Manual Del Lab Oratorio de Cultivo de Tejidos

Instituto Politécnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

Laboratorio de Cultivo de Tejidos

Manual elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María del Carmen Oliver Salvador, Karen Gisela Moreno Guerrero, Verónica Pacheco González y Hernán Cortés Arroyo

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS

ACADEMIA DE BIOTECNOLOGÍA

MANUAL DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS

ELABORADO POR:

Dr. Jesús Agustín Badillo Corona

Dra. María del Carmen Oliver Salvador

IBt. Karen Gisela Moreno Guerrero

Biol. Verónica Pacheco González

IBt. Hernán Cortes Arroyo

México D. F. Agosto 2009




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Relación de prácticas

No. Titulo Numero de sesiones*

1 Germinación de semillas de diversas especies en condiciones de asepsia 4

2 Preparación de medios de cultivo para la generación de callos y micropropagación

5

3 Establecimiento de un cultivo de callos de explantes de zanahoria (Daucus carota).

4

4 Micropropagación de violeta africana Saintpaulia ionantha Wendi. 5

5 Regeneración de plantas completas a partir de explantes de hojas de Nicotiana tabacum

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*La sesiones necesarias para la realización de cada práctica no son necesariamente continuas.




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Práctica 1. Germinación de semillas de diversas especies en condiciones de asepsia.

INTRODUCCION

Durante el desarrollo de una planta los procesos de formación de semillas y de germinación son procesos absolutamente indispensables para la dispersión y perpetuación de la especie. Por este motivo, averiguar los mecanismos que gobiernan la germinación de semillas ha sido esencial para comprender tanto el papel reproductivo de éstas, como el papel que juegan en un contexto ecológico que tiene implicaciones de competitividad y dispersión.

Hasta el día de hoy se han identificado 4 requerimientos abióticos básicos necesarios para la germinación:

1. Agua, mediado principalmente por el potencial hídrico del ambiente y de la semilla. Se considera que es el factor determinante para que se realice la germinación (si no hay agua no hay germinación).

2. Oxígeno, el cual ingresa a la semilla en forma gaseosa o disuelto en agua.

3. Temperatura, específica para cada especie.

4. Luz, no es considerada un factor determinante, pero si un promotor de la germinación.

La semilla contiene al embrión generado por la fecundación en la planta madre y el éxito que tenga para su supervivencia depende mucho de su habilidad para germinar en el lugar y momento apropiado. Esto se asocia a mecanismos adaptativos que previenen la germinación en ausencia de un ambiente adecuado, lo que se denomina latencia de semillas. En estos casos las estructuras de la semilla restringen cualquiera de los factores antes mencionados, en especial el agua y el oxígeno, con lo cual se limita la germinación. Dentro de los procesos y factores reconocidos para la liberación de las semillas del estado de latencia se encuentran los siguientes:

• Post maduración (afterrippening): se obtiene cuando la semilla ha reducido el nivel de humedad por desecación.




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• Escarificación natural. Se refiere a la permeabilización de la testa producto de la degradación de ésta por diversos medios naturales (microorganismos, desgaste mecánico, paso por el tracto digestivo etc.), permitiendo la penetración de agua y oxígeno hacia el embrión.

• Congelamiento/enfriamiento: existen semillas que requieren períodos de congelamiento para germinar.

• Luz.

OBJETIVOS GENERALES

• Inducir la germinación de semillas de diferentes especies vegetales para la obtención de plántulas libres de hongos y bacterias.

• Familiarizar al estudiante con las técnicas de cultivo de vegetales in vitro

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Propiciar el desarrollo de habilidades cognitivas y procedimentales del alumno en el empleo adecuado de las técnicas de asepsia para el cultivo de semillas in vitro.

• Preparar medios de cultivo para la germinación de diferentes especies de semillas y analizar las diferencias entre ellos.

• Analizar las diferencias que existen entre las condiciones que propician la germinación de cada especie vegetal empleada.

• Obtener plántulas sanas a partir de semillas de diferentes especies vegetales.

• Cultivar las plántulas sanas obtenidas en condiciones óptimas para su desarrollo.

MATERIALES POR EQUIPO:

BIOLÓGICO

Semillas de jitomate, tabaco, lechuga, zanahoria y de una Bromeliácea, Bromelia hemisphaerica.

