrágica del dengue. La aparición de síntomas de dengue se caracteriza por la presencia de la Ag NSI (dengue) en el suero del paciente, NSI es una glicoproteína común a todos los serotipos del dengue y se le puede utilizar para detectar infecciones primarias o secundarias en las primeras etapas de la enfermedad. Las pruebas serológicas para los Ac específicos al dengue, tipos IgG e IgM, pueden ser útiles para confirmar el diagnóstico primario o secundario. En las infecciones primarias y secundarias, IgM se presenta después de aproximadamente cinco días, mientras que IgG se produce entre dos y cuatro semanas después de la aparición de una infección secundaria. PRINCIPIO DE LA PRUEBA RAPIDA El principio de la prueba de anticuerpos de un solo paso de Dengue IgG/IgM es un ensayo inmunocromatográfico de captura de anticuerpos para la detección simultánea y diferenciación de anticuerpos IgG e IgM para el virus del dengue en muestras de suero humano, plasma y/o sangre entera. Antígenos específicos del virus del dengue se conjugan con un oro coloidal y se depositan en la almohadilla de conjugado. Una combinación única de anticuerpos IgG e IgM anti-humano se inmoviliza en la zona de prueba (T1 y T2) de la membrana de nitrocelulosa, como dos líneas de prueba individuales (línea de IgG y línea de IgM) en la ventana de prueba del dispositivo de prueba. La línea de IgG (T1) en la ventana de prueba está más cerca del pocillo de muestra y así seguido por la línea de IgM (T2). Cuando se añade la muestra, se rehidrata el conjugado de oro-antígeno. Si anticuerpos IgG y/o IgM de Dengue están presentes en la muestra, interactuaran con el antígeno conjugado de oro.





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El complejo antígeno-anticuerpo-oro va a migrar hacia la ventana de prueba hasta que la zona de prueba (T1 y T2), donde será capturado por el IgG anti-humano (T1) y/o IgM anti-humano (T2) relevantes, formando una visible línea rosa, indicando un resultado positivo. Si los anticuerpos de dengue están ausentes en la muestra, no aparecerá la línea rosa en la Zona de Prueba, lo que indica un resultado negativo. Como proceso de control interno, una línea de control debe aparecer siempre en la zona de control (C) después de que se complete la prueba. La ausencia de una línea de control de color en la zona de control es una indicación de un resultado no válido. OBJETIVO Mediante la prueba rápida detectar la presencia de dengue. Determinar la presencia de los anticuerpos IgM e IgG infecciones primarias y secundarias. MATERIAL Cassette de Prueba Diluyente de muestra (4ml) por frasco Sangre capilar o venosa. Tubo con anticoagulante Torundas con alcohol Lanceta Guantes Reloj o cronómetro PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

a) Las muestras de sangre pueden ser recolectadas por punción en el dedo o venopunción, siguiendo procedimientos de asepsia.

b) Para las muestras de suero, recoger la sangre en un tubo sin anticoagulante y permitir que se coagule.

c) Para muestras de plasma, recoger la sangre en un tubo que contiene anticoagulante.

d) Separar el suero o plasma de la sangre tan pronto como sea posible para evitar la hemólisis. Utilice sólo muestras claras, no hemolizadas.

e) Para muestras de sangre entera, recolecte la sangre en un tubo que contiene anticoagulante.





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f) Las muestras de sangre entera deben hacerse la prueba inmediatamente después de la toma de muestras.

g) La sangre se puede almacenar a entre 2 º C y 8 º C durante un máximo

de tres días si las pruebas no pueden realizarse inmediatamente. Asegúrese de que la muestra de sangre alcanzara la temperatura ambiente antes de su uso.

. PROCEDIMIENTOS

1. Retire el dispositivo de prueba de la envoltura metálica y coloque el dispositivo de prueba en una superficie uniforme.

2. Añada 5 μl de muestra de sangre con pipeta a el área superior (cercana a la ventana de prueba) del pocillo de muestra del dispositivo (sostenga la pipeta verticalmente y gentilmente toque el extremo contra la almohadilla dentro del pocillo de muestra para transferir).

