Manual Hematología Modulo I

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7/23/2019 Manual Hematología Modulo I http://slidepdf.com/reader/full/manual-hematologia-modulo-i 1/38 1 ANTICOAGULANTES La sangre es una suspensión de eritrocitos, leucocitos y plaquetas en un líquido de compleja composición llamado plasma, al impedirse el mecanismo de coagulación sanguínea pueden separarse los elementos formes de este líquido, el cual tiene un color paja claro. Cuando la sangre se coagula se obtiene otro líquido al separar el coágulo formado, a este líquido se le llama suero, el cual es de composición diferente al plasma. La diferencia entre estos dos líquidos obtenidos de la sangre radica en su composición pues al inhibir la coagulación de la sangre se conserva el fibrinógeno en el  plasma, mientras que el suero carece del mismo por su transformación a filamentos insolubles de fibrina por la activación de proteínas coagulantes durante la hemostasia. Debido a que la sangre fuera del sistema vascular coagula entre 3 y 7 minutos es necesario el uso de sustancias que permitan que los elementos formes de la sangre  permanezcan en suspensión para su estudio. Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para estudiar las características morfológicas y realizar los recuentos celulares. Deben intentar que las células sanguíneas a estudiar se encuentren en el estado más parecido al fisiológico, como cuando se encuentran circulando por el torrente sanguíneo. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfología de los leucocitos, el tamaño eritrocitario, no  producir hemólisis e impedir la agregación plaquetaria, posibilitando al mismo tiempo el máximo período de conservación de la muestra (cerca de 24 horas a 25°C o incluso 48 horas refrigerada a 4° C). Los anticoagulantes más utilizados son:  EDTA (C 10  H 16  N 2 O 8  ) Sal disódica, dipotásica o tripotásica del ácido etilendiaminotetraacético, actuando mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca ++ ), impidiendo el proceso de la coagulación al fijarlo. Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la realización de recuentos celulares, sobre todo en los autoanalizadores y permite además la realización del hematocrito y del frotis sanguíneo hasta dos horas después de la extracción de la muestra. Las sales de potasio tienen la ventaja con respecto a la de sodio, por ser más fácilmente solubles en sangre cuando las usamos a partir del producto sólido, sin embargo , las tres sales afectan el tamaño del eritrocito, especialmente después del almacenamiento de la sangre anticoagulada por espacio de algunas horas. El International Council for Standardization in Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotásica como anticoagulante  para recolectar muestras sanguíneas destinadas al recuento y caracterización del tamaño celular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren para la calibración de los contadores automáticos. El K 2 EDTA .2H 2 O posee un peso molecular relativo de 404,1g; 1g quela 100 mg de calcio iónico y el pH para una solución al 1% es de 4.8+/-1,0. La cantidad de EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de 1.5-2.2 mg/mL de sangre total. Esta cantidad es un compromiso entre la cantidad requerida para evitar la coagulación y la cantidad a la cual se producen las alteraciones celulares.  Heparina Es un anticoagulante fisiológico que actúa impidiendo que la protrombina se transforme en trombina. Estructuralmente es un mucopolisacárido ácido. Los frotis realizados con muestras sanguíneas anticoaguladas con heparina producen un color azulado

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ANTICOAGULANTES 

La sangre es una suspensión de eritrocitos, leucocitos y plaquetas en un líquido decompleja composición llamado plasma, al impedirse el mecanismo de coagulaciónsanguínea pueden separarse los elementos formes de este líquido, el cual tiene un color pajaclaro. Cuando la sangre se coagula se obtiene otro líquido al separar el coágulo formado, aeste líquido se le llama suero, el cual es de composición diferente al plasma.

La diferencia entre estos dos líquidos obtenidos de la sangre radica en sucomposición pues al inhibir la coagulación de la sangre se conserva el fibrinógeno en el plasma, mientras que el suero carece del mismo por su transformación a filamentosinsolubles de fibrina por la activación de proteínas coagulantes durante la hemostasia.

Debido a que la sangre fuera del sistema vascular coagula entre 3 y 7 minutos esnecesario el uso de sustancias que permitan que los elementos formes de la sangre permanezcan en suspensión para su estudio.

Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total paraestudiar las características morfológicas y realizar los recuentos celulares. Deben intentarque las células sanguíneas a estudiar se encuentren en el estado más parecido al fisiológico,como cuando se encuentran circulando por el torrente sanguíneo. Para ello losanticoagulantes no deben alterar la morfología de los leucocitos, el tamaño eritrocitario, no producir hemólisis e impedir la agregación plaquetaria, posibilitando al mismo tiempo elmáximo período de conservación de la muestra (cerca de 24 horas a 25°C o incluso 48horas refrigerada a 4° C).