MATERIAL DE LABORATORIO • 2 matraz Erlenmeyer de 500 mL




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• 2 vaso de precipitados de 100 o 250 ml

• 1 piceta de 250 mL

• 1 agitador de vidrio

• rollo de papel aluminio

• 4cajas de Petri

• rollo de algodón

• 1esponja

• 10 Frascos tipo “Gerber” con tapa de polietilino o Tubos de ensaye 2.5 x 30 cm

• Masking-tape

• 2 Espátulas o cucharas de acero inoxidable

EQUIPOS

• Campana de flujo laminar

• Autoclave

• Potenciómetro

• Balanza analítica

REACTIVOS

• Etanol al 70%

• HCl 1.0 N

• NaOH 1.0 N

• H2SO4 3.0 M

• Sustancias orgánicas e inorgánicas (ver anexo).

DESARROLLO EXPERIMENTAL:

Esterilizar previamente por equipo:

• 2 vasos de precipitado de 250 mL

• 1L de agua destilada

• 2 espátulas

PROCEDIMIENTO:

Preparación del medio de cultivo:

1. Conforme a las indicaciones dadas por el profesor según el número de equipos y las especies vegetales a utilizar, preparar medio de cultivo semisólido de Knop o MS




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según la formulación indicada en el Anexo 1. El pH deberá ajustarse con NaOH 1.0 N antes de adicionar el agar a los medios (Medio Knop a pH de 5.5 y Medio MS a pH.Preparar medio de cultivo en cantidad suficiente para 10 frascos o 10 tubos.

2. Fundir el agar en calor y verter 20 mL en cada frasco (tipo “Gerber”) o 15 mL en cada tubo, cubrir con tapa de plástico o doble tapa de papel aluminio y sujetar con ligas o Masking-tape, esterilizar en autoclave a 121°C y 15 psi de presión durante 15 min.

Desinfección de semillas:

El siguiente protocolo puede ser utilizado para semillas de zanahoria, jitomate y lechuga.

a. Colocar las semillas en agua con extrán al 2% (o detergente) durante 30-40 minutos, mantener en agitación (manual o con un agitador magnético).

b. Enjuagar tres veces con agua estéril para eliminar el detergente. A partir de este paso trabajar en la campana de flujo laminar. Utilizar la espátula estéril para retener las semillas.

c. Sumergir las semillas en una solución de etanol al 70% por 30 segundos (exactos).

d. Enjuagar tres veces con agua estéril para eliminar el etanol.

e. Transferir las semillas a un vaso estéril y sumergirlas en una solución de hipoclorito de sodio al 1% de cloro libre durante 10 min.

f. Lavar las semillas cinco veces con agua estéril para eliminar el hipoclorito de sodio y decantar, ayudándose con la espátula estéril.

Siembra e incubación de las semillas

g. Del vaso de precipitados, tomar una a una las semillas y colocarlas en los tubos o frascos que contengan medio de Knop o MS con la ayuda de una espátula estéril.

h. Colocar 3-5 semillas en cada tubo o frasco, procurando que queden separadas y en contacto con el medio de cultivo.

i. Colocar los recipientes con las semillas en un cuarto de cultivo en oscuridad a una temperatura de incubación de entre 24 a 26 ºC.




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j. Observar cada semana las semillas. Separar los tubos o frascos contaminados y anotar si se trata de contaminación bacteriana o fúngica. Los frascos o tubos contaminados deberán esterilizarse a la brevedad.

k. A la aparición del coleóptilo, exponer los tubos al fotoperíodo natural hasta que la plántula alcance una altura aproximada de 8-10 cm (dependiendo de la especie).

Protocolo para semillas de B. hemisphaerica:

IMPORTANTE: Durante el seguimiento de este protocolo, deberán extremarse precauciones al manejar el acido sulfúrico ( H2SO4). Es altamente tóxico y corrosivo.

a. Colocar las semillas en extrán al 2% (o detergente) durante 40 minutos. Mantener en agitación de forma manual o con un agitador magnético.

b. Enjuagar varias veces con agua para eliminar el detergente. A partir de este paso trabajar en la campana de flujo laminar.

c. Transferir las semillas a un vaso estéril y sumergir las semillas en una solución de H2SO4 3.0 M durante 10 min.

d. Enjuagar varias veces con agua estéril para eliminar el H2SO4. El enjuague debe realizarse con extremo cuidado a fin de no mermar la cantidad de semillas durante el proceso.

e. Transferir las semillas enjuagadas a un vaso estéril y sumergirlas en una solución de etanol al 70% durante 30 segundos.

f. Enjuagar varias veces con agua estéril para eliminar el etanol.

g. Transferir las semillas a un vaso estéril y dejarlas en el mismo vaso, hidratando con agua estéril aproximadamente 24 horas, en condiciones de asepsia (el vaso deberá permanecer perfectamente tapado).

h. Del vaso de precipitados, tomar una a una las semillas y transferirlas a los frascos con medio Knop con la ayuda de una espátula estéril.

i. Colocar de 3 a 5 semillas por frasco, procurando que queden separadas y en contacto con el medio de cultivo.




