MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO HEMOSTASIA

Facultad de Bioanálisis, Veracruz Manual de Prácticas de Hematología

Hemostasia 1

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

HEMOSTASIA

ELABORÓ:

Q.C. MARIA ESTHER DESCHAMPS LAGO


Hemostasia 2

HEMOSTASIA: PRACTICA NO.1 OBTENCIÓN DE LA MUESTRA DE SANGRE

1. INTRODUCCIÓN

Obtención De Sangre Capilar Es el método empleado cuando se necesita tan solo una pequeña cantidad de sangre, ya que los estudios a realizar así lo requieren. El sitio más apropiado para obtener sangre capilar es la yema del dedo. En los niños más pequeños, es más conveniente obtenerla del talón ó del dedo pulgar del pie. Los detalles relativos a los recipientes y portaobjetos que se utilizan, se indican a continuación.

VENTAJAS.

Facilidad con que puede obtenerse

Especialmente útil en pacientes geriátricos y en niños, en particular, recién nacidos. DESVENTAJAS.

Sólo logra obtenerse una pequeña cantidad de sangre que puede ser insuficiente.

Es un método por lo general tardado y que tiende a provocar hemólisis de la muestra

En pacientes inmunocomprometidos puede provocar infecciones, excepto cuando se realiza la punción después de 8 a 10 min. de contacto con la piel con un buen antiséptico.

Obtención De Sangre Venosa . Es el principal método de extracción de sangre en el laboratorio de análisis clínicos, ya que es relativamente fácil de realizar.

VENTAJAS.

Nos permite hacer múltiples exámenes y en repetidas veces si se desea, con la misma muestra.

Las alícuotas de plasma y suero pueden congelarse para futura referencia. DESVENTAJAS

Puede provocar la coagulación de la sangre si el procedimiento lleva mucho tiempo.

Algunos componentes no son estables en sangre anticoagulada.

Puede dificultarse en niños, pacientes obesos ó en estado de shock.

Puede ocasionarse hemólisis de las muestras afectando ciertas determinaciones, por las siguientes causas:

Por forzar el paso de la sangre al tubo

Por agitar el tubo enérgicamente

Por extraer sangre de un hematoma


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Anticoagulantes Empleados. Estas sustancias impiden la formación de coágulos. El mecanismo por el que se evita la coagulación, varía según el anticoagulante; por ejemplo, EDTA, citrato y oxalato se unen con el calcio, mientras que la heparina impide la conversión de protrombina en trombina. Ejemplos de anticoagulantes son EDTA, citrato de sodio, y heparina en forma de sal de litio ,Los tubos deben invertirse varias veces para asegurar la mezcla adecuada después de la recolección, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2. PRINCIPIO Y METODOLOGÍA . El sitio más práctico para obtener sangre venosa es la flexura anterior del brazo, de preferencia justo por arriba de alguna de las ramas venosas que allí se encuentran. Las venas superficiales de la cara anterior del antebrazo son las más comúnes para la venopunción. Las tres venas principales que se utilizan son: 1) vena cefálica, ubicada en la parte superior del antebrazo y del lado del pulgar de la mano; 2) vena basílica, ubicada en la parte inferior del antebrazo y del lado del dedo meñique de la mano; y 3) vena cubital mediana, que conecta las venas basílica y cefálica en la fosa antecubital ( flexión del codo) y es la vena de elección.Si el paciente aprieta el puño después de aplicar el torniquete, la vena se tornará más prominente. El torniquete facilita la obtención. En los niños pequeños se pueden utilizar otros sitios; si es así, es mejor que la sangre la obtenga alguna persona con experiencia. Usar una aguja puntiaguda, nunca menor de calibre 21 y una jeringa de 5 ml ó de 10 ml. Tanto la aguja como la jeringa deberán estar limpias, secas y estériles. Con práctica se puede obtener sangre usando sólo una aguja con un tubo de goma por el que se deja correr la sangre hasta los tubos en los que se recoge la muestra. Para esta técnica se utilizan agujas de calibre 19. 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS

3.1 Materiales de Laboratorio

CANTIDAD DESCRIPCIÓN

2 Tubos de recogida de muestras con EDTA

1 Aguja de Vacutainer

1 Contenedor de Vacutainer

1 Jeringa

1 Lanceta

1 Torundas de algodón con alcohol isopropílico

1 Ligadura


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4. PROCEDIMIENTO.

4.1 Punción Capilar

4.1.1 Indicaciones. En lactantes, se realiza en la superficie plantar interna ó externa del talón. En niños de más de un año, en la superficie palmar de la última falange del segundo, tercero ó cuarto dedo de la mano.La punción no deberá realizarse en una parte edematosa ó congestionada, ó donde la piel se encuentra fría y cianótica.

4.1.2 Identificación del Paciente

Asegurarse de que el paciente llegue en condiciones óptimas y tranquilizarlo.

Colocar al paciente adecuadamente. Checar el material para la extracción:

4.1.3 Técnica.

4.1.3.1 Limpiar cuidadosamente la piel en el sitio de punción y a su alrededor con

algodón mojado en algún desinfectante , como alcohol de 70%. 4.1.3.2 Secar el área con gasa estéril seca. 4.1.3.3 Puncionar con una lanceta estéril ó aguja desechable. El movimiento debe ser

rápido y la punción suficientemente profunda para asegurar que la sangre fluya libremente.La salida de la sangre puede facilitarse ejerciendo una suave presión en la cara lateral del dedo. A corta distancia del sitio de punción.

4.1.3.4 La sangre deberá fluir libremente. Si se ejerce demasiada presión, se diluirá con los líquidos tisulares, lo que la puede hacer inapropiada para estudio.

4.1.3.5 Descartar siempre la primera gota de sangre, limpiándola con una gasa seca y dejar el sitio de punción limpio y seco.

4.3.1.6 Obtener la cantidad requerida de muestra, aspirando la sangre con pipeta ó colocándola en un portaobjetos.

4.2 Punción Venosa 4.2.1 Indicaciones.

Debe indicarse al paciente la posición correcta, que puede ser sentado ó recostado, apoyando bien el brazo en posición horizontal. Elegir la vena adecuada, prefiriéndose la cubital mediana, la vena basílica, la cefálica, las venas de la muñeca, tobillo y mano, ya que resultan fáciles de palpar.


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4.2.2 Técnica

1. Desinfectar la piel en el sitio de punción con algodón mojado en un desinfectante apropiado como alcohol de 70%.

2. Preparar la jeringa y la aguja, ó en su defecto la aguja con el contenedor en el caso del sistema de tubos al vacío, cuidando que la técnica sea aséptica.

3. Aplicar un torniquete en el brazo ( por arriba del sitio de punción), suficientemente apretado para que restrinja el flujo de la sangre venosa.

4. Desinfectar nuevamente el sitio de punción, y secar la piel con algodón ó gasa limpios, secos y estériles.

5. Asegurarse de que el émbolo de la jeringa esté hasta el fondo , es decir, que la jeringa no contenga aire. Insertar la aguja de la jeringa en una vena con un movimiento preciso.

6. Jalar lentamente el émbolo y obtener 2 a 3 ml de sangre. 7. Retirar la jeringa de la aguja y sustituirla por otra jeringa que contenga la solución

anticoagulante de citrato de sodio. O directamente introducir el tubo del sistema de vacío.

8. Obtener el volumen de sangre deseado jalando el émbolo muy despacio. 9. Soltar el torniquete y colocar una gasa seca sobre el sitio de la punción, retirando

después la aguja con un solo movimiento. 10. Presionar ligeramente la gasa sobre el sitio de punción durante algunos

momentos y después pedir al paciente que continúe aplicando la presión durante unos minutos.

11. Cuando la sangre se obtiene empleando sólo una aguja sin jeringa, se emplea el mismo procedimiento y cantidad de anticoagulante. Deben usarse tubos graduados para obtener la proporción adecuada de anticoagulante y sangre.

Actividades:

- Practicar la toma de sangre capilar. - Practicar la toma de sangre venosa. -Realizar esquemas de punción capilar .