Los anticoagulantes más utilizados son: EDTA (C 10 H 16  N 2O8 )

Sal disódica, dipotásica o tripotásica del ácido etilendiaminotetraacético, actuandomediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca++), impidiendo el proceso de la coagulaciónal fijarlo. Este anticoagulante se utiliza fundamentalmente para la realización de recuentoscelulares, sobre todo en los autoanalizadores y permite además la realización delhematocrito y del frotis sanguíneo hasta dos horas después de la extracción de la muestra.Las sales de potasio tienen la ventaja con respecto a la de sodio, por ser más fácilmentesolubles en sangre cuando las usamos a partir del producto sólido, sin embargo , las tressales afectan el tamaño del eritrocito, especialmente después del almacenamiento de lasangre anticoagulada por espacio de algunas horas. El International Council forStandardization in Hematology (ICSH) recomienda la sal dipotásica como anticoagulante para recolectar muestras sanguíneas destinadas al recuento y caracterización del tamañocelular y especialmente cuando los valores del hematocrito se requieren para la calibraciónde los contadores automáticos. El K 2EDTA .2H2O posee un peso molecular relativo de404,1g; 1g quela 100 mg de calcio iónico y el pH para una solución al 1% es de 4.8+/-1,0.La cantidad de EDTA dihidratado agregada a la sangre debe ser de 1.5-2.2 mg/mL de

sangre total. Esta cantidad es un compromiso entre la cantidad requerida para evitar lacoagulación y la cantidad a la cual se producen las alteraciones celulares.

 HeparinaEs un anticoagulante fisiológico que actúa impidiendo que la protrombina se

transforme en trombina. Estructuralmente es un mucopolisacárido ácido. Los frotisrealizados con muestras sanguíneas anticoaguladas con heparina producen un color azulado

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en el fondo del frotis y una pseudovacuolización celular por lo tanto no se recomienda paratal fin. La proporción adecuada es de 15-20 UI (0.1-0.2 mg) de heparina por mL de sangre.

Citrato trisódico, C 6  H 5O7  Na3 

Actúa impidiendo que el calcio se ionice, evitando así la coagulación. Se utiliza para

realizar las pruebas de Hemostasia en una proporción sangre: anticoagulante 9:1; así como para la velocidad de sedimentación (VSG) en una proporción sangre: anticoagulante 4:1. Elcitrato sódico se utiliza a una concentración de 0.106 mol/l (31,3 g/L de C6H5O7 Na3.2H2O).

Oxalato sódicoRecomendado en las pruebas de coagulación y su proporción es de 2 volumen de

solución de oxalato sódico 0,1M en 4 volúmenes de sangre.

Oxalato de sodio y potasio Conocido también como mezcla de Wintrobe, fue empleado durante mucho tiempo

 para la realización de la biometría hemática, sin embargo dejo de emplearse al observar quealtera sensiblemente la morfología del eritrocito alterando por tanto el volumen corpuscularmedio (VCM). Actúa por precipitación del calcio. Se emplea en forma de polvo,constituido por 3 parte de oxalato de amonio y 2 partes de oxalato de potasio. La proporción recomendada es de 2 mg de mezcla por mL de sangre. ACD

Se emplea fundamentalmente en Bancos de Sangre para conservar las unidades desangre y estudios metabólicos eritrocitarios por permitir una buena conservación de loshematíes. Se utiliza en una proporción de un volumen de ACD por cada cuatro volúmenesde sangre. La proporción de la mezcla del anticoagulante es de: Acido Cítrico 0.9 g, Citratodisódico 2 g, Dextrosa 2 g, H2O destilada 120 ml. Permite conservar los hematíes durante21 días entre 2-6°C.

Soluciones anticoagulantes conservadoras

Los factores más importantes que influyen sobre la recuperación eritrocitaria en lasangre conservada es la solución anticoagulante conservadora utilizada. Por este motivo, lamayoría de las investigaciones actuales se proponen mejorar este tipo de soluciones, masque modificar los recipientes o la refrigeración. Todas las soluciones que se utiliza hoy endía son anticoagulantes y conservadoras, pero se habla más de su función anticoagulante yse olvida la no menos importante de conservación. Las distintas modificaciones que tienenlugar en la sangre durante el período de conservación denominadas lesiones deconservación están en relación tanto con el período de tiempo como con la naturaleza de lasolución anticoagulante, y son similares se recoja la sangre en solución ACD, CPD oCPDA-1.

Desde hace años, la solución anticoagulante-conservadora estándar utilizada fue lasolución ACD. En la fórmula original descrita por Robertson en 1918 se utilizo dosingredientes críticos: dextrosa y citrato sódico, más tarde Loutit, Mollison y Youngsustituyeron parte del citrato sódico por ácido cítrico, logrando disminuir su pH, lo que permitió una mejora de la supervivencia postransfusional de los hematíes conservados. Estasolución se dejo de utilizar, dando paso en primer lugar, a la formula A de la soluciónACD, después a la solución CPD y actualmente a la CPDA-1.

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La solución de citrato fosfato dextrosa fue preparada por Gibson para obviaralgunos de los defectos de la solución ACD. Trataban de conseguir, sobre todo, unasolución más isotónica y con un pH superior. Los estudios realizados con soluciones CPDdemostraron que la recuperación y supervivencia de los eritrocitos eran tan buenas omejores que las conseguidas con ACD y que la función celular, especialmente la

determinada por la tasa de disminución de 2,3-DPG, era superior.Por esos motivos, el CPD sustituyó casi totalmente al ACD como anticoagulante deelección. A fin de mejorar la calidad de la sangre conservada se han añadido a lassoluciones conservadoras muchos compuestos, como adenina, la guanina, la hipoxatina, lainosina y la uridina. Como los eritrocitos dependen del ATP como fuente de energía, ladisponibilidad de la adenina parece ser un factor crítico en el mantenimiento de unosniveles elevados de ATP. Simon demostró que la adición de 0,75 micromoles de adenina por ml de sangre mejora la supervivencia de la sangre conservada y a partir de suobservación, se han probado varias fórmulas de CPD-adenina. Ciertos estudios clínicosindican que la sangre recogida en CPDA-1 se tolera bien y carece de riesgos y que loshematíes conservados como sangre total tienen un, período de vida de 35 días, con fórmulasde soluciones CPDA-2 y CPDA-3 la conservación de los hematíes puede alcanzar los 42días.