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j. Coloque los frascos, con las semillas en el cuarto de cultivo en la oscuridad a una temperatura de incubación de entre 24 y 26 ºC.

k. Observar cada semana las semillas. Separar los tubos o frascos contaminados y anotar si se trata de contaminación bacteriana o fúngica. Los frascos o tubos contaminados deberán esterilizarse a la brevedad

l. A la aparición del coleóptilo, exponer los frascos al fotoperíodo natural hasta que la plántula alcance una altura aproximada de 2-3 cm.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué pasa si las semillas se dejan más tiempo en etanol?

2. ¿Por qué las semillas de B. hemisphaerica son tratadas con H2SO4?

3. ¿Qué es el coleóptilo?

4. Mencionar 3 puntos críticos para la germinación de semillas de B. hemisphaerica.

5. ¿Por qué algunas semillas requieren de la obscuridad para germinar? ¿Qué tipo de tratamiento luminoso requieren algunas semillas para poder germinar?

NOTA. Además de los puntos mínimos que debe incluir el informe escrito de la práctica (Objetivos, introducción, desarrollo, resultados, etc.) se deberán incluir y discutir los siguientes puntos:

El tiempo de germinación de las semillas

El % de germinación.

Una comparación de estos resultados con los demás equipos.

Discutir a detalle el papel que juega cada una de la soluciones en el proceso de desinfección.

BIBLIOGRAFÍA




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• Barrera Badillo G. y Oliver Salvador (2004). III Congreso Internacional y XIV Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica. Veracruz, Ver. del 31 de marzo al 2 de abril.

• Kieran, P.M., Mac Loughlin P.F., Malone D.M. (1997). Plant cell suspension cultures: some engineering considerations. Journal of Biotechnology. 59, 39-52.

• Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3): 473-497.




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Práctica 2. Preparación de medios de cultivo para la generación de callos y micropropagación

INTRODUCCIÓN Entre los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfológica deseada en un cultivo de tejido in vitro, es la composición del medio de cultivo. El medio de cultivo está conformado por macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia de la planta, nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores del crecimiento y hormonas vegetales, que ayudarán a obtener un callo, una planta completa, o un órgano vegetal en particular, a partir del explante elegido (en condiciones de asepsia) y algún agente gelificante inerte (agar, gelrite, etc.). Los principales componentes de los diferentes medios de cultivo se presentan en el cuadro 1: Cuadro 1. Principales componentes del medio para cultivos vegetales in vitro.

Componentes Características

Fuente de carbono

Generalmente, la mayoría de los cultivos de células vegetales no son autótrofos y por lo tanto dependen completamente de una fuente externa de carbono. En muchos casos, se prefiere sacarosa, y ocasionalmente glucosa (Ej., cultivos de algodón) o maltosa (Ej., cultivo de anteras).

Sustancias inorgánicas

Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y microelementos (Fe, Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I) en proporciones adecuadas.

Vitaminas

Vitaminas B1, B2, B6, vitamina H, vitamina E, ácido fólico, ácido nicotínico, entre otras.

Hormonas reguladores del crecimiento

Auxinas: promueven la elongación celular, la formación de callos y raíces adventicias, inhiben la formación de brotes axilares adventicios y, en ocasiones, inhiben la embriogénesis. Citocininas: promueven la división celular, regulan el crecimiento y el desarrollo de los tejidos vegetales. Otras: giberelinas, ácido absícico, etileno.

Adaptado de Hall (2000). Las exigencias minerales varían con la especie, la naturaleza del tejido y su estado fisiológico, pero, además, también varían con el método de cultivo y el tipo de