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-Realizar esquemas de punción venosa y de las principales venas empleadas.


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-Realizar esquema de los diferentes sistemas de extracción: jeringa y sus partes; sistema vacutainer y sus partes; tipos de tubos y colores de tapones empleados en el sistema vacutainer, de acuerdo con el anticoagulante empleado .

- Reporte de resultados.____________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________


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HEMOSTASIA:PRÁCTICA No. 2 “EXTENDIDOS DE SANGRE”

1. INTRODUCCIÓN.

Los extendidos de sangre se realizan dentro del estudio del hemograma completo, ó bien de manera aislada .En ellos se pueden estudiar los eritrocitos, los leucocitos y las plaquetas, y el propósito de ello es determinar las características morfológicas de cada tipo celular y evaluar la frecuencia relativa de los distintos tipos de leucocitos. Se deben teñir con una de las tinciones de Romanowsky las cuales varían en sus propiedades de tinción, y por lo tanto, es importante seleccionar una y familiarizarse con ella. La coloración de Wright es muy confiable y sencilla, pero otras también lo son, tales como la de Giemsa. Leishman ó May-Grünwald, las cuales son igualmente satisfactorias, aunque puede variar la tinción de un lote a otro de colorante.

2. PRINCIPIO Y METODOLOGÍA .

Los frotis de sangre deben confeccionarse con láminas portaobjetos de vidrio que previamente se hayan lavado y secado de manera conveniente, con la finalidad de eliminar cualquier resto de grasa que pudiera quedar en ellos y evitar así una mala calidad en la tinción. Los frotis de sangre son esenciales para el estudio morfológico y cuantitativo de las células sanguíneas. Cuando un frotis se encuentra bien realizado, se podrán distinguir en él tres áreas importantes: la cabeza ó zona de inicio, el cuerpo ó zona media y la cola ó área final del mismo. Un frotis no deberá ser ni grueso ni delgado, pues en ninguno de ellos se podrán apreciar bien las áreas antes mencionadas. En un frotis bien realizado, la tinción será de mejor calidad.

3.LISTA DE REQUERIMIENTOS


NÚMERO DESCRIPCIÓN

2 Tubos de recogida de muestras



1 Jeringa


1 Ligadura

1 Caja de portaobjetos limpios


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4. PROCEDIMIENTO.

Técnica de los dos Portaobjetos.

1. Colocar a una distancia de 1.5-1.9 cm del extremo derecho de un portaobjetos, una pequeña gota desangre ( del tamaño de 3 cabezas de alfiler) obtenida por punción capilar del talón, del lóbulo de la oreja ó por extracción venosa.

2. Si se emplea sangre venosa mezclada con anticoagulante, el frotis deberá realizarse lo más pronto posible, debido a que el contacto prolongado con éste altera la morfología celular.

3. Aproximar el portaobjetos extensor a la gora, dejando que hagan contacto y que por capilaridad éste se extienda a lo largo del borde.

4. Se desliza el portaobjetos extensor hacia el extremo contrario, para lograr una película delgada de sangre.

5. dejar secar y teñir.

ACTIVIDADES: -Realizar 10 frotis correctamente confeccionados. -Realizar esquema que muestra las partes de un frotis .


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-Realizar esquema de tres frotis: demasiado grueso, demasiado delgado y correctamente realizado. - Reporte de resultados.____________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________ _______________________________________________________________


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HEMOSTASIA: PRACTICA NO. 3 “TINCIÓN DE WRIGHT Y REACTIVOS

COMUNMENTE EMPLEADOS EN HEMATOLOGIA “

1. INTRODUCCIÓN La finalidad de la tinción de Wright es lograr que el alumno se sienta capacitado para preparar adecuadamente algunos de los reactivos y colorantes más comúnmente empleados en las áreas de hematología y microbiología, que como químico clínico tiene la obligación de conocer y dominar. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGÍA .

COLORANTES. A los colorantes de les puede clasificar en tres grupos: 1) Acidos. Son aquellos constituídos por sales cuya base es incolora y cuyo ácido

es coloreado. A este grupo pertenecen las eosinas. Estas soluciones se usan para la coloración citoplasmática ó coloración de fondo.

2) Basicos. Son aquellas sales de ácido incoloro y base coloreada como el clorhidrato de azul de metileno. Estos colorantes tiñen por lo general algunos elementos del núcleo.

3) Neutros. Son aquellas sales con el ácido y la base coloreados, por ejemplo, los eosinatos de azul y azur de metileno , los más empleados en hematología. El método de Romanowsky, que emplea estos colorantes, ha sido la base de las coloraciones panópticas utilizadas en la actualidad ya que ha tenido un gran éxito en la tinción diferencial de la mayoría de las estructuras normales y anormales de la sangre. La mayor parte de estos colorantes policromos derivados del método de Romanowsky, se disuelven en alcohol metílico, combinando así, la fijación con la tinción. Los más conocidos de todos ellos, son los de Giemsa y de Wright.

Tipo de Error Causas Como se Corrige

Tinción demasiado azul Tiempo excesivo de tinción Lavado deficiente Ph muy alcalino

Disminuir el tiempo de tinción Lavar adecuadamente Acidificar el pH

Tinción demasiado rosa Tiempo insuficiente de tinción Lavado excesivo pH muy ácido

Aumentar el tiempo de tinción Lavar adecuadamente Elevar el pH

Precipitación de colorante Colorante no filtrado Secado de la laminilla durante la tinción.

Filtrado de colorante Procurar que siempre haya un buen menisco de colorante durante la tinción.


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ANTICOAGULANTES. Los 4 anticoagulantes más usados son: mezcla de oxalato amónico y de potasio ( ó

simplemente oxalato amónico ), citrato trisódico, sequestrene ( EDTA ), y heparina. Los 3 primeros impiden la coagulación sustrayendo el calcio del plasma sanguíneo

por precipitación ó fijación en forma no ionizada. La heparina neutraliza la trombina y otras fases de la activación de los factores de coagulación.

El citrato trisódico, el EDTA y la heparina, pueden emplearse para impedir la coagulación de la sangre destinada a transfusiones, sin embargo, la mezcla de oxalatos, no, por ser tóxica.

Los oxalatos pueden usarse para determinaciones como hemoglobina, hematocrito y recuentos globulares, aunque para extensiones sanguíneas puede usarse tan sólo en los primeros minutos, pues más tarde pueden desarrollarse alteraciones de las células sanguíneas como formas dentadas de los hematíes, vacuolización en el citoplasma de los granulocitos, fagocitosis de los cristales de oxalato, artefactos en los núcleos de los linfocitos y monocitos, etc.Además no deben emplearse para determinaciones químicas de nitrógeno y potasio. Para investigaciones de coagulación, es muy útil el citrato trisódico.

El EDTA ó sequestrene es tal vez el anticoagulante más usado para el recuento de células sanguíneas. Se le compara con el oxalato para el estudio del hematocrito y hemoglobina, pero para estudios morfológicos, es todavía mejor, pues con él, no se forman alteraciones ni artefactos en las células sanguíneas, aún después de un buen tiempo de estar hecha la mezcla, si la sangre se refrigera ( 2 horas a 24 horas ).

La heparina también puede usarse para determinaciones como hematocrito y hemoglobina, pero no de óptimos resultados en las extensiones sanguíneas, ya que produce un fondo azul en aquéllas que son teñidas con el colorante de Wright.

3. LISTA DE REQUERIMIENTOS

3.1 Reactivos.

NUM. NOMBRE DEL REACTIVO CANTIDAD

1 Colorante de Wright 0.1 g

2 Metanol 60 ml

3 Na2HPO4 2.56 g

4 KH2PO4 6.66 g

5 EDTA 3g

6 Oxalato de amonio 0.8g

7 Agua destilada 1.5L


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3.2 Equipo de Laboratorio Balanza Granataria Balanza Analítica


3.4 Preparación de los reactivos

3.4.1Colorante de Wright: Colorante de Wright: 0.1 g Metanol: 60 ml Se tritura el colorante con el alcohol en un mortero; ésto se hace poco a poco. Esta

operación debe durar 30 min. hasta completar disolución. Se deja reposar dos días y se filtra.