En la tabla No. 1 se muestran los anticoagulantes mas comúnmente empleados enhematología, haciendo referencia a su concentración, proporción, pruebas indicadas ycontraindicadas, ventajas y desventajas de los mismos.

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Tabla No. 1 Anticoagulantes comúnmente empleados en HematologíaAnticoagulante Concentración Proporción Pruebas

indicadasPruebas

no indicadasVentajas Desventajas

EDTA 10% 0.1mL/5mL desangre

2.5-2.2mg/mLde sangre

-BH-Frotis sanguíneo yde médula ósea

-Muy soluble en la sangre.-No destruye las células.-Poco tóxico-Impide la agregación de plaquetas (en algunos casosno)

-No diluye la muestra poremplearse en forma de polvo.

-Puede generarvacuolizacióntóxica enmuestras con masde 2 horas dehaberse tomado.

Heparina 0.1-0.2mg/mLde sangre15-20 UI

-Fragilidadosmótica-Degranulación de basófilos-Reducción de NBT

-Leucocitos-Frotis-Fosfatos inorgánicos

-Reduce la hemolisis -Es caro-Norecomendable para banco desangre

Citrato de sodio 3.8% 1 parte:4 partes de

sangre1 parte:9

 partes desangre

-VSG

-Pruebas decoagulación-Plaquetas

-BH -Permite realizar las pruebas de coagulación, por conservar mejor las proteínas coagulantes,debido a su acciónanticoagulante.

-Diluye lamuestra y no puede emplearse para la BH.

Oxalato de potasio 30% 0.01mL/mL desangre

-Pruebas bioquímicas-VSG

-Nitrógeno en sangre -Soluble. -Altera la permeabilidad deleritrocito, ligera

hemólisis.Oxalato de amonio

y potasio3 partes de oxalatode amonio/2 partes

de potasio

2mg/mL desangre

-Fórmula roja-Leucocitos-Pruebas bioquímicas

-Frotis-Nitrógeno en sangre-Determinación de potasio

-Económico.-Fácil de preparar.-No diluye la muestra.

-No se puedeemplear en lastransfusiones.-Altera lamorfología deleritrocito.-Altera el VCM.

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TOMA DE MUESTRA

  Un flebotomista debe mantener buena salud e higiene personal, con su ropa, cabelloy uñas limpios.

Algunos factores fisiológicos específicos del paciente pueden afectar los resultados de las

 pruebas de laboratorio. Entre ellos se incluyen la posición (supina o erecta), el ritmocircadiano (día o noche), el ejercicio, el estrés y el hábito de fumar. 

Postura: Un cambio de posición supina (boca arriba) a sentado o acostado genera un paso de agua de los vasos sanguíneos a los espacios intersticiales provocando que lasangre se concentre afectando el resultado de lípidos, enzimas y proteínas por sermoléculas grandes que no pueden atravesar los vasos sanguíneos.

 

Ritmo circadiano: El hecho de tomar una muestra durante el día o por la noche provoca un cambio en los resultados para las hormonas por las fluctuaciones delíquidos que ocurren durante el día; en el caso de los eosinófilos y el hierroaumentan en la tarde.

  Ejercicio: El ejercicio aumenta los valores de proteínas y sus metabolitos, así como

el valor de las plaquetas activando la coagulación y la fibrinólisis.  Estrés: genera un aumento transitorio en los leucocitos y en el equilibrio ácido-base.  Dieta: ayuno prolongado o muy corto generando lipemia en las muestras.  Habito de fumar: Puede aumentar la cuenta de leucocitos, así como de hemoglobina

en casos crónicos. También dificulta las punciones cutáneas por las alteracionescirculatorias que genera.

ZONAS DE RECOLECCIÓNEspecímenes venosos

Las venas superficiales de la cara anterior del antebrazo son las más comunes parala venopunción, las tres venas principales para la recolección son (Figura 1):

1. 

Vena cefálica, ubicada en la parte superior del antebrazo y en dirección del pulgar de la mano.2.  Vena basílica, ubicada en la parte inferior del antebrazo y en dirección

contraria al pulgar.3.  Vena cubital mediana, ubicada en la parte anterior del codo y conecta las

venas cefálica y basílica; a esta zona se le llama fosa antecubital. Esta venaes la de elección para los especímenes venosos.

Especímenes capilares o cutáneosDebido a que este tipo de sangre difiere ligeramente en la composición de la sangre

venosa, su obtención queda restringida a casos especiales, tales como, pacientes

 pediátricos, personas obesas a las cuales no se les pueda localizar una vena y en pacientesquemados o con quimioterapia. También este tipo de sangre es empleada para algunos tiposde estudios, por ejemplo, tiempo total de coagulación y tiempo de sangrado.

Existen tres zonas para poder obtener estos especímenes sanguíneos (figura 2):1.