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organogénesis estudiado. Por ejemplo, los meristemos y, en forma general, los tejidos con actividad metabólica elevada, pueden presentar importantes necesidades en potasio. En 1962, Murashige y Skoog propusieron un medio para la investigación del crecimiento óptimo de callos de la planta del tabaco (Nicotiana tabacum). Este medio es netamente superior a los medios anteriormente usados para iniciar la organogénesis y, particularmente, para la formación de yemas. A partir de estos resultados, el medio MS se ha empleado de una manera muy general para todos los tipos de cultivo in vitro. Además, puede afirmarse que ha sido la utilización del medio MS junto con el empleo de fitohormonas apropiadas (citocininas y auxinas), lo que ha permitido el éxito de los trabajos sobre organogénesis en cultivo in vitro. El medio MS está caracterizado, principalmente, por un contenido elevado de nitrógeno del cual 1/3 del total está aportado en forma reducida (NH4+) y por una concentración igualmente elevada en potasio. Los tejidos y células cultivadas in vitro son ampliamente heterótrofos con respecto al carbono debido a la ausencia o insuficiente asimilación por clorofila. Por lo que resulta indispensable añadir azúcares a los medios de cultivo, siendo los dos más utilizados la sacarosa y la glucosa. La concentración óptima del azúcar en los medios de cultivo varía entre 20–80 g/L, en dependencia del tipo de cultivo, material vegetal, etc. Los azúcares presentan una acción metabólica y energética (Hall, 2000). OBETIVO GENERAL

• Preparar medios de cultivo para el cultivo in vitro de tejidos vegetales DESARROLLO EXPERIMENTAL 1. Preparar medio de cultivo MS semi-sólido (ver anexo). Complementarlo con los

reguladores del crecimiento vegetal apropiados. Para cultivos de zanahoria utilizar 1.0 mg/L 2,4-D (2,4 ácido diclorofenoxiacético). Para generación de callos de la planta del tabaco, adicionar 1.0 mg/L de BAP (Bencil aminopurina) y 0.1 mg/L de ANA. Para la micropropagación de violeta utilizar 1.0 mg/L de AIA y 0.08 mg/L de BAP.

2. Adicionar a todos los medios sacarosa 20 g/L y agar-agar 6.0 g/L, mioinositol 0.1 g/L.

3. Utilizar las vitaminas de Gamborg (1976), también conocidas como B5. Para violeta y zanahoria utilizar vitaminas MS.

4. Ajustar el pH a 5.5 con NaOH 1.0 N, antes de agregar el agar.




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5. Fundir el agar en calor y verter 25 mL por frasco (tipo “Gerber”). Cubrir con doble tapa de papel aluminio y sujetar con una liga o con tapa de plástico, esterilizar en autoclave a 121°C y 15 lb. de presión durante 15 min.




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BIBLIOGRAFÍA

• Hall R.D (2000). Plant cell culture initiation. Molecular Biotechnology 16: 161-173.

• Gamborg OL, Miller RA and Ojima K. (1968). Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res. 50:151-8.

• Murashige T and Skoog F (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3): 473-497.




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Práctica 3. Establecimiento de un Cultivo de Callos de Explantes de Zanahoria (Daucus carota)

Adaptada de Dodd and Roberts, 1985. INTRODUCCION Los callos de plantas son masas celulares diferenciadas, no organizadas y de rápido crecimiento que pueden ser producidas en todas las especies de plantas en respuesta a un suplemento de hormonas endógenas o externas. Los cultivos de callos de plantas (callos que crecen asépticamente en medios semisólidos con agar y hormonas vegetales) y cultivos de suspensión de callos (callos que crecen asépticamente en medio líquidos en matraces o biorreactores) han incrementado su uso en Biotecnología como una herramienta para la manipulación genética de plantas, micropropagación, estudios del metabolismo y de desarrollo celular de plantas, así como para la producción comercial de productos naturales (metabolitos primarios y secundarios). (Mc Donald, y col. 1995). OBJETIVO GENERAL • Familiarizar al estudiante con las técnicas de cultivo de vegetales in vitro y establecer

cultivos de callos. MATERIALES: BIOLÓGICO Raíces de Zanahoria (Daucus carota) sanas y frescas. MATERIAL DE LABORATORIO (por cada equipo) 3 vasos de precipitado de 250 ml 2 pipetas de 1 ml 1 piceta de 250 ml 2 cajas de Petri Hojas de papel blanco o papel “kraft” (estéril) Algodón

Bisturí, navajas de bisturí y pinzas de disección EQUIPOS Campana de flujo laminar Autoclave Potenciómetro Balanza analítica REACTIVOS Etanol al 70% Solución de hipoclorito de sodio: blanqueador comercial (5.5 % de cloro libre) al 10 %. HCl 1.0 N NaOH 1.0 N




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1.0 litro de agua destilada estéril. Frascos “Gerber” con Medios de Murashige y Skoog (MS) preparados en la Práctica 2 o (Soluciones patrón de sustancias orgánicas e inorgánicas del Anexo de dicha práctica). PROCEDIMIENTO 1. Preparar medio de cultivo MS semi-sólido, complementarlo con 2,4-D 1.0 mg/L,

sacarosa 20 g/L y agar-agar 6.0 g/L, mioinositol 0.1 g/L y vitaminas. Ajustar el pH a 5.5 con NaOH 1.0 N, antes de agregar el agar.