3.4.2 - Amortiguador ó Buffer de fosfatos Na2HPO4 2.56 g KH2PO4 6.66 g Agua destilada para aforar a 1 L Mezclar las sales con poca cantidad de agua destilada, e ir agregando poco a poco

más agua, hasta aforar a 1 L. Guardar en un frasco ámbar de 1 L.


1 Mortero

2 Probetas de 100 ml

1 Matraz Volumétrico de 100 ml

4 Varillas de vidrio

1 Frasco de vidrio color ambar de 1L de capacidad

3 Frascos de vidrio color ámbar de 150 ml de capacidad

1 Jeringa ó sistema vacutainer para toma de muestra

1 Ligadura

10 Portaobjetos


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3.4.3- EDTA. EDTA 3 g Agua destilada 100 ml Mezclar el EDTA poco a poco con el agua destilada.

3.4.4 -Solución de Oxalato de amonio. Oxalato de amonio 0.8 g Agua destilada 80 ml

Mezclar poco a poco el oxalato de amonio con el agua destilada. En ambos, se utiliza 1 gota de solución por ml de sangre. 4.PROCEDIMIENTO.

4.1 Técnica: Tinción de Wright. 4.1.1. Seleccionar un portaobjetos nuevo de 25 X 75 mm para hacer extendidos,

que tenga la orilla relativamente lisa. 4.1.2 Obtener una pequeña cantidad de muestra de sangre periférica. 4.1.3Colocar una pequeña gota de sangre a 2 ó 3 mm de la orilla de un portaobjetos

limpio y seco. Colocar el portaobjetos para hacer extendido en un ángulo de 30 a 45 grados con respecto al portaobjetos que tiene la muestra y hacer contacto cn la gota. Esta debe extenderse rápidamente a lo largo de la orilla del portaobjetos para hacer los extendidos. Deslizar el portaobjetos de extensión sobre la superficie dispersando la muestra de sangre. El extendido de sangre debe medir aproximadamente 30 mm de largo . El portaobjetos de extensión no se despegará hasta haber extendido toda la sangre. El grueso del extendido de sangre puede regularse modificando el ángulo del portaobjetos de extensión, variando el tamaño de la gota de sangre, la presión ó la velocidad de extensión.

4.1.4 El extendido de sangre se seca con el aire. Una vez seco, se escribe con lápiz el nombre del paciente en una orilla del portaobjetos.

4.1.5 Fijar el extendido de sangre en alcohol metílico absoluto durante 2 a 3 minutos. El color del extendido de sangre cambiará de rojo a café claro. Esta fijación es recomendable aunque el colorante que se vaya a emplear se encuentre diluído en alcohol metílico absoluto.


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4.1.6 Cubrir el portaobjetos completamente con el colorante. Después de 3 minutos añadir un volumen igual de amortiguador. Soplar ligeramente para mezclar uniformemente. Aparecerá un brillo metálico verde.

4.1.7 Después de 5 minutos enjuagar cuidadosamente con agua de la llave ó amortiguador de fosfatos, al principio con chorro delgado y suavemente y después con el chorro fuerte para eliminar todo exceso de colorante. Limpiar el reverso del portaobjetos en posición erecta. Cuando se haya secado, cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos rectangular y fijarlo con una gota de líquido de montaje. Se puede usar sólo aceite de inmersión en una preparación temporal.

El alumno deberá ensayar tiempos hasta ajustar aquellos que más convengan para

una óptima coloración. Así, con tres frotis más deberá ensayar: 2 minutos de colorante y 4 de amortiguador; 6 minutos de colorante y 6 minutos de amortiguador; 6 minutos de colorante y 11 minutos de amortiguador.

4.2 Resultados Esperados. Los resultados esperados en la tinción serán los siguientes:

Hematíes en color rosa. Núcleos de los leucocitos de azul púrpura, con la cromatina y paracromatina netamente diferenciadas. Gránulos neutrófilos del citoplasma, lila ó violeta Gránulos eosinófilos, rojo tirando a naranja. Gránulos basófilos, púrpura tirando a azul oscuro. Plaquetas, color lila oscuro. Citoplasma de los linfocitos, azul claro. Citoplasma de los monocitos, ligero azul. Actividades: -Practicar la tinción de Wright con frotis de sangre periférica. -Corregir de acuerdo al recuadro , errores encontrados en la tinción. - Reporte de resultados .____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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HEMOSTASIA:PRÁCTICA No. 4

“EVALUACIÓN DE SANGRE PERIFÉRICA”

1.INTRODUCCIÓN. Una vez que se ha hecho y teñido un frotis satisfactorio, éste puede ser evaluado en

búsqueda de anormalidades. Cada examen debería incluir análisis con bajo poder ( 10X ),

con alto poder ( 40 ó 45 X), e inmersión ( 100X ).Un error común consiste en comenzar el

examen con el objetivo de inmersión. Ciertos problemas de la muestra y anormalidades

morfológicas significativas pueden pasarse por alto a menos que todos los objetivos sean

empleados.

La presencia de eritrocitos anormales en el frotis de sangre periférica a menudo

brinda importantes claves en el diagnóstico diferencial de las anemias, y puede ser

también de ayuda en el diagnóstico de otras enfermedades. La morfología de los

eritrocitos puede verse alterada con cambios en el tamaño, en la forma, en las propiedades

tintoriales de células individuales ó por la presencia de ciertos materiales dentro de ellas.

Incluso, la presencia de solo una única célula con ciertos cambios, puede considerarse

significativa; en otros, la anormalidad se considera importante sólo si un número

significativo de células se ven afectadas.

Asimismo, en la serie blanca, es importante realizar el recuento diferencial, aún

cuando los nuevos contadores electrónicos den un resultado anticipado del mismo, ya que

sólo puede confirmarse éste por medio de dicha lectura. Del mismo modo, se buscarán

anormalidades en las células blancas y éstas se reportarán, así como la presencia de

células que normalmente no se ven en sangre periférica, sino únicamente en médula ósea,

a menos que exista alguna patología presente.

Lo mismo aplica para las plaquetas, las células más pequeñas de sangre

periférica.Se puede hacer un recuento indirecto de las mismas cuando así se requiera, y

buscar anormalidades en su forma y en su tamaño. Algunas anormalidades pueden

requerir que se indique le severidad del cambio. Todas estas determinaciones pueden

diferir de observador a observador, conduciendo a una variación considerable en el análisis

del mismo frotis de sangre.

Los laboratorios actualmente tratan de controlar estas inconsistencias

desarrollando criterios para estandarizar la evaluación de la morfología. Así, muchos


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laboratorios usan un método semicuantitativo de evaluación, consistente en los términos:

leve, moderado ó severo. O bien un sistema " por cruces" :1+, 2+, 3+, etc.

Tan importante como el que haya consistencia entre los observadores, es importante

también la selección de una área apropiada del frotis para la evaluación. En un frotis en "

cuña ", en el área "aplumada" ó terminal del frotis, demuestran cambios que pueden

considerarse patológicos, p.e. macrocitosis, esferocitosis, células en "diana ", etc. En el

área gruesa del frotis, las células pueden interpretarse como microcíticas en forma

equivocada, y la morfología puede ser difícil de evaluar. También tenderán a formar

apilamientos ( rouleaux ) en esta área. Por ello, el área ideal para examinar un frotis, es

aquella que contiene aproximadamente 200-250 células por campo a seco fuerte. Esto

corresponde a una área en donde los eritrocitos se tocan pero no se enciman. En el

verdadero Roleaux, los márgenes individuales de las células son difíciles de distinguir y dan

una imagen como de pilas de monedas que han sido empujadas y tiradas, imagen que

persiste aún en las áreas más delgadas del frotis, aunque ahí exista menor cantidad de

células. La intensidad de la formación de "rouleaux" depende de la concentración de las

proteínas plasmáticas, especialmente el fibrinógeno. En enfermedades inflamatorias, los

niveles de fibrinógeno pueden aumentar. También la elevación de gama globulinas, como

se observa en el Mieloma múltiple, provoca formación de "rouleaux".