 

Yema de los dedos2.  Lóbulo de la oreja3.  Talón (solo neonatos)

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Fig. 1. Venas del antebrazo (dos incidencias)

Fosa antecubital

Posterior

Anterior

Vena cefálicaVena cubital

mediana

Vena basílica

Vena basílica

Vena cefálica

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Fig. 2 Zonas de punción cutánea (sangre capilar)

Las líneas punteadas indican la

zona indicada para la punción en

la planta del pie

Punción perpendicular a las

huellas digitales

Imagen del dedo pulgar que muestra la

zona correcta para la punción

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Especímenes arterialesEste tipo de sangre rara vez se emplea para estudios de rutina, pero esto no la

descarta de emplearse para cualquier tipo de estudio, sin embargo su principal empleo es para la determinación de gases sanguíneos. Debido al riesgo que conlleva la obtención deestos especímenes, estos únicamente deberán ser obtenidos por un médico, un químico o

una enfermera con entrenamiento especial.Los sitios habituales para obtener sangre arterial son:1.  Arteria radial2.  Arteria braquial3.

 

Arteria femoral

INSTRUMENTOS PARA RECOLECCIÓN

Jeringas Son sistemas integrados por un cilindro graduado en mililitros, un embolo y una

aguja con punta en un solo extremo y una base para montarse en el cilindro de la jeringa.Deben emplearse en la extracción de sangre en pacientes pediátricos, geriátricos u en casode pacientes con venas frágiles o diminutas que no puedan resistir la presión negativa delsistema al vacío.

Sistema al vacío 1.  Agujas: Son estériles y presentan varias longitudes y anchos (calibre o apertura).

Diseñadas para encajar en el sistema de sujeción del tubo al vacío mediante unarosca o para adherirse en los extremos de las jeringas. Son consideradas de muestramúltiple por el capuchón de goma en el extremo posterior al bisel para impedir lasalida de sangre. Las agujas para jeringa son de muestra única. Calibre paraadultos.- 21, longitud de 1 pulgada (2.4 cm). Ejemplos de agujas son la agujaEclipse Blood Collection Needle (BD) y el dispositivo Vacu-Pro Venipuncture Needle Protection Device (Concord Portex).

2. 

Dispositivo de sostén: Son bases plásticas diseñadas para sujetar las agujas, sondesechables y de uso único. Pueden limpiarse sumergiendo en solución de lavandinaal 10%. Ejemplos: sostén BD Pronto Quick Release Needle Holder, dispositivoSafety-Lok Needle Holder (BD) y Saf-T Clic (Winfield Medical).

3.  Tubos al vacío: Son de plástico o vidrio, contienen una cantidad preestablecida deun aditivo sellado al vacío. El vacío corresponde al volumen indicado en la etiqueta.Por lo general están recubiertos con silicona para disminuir las posibilidades dehemólisis.

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Tabla No. 2 Código de colores de tubos al vacíoColor del tapón

VacutainerAditivo No de inversiones

Rojo con negro Gel separador y activador de la coagulación 5

Verde con negro Gel separador y heparina de litio 8Rojo Activador del coágulo 0Amarillo con negro Trombina 8

Verde Heparina sódicaHeparina de litio

8

Gris Oxalato de potasio y fluoruro de sodioFluoruro de sodio

Fluoruro de sodio/K 2EDTA

8

88

Amarillo Polianetolsulfonato de sodio (SPS)Ácido citrato dextrosa (ACD)

8

8Lavanda o lila K 2EDTA líquido (vidrio)

K 2EDTA desecado (plástico)8

Celeste Citrato de sodio 0.105 M =3.2%Citrato de sodio 0.129 M =3.8%

3-4

Tabla No. 3 Código de colores de tubos al vacíoColor del tapón con

cierre HemogardAditivo No de inversiones

Dorado Gel separador y activador de la coagulación 8Verde claro Gel separador y heparina de litio 8

Rojo Activador del coágulo 5Anaranjado Trombina 8Azul militar Heparina sódica

 Na2EDTA Ninguno

880

Verde Heparina sódicaHeparina de litio

8

Gris Oxalato de potasio y fluoruro de sodioFluoruro de sodio

Fluoruro de sodio/K 2EDTA

8

Tostado Heparina sódica (vidrio)K 2EDTA 8Lavanda o lila K 2EDTA líquido (vidrio)

K 2EDTA desecado (plástico)8

Rosa K 2EDTA desecado 8Celeste Citrato de sodio 0.105 M =3.2%

Citrato de sodio 0.129 M =3.8%3-4

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Equipos de infusión alados (mariposas = butterflies)Dispositivos intravenosos que presentan una aguja corta y una sonda delgada con

alas plásticas adheribles. Pueden conectarse a los dispositivos de sostén Vacutainer, jeringas o frascos para hemocultivos con adaptadores especiales. Son empleados en la tomade muestra de niños o pacientes internados difíciles de extraerles sangre.

TorniqueteSe emplea como barrera contra el flujo de sangre venosa, con el objetivo de

visualizar una vena con mayor facilidad. Puede ser una tira o manguera de látex, una correade velcro o bandas ajustables. En la actualidad existen una gran variedad de formas para lostorniquetes, las cuales dan una mejor presentación, pero sobre todo mayor comodidad tanto para el paciente como para el flebotomista.