3. Inmediatamente añada 2 gotas (80 μl) del diluyente a la muestra al mismo pocillo de muestra del dispositivo de prueba.

4. Lea los resultados en 10 minutos. Lea los resultados como se muestra en el manual.

NOTA: Muestras fuertes positivas pueden producir resultados positivos en tan poco solo 1 minuto y confirmar resultados negativos en 20 minutos.





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INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Negativo Una sola banda de color rosa aparece en la region de control(C) , lo que indica un resultado negativo para la infeccion por dengue. Positivo Bandas de color rosa aparecen en la regíon de control (c )y la region T1 y/o T2. 1) IgG y IgM positivos, bandas visibles en T1 y T2, indica resultado positivo para una posible infección primaria tardía o infección secundaria aguda. 2) IgM positiva, una banda visible en la región de T2, lo que indica resultado positivo para una posible infección secundaria o una infección previa. 3) IgG positiva, una banda visible en la región T1, lo que indica resultado positivo para una posible infección primaria del dengue. Inválido. No hay banda visible en la región de control (C).

3) IgG 2) IgM





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Cuestionario:

1.- Que otras infecciones virales podrían dar resultados positivos con esta prueba y por qué?

2.- Que otras pruebas existen para hacer diagnóstico de esta enfermedad?





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COPROPARASISTOCÓPICO DIRECTO

PRÁCTICA No. 16 INTRODUCCIÓN Los parásitos intestinales representan problemas de salud bastante frecuentes y por tanto, los exámenes de materia fecal o “copros” se utilizan a menudo para identificar a los parásitos en diferentes etapas, como son huevecillos, larvas, quistes, trofozoítos, etc. El examen coproparasitoscópico puede hacerse directo, cualitativo, cuantitativo, por concentración (flotación, sedimentación), etc., El examen directo tiene la ventaja de que mediante este, se pueden observar huevecillos, quistes, larvas y trofozoítos y como desventaja, la mínima cantidad de muestra analizada no permite observar las estructuras mencionadas cuando son escasas. OBJETIVO Mediante el coproparasitoscópico directo, observar huevecillos, larvas, quistes y trofozoítos de parásitos intestinales. MATERIAL Materia fecal reciente. Porta y cubreobjetos limpios y secos. Solución fisiológica de Cloruro de Sodio al 0.85 %. Solución de lugol diluida en solución fisiológica. Aplicadores de madera. Microscopio.





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PROCEDIMIENTO 1. En un portaobjetos limpio y seco, poner una gota de solución fisiológica de

Cloruro de Sodio al 0.85% y al lado otra de solución de lugol. 2. Con un aplicador de madera, tomar una pequeña cantidad de muestra y

ponerla sobre una de las gotas y hacer una suspensión, realizando movimientos de rotación. Tomar otra pequeña cantidad de muestra y repetir la operación en la otra gota.

3. A cada una colocarle un cubreobjetos. 4. Observar al microscopio con objetivo de poco aumento (10X), enfocar y

recorrer toda la muestra, observando todas las estructuras, cambiando al objetivo de seco fuerte (40X) cada vez que se desee precisar una imagen y tomando nota de las mismas mediante dibujos y descripciones. Trate de encontrar a los parásitos con ayuda del instructor.





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CUESTIONARIO

1. ¿Por qué utilizamos solución fisiológica de Cloruro de Sodio al 0.85%?

2. ¿Qué diferencia observa en la solución de lugol?

3. ¿Qué tipo de estructuras no veremos con la solución de lugol?

4. Investigue ¿qué es un procedimiento de concentración?

muestra de heces





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Huevo de Tenia Huevo de Schistosoma haematobium liso y con espícula característica.