2. PRINCIPIO Y METODOLOGÍA . 2.1 Análisis con bajo poder. Este objetivo debe utilizarse para evaluar la calidad de la tinción.Las células blancas

deberían verse fácilmente con este aumento.Si no es asi, el frotis debe ser nuevamente

teñido.El borde aplumado debe ser examinado para buscar cúmulos de plaquetas ó

filamentos de fibrina, indicando esto que debe realizarse una nueva toma, ya que esta

evidencia de coagulación podría interferir con muchas pruebas hematológicas. Los

extremos laterales y aplumado deben evaluarse en búsqueda de un número

desproporcionado de leucocitos.,Las células más grandes ( por ejemplo los neutrófilos y los

monocitos, tienden a acumularse más en estos lugares y si el frotis está mal hecho, se

acumularán más en estas áreas, las cuales están fuera del área ideal de observación.Si la

mayoría de las células se encuentran en el borde aplumado, el frotis deberá descartarse y

prepararse uno nuevo.

2.2 Análisis con alto poder.

Con este objetivo existen dos problemas por resolver. En primer lugar, se debe

seleccionar el área apropiada para iniciar la cuenta diferencial. Esta debe ser donde los

eritrocitos se tocan pero no se sobreponen, y puede ser un área en donde se encuentren


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200 eritrocitos por campo. Si la cuenta de leucocitos es muy baja, puede ser necesario

incluir áreas fuera del área ideal con el fín de encontrar suficientes células blancas.El

segundo problema por resolver con este objetivo, será estimar la cuenta total de leucocitos.

Estando en el área ideal, contar el número de células blancas observadas en cinco a diez

campos y determinar el promedio. El promedio, multiplicado por un factor de corrección

que a menudo está entre 2000 y 2,500 ( 2 a 2.5 en miles) representará la cuenta total del

leucocitos.

2.3 Análisis con objetivo de inmersión.

Con este objetivo, la cuenta diferencial de leucocitos debe estimarse, la cuenta de

plaquetas, también debe poder estimarse y los tres tipos de células ( leucocitos , eritrocitos

y plaquetas ) deben observarse en búsqueda de anormalidades morfológicas.

La cuenta diferencial consiste en identificar cuando menos 100 leucocitos consecutivos,

y reportar estos valores como un porcentaje. Es importante incluir las células de los

márgenes, así como las del cuerpo del frotis. Así, para lograr esto, debe seguirse el patrón

de observación de la imagen siguiente:

El número de plaquetas también puede ser estimado con este objetivo. Empleando

la misma área que para la cuenta diferencial, es decir, donde los eritrocitos se tocan pero

no se sobreponen, deben contarse las plaquetas en al menos diez campos. Este número

será convertido en no. de plaquetas/μl de sangre, como se hizo con la cuenta de

leucocitos. Deberá calcularse el número promedio de plaquetas por campo, y dicho número

se multiplicará por un factor determinado por el propio laboratorio en base a la combinación

de los objetivos y oculares empleados en sus microscopios. Por ejemplo, cada plaqueta,

observada representa 15,000 plaquetas ó 20,000 / μl. Si se llegaron a observar un

promedio de 12 plaquetas por campo, entonces, la cuenta total de plaquetas sería de

180,000/ μl en el primer caso, ó 240,000 / μl en el segundo caso.

La última actividad a realizar con este objetivo, sería evaluar la morfología celular.

Esto puede irse haciendo a medida que se va realizando la cuenta diferencial. Cualquier

anormalidad ó inclusión en células rojas y blancas, deberá reportarse. También es

importante evaluar la forma y el tamaño de los eritrocitos en esta misma área. Las células

suelen distorsionarse en áreas muy delgadas, ó demasiado gruesas. Las plaquetas


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también deberán evaluarse en su tamaño y forma. Más de una forma inusualmente grande

de plaquetas, en cada cinco campos deberán ser reportadas .

3. LISTA DE REQUERIMIENTOS. 3.1 Equipo de laboratorio.

Microscopio de Luz



1 Frotis de sangre periférica teñidos con colorante de Wright

4. PROCEDIMIENTO.

4.1 Análisis con bajo poder.

4.1.1Evaluar la calidad de la tinción. 4.1.2Examen en el borde aplumado del frotis en búsqueda de cúmulos de plaquetas

ó filamentos de fibrina. 4.1.3Evaluar extremos laterales y aplumado en búsqueda de leucocitos desproporcionados.

4.2 Análisis con alto poder. 4.2.1Seleccionar el área apropiada para iniciar la cuenta diferencial.

4.2.3Estimar la cuenta total de leucocitos.

4.3Análisis con objetivo de inmersión. 4.3.1Realizar el recuento diferencial, contando cien células en total, y diferenciando la línea celular a la que pertenecen.

4.3.2Realizar el recuento indirecto de plaquetas. 4.3.3Buscar anormalidades morfológicas tanto de los leucocitos como de los eritrocitos y de las plaquetas.


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ACTIVIDADES: - Reporte de resultados

1. Análisis con bajo poder.

1.1 Calidad de la tinción:_________________________________________________ __________________________________________________________________

1.2 Examen del borde aplumado del frotis ___________________________________

__________________________________________________________________

1.3 Examen de los extremos laterales y aplumado del frotis._____________________________________________________________________________________

2. Análisis con alto poder.

2.1 Seleccionar el área ideal para búsqueda de anormalidades en las células:

(donde los eritrocitos se tocan, pero no se sobreponen, en el cuerpo del frotis )_que es la misma donde se realizará el recuento diferencial de leucocitos.__________________________________________________________________________________

3. Análisis con objetivo de inmersión.

3.1 Recuento indirecto de plaquetas

3.2 Búsqueda de anormalidades morfológicas de:

plaquetas___________________________________________________________


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HEMOSTASIA: PRACTICA NO. 5 “RECUENTO DIRECTO DE PLAQUETAS “

1. INTRODUCCIÓN.

El recuento de plaquetas puede hacerse de manera directa y de manera indirecta. El método directo, a su vez, requiere de un contador electrónico que sea capaz de hacer el recuento de las diferentes células sanguíneas ( leucocitos, eritrocitos y plaquetas), ó en su defecto, podrá hacerse mediante el método manual, en el que se empleará la cámara de Neubauer y la pipeta de Thoma. El método indirecto es muy útil cuando se tiene dudas sobre los resultados emitidos por cualquiera de los métodos directos, y/ó como modo de confirmar éstos.Esto sucede por ejemplo, cuando la muestra no fue adecuadamente anticoagulada a la hora de ser tomada, ó cuando se tienen cifras anormalmente altas ó anormalmente bajas,

2. PRINCIPIO Y METODOLOGÍA En el recuento directo de las plaquetas mediante la cámara de Neubauer, se mezcla la sangre en la pipeta de Thoma con un diluyente que cause la hemólisis de los eritrocitos. Se llena el hemocitómetro con dicha mezcla y se recuentan las plaquetas en la cuadrícula central, de preferencia con microscopio de contraste de fases y con el objetivo de 40X.

3. LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Reactivos

NUMERO NOMBRE DEL REACTIVO CONCENTRACIÓN CANTIDAD

1 Oxalato de amonio 1% 1 ml

3.2 Equipo de Laboratorio

3.2.1 Centrífuga 3.2.2 Agitador eléctrico 3.2.3 Microscopio de luz


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4.PROCEDIMIENTO.

4.1 Técnica 4.1.1 Si se obtiene la muestra por punción digital, el sitio debe estar limpio y la sangre

debe fluir libremente. Limpia la primera gota. Si la muestra es de sangre venosa debe obtenerse con una jeringa de plástico seca ( ó de vidrio siliconizado ) con aguja corta, de calibre no menor al 21.Retirar la aguja antes de poner la sangre en un tubo de plástico con EDTA. La sangre y el anticoagulante deben mezclarse inmediata y cuidadosamente, para evitar la formación de espuma.