Solución para la asepsia de la pielLa solución limpiadora más común es el alcohol isopropílico al 70%. Debe aplicarse

con torundas empapadas de esta solución. Pueden emplearse también soluciones de etanolal 70% (ya no es recomendable), cloruro de benzalconio (cloruro de zefirán) o antisépticos.

Tabla No. 4 Orden de extracción de muestras con sistema VacutainerOrden deextracción

Tubo

1 Hemocultivo

2 Rojo o Amarillo3 Azul4 Dorado5 Verde

6 Lila7 Gris

Tabla No. 5 Orden de llenado de tubos con jeringaOrden deextracción

Tubo

1 Hemocultivo2 Azul3 Verde4 Lila5 Gris

6 Dorado7 Rojo o Amarillo

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FundamentoLos resultados de un examen de laboratorio como toda prueba analítica consisten de

tres etapas; preanalítica, analítica y postanalítica, por lo tanto la etapa preanalítica es la de

mayor importancia pues de la calidad del espécimen sanguíneo dependerá el resultado finaldel examen realizado.Material

  Torniquete (ligadura)  Torundas de algodón impregnadas de solución alcohólica al 70%  Jeringas de plástico estériles (5 mL) o sistema Vacutainer  Agujas calibre 20-22 

Agujas para toma múltiple (Vacutainer) 

Recipiente de plástico

Reactivos

 

Alcohol al 70%  Cloro al 5%

Procedimiento1.  Preparar la orden de ingreso.2.

 

Identificar al paciente mediante la confirmación de su nombre.3.  Si corresponde verificar alguna restricción del la dieta.4.  Verificar el protocolo de trabajo y selección de los tubos.5.  Etiquetar los tubos con la identificación correspondiente al paciente.6.

 

Posicionar al paciente para que este cómodo.7.  Seleccionar el sitio adecuado para la venopunción.

8. 

Limpiar la zona con una torunda humedecida en alcohol al 70%, demanera circular de adentro hacia fuera o verticalmente en un solosentido y asegurándose de girar la torunda.

9.  Dejar secar.10. Aplicar el torniquete 5 a 10 cm por encima de la zona de punción

durante no más de 1 minuto.11. Realizar la punción fijando la vena con el pulgar 2.5 a 5 cm por

debajo de la zona e insertar la aguja, con el bisel hacia arriba, con unángulo entre 15-30° entre la aguja y la piel

12. Se insertan los tubos al vacío en el orden correcto de extracción, conla inversión inmediata de los tubos que contengan anticoagulante. En

el caso de emplear jeringa se retira un poco el émbolo de la jeringa, para que la sangre comience a fluir.13. Se retira el torniquete una vez extraída la cantidad de sangre

requerida.14.

 

colocar la torunda sobre la zona de punción, sin presionar y se retirala aguja o la jeringa. Presionar ligeramente sobre la zona una vezretirada la aguja hasta que deje de fluir sangre.

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15. En el caso de extracción con jeringa se vierte la sangre en los tubosen el orden correcto.

16. Desechar el equipo de punción y otros residuos biopeligrosos en losrecipientes correspondientes y adecuados para cada material.

17. Lavar el material que haya tenido contacto con la sangre, después de

inactivar por lo menos 1 hora en cloro al 5%. El empleo de guantesde látex es obligatorio para el lavado de todo este tipo dematerial. 

Nota: Estos dos últimos pasos del procedimiento se deben efectuar de manerasistemática en cada una de las prácticas que se realizaran en este módulo deHematología y que siempre   deberán de seguir aquí y en el futuro de susprocedimientos de Laboratorio Clínico.NO SE VOLVERÁN A INDICAR AL FINAL DE CADA PROCEDIMIENTO.

PrecaucionesToda muestra de sangre y cualquier otro tipo de muestra biológica debe manipularse

con extremo cuidado para evitar la contaminación del analista y del área de trabajo. Por locual se deben emplear guantes durante todo el proceso y algún otro tipo de protección,como, gogles o gabinetes de seguridad cuando el proceso lo requiera; así como seguir entodo momento las reglas de seguridad del laboratorio.

Actividades  Adquirir conocimientos para la adecuada recolección de sangre y las aplicaciones de

los procedimientos de seguridad  que se deben aplicar en este Laboratorio.

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HEMATÓCRITO

El hematócrito es la fracción de volumen en la sangre que está ocupada por loseritrocitos, puede ser medido tanto en sangre capilar como en sangre venosa, sin embargo por la composición de la sangre capilar, en la cual se aumenta en un 5% la cantidad total de

eritrocitos, es preferible emplear sangre venosa. El hematocrito puede ser expresado como porcentaje o como fracción decimal.La masa de eritrocitos está mantenida y regulada por la médula ósea, pues en

condiciones normales está se encarga de reemplazar las células perdidas porenvejecimiento, sangrado o destrucción, por lo cual el hematocrito es útil para definiranemias y policitemia. Sin embargo hoy en día ya no se le da tanta importancia a este parámetro para diagnosticar anemia debido al margen de error que presentan las técnicasmanuales al no ser un cálculo directo y que está influido por los cambios en el volumen plasmático y puede no reflejar el tamaño de los eritrocitos en la deshidratación, en lasanemias falciformes, en los pacientes con policitemia y en la anisocitosis, pues el porcentaje de plasma atrapado entre los eritrocitos es superior al 2% en estos casos. Existeun método de referencia para corregir el porcentaje de plasma atrapado, pero requiere demucho tiempo y pericia, por lo que es poco práctico para su uso ocasional en loslaboratorios de rutina. Para lo cual la International Council for Standardization inHaematology (ICSH) desarrollo un método de referencia alternativo, que resulta práctico para la calibración de equipos automatizados.