Huevos de Trichuris trichura Huevos de uncinaria con blastómeros (b)

Huevo de Dicrocoelium dentriticum, liso y

operculado (o) Huevos de Himenolepis con cubierta lisa

(l)





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Huevos de Oxiuro con cubierta lisa (l) Huevo de áscaris con cubierta

mamelonada (m)

Quiste de Giardia intestinali Trofozoitos de Giardia intestinali

Trofozoito de Entamoeba histolytica Quiste de Entamoeba histolytica





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INVESTIGACION DE HEMATOZOARIOS (GOTA GRUESA)

PRÁCTICA No.17 INTRODUCCIÓN Los parásitos que invaden la sangre con más frecuencia son Plasmodium, Tripanosoma y excepcionalmente Leishmania; algunos invaden a los eritrocitos, otros a los leucocitos y aún otros pueden encontrarse en forma extracelular. El parasito más frecuentemente diagnosticado, según el método de la gota gruesa, es sin duda el Plasmodium, para lo que se requiere conocer las diferencias morfológicas entre P. vivax, P. malarie, P. falciparum y P. ovale, para reconocer la especie presente. El método de la gota gruesa consiste en la preparación de una extensión de sangre más gruesa que una extensión ordinaria. MATERIAL

Sangre capilar o venosa. Colorante de Wright ó Giemsa. Portaobjetos limpios y secos. Lancetas estériles. Microscopio. Aceite de inmersión.

PROCEDIMIENTO

1. Obtener sangre capilar mediante punción en la parte externa de la yema del dedo anular o por punción venosa.

2. Depositar dos gotas de sangre en un portaobjetos, separadas una de otra.





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3. Con la ayuda de otro portaobjetos y formando un ángulo de de 30 a 45º, extender la gota de la parte interna del portaobjetos.

4. Con la esquina del segundo portaobjetos distribuir la gota de sangre más cercana al borde, hacer movimientos de rotación suave.

5. Dejar secar a temperatura ambiente; ojo: no fijar con calor. Tinción con Wright:

1. Colocar los frotis secos sobre las varillas de tinción y cubrir completamente con el colorante de Wright, evitando que se derrame.

2. Agregar solución Buffer para Wright ó agua destilada en la misma proporción del colorante.

3. Mezclar, soplando con una pipeta o directamente y dejar reposar 10 minutos.

4. Decantar el colorante y lavar con abundante agua de la llave, y dejar secar. 5. Examinar al microscopio, utilizando el objetivo de 100X y aceite de

inmersión. Tinción con Giemsa:

6. Colocar los frotis en las varillas de tinción y cubrir con alcohol metílico absoluto, durante 5 minutos; decantar y dejar secar.

7. En un tubo, conteniendo 1 ml. de agua destilada precalentada a 37ºC. agregar dos gotas de colorante de Giemsa y mezclar bien.

8. Cubrir el frotis con el colorante previamente preparado y dejar actuar 20 minutos.

9. Decantar, lavar y dejar secar. 10. Observar al microscopio con objetivo de 100X, utilizando aceite de

inmersión.





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Tinción con Wright:





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Tinción con Giemsa:

CUESTIONARIO

1. ¿Por qué se prefiere la sangre fresca sin anticoagulante para elaborar el frotis de gota gruesa?

2. ¿Qué tipo de protozoarios son Plasmodium y Tripanosoma? 3. Investigue qué son los gránulos de Ziemann, Schûffner, Maurer y James. 4. ¿Por qué los frotis no se tiñen con calor como en el caso de los frotis para

ver bacterias 5. Investigue otras pruebas diagnósticas para Plasmodium.





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Preparación de una gota gruesa

Preparación de una muestra sanguínea





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Tripanosoma en una extensión sanguínea