4.1.2 El mezclado de la sangre con anticoagulante debe realizarse suavemente y durante unos cinco minutos.

4.1.3 Con la pipeta de Thoma, aspirar sangre hasta la marca de 1.0 y se diluye hasta la marca de 101 con el oxalato de amonio ( dil.1:100).Hacer por duplicado.

4.1.4 Colocar las pipetas en el agitador de 10 a 15 minutos. 4.1.5 Llenar la cámara de Neubauer con el contenido de las pipetas debidamente

mezclado, desechando las primeras 4-6 gotas. 4.1.6 Cubrir la cámara con una caja de Petri de 10 a 20 min, para permitir que las

plaquetas se sedimenten. Colocar un pedazo de algodón ó de papel filtro mojados dentro de la caja para evitar la evaporación.

4.1.7 Empleando el microscopio de contraste de fases, contar las plaquetas en la cuadrícula central destinada a la cuenta de glóbulos rojos ( 25 cuadros centrales )calculando la cifra de plaquetas como sigue:

No. De plaquetas /μl= No de plaquetas contadas X factor de dilución( 100) X factor de corrección de volumen ( 10)= No de plaquetas contadas X 1000.

NÚMERO DESCRIPCIÓN

2 Tubos de recogida de muestras con EDTA



1 Jeringa


1 Ligadura

1 Cámara de Neubauer

1 Pipeta de Thoma

1 Boquilla y manguera para aspiración


Hemostasia 23

4.2 Factores de Error en las Cuentas Celulares. 4.2.1 Cuando se use sangre capilar se requiera una gota que fluya

libremente. 4.2.2 Las muestras de sangre anticoagulada se deben mezclar

cuidadosamente invirtiendo el tubo de sangre por lo menos 20 veces. No se debe agitar el tubo pues se forma espuma que impide medir cantidades exactas. Inclinar el tubo bien mezclado a un ángulo de 45°, ó ligeramente mayor, y pipetear del borde superior del tubo siguiendo las mismas indicaciones que para sangre capilar.

4.2.3 Las pipetas deben estar limpias y secas. 4.2.4 Tomar las muestras con la pipeta en forma rápida y precisa. Si se

rebasa la línea del volumen deseado ligeramente, ajustar tocando un papel absorbente con la punta de la pipeta,

Cuadrículas ( L ) para recuento

de glóbulos blancos

El recuento de plaquetas se realiza en los 25 cuadros del cuadrante central.


Hemostasia 24

4.2.5 Limpiar el exterior de la pipeta antes de introducirla en la solución disolvente.

4.2.6 La cámara se llena por acción capilar, regulando el flujo del líquido de la pipeta, para que fluya suave y rápidamente, Llenar la cámara completamente, sin permitir que el líquido rebase los límites. Esperar de 10 a 20 minutos a que las células se asienten en el área de conteo. Proseguir con el conteo.

4.2.7 La cámara del hemocitómetro y el cubreobjetos deben estar limpios y secos antes de usarse. Esto evita errores graves que se producen por las huellas digitales y las superficies aceitosas.

ACTIVIDADES. 1. Reportar resultados

- Reporte de resultados .____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2. Enumerar todos los casos en que pueda haber aumento ó disminución de plaquetas.


Hemostasia 25

HEMOSTASIA: PRACTICA NO. 6 “TIEMPO DE COAGULACIÓN “

1. INTRODUCCIÓN. El tiempo de coagulación es un estudio creado en 1939. Nos da un indicio

aproximado de la eficacia global del mecanismo intrínseco de la coagulación. La prueba carece de valor para las insuficiencias ligeras de distintos factores, porque basta con una pequeña cantidad de trombina para producir un coágulo fibrina. Todavía es menos útil para las anomalías de las últimas etapas de la coagulación.

2. PRINCIPIO Y METODOLOGÍA El tiempo de coagulación mide el intervalo de tiempo necesario para que una muestra de sangre completa recién obtenida coagule in vitro a 37°C y evalúe en forma general el mecanismo de coagulación intrínseco. Dos son las finalidades más relevantes de este método:

1. Evaluar la función del sistema intrínseco de la coagulación

sanguínea. 2. Vigilar la eficiencia de la administración de heparina.

3 .LISTA DE REQUERIMIENTOS.

3.1Equipo de laboratorio. 3.1.1Baño María a 37°C 3.1.2Cronómetro

3.2Material de Laboratorio.


3 Tubos de vidrio de 12X75

1 gradilla


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4.PROCEDIMIENTO. 4.1 Método de Lee-White

1. Se extrae sangre venosa con una jeringa de 5 ml, y una aguja gruesa ( del No.18 ó 19 ). La punción venosa debe ser perfecta, pues la contaminación con linfa puede modificar los resultados.

2. Preparar el baño María a 37°C, colocando una gradilla dentro de él, con 3 tubos de 12 X 75.

3. Se le realiza al paciente una punción de 3 ml poniendo en marcha el cronómetro en el momento en que entra la sangre a la jeringa.

4. Terminada la punción, se deposita 1ml de sangre en cada tuboy se vigilan cada 30 seg., inclinándolos suavemente y anotando el tiempo en que coagula cada uno de ellos.

5. Se suman los tres tiempos, y se calcula el promedio, obteniendo así el resultado. 6. Durante el proceso, evitar la agitación, que podría retardar el tiempo de coagulación.

4.2 Valores de Referencia: 4-10 minutos ACTIVIDADES. Realizar la toma de muestra sanguínea como se indica y continuar con los demás pasos de la técnica. Realizar cálculos y obtener resultados. - Reporte de resultados .____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Anotar observaciones.


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HEMOSTASIA: PRACTICA NO. 7 “OBSERVACIÓN DEL COÁGULO “

1. INTRODUCCIÓN.

La observación del coágulo formado en un tubo de ensayo proporciona información sobre: a) La concentración del fibrinógeno,b) el número y función de las plaquetas y c) la

actividad del sistema fibrinolítico.

2. PRINCIPIO Y METODOLOGÍA.

2.1 Aproximadamente el 30% del volumen total de sangre en el tubo debe coagularse

2.2 En casos de trombocitopenia ó de disfunción plaquetaria muy anormal, como en la trombastenia, se forma un coágulo grande de estructura débil. Asimismo, en casos de paraproteinemia ( mieloma ó macroglobulinemia de Waldenstrom), la retracción del coágulo puede estar muy trastornada.

2.3 Un coágulo pequeño de forma regular ocurre cuando la concentración del fibrinógeno es baja.

2.4 Un coágulo pequeño de forma irregular se observa cuando el incremento en la actividad fibrinolítica lo digiere, como ocurre en la coagulación intravascular diseminada ( CID ).

2.5 No se observa formación de coágulo alguno.

2.6 Causas de error

Tubos de ensayo sucios Contaminación de sangre con anticoagulante

1 2 3 4


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3. LISTA DE REQUERIMIENTOS.

3.1Equipo de Laboratorio.

Baño María a 37°C

3.2Material de Laboratorio

4. PROCEDIMIENTO 4.1 Tomar una muestra de sangre y depositar la muestra en un tubo de vidrio

de 13 X 100 4.2 Colocar el tubo con la muestra de sangre en el baño María a 37°C

durante 3 horas. 4.3 Observar después de transcurrido este tiempo, la forma del coágulo,

rodeado de suero 4.4 .Ayudarse con el gancho de alambre para vaciar el contenido del tubo

lentamente a la caja de Petri con un papel filtro dentro de ella. 4.5 Observar y buscar un coágulo pequeño en caso de que en el tubo no se

haya apreciado un coágulo grande. ACTIVIDADES Reportar resultados mediante la descripción del coágulo formado, ó reportar la ausencia de éste.