En la actualidad el uso del macro y micrométodo está en desuso pues eladvenimiento de los automatizados desplazo en su totalidad las técnicas manuales, sinembargo en muchos laboratorios se emplea el microhematócrito para calibrarautomatizados debido a que los equipos calculan este parámetro a partir de la cuenta totalde eritrocitos y el volumen globular medio.

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Fundamento 

En el macro y micro métodos se centrifuga una columna de sangre dentro de untubo uniforme cerrado en uno de los extremos, hasta obtener un paquete de eritrocitos en elfondo del tubo. La centrifugación se prolonga hasta que el paquete celular este tan apretado

que al volver a centrifugar en las mismas condiciones se obtenga la misma columnainalterada.

Material   Capilares de vidrio sin anticoagulante  Plastilina 

Mechero bunsen  Microcentrifuga 

Centrifuga clínica  Pipeta Pasteur con bulbo  Tubo de Wintrobe 

Sangre venosa con EDTA

PROCEDIMIENTO 

Macrométodo 1.

 

Recolectar 5 mL de sangre venosa con anticoagulante.2.  Mezclar perfectamente la sangre mediante la inversión del tubo.3.  Llenar el tubo Wintrobe de la parte inferior hacia arriba con sangre empleando una

 pipeta Pasteur, teniendo cuidado de no formar burbujas, y en su defecto extraerlas.4.

 

Llenar con sangre hasta la marca de 100 mm.5.  Centrifugar durante 10 minutos a 2000-2300 g (Ver tabla No.). En la mayoría de los

casos no se completa el empaquetamiento en este periodo, por tanto es necesarioextender el tiempo de centrifugación hasta 60 minutos.Tabla No. 6 Revoluciones por minuto requeridas para alcanzar aproximadamente 2000-2300 g a varias distancias del eje

REVOLUCIONES POR MINUTORADIO (cm) 2000g 2300g

15 3400 360020 2900 310025 2600 2800

6.  Retirar los tubos de la centrifuga. La altura de la columna de eritrocitos es expresadacomo una fracción de la longitud original de la columna de sangre (100mm=100%),

se lee la columna excluyendo la capa de leucocitos y plaquetas.7.  Invertir los tubos y colocarse en agua inmediatamente después de medirse el

 paquete globular. Cada tubo se limpia forzando el agua hasta el fondo del tubo paradesplazar la columna de eritrocitos o con la ayuda de un aplicador de madera seremueve la sangre para facilitar su salida.

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Micrométodo 1.  Mezclar la sangre por inversión del tubo.2.  Llenar 2 capilares de vidrio hasta las dos o tres cuartas partes de su longitud total.3.

 

Sellar el extremo opuesto al orificio de llenado con plastilina o mediante el calor deuna flama (en este caso procurar que no se estreche el cuello del capilar y que esté

quede plano en la punta).4. 

Colocar los capilares en la microcentrífuga y asegurarlos, registrar la posición queocupan los capilares.

5.  Centrifugar de 10000-15000g por 5 minutos (las microcentrífugas ya están programadas para alcanzar está velocidad en el tiempo seleccionado).

6. 

Sacar los capilares de la microcentrífuga y medir. Si no se van a medirinmediatamente, se colocan de manera vertical hasta que se lean.

7.  Medir la longitud de la columna de eritrocitos contra la longitud total sobre un papelmilimétrico o en un dispositivo para la lectura de microhematócrito.

8. 

Cuando la prueba se realiza con fines de control de calidad los resultado no debendiferir más de 2%(0.02 L/L).

Valores de referencia A nivel de la ciudad de México los valores de referencia oscilan entre:

  Hombres: 46-56% (0.46-0.56 L/L)  Mujeres. 39-50% (0.39-0.50 L/L)

Los valores del hematocrito dependen del sexo, de la edad y altura del sitio de residencia.

Actividades   Solo se efectuara el micrométodo para la obtención del hematocrito.

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VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN GLOBULAR (VSG) 

La VSG es una prueba sencilla, barata e inespecífica empleada desde hace muchosaños para contribuir al diagnostico de enfermedades inflamatorias, incluyendo infecciones,cáncer y enfermedades autoinmunes. La VSG es un prueba inespecífica porque sus

aumentos indican un probable proceso inflamatorio, pero no el sitio donde se estádesarrollando y mucho menos la causa, además de que otras causas diferentes a lainflamación pueden llevar a un aumento de la VSG. Es por ello que esta prueba no se puedeemplear aisladamente.

La VSG constituye una medida indirecta del grado de inflamación presente en elorganismo. Está midiendo en realidad la velocidad de caída (sedimentación) de loseritrocitos en el plasma, por lo cual esta velocidad depende de tres factores principalmente:

1.  la composición proteínica del plasma,2.  el tamaño y forma de los eritrocitos, y3.