2. Preparar otro medio de cultivo, MS sin mioinositol. Todo los demás componentes a la

misma concentración y ajustar el pH del medio a 5.5. 3. Fundir el agar en calor y verter 25 mL por frasco, tapar con doble tapa de papel

aluminio y sujetar con una liga o con tapa de plástico, esterilizar en autoclave a 121°C y 15 lb. de presión durante 15 min.

MATERIAL VEGETAL Utilizar zanahorias de aproximadamente 20 cm de longitud y 4 cm de diámetro. a. Lavar las zanahorias con agua corriente y jabón dentro de un recipiente agitando

manualmente. b. Pelar las zanahorias con un pelador de vegetales, eliminar 2 mm del tejido. c. Cortar a las zanahorias en rebanadas de un cm de grueso. d. Sumergir las rebanadas en una solución de etanol al 70% por 30 seg. e. Sumergir las rebanadas en una solución de hipoclorito de sodio al 10%, durante 10

minutos, a partir de este paso trabajar en la campana de flujo laminar. f. Durante el tiempo de espera, numerar y pesar los frascos en los cuales se van a

colocar los tejidos. g. Lavar el material vegetal cinco veces con agua destilada y estéril, con agitación

dentro de un vaso de precipitados, durante 30 seg. h. Del vaso de precipitados, tomar una a una las rebanadas y transferirlas a una caja de

Petri estéril y con la ayuda de unas pinzas de disección, cortar cubos de la zona del cambium de un centímetro por lado de acuerdo con lo indicado en la figura 1.

i. Colocar tres cortes (cubos) de cambium por frasco, procurando que la superficie de uno de los lados del cubo quede en contacto con la superficie del medio de cultivo.




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j. Volver a pesar los frascos y calcular el peso de los explantes por diferencia. k. Coloque los frascos con los explantes en un cuarto de cultivo con fotoperiodo de 16

horas de luz por 8 de oscuridad a una temperatura de 24-26 ºC. l. Observar cada tres días el desarrollo de los cultivos, anotar las apariencias y cambios

que van sufriendo los explantes. Separar los frascos con explantes necrosados y contaminados y describir si se trata de contaminación bacteriana o fúngica. Es de particular importancia determinar el tiempo de aparición de los callos.

m. Pesar los frascos cada semana para calcular la tasa de crecimiento del callo. Requisitos para el informe escrito.

1. Con los datos obtenidos del peso de los frascos, realizar la curva de crecimiento del cultivo de callos, en peso fresco vs tiempo.

2. El informe de la práctica debe contener los resultados de todos los equipos del grupo con los que se realizará la discusión y las conclusiones de los experimentos realizados en la misma.

3. ¿Cual es el papel, en general, del mioinositol en la fisiología de las plantas? 4. Incluir en su informe (después de haberlo leído) una copia de, por lo menos, un

artículo reciente sobre el tópico o el cultivo de células y/o tejidos vegetales. BIBLIOGRAFÌA. 1. Lebowitz, R. J. 1995. Micropropagation of African Violet. In Plant Biothecnology. A

Laboratory Manual. WCB Wm. C. Brown Publishers. Dubuque, Iowa; Melbourne, Australia; Oxford, England.

2. Mc Donald, K., Jackman, A., Thorup, J. And Dandekar, A. (1995), Applied Biochemistry and Biotechnology. 54. 93-108.

3. Dixon, R. A.(1985), Isolation and Maintenance of callus and cell suspension cultures in plant cell culture. A practical approach. Ed. Dixon R. A. IRL Press, Oxford. Washington.

4. Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3): 473-497.




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Práctica 4. Micropropagación de violeta africana Saintpaulia ionantha Wendi. Adaptada de Franco y García, 1995.

INTRODUCCION

La técnica de micropropagación de especies vegetales, utiliza diversas porciones de órganos, tejidos, etc. y proporciona una herramienta capaz de producir un gran número de plantas en cada cultivo; como consecuencia de la totipotencialidad de las células vegetales.

Una planta ornamental de gran interés dentro del comercio y la jardinería, es la violeta africana Saintpaulia ionantha Wendi, originaria del este de África. En la actualidad, se conocen más de 20 especies y cientos de variedades, las que se propagan por germinación de semillas o en forma vegetativa por esquejes. Las violetas son plantas muy apreciadas y por lo mismo, se encuentran ampliamente distribuidas por todo el mundo a través de las asociaciones de floricultores y aficionados. Las violetas africanas presentan gran diversidad morfológica y con una amplia gama de tonalidades de flores que van desde violeta púrpura a blancas.