Plasmodium falciparum en una extensión sanguínea





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REACCIONES FEBRILES

PRÁCTICA No. 18 INTRODUCCIÓN Las pruebas serológicas constituyen un método de diagnóstico indirecto, al detectar en el suero del paciente los anticuerpos formados frente al microorganismo causante de la infección. Para detectar los anticuerpos, se enfrenta in vitro una muestra de suero del paciente, al microorganismo que se sospecha que está causando la infección, para ver si se produce una reacción antígeno-anticuerpo, que constate la presencia de anticuerpos frente al microorganismo. La reacción antígeno-anticuerpo puede evidenciarse por distintas técnicas, como las de aglutinación, precipitación, fijación de complemento, inmunodifusión, inmunofluorescencia, ELISA, RIA, etc. Para fines prácticos y para ejemplificar dichas pruebas, nos referiremos aquí a las pruebas de aglutinación. La aglutinación específica de antígenos particulados por anticuerpos es una de las reacciones serológicas más simple. Cuando se colocan células completas en suspensión, al estar cargadas con la misma polaridad (carga neta negativa), se producen repulsiones, que se traducen en una suspensión homogénea de aquellas. En presencia de puentes cruzados entre ellas (por ej., inmunoglobulinas) se vence la repulsión, las células se agrupan y el mayor peso de estos agregados hace que se sedimenten o se aglutinen. Las reacciones febriles son un ejemplo de las pruebas de aglutinación. Las reacciones febriles incluyen las reacciones de Widal y la de Weill-Félix. La de Widal es un método serológico que se utiliza frecuentemente para el diagnóstico de la Tifoidea, de las fiebres intestinales y de las fiebres ondulantes y la de Weill – Félix para el Tifo exantemático producido por Proteus OX 19, pero también por Rickettsia. El género Salmonella comprende una gran variedad de especies patógenas, cuya diferenciación es factible verificar por medio de antígenos flagelares H y somáticos O, que ponen de manifiesto los anticuerpos aglutinantes que éstas producen, Las reacciones aglutinantes tiene capacidad diagnóstica después de 10 días de iniciarse la enfermedad.





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El proteus OX19 y la Rickettsia, productores del Tifo, comparten un antígeno glucolípido común. La reacción se hace positiva a partir de 5 a 7 días de la enfermedad con mayor frecuencia en el día 12. MATERIAL

Material biológico suero del paciente. Antígenos correspondientes (Suspensión de microorganismos). Placa de cristal. Pipetas serológicas (pipetas automáticas). Aplicadores de madera. Centrífuga clínica. Agitador mecánico.

PROCEDIMIENTO

1. De manera aséptica obtener sangre del paciente, dejarla coagular y centrifugar para separar el suero.

2. En la placa de cristal correspondiente, colocar en cada uno de los 6 círculos horizontales de la de la misma 80 µl. de suero y de izquierda a derecha agregar una gota de antígeno, comenzando con el Tífico O, Tífico H, Paratífico A, Paratífico B, Proteus OX19 y por último la Brucella abortus.

3. Mezclar cada gota de suero con su correspondiente antígeno, utilizando un aplicador de madera diferente para cada uno.

4. Colocar en el agitador mecánico durante 3 minutos y observar frente a una adecuada fuente de luz y buscar aglutinación.

5. Si se observa aglutinación se continúa en la fila de abajo nuevamente poner suero del paciente pero ahora 40 µl. y repetir la operación, Si se observa aglutinación en alguna de ellas, continuar con los siguientes círculos de abajo, aplicando en la siguiente fila, 20 µl. de suero, en la siguiente 10 µl. y por último 5 µl.





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INTERPRETACIÓN Aglutinación en la primera fila equivale a positivo (1:20) “ “ “ segunda “ “ “ “ (1:40) “ “ “ tercera “ “ “ “ (1:80) “ “ “ cuarta “ “ “ “ (1:160) “ “ “ quinta “ “ “ “ (1:320) Sin aglutinación la prueba es negativa.





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CUESTIONARIO:

1. ¿Por qué se utiliza suero del paciente y no sangre total?

2. ¿Por qué las pruebas serológicas en las que se investiga la presencia de anticuerpos, solamente son positivas después de varios días del comienzo de la enfermedad?





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REACCION V.D.R.L (Venereal, Disease, Research, Laboratory)

PRÁCTICA No. 19 INTRODUCCIÓN La reacción V.D.R.L., es una prueba muy sensible, aunque poco específica, utilizada fundamentalmente para el diagnóstico de la Sífilis, mediante pruebas de aglutinación y floculación con antígenos cardiolipínicos; esta prueba, como también la de RPR (Reagent-Plasma-Rápido), son pruebas rápidas y sensibles. En caso de positividad, el resultado debe confirmarse mediante pruebas con antígenos treponémicos, como la de hemoaglutinación pasiva, fluorescencia indirecta, o enzimo inmuno análisis, mismas que poseen extraordinaria especificidad. MATERIAL

Material biológico, suero del paciente. Antígeno cardiolipínico. Placa de cristal. Aplicadores de madera. Pipetas Pasteur. Baño María a 56°C. Centrífuga clínica. Microscopio de campo claro.