 

la concentración de los eritrocitos.Los resultados se expresan como milímetros de plasma transparente que quedan en la

 parte superior de la columna después de que haya transcurrido una hora. Normalmente, losglóbulos rojos van cayendo lentamente, dejando poca cantidad de plasma transparente. Elhecho de que exista una concentración elevada de ciertas proteínas (como el fibrinógeno olas inmunoglobulinas, aumentados en la inflamación) provoca que los glóbulos rojos caiganmás precipitadamente, debido a que se ve afectado el potencial Z (carga negativa) de loseritrocitos por la presencia de las cargas positivas de estas proteínas.

Algunos de los trastornos vinculados con el aumento de la VSG son, padecimientosinflamatorios con aumento de reactantes de fase aguda, lupus eritematoso sistémico, artritisreumatoide, infecciones agudas y crónicas, tuberculosis pulmonar, endocarditis bacterianasubaguda, fiebre reumática, hepatitis, infartos del miocardio, mieloma múltiple,macroglobulinemia de Waldenstrom. Además el embarazo la menstruación y el uso deanticonceptivos orales también son causa de aumento de la VSG.

Se han empleado principalmente dos métodos para medir la VSG: el método deWintrobe y el método de Westergren, siendo este el método recomendado por el Comité Nacional de Estándares para los laboratorios Clínicos (NCCLS) por permitir un tiempo decaída libre más largo en comparación con el método de Wintrobe.

En la actualidad hay equipos comerciales descartables para VSG, que consisten en pipetas enroscables a los tubos barrera que permiten el asenso de la muestra hasta la marcainicial y así no tener contacto alguno con la muestra. También existen en el mercadoequipos automatizados que permiten obtener resultados en 20 minutos comparables con losobtenidos con el método de Westergren en 1 hora, ejemplo de estos equipos es el sistemaVes-Matic que posee un sensor optoelectrónico que mide el cambio de la opacidad de unacolumna de sangre a medida que se produce la sedimentación de la sangre. La aceleraciónde la sedimentación se logra al colocar los tubos en un ángulo de 18° con respecto al ejevertical.

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Fundamento Dado que la sangre es una suspensión de elementos formes cuando se deja sangre

anticoagulada en reposo dentro de un tubo perpendicular a temperatura ambiente, loseritrocitos sedimentan hacia el fondo del tubo debido a su mayor peso sobre los demáscomponentes de la sangre. La determinación de los milímetros que los eritrocitos

sedimentan se realiza durante un periodo de tiempo dependiendo del método empleado.En la prueba pueden observarse tres fases:1.  Periodo inicial de agregación. Durante esta fase ocurre el apilamiento de los

eritrocitos y la sedimentación es bastante lenta. Duran aproximadamente 10 minutosdel periodo de 1 hora.

2. 

Periodo de sedimentación rápida. Dura cerca de 40 minutos y en esta fase lavelocidad de sedimentación es constante.

3.  Periodo final de concentración. Se toma en cuenta solo hasta completar la hora, yaque esta persiste durante más tiempo.

Material  

Tubos de Wintrobe  Pipetas Pasteur de punta larga con bulbo 

Soporte para tubos Wintrobe 

Sangre venosa con EDTA

Procedimiento  Método de Wintrobe 

1.  Recolectar 5 mL de sangre venosa en un tubo con tapón lila, mezclar por inversióndel tubo.

2.  Llenar el tubo de Wintrobe desde el fondo hacia arriba con sangre empleando una pipeta Pasteur, teniendo cuidado de no formar burbujas de aire.

3. 

La sangre debe quedar en la marca superior marcada como 0.4.  Colocar el tubo Wintrobe en posición vertical en un soporte para tubos de Wintrobe.Una vez colocado el tubo en el soporte este no debe ser sometido a movimientos nivibraciones.

5.  Activar un cronometro o tomar el tiempo inicial.6.  Al finalizar la hora de sedimentación se lee la longitud de la columna de plasma que

queda por el desplazamiento de los eritrocitos hacia abajo. La lectura se toma dearriba hacia abajo y cada marca del tubo corresponde a 1mm.

Intervalos de referencia Hombres: 0-10 mm/hora

Mujeres: 0-20 mm/horaActividades: 

  Determinar la VSG y el hematocrito (macrométodo).  En caso de que el hematócrito haya resultado por debajo de los valores de referencia

efectuar la corrección de la lectura de la VSG según el gráfico de Wintrobe-Landsberg (Fig. No. 3)

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Fig. 3. Gráfico de Wintrobe-Landsberg

Valores de referencia del hematócrito para mujeres

Valores de referencia del hematócrito para hombres

Se busca la línea horizontal que corresponde a los milímetros de sedimentación en unahora. Se sigue esta línea hasta interceptar la vertical correspondiente al hematócrito, desdeese punto se sigue la línea hacia abajo hasta cruzar la curva remarcada en negro. Laintersección representa la VSG corregida.