En la literatura encontramos varios autores que desarrollaron diversas técnicas de cultivo “in vitro” para obtener violetas africanas a gran escala, a partir de pequeñas porciones de peciolo y tejido foliar, entre ellos se puede citar a Start y Cumming (1976), Bilkey y Mc.Cown (1978) y Cooke R. (1977).

OBJETIVOS GENERALES

• Demostrar los principios de la micropropagación y regeneración de plantas. • Propagar violeta africana Saintpaulia ionantha Wendi, por cultivo in vitro de

explantes foliares y de peciolo.

MATERIALES

BIOLOGICOS

1 maceta con una planta de violeta africana (Saintpaulia ionantha Wendi.)

EQUIPOS

Campana de flujo laminar

Autoclave

Potenciómetro




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Balanza analítica

MATERIAL DE LABORATORIO

1 matraz Erlenmeyer de 2L

1 matraz Erlenmeyer de 1L

2 vasos de precipitados de 250 ml

2 pipetas de 1 ml

1 piceta de 250 ml

1 agitador de vidrio

5 cajas de Petri

rollo de papel aluminio

rollo de algodón

bisturí y pinzas de disección

REACTIVOS

Etanol al 70%

Solución de hipoclorito de sodio: blanqueador comercial (5.5 % de cloro libre) al 10 %

HCl 1.0 N

NaOH 1.0 N

2.0 litros de agua bidestilada estéril.

Soluciones patrón de sustancias orgánicas e inorgánicas (ver apéndice).

DESARROLLO EXPERIMENTAL

1. Preparar un litro de medio de cultivo semi-sólido de Murashige y Skoog (1962), MS, complementarlo con ácido nicotínico 0.5 mg, piridoxina 0.5 mg, ácido indolacético 2.0 mg, 6-bencil aminopurina 0.08 mg, sacarosa 30 g y agar 6.0 g. Ajustar el pH a 5.7.

2. Preparar el medio MS disminuyendo a la cuarta parte la concentración de las sustancias inorgánicas y sacarosa 15 g/L. El resto de los componentes se utilizará en la misma concentración. Ajustar el pH a 5.7.

3. Fundir el agar en calor y verter 20 mL por frasco, tapar con doble tapa de papel aluminio y sujete con una liga o con tapa de plástico. Esterilizar en autoclave a 15 libras de presión y 121°C durante 15 min.

PREPARACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL.

Utilizar hojas de violeta africana, de la planta patrón o una planta sana. Escoger varias hojas desarrolladas, jóvenes (2-3 cm de diámetro) y sanas, dejar un centímetro de peciolo.




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a. Colocar las hojas dentro de un vaso de precipitados, lavar con agua corriente y jabón agitando manualmente.

b. Sumergirlas en una solución de etanol al 70% por 30 seg. c. Sumergir las hojas en una solución de hipoclorito de sodio al 10%, durante 10

minutos. A partir de este paso trabajar en la campana de flujo laminar. d. Lavar el material vegetal cinco veces con agua destilada y estéril, con agitación

dentro de un vaso de precipitados, durante 30 seg. e. Del vaso de precipitados, tomar una a una las hojas, trasnferir a una caja Petri estéril y

con la ayuda de unas pinzas de disección, cortar en fracciones de un centímetro cuadrado como se muestra en la figura 1.

f. Colocar dos o tres fracciones foliares por frasco, procurando que el envés foliar quede en contacto con la superficie del medio de cultivo.

g. Colocar los frascos con los explantes en un cuarto de cultivo, con fotoperiodo de 16 horas luz, por 8 horas de oscuridad, a temperatura de 24ºC.

h. Observar cada tercer día el desarrollo de sus cultivos. Anotar los cambios en la apariencia de los explantes. Separar los frascos con explantes necrosados y contaminados y registrar si se trata de contaminación bacteriana o fúngica

Colocar en diferentes frascos los explantes de: a) peciolo, b) parte central de hoja y c) parte externa de la hoja (ver figura 1). Deben utilizarse los siguientes medios con los explantes: 1) MS y 2) MS a un cuarto de sales y 15 g/L de sacarosa.

Discutir en el informe escrito sobre los siguientes puntos:

1. ¿Cuál es el significado del término totipotencialidad celular?. 2. ¿En la práctica, considera factible el cultivo de una célula aislada y obtener una planta

completa? 3. Escriba el significado del término micropropagación. 4. ¿Qué es una célula somática?