- Reporte de resultados .___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


2 Tubos de vidrio de 13 X 100 de fondo redondo

1 Gancho de alambre

1 Aplicador de madera

1 Caja Petri con papel filtro dentro de ella

1 Jeringa de 5 ml ó Sistema Vacutainer

1 Ligadura

1 Torunda con alcohol isopropílico


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HEMOSTASIA: PRÁCTICA NO 8 TIEMPO DE SANGRADO

1.INTRODUCCIÓN. El tiempo de sangrado es una medida de Integridad vascular y plaquetaria. Las plaquetas se adhieren a la colágena expuesta ( subendotelial) y después entre ellas, para formar un agregado que obtura la herida. Para la agregación plaquetaria, también es necesario un factor del plasma: el factor de Von Willebrand. 2.PRINCIPIO Y METODOLOGÍA

El tiempo de sangrado se mide determinando el tiempo necesario para que dejen de sangrar los pequeños vasos subcutáneos que han sido lesionados por una Incisión estandarizada. Uno de los mayores problemas que confronta la medición del tiempo de sangrado es la reproducibilidad. Por esta razón se han desarrollado tres generaciones de pruebas, cada una con aumento en la estandarización de la herida en profundidad y longitud. El método más antiguo es el de Duke, que consiste en hacer una punción del lóbulo de la oreja con una lanceta estéril. La desventaja de este método es que es muy difícil estandarizar la profundidad de la incisión. Además, si el paciente tiene un serio problema hemorrágico, el sangrado en el tejido celular blando del lóbulo de la oreja puede causar un hematoma grande.

El método de Ivy está mejor estandarizado que el de Duke. Se utiliza una lanceta ó estilete para producir una incisión en la cara anterior del antebrazo. La navaja tiene un tope que "limita la profundidad de la Incisión. Además, como la cara anterior del antebrazo es suficientemente larga para permitir varias incisiones, pueden hacerse dos ó tres de ellas y promediar sus resultados. Adicionalmente, en este método está mejor estandarizada la presión del sistema vascular, ya que un esfingomanómetro que se coloca en el brazo (40 mmHg), mantiene la presión venosa dentro de límites reducidos.


Hemostasia 30

3.LISTA DE REQUERIMIENTOS 3.1 Equipo de Laboratorio

Esfingomanómetro Cronómetro. 3.2Material de Laboratorio


1 Lancetas desechables estériles

1 Tiras de papel filtro

1 Torundas de algodón con alcohol

4.PROCEDIMIENTO 4.1 Técnica: Método de Duke. 1. Limpiar perfectamente el lóbulo de la oreja o la yema de un dedo con una torunda con alcohol. Dejar secar . 2. Puncionar el sitio elegido con la lanceta, echando a andar al mismo tiempo, el cronómetro. La punción debe hacerse en un solo movimiento, introduciendo la lanceta hasta el fondo y sin hacer movimientos laterales de ésta para no rasgar la piel o hacer más amplia la punción. 3. Sin tocar la piel, con una tira de papel filtro, secar la gota de sangre que salga por el sitio de punción cada 30 segundos, hasta que el papel flltro ya no absorba sangre. 4. Anotar el tiempo en que deje de sangrar . Ventajas: es muy sencillo de realizar . Desventajas: Las condiciones de la prueba no son constantes, por lo tanto los resultados son imprecisos. 4.2 Técnica: Método de Ivy. 1. Colocar el brazalete del esfingomanómetro en el brazo del paciente. limpiar la cara anterior del antebrazo con una torunda de algodón mojada en alcohol y dejar secar . 2. Inflar el brazalete a 40 mmHg y esperar 30 segundos para permitir que el llenado capilar se equilibre. 3. Hacer tres incisiones en la cara anterior del antebrazo, de preferencia donde no existe vello y evitando las venas superficiales. 4. Poner a andar un cronómetro para cada herida en el momento en que comience el sangrado, lo que ocurre, generalmente, de 15 a 30 segundos después.


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5. Si el sangrado no se inicia antes de 30 segundos de efectuada la incisión, oprimir suavemente la herida entre dos dedos ( esto no modifica el resultado final). 6. Absorber la sangre con el papel filtro circular cada 15 segundos. Debe evitarse el contacto directo entre el papel filtro y la herida. 7. El tiempo de Sangrado corresponde al momento en que la sangre ya no mancha el papel filtro. Registrar el tiempo en el que esto ocurre para cada incisión . 8. Sacar el promedio del tiempo de las tres heridas. 9. Limpiar los sitios de incisión y cubrirlos con vendas adhesivas estériles. Ventajas: Las condiciones de prueba son constantes, por lo que tiene mayor reproducibilidad. Desventajas: Es un poco más laboriosa para realizar. 4.3 Valores de Referencia. Método de Duke: 1 a 4 minutos Método de Ivy: de 2 a 6 minutos

- Reporte de resultados .____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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HEMOSTASIA: PRÁCTICA No.9 VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR

1. INTRODUCCIÓN. La Velocidad de Sedimentación Globular ( VSG ) es útil para monitorizar la evolución de una enfermedad inflamatoria ó diferenciar enfermedades similares. la VSG es normal en los pacientes con artrosis, pero está elevada en los que presentan fiebre reumática, artritis reumatoidea o artritis piógena. Esta elevada en las fases iniciales de la enfermedad inflamatoria pelviana aguda o de un embarazo ectópico roto, pero es normal en las primeras horas de una apendicitis aguda. Puede usarse para indicar tuberculosis pulmonar activa. 2. PRINCIPIO Y METODOLOGÍA Cuando Se deja sangre anticoagulada en reposo un tiempo a temperatura ambiente, los eritrocitos sedimentan hacia el fondo del tubo. La VSG es la cantidad de milímetros que los eritrocitos sedimentan en 1 hora, y es afectada por los eritrocitos, el plasma y factores mecánicos y técnicos. Los eritrocitos tienen una carga superficial neta negativa, por consiguiente tienden a repelerse entre sí. Las fuerzas repulsivas se neutralizan en forma parcial ó total si hay aumento de la cantidad. de proteínas plasmáticas con carga positiva; los eritrocitos sedimentan con mayor rapidez debido a la formación de agregados de eritrocitos o "rodillos". Los ejemplos de macromoléculas que pueden producir esta reacción son: fibrinógeno, beta globulinas e inmunoglobulinas patológicas. Los eritrocitos normales tienen una masa relativamente pequeña y sedimentan despacio. Algunas enfermedades como el mieloma múltiple, pueden causar la formación de "rodillos" debido a la alteración del fibrinógeno y las globulinas plasmáticas. Esta alteración cambia la superficie del eritrocito, lo que genera su aglutinación, aumento de su masa, y una VSG más rápida. esta última es directamente proporcional a la masa del eritrocito e inversamente proporcional a la viscosidad del plasma. 3. LISTA DE REQUERIMIENTOS

3.1 Material de Laboratorio


1 Tubio de Wintrobe graduado

1 Pipeta Pasteur

1 Gradilla para tubos de Wintrobe

1 Tubo con sangre anticoagulada


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4.PROCEDIMIENTO. 4.1 Técnica 1. Llenar la pipeta de Wintrobe graduada hasta la marca cero con sangre anticoagulada con EDTA. 2. colocar la pipeta en el soporte y dejar sedimentar sin tocar 60 min 3. registrar la cantidad de milímetros que descendieron los eritrocitos. La capa leucocitaria no debe incluirse en la Lectura. 4. La VSG se informa como 1 hora= _________mm 4.2 Valores de Referencia.