PROCEDIMIENTO

1. De manera aséptica obtener sangre del paciente, dejar coagular y centrifugar a 1500 r.p.m. durante 5 minutos, separar el suero.

2. Inactivar el suero (colocarlo en baño María a 56°C durante 30 minutos).





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3. En la placa de cristal poner 0.05 ml. de suero problema y añadir una gota del antígeno cardiolipínico.

4. Mezclar con un aplicador de madera y luego colocar en el agitador mecánico durante 4 minutos.

5. Observar a simple vista si hay floculación y luego en el microscopio con poco aumento (10X).

6. Si se observa floculación, la prueba es positiva, titularla; si no la hay, será negativa.





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CUESTIONARIO

1. ¿Por qué se sigue utilizando esta prueba, aún sin ser completamente específica?

2. ¿Por qué debe inactivarse el suero del paciente a 56°C?

3. ¿En qué otros casos puede resultar positiva esta prueba?

4. ¿Por qué se le llama prueba no treponémica?





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ESTUDIO MORFOLÓGICO DE HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS

PRÁCTICA No. 20 INTRODUCCIÓN. Los criterios más empleados para la identificación de los hongos filamentosos incluyen el estudio de las características macro y microscópicas de las colonias. Entre estas, la morfología microscópica de los cultivos es la que proporciona los datos más importantes: el grosor de los filamentos, el tipo y la distribución de los septos y, sobre todo, la forma, el tamaño y la disposición de las esporas y de las estructuras formadoras de estas. Los principales métodos aplicados para la observación microscópica de los cultivos son: la observación en fresco, con una solución adecuada, y las preparaciones en cinta adhesiva. Los cultivos observados, según estos métodos, resultan útiles en la mayoría de los casos para identificar las especies. OBJETIVO. Conocer las estructuras fundamentales de los hongos MATERIAL:

Medio de Saboraud o agar papa dextrosa. Pinzas de disección. Asa bacteriológica en “L”. Porta y cubreobjetos. Colorante de azul violeta ó de lactofenol. Hidróxido de Potasio al 15 %.





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PROCEDIMIENTO

1. Humedecer un trozo de pan o tortilla u otro alimento y dejarlo apartado durante varios días.

2. Tomar de las colonias formadas en los alimentos, con el asa bacteriológica y colocarlo en un medio de Saboraud o papa dextrosa; incubarlo a 37ºC durante 4-5 días ó dejarlo durante varios días a la temperatura ambiente.

3. Observar las características de las colonias desarrolladas (color, tamaño, consistencia, etc.).

4. Tomar una pequeña porción de la colonia y colocarla en un portaobjetos; agregarle una pequeña gota de Hidróxido de Potasio al 15 % o azul de metileno o azul de lactofenol.

5. Observar al microscopio, describir las estructuras observadas. También puede hacer frotis y teñirlo según la técnica de Gram.





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CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es la unidad anatómica y funcional de los hongos filamentosos?

2. ¿A qué se llama dimorfismo?

3. ¿Cuál es la diferencia entre un moho y una levadura?

4. ¿Qué tipo de reproducción tienen los hongos?

5. ¿Cuál es la importancia de las setas?

Colonia de hongos Aspergillus flavus





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Aspecto microscópico de Aspergillus Aspecto microscópico de Aspergillus

Aternaria Penicilium

Fusarium





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DIRECTORIO DE LA FACULTAD DE MEDICINA Y CIRUGÍA

Dra. Salustia Efigenia González Rosales Encargada de la Dirección de la Facultad de Medicina y Cirugía

Dra. Elsa Gallegos Rivera

Coordinadora Académica de Ciencias Básicas

Dr. David Alejandro Méndez Ibáñez Coordinador Académico de 1° año

Dra. Patricia Aquino Pérez

Coordinadora de Ciencias Clínicas

Dra. Gabriela Salud Morales Encargada de la Coordinación de Internado Médico y Servicio Social

P.S.C. Isabel Mejía Llanos

Coordinadora de Vinculación Comunitaria

L.A. Eddy Alberto Torres Carballido Coordinador Administrativo

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