Incluir en su informe, al menos un artículo, reciente, sobre el tema de la práctica o el cultivo de callos, células y/o tejidos vegetales al que previamente se le ha dado lectura.

5. El informe de la práctica debe contener los resultados de los todos los equipos , discusión y conclusiones sobre los experimentos realizados bien estructuradas y sustentadas en la literatura consultada.

BIBLIOGRAFIA.

1. Bilkey, P.C. and B.H. Mc Cown 1978. Micropropagation of African Violet from Petiolo Cross- Section. HortScience 13 (1):37-38.




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2. Cooke, R. 1997. Tissue Culture Propagation of African Violets. HortScience 12(6):549

3. Franco Rodríguez José y M. T. García, 1995. Ensayo demostrativo sobre la propagación de violeta africana Saintpaulia ionantha Wendi por cultivo de tejidos. An.Esc.Nac.Cienc.Biol.México, 40:107-115.

4. Martin, C. 1985. Cultivo de plantas en probeta. Mundo Científico. No.44:160-169. 5. Murashige, T. And Skoog, 1962. A revised medium of rapid growth and bioassays

with tobacco tissue. Physiol.Plantarum. 15:473-497. 6. Pierik, R.L.M.1994. Biotecnología Vegetal como herramienta en la horticultura

ornamental: Revista Chapingo, serie Horticultura 1:45-57. México. 7. Smith, R.H. and R.E. Noris. 1983. In vitro propagation African Violet chimeras.

HortScience 18(4):436-437. 8. Star, N.D. and B.G. Cumming. 1976. In vitro propagation of Saintpaulia ionantha

Wendl. HortScience 11:204-206. 9. Lebowitz, R. J. 1995. Micropropagation of African Violet. In Plant Biothecnology. A

Laboratory Manual. WCB Wm. C. Brown Publishers. Dubuque, Iowa; Melbourne, Australia; Oxford, England.




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Práctica 5. Regeneración de plantas completas a partir de explantes de hojas de Nicotiana tabacum

Introducción.

Para poder regenerar una planta completa en cultivo de tejido in vitro, es necesario proveer al tejido de los requerimientos nutricionales y factores ambientales necesarios, tales como el medio de cultivo, vitaminas, reguladores del crecimiento vegetal, pH, temperatura, etc. De particular importancia son los reguladores del crecimiento vegetal, ya que de éstos depende la respuesta que tendrá el tejido in vitro. En 1962, Murashige y Skook realizaron experimentos con la planta del tabaco y con ello marcaron la pauta para determinar los requerimientos para poder regenerar la planta completa del tabaco a partir de explantes de hojas. Actualmente, la regeneración de cualquier planta completa en cultivo de tejidos in vitro es de particular interés para la Ingeniería genética de plantas ya que este paso ha sido decisivo para llevar a cabo modificaciones genéticas de plantas utilizando Agrobacterium tumefaciens (Práctica 6) y bombardeo de micropartículas.

OBJETIVO GENERAL

Familiarizar al alumno con las técnicas utilizadas para el cultivo de explantes de la planta del tabaco y regenerar la planta completa.

MATERIALES:

BIOLOGICO

Plantas de tabaco crecidas en condiciones de asepsia. Utilizar las obtenidas en la práctica

MATERIAL DE LABORATORIO (por cada equipo)

2 cajas de Petri

Bisturí, navajas de bisturí y pinzas de disección

EQUIPOS

Campana de flujo laminar

Autoclave

Potenciómetro




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Balanza analítica

REACTIVOS

Etanol al 70%

Frascos “Gerber” con Medios de Murashige y Skoog (MS) preparados en la Práctica 2. (Ver Anexo I para la composición de las soluciones patrón de sustancias orgánicas e inorgánicas).

PROCEDIMIENTO

1. En una campana de flujo laminar, abrir los frascos en los que se germinaron las semillas de tabaco.

2. Con un bisturí, cortar hojas jóvenes de la planta del tabaco. Las hojas que mas rápido y mejor regeneran son las jóvenes pero en teoría hojas de cualquier edad son útiles.

3. Colocar las hojas en una caja de Petri y realizar cortes de 1 x 1 cm. Cortar el tejido vascular principal y eliminar. Las hojas se manipulan mejor si se colocan con el envés hacía arriba.

4. Colocar los cortes (3-4 por frasco) en medio MS semi-sólido suplementado con 1.0 mg/L de BAP y 0.1 mg/L de ANA.

5. Realizar observaciones cada semana. El tejido se expande y luego forma brotes pasando por un periodo casi imperceptible de callo.