Edad VSG (mm/hr) Niños 0 a 10 Hombres <50 años 0 a 15 >50 años 0 a 20 Mujeres <50 años 0 a 20 >50 años 0 a 30 ACTIVIDADES Reportar los resultados obtenidos. - Reporte de resultados .____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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HEMOSTASIA: PRÁCTICA No.10 MEDICIÓN DEL SISTEMA EXTRÍNSECO

TIEMPO DE PROTROMBINA ( TP } EN UNA ETAPA

1. INTRODUCCIÓN.

El análisis de tiempo de Protrombina es sensible a las deficiencias del sistema extrínseco de la coagulación ( factores I, II, V, VII ó X ). El TP se utiliza como exploraci6n prequirúrgica para detectar posibles problemas hemorrágicos. Un TP prolongado Generalmente es indicativo de un nivel bajo en uno o más de los factores del sistema de coagulación extrínseco ó común, cuya causa pueden ser trastornos hereditarios de la coagulación, una deficiencia de vitamina K, problemas hepáticos ó ingestión de fármacos. El TP es el análisis de laboratorio más corriente empleado para monitorizar la terapia anticoagulante oral, puesto que es sensible a los factores VII y X. No es sensible a las deficiencias del sistema intrínseco ( factores VIII. IX. XI y XII ) ó a las disfunciones plaquetarias. No puede utilizarse para la monitorización de la terapia de heparina, para la cual está recomendada la determinación del Tiempo de activación Parcial de Tromboplastina ( ATTP)

2. PRINCIPIO Y METODOLOGÍA El TP es el tiempo requerido para que se coagule el plasma después de agregarle tromboplastina tisular v una cantidad óptima de cloruro de calcio, reponiendo el calcio que fue inactivado con el anticoagulante y agregando una tromboplastina completa para activar la vía extrínseca. El método de referencia de la Prueba del TP en una etapa es el recomendado por el Consejo Internacional de Estandarización en Hematología/Consejo Internacional de Trombosis y Hemostasia (CIEH/CITH). Los resultados obtenidos dependen de numerosos factores como la temperatura, la calidad del agua, el pH, la fuerza iónica, el método de ensayo utilizado, la recogida y conservación de las muestras, y la población de pacientes en consideración. Los rangos normales de muestras deben ser establecidos para cada laboratorio. Para cada nuevo lote de tromboplastina ( preparada en el laboratorio ó comercial ), se deben establecer valores normales en muestras de plasma, de aproximadamente 20 hombres ó mujeres que no estén tomando anticonceptivos. Para ello, no es necesario que todas las pruebas se efectúen el mismo día. Es preferible hacerlas en días distintos pues así se consigue agregar la variabilidad de día a día. La media y la desviación estándar se calculan a partir de los resultados.


Hemostasia 35

El resultado de la prueba en segundos se convierte a Porcentaje de Actividad normal por medio de una curva de referencia. El Índice de tiempo de Protrombina se calcula dividiendo el TP por el TP medio Del rango normal del laboratorio, representado por una muestra testigo normal. Para emplearse en el control de la medicación anticoagulante, el Índice de Protrombina debe designarse en los informes de laboratorio de manera estándar como Tasa Normalizada Internacional de Protrombina ó INR del inglés International Normalizad Ratio. SE SUGIERE PUES, REPORTAR DE LA SIGUIENTE MANERA: TIEMPO DE PROTROMBINA: Testigo del dia ……………………………………..X segundos Plasma Problema …………………………….... …X segundos Porcentaje de actividad ……………………… ……….% INR ………………………………………………………X 3.LISTA DE REQUERIMIENTOS.

3.1 Reactivos

NUM NOMBRE DEL REACTIVO CONC CANTIDAD

1 Reactivo de Tromboplastina.* 200μl

2 Diluyente** 10 ml

3 Anticoagulante Citrato de sodio 3.2 a3.8% 1gota/ml de sangre

*Reactivo de Tromboplastina: Tromboplastina tisular procedente de cerebro de conejo, iones de Caldo V estabilizador . **Diluyente. Estabilizadores y Conservantes. Contiene azida sódica al 0.05% como conservante.

3.2 Equipo de Laboratorio - Baño María con termostato a 37º C - Cronometro.



1 Micropipeta con punta desechable

1 Tubos de recogida al vacío con citrato de sodio al 3.2% ó 3.8%.

1 Gradilla.

3 Tubos de ensayo de fondo redondo que quepan en la Gradilla.

1 Gancho de alambre metálico,


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4.PROCEDIMIENTO 4.1Técnica.. 4.1.1 Calentar previamente un volumen suficiente del reactivo de tromboplastina reconstituido a 37ºC .Tomar las precauciones necesarias para Impedir la evaporación y no mantener a 37ºC sin tapón durante más de 60 minutos antes del uso. 4.1.2. Etiquetar un tubo de ensayo para cada muestra ( paciente y control) del análisis. 4.1.3. Agregar 0.1 ml de muestra al tubo apropiado. 4.1.4 Incubar cada muestra y control a 37ºC de 3 a 10 min. 4.1.5 Con fuerza, agregar 0.2 ml del reactivo de tromboplastina precalentado, y al mismo tiempo, iniciar el cronometraje de detección de coagulación. 4.1.6 Anotar el tiempo en segundos requerido para detectar la coagulación. 4.2 Preparación de la Muestra y del Reactivo. 4.2.1Muestra: No es necesario que el paciente esté en ayunas ni se someta a otra preparación especial. Se recomienda plasma con anticoagulante de citrato de sodio al 3.2% en una proporción de nueve partes de sangre por una de anticoagulante. 4.2.2Reactivo: El reactivo se prepara de la siguiente manera: Reconstituir un vial de reactivo de tromboplastina con un vial de diluyente. Los dos componentes deben ser del mismo lote del kit. Volver a tapar el vial e invertirlo suavemente varias veces para garantizar una rehidratación completa. Dejar reposar durante 30 min. A temperatura ambiente. Invertir suavemente antes de su uso para garantizar homogeneidad .El reactivo permanece estable durante cuatro días si se mantiene en el vial original, tapado herméticamente y se almacena a 2-8ºC, y registrar la fecha de la reconstitución en la etiqueta del vial. ACTIVIDADES: - Realizar la determinación del TP problema y del TP del testigo normal y reportar en segundos. TIEMPO DE PROTROMBINA: Testigo del dia ……………………………………..segundos Plasma Problema …………………………….... segundos Porcentaje de actividad ……………………… ……….% INR ………………………………………………………


Hemostasia 37

- Realizar un esquema ( dibujado) de la vía de la reacción de la coagulación de TP en la que se agrega reactivo de tromboplastina, que incluye factor tisular, fosfolípido y Ca++. - Explicar, en base al esquema, un TP prolongado, para deficiencias de qué factores es más sensible y para cuáles es menos sensible.


Hemostasia 38

HEMOSTASIA: PRACTICA NO.11 "CURVA DE CALIBRACIÓN PARA TIEMPO DE

PROTROMBINA"

1. INTRODUCCIÓN. El resultado de la prueba de TP ( en segundos) se convierte a porcentaje de actividad normal por medio de una curva de calibración.

2. PRINCIPIO Y METODOLOGÍA. La Curva de Calibración se prepara mediante el análisis de diluciones de una mezcla de

plasmas citratados normales o material de referencia. 3.LISTA DE REQUERIMIENTOS

3.1 Reactivos


1 Reactivo de Tromboplastina.* 200μl

2 Diluyente** 10 ml

3 Anticoagulante Citrato de sodio 3.2 a3.8% 1gota/ml de sangre

4 Solución Salina Fisiológica 10 ml

*Reactivo de Tromboplastina: Tromboplastina tisular procedente de cerebro de conejo, iones de Calcio V estabilizador . **Diluyente. Estabilizadores y Conservantes. Contiene azida sódica al 0.05% como conservante.






1 Gradilla.

3 Tubos de ensayo de fondo redondo que quepan en la Gradilla.


1 Pool de 5 ó 6 plasmas citratados de pacientes normales.


Hemostasia 39

4.PROCEDIMIENTO 4.1 Técnica 4.1.1Preparar las diluciones en solución salina fisiológica según el siguiente esquema.

Porcentaje de actividad 100% 50% 25% 12.5%

Dilución Sin diluir 1:2 1:4 1:8

Plasma 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml

Solución salina 0.0ml 0.5ml 1.5ml 3.5ml

4.1.2 Se toma 0.1 ml de cada una de las diluciones y se procede a determinar el tiempo de protrombina por duplicado de cada una de ellas. 4.1.3 Con los datos obtenidos, se traza una curva en papel milimétrico, poniendo el tiempo en segundos en el eje de las ordenadas y la concentración en porcentaje en el eje de las abcisas. 4.2 Resultados.

Porcentaje de actividad Tiempo de protrombina en segundos

100%

50%

25%

12%

ACTIVIDADES: Realizar las diluciones como se Indica en la tabla y seguir el procedimiento para las determinaciones de Tp a cada una de ellas. Transferir los datos en papel milimétrico como se indica arriba trazando la curva correspondiente. Efectuar lo mismo en la tabla que se presenta abajo.


Hemostasia 40


Hemostasia 1


Hemostasia 1

HEMOSTASIA: PRACTICA NO. 12 CONTROL DE LA TERAPÉUTICA ANTICOAGULANTE:

CÁLCULO DE LA TASA NORMALIZADA INTERNACIONAL TNI ó INR

1.INTRODUCCIÓN. El control de la medicación anticoagulante oral se basa en el tiempo de protrombina en una etapa ( TP ) con tromboplastina. El TP debe expresarse como la relación del TP del enfermo con la del plasma normal control. Para controlar de manera confiable la terapéutica anticoagulante, el laboratorista y el médico deben estar capacitados para comparar sus resultados con los de otros laboratorios y también con los de su propio laboratorio, empleando diversos lotes de tromboplastina. Para este propósito, la OMS recomienda que todas las tromboplastinas deban calibrarse comparándolas con un Índice Internacional de Sensibilidad ó IIS. La OMS ha establecido un estándar primario internacional de referencia de cerebro humano, y posteriormente, estándares de referencia de tromboplastinas humanas, de res y de conejo. Estas preparaciones han sido calibradas en relación con el estándar primario original al que se le adjudicó un IIS de 1.0 Debido al riesgo biológico implicado, el cerebro humano no debe utilizarse como fuente de tromboplastina. 2.PRINCIPIO Y METODOLOGÍA. 2.1 Interpretación. La TNI o INR de los pacientes que estén bajo tratamiento con anticoagulantes orales, tales romo la warfarina, debe mantenerse dentro de los límites terapéuticos, ajustando la dosis ron determinaciones periódicas de TP, habitualmente cada 2 a 3 semanas. Se recomiendan los siguientes límites: Condición TNI o INR -Profilaxis preoperatorio de trombosis venosa profunda 2.0- 2.5 -Profilaxis para cirugía de cadera ó para operar un fémur fracturado 2.0- 3.0 -Tratamiento de trombosis venosas profundas ó de embolia pulmonar 2.0 -3.0 -Episodios Transitorios de Isquemia 2.0 -3.0 -Trombosis venosas recurrentes profundas ó de embolia pulmonar 3.0 -4.5 -Infarto del miocardio 3.0 -4.5 -Injertos arteriales 3.0 -4.5 -Prótesis valvulares cardiacas e injertos 3.0 -4.5


Hemostasia 2

Si se prolonga la TNI ó INR, ( > 5.0 },es probable que ocurran hemorragias espontáneas. Cuando el paciente informa alguna hemorragia, la TNI ó INR debe determinarse de inmediato. También debe efectuarse un seguimiento cuidadoso de la TNI ó INR en los pacientes que se encuentran recibiendo otros medicamentos, particularmente aquellos que se sabe aumentan 6 disminuyen el efecto de los anticoagulantes, como se muestra en la tabla de abajo. Los anticoagulantes orales pueden lesionar al feto. Deben interrumpirse al primer signo de embarazo y sustituirse por heparina. A diferencia de la terapéutica anticoagulante por vía oral, la anticoagulación con heparina, sin embargo, no está bien estandarizada.

INCREMENTAN SU EFECTO

CIRCUNSTANCIAS CLÍNICAS MEDICAMENTOS Trastornos hepáticos Acido acetilsalicílico Desnutrición Alopurinol Esteatorrea Ampicilina Diarrea Esteroides anabólicos Carcinoma en Vísceras Aspirina fiebre e Infección Cloramfenicol Insuficiencia cardíaca Clofibrato Insuficiencia renal Medicamentos citotóxicos Tirotoxicosis Neomicina Radioterapia Fenilbutazona Alcoholismo Sulfonamidas Antidepresivos tricíclicos

DISMINUYEN SU EFECTO

Antiácidos Barbitúricos Colestiramina Corticosteroides Diuréticos Estrógenos Anticonceptivos orales Fenitoína Rifampicina 2.2 Cálculos. El TNI ó INR ( por sus siglas en inglés Internacional Normalizad Ratio ) se calcula por medio del Índice Internacional de Sensibilidad IIS y el Índice de Protrombina de la siguiente manera:

Índice de TP = Tasa Normalizada Internacional o INR = (Índice de TP)

ISI


Hemostasia 3

Para cada lote de reactivo de tromboplastina, se determina su valor de IIS mediante su calibración relativa a un Preparado de Referencia Internacional, y se suministra en el cuadro de valores de INR del reactivo. ACTIVIDADES. Efectuar el cálculo del INR a partir de las determinaciones del TP realizadas a las muestras problema.


Hemostasia 4

HEMOSTASIA: PRACTICA NO. 13

MEDICIÓN DEL SISTEMA INTRÍNSECO TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA

( TTPa )

1. INTRODUCCIÓN Esta prueba mide la actividad procoagulante intrínseca del plasma. Esta prueba es sensible a todos los factores que intervienen en el sistema intrínseco, y no mide la actividad de los factores VIl y XIII. 2.PRINCIPIO Y METODOLOGÍA. 2.1 Principio. La tromboplastina parcial es un sustituto del factor plaquetario 3 ( fosfolípidos de cerebro de conejo). La activación por contacto se estandariza añadiendo un activador como caolín, celita ó ácido elágico al reactivo.

2.2 Metodología : Preparación de las Muestras. En un tubo limpio, conteniendo una parte de sol. Anticoagulante , añadir 9 partes de sangre recién obtenida. Mezclar con suavidad. Conservar el tubo en refrigerador ó en hielo picado. Antes de realizar la prueba, centrifugar y separar el plasma. Las pruebas deben complementarse dentro de las 4 horas siguientes a la obtención de la muestra. 3.LISTA DE REQUERIMIENTOS.

3.1 Reactivos


1 Reactivo de Tromboplastina Parcial* 200μl

2 Cloruro de calcio 0.025 M 10 ml

*Fosfolípidos de cerebro de conejo adicionado de partículas de sílice micronizada que actúan como activador ( superficie de contacto) y tampón ácido.



Hemostasia 5





1 Gradilla.

3 Tubos de ensayo de 12 X 75


3. PROCEDIMIENTO

3.1TÉCNICA. ( método manual) . 3.1.1. Calentar previamente a 37°C un volumen suficiente de solución de cloruro de Calcio 0.025M. 3.1.2. Identificar un tubo de ensayo para cada muestra a analizar ( pacientes y controles). Se aconseja hacer las pruebas por duplicado. 3.1.3 Dispensar 0.1 ml de plasma a su tubo correspondiente. Añadir 0.1 ml del reactivo de tromboplastina parcial a cada tubo. 3.1.4. Incubar a 37°C durante 5 minutos exactos ( tiempo de activación). 3.1.5. Inmediatamente añadir 0.1 ml de solución de Ca 0.025M. Simultáneamente poner el cronómetro en marcha y determinar la formación del coágulo. 3.1.6. Anotar el tiempo en segundos, transcurridos hasta la formación del coágulo. ACTIVIDADES - Efectuar la prueba de TTPa en el plasma problema y anotar el resultado en segundos. - Realizar un esquema ( dibujado) de la vía de la reacción de la coagulación de TTPa en la que se agrega reactivo de tromboplastina parcial, sustituto de factor plaquetario 3. - Explicar, en base al esquema, un TPT prolongado, para deficiencias de qué factores es más sensible y para cuáles es menos sensible. - Anexar esquemas en donde se conjunten las posibles interpretaciones de los tiempo de TP y TTPa realizados a un mismo paciente.

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