6. Si a las 4 semanas no han surgido brotes, transferir el tejido a medio fresco. 7. Cuando hayan surgido brotes y éstos hayan crecido de 2-3 cm, transferirlos a

medio MS semi-sólido, con vitaminas B5 y SIN REGULADORES DEL CREIMIENTO VEGETAL, para que formen raíces.

Requisitos para el reporte escrito.

• Incluir fotos del desarrollo del tejido.

• Explicar si es posible utilizar explantes de otros tejidos (tallo, hojas, polen, etc)

• ¿Cómo se llama a la regeneración que no pasa por tejido calloso?

• ¿Qué otras especies son capaces de formar una planta completa a partir de explantes de hojas?




23

Bibliografía

1. Murashige, T. And Skoog, 1962. A revised medium of rapid growth and bioassays with tobacco tissue. Physiol.Plantarum. 15:473-497.




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Anexo I Formulación de medios de cultivo

Medio de Knop Sustancia mg/L

MgSO4 • 7H2O 200

KNO3 200

KH2PO4 200

Ca(NO3) • 4H2O *CaCl2 800 *374

Agar 6000

pH 5.5

Medio de Murashige y Skoog (1962)

Macronutrientes Concentración final mg/L g (para un stock 10X en 1L)

NH4NO3 1650 16.5

KNO3 1900 19.0

CaCl2 • H2O 440 4.4

MgSO4 • 2H2O 370 3.7

KH2PO4 170 1.7

NaH2PO4 • H2O 85 0.85

Micronutrientes mg/L mg (para un stock 100X en 100 mL)

KI 0.83 83

H3BO3 6.2 620

MnSO4 • 4H2O 22.3 2203

ZnSO4 • 4H2O 8.6 860




25

NaMoO5 • 2H2O 0.25 25

CuSO4 • 5H2O 0.025 25

CoCl2 • 6H2O 0.025 25

Na2EDTA • 2H2O 37.2 3720

FeSO2 • 7H2O 27.8 2780

Murashige y Skoog (micronutrientes) No cat. Sigma M0519 1L (Stock 10X)

Se recomienda preparar por separado los stocks para macronutrientes, micronutrientes y Na2EDTA • 2H2O y FeSO2 • 7H2O. Es importante verificar la cantidad de moléculas de agua que contiene el compuesto, en caso de tener más o menos moléculas de agua, es necesario hacer el ajuste.

Compuestos Orgánicos

Murashige & Skoog (1962) mg/L

*MS Vitaminas 1000X mg/mL

Ácido nicotínico 0.5 0.5

Piridoxina•HCl 0.5 0.5

Tiamina•HCl 0.1 0.1

Glicina 2.0 2.0

Mioinositol 100

*MS Vitamin solution (1000X) 50 ml No cat Sigma M3900

Sacarosa 20 g/L

Agar-agar o agar bacteriológico 6.0 g/L

pH 5.8




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ANEXO II

GLOSARIO

Apical: zona extrema del tallo que le proporciona crecimiento en longitud al mismo.

Aséptico: libre de gérmenes contaminantes.

Axial: zona comprendida entre el eje de un tallo o rama y una hoja.

Callogénesis: proceso en el que a partir de un explante se genera una masa amorfa de células llamada callo.

Cámara de flujo laminar: aparato que proporciona en su interior un ambiente totalmente estéril, necesario para la manipulación del material aséptico (tejido y medios de cultivo).

Catalogación: método utilizado para determinar si una planta tiene o no virus.

Clon: elemento de un grupo de individuos propagados asexualmente a partir de un solo organismo, del cual conservan las características genéticas.

Embriogénesis somática: proceso en el cual se forman, a partir de un explante, embriones asexuales, los cuales dan origen a plantas completamente desarrolladas.

Explante: pequeña porción del tejido vegetal que funciona como generador de nuevas plantas en el cultivo in vitro.

Fito-hormonas: compuestos químicos que actúan, en muy bajas concentraciones, regulando el crecimiento de los tejidos vegetales.

Fito-patógenos: microorganismos que actúan en forma dañina en las plantas.

Hibridación: cruza entre dos organismos de variedades o especies diferentes.

Híbrido: organismo obtenido por la hibridación.

In vitro: técnicas de reproducción artificial en condiciones de laboratorio.

Meristemo: estructura localizada en diferentes zonas de la planta a partir del cual se forman todos los órganos de la misma.




27

Organogénesis somática: proceso en el cual se forman órganos (raíces, tallos, etc.) a partir del explante.

Plántulas: plantas pequeñas en proceso de desarrollo.

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