100

80

90

100

40

50

60

70

30

20

10

0

70

80

90

30

40

50

60

60

10

20

20 30 40 5010

Hematócrito (%)

V

S

G

(mm/hora) 

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19

K 3Fe(CN)6  KCN

HEMOGLOBINA (Hb) 

La hemoglobina es la proteína eritrocitaria intracelular encargada del transporte deoxígeno de los pulmones hacia los tejidos y del transporte del dióxido de carbono de lostejidos hacia los pulmones. Su propiedad tan extraordinaria de afinidad por el oxígeno se ve

reflejada en el hecho de que cada gramo de hemoglobina puede transportar hasta 1.34 mLde oxígeno.Cada molécula de hemoglobina está compuesta por un anillo tetrapirrólico que

surge del metabolismo de las porfirinas y que una vez unido a un átomo de hierro forman elgrupo Hem y dos pares de cadenas polipeptídicas (globinas) de tipo α (α o ζ) o no α (β, γ o

δ). Las globinas de tipo α son cadenas de 141 aminoácidos y los genes que las

codifican están localizados en el cromosoma 16. Las globinas no α se forman de 146

aminoácidos y los genes que las codifican se localizan de manera lineal en orden deactivación en el cromosoma 11. La combinación por pares de estas globinas da comoresultado distintos tipos de hemoglobina:

1.  ζ2γ2 Hb Portland2.

 

ζ2ε2 Hb Gower I3.  α2ε2 Hb Gower II4.  α2γ2 Hb F5.

  α2δ2 Hb A26.  α2β2 Hb A7.  γ4 Hb de Bart8.  β4 Hb H

La concentración de hemoglobina puede calcularse por medición de su color, de suafinidad por el oxígeno o por el dióxido de carbono o bien por su contenido en hierro. Estosmétodos se basan en técnicas que comparan la intensidad de la luz o del color, en el hechode que 1 g de hemoglobina puede captar 1.34 mL de oxígeno (poco práctico en la rutina) o por la medición de hierro en la hemoglobina asumiendo que 0.347g de hierro = 100 g deHb.

Hay dos métodos de uso habitual:a)  El método de cianuro de hemoglobina o cianmetahemoglobina (HiCN), y b)  El método de la oxihemoglobina (HbO2)

Siendo el método de la cianmetahemoglobina el método de elección internacionalmente porla estabilidad del compuesto. La Hb se oxida a metahemoglobina (Fe3+) por el ferricianurode potasio (K 3Fe(CN)6). El cianuro de potasio (KCN) a continuación convierte lametahemoglobina a cianmetahemoglobina:

Hb(Fe2+) metahemoglobina(Fe3+) cianmetahemoglobina

La absorbancia de la cianmetahemoglobina a 540 nm es directamente proporcional ala concentración de Hb

Hemoglobinas embrionarias

Hemoglobinas adultas

Hemoglobinas talasemicas

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Hb(g/dL) =

Fundamento La sangre se hemoliza y se diluye por adición de un agente tensoactivo. El

ferricianuro oxida el Fe2+ de la hemoglobina a Fe3+ para formar metahemoglobina que alcombinarse con el cianuro potásico forma cianmetahemoglobina, compuesto muy estable yque absorbe en el canal óptico de 540 nm. Esta medición espectrofotométrica se sigue

típicamente la Ley de Lambert-Beer. La dilución a manejar es de 1:251.Material 

  Pipeta de Sahli de 0.02 mL(20µL)  Boquilla  Pipetas volumétricas de 1, 2, 3, 4 y 5mL  Celdas espectrofotométricas 

Espectrofotómetro  Sangre venosa con EDTA

Reactivos 

 

Solución diluyente de Drabkin  Estándar de cianmetahemoglobina

Procedimiento 

 Preparación de la curva estándar de Hb 1.  Realizar las diluciones en 6 tubos de ensayo de 13x100mm como se muestra en la

tabla No.Tabla No. 7.  Curva de calibración para la determinación de Hemoglobina

 No. de tubo Vol. Drabkin(mL)

Vol. estándar(mL)

Absorbancia Concentraciónde Hb (g/dL)

Blanco 5.0 0.01 4.0 1.02 3.0 2.03 2.0 3.04 1.0 4.05 0.0 5.0

2. 

Transferir las diluciones a las cubetas espectrofotométricas.3.  Medir las absorbancias de los tubos 1, 2, 3, 4 y 5 respectivamente, ajustando a 0 con

el blanco a 540nm.4.

 

Obtener la concentración de Hb(g/dL) aplicando la siguiente fórmula:

Volumen del estándar X concentración del estándar 1 (g/dL) X 251Volumen total

251 = dilución de sangre1  La concentración del Estándar comercial dependerá de la concentración que este indicada en la

etiqueta.

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 Muestra problema 1.  Recolectar 5 mL de sangre venosa en un tubo con tapón lila y mezclar por inversión

del tubo.2.

 

Con una pipeta volumétrica de 5 mL adicionar un volumen de solución de Drabkina un tubo de ensayo.

3. 

Llenar la pipeta de Sahli con sangre hasta la marca de 0.02mL. Si se emplea sangrecapilar, tomar la muestra directamente de herida.4.  Limpiar la sangre del exterior de la pipeta de arriba hacia abajo sin tocar la punta de

la pipeta para evitar la pérdida de muestra.5.  Descargar el contenido de la pipeta de Sahli en los 5mL de diluyente Drabkin,

enjuagar tres veces la pipeta con la misma solución, aspirando y expeliendocuidadosamente. Se obtiene una dilución 1:251.

6.  Mezclar por burbujeo, con ayuda de un vortex o por inversión repetida del tubo.7.  Dejar reposar la mezcla durante 10 minutos para que se efectué en su totalidad la

reacción de la cianmetahemoglobina.8.  Transferir la mezcla reacción a la celda espectrofotométrica.9.  Medir la absorbancia de la mezcla a 540nm, empleando solución de Drabkin como

 blanco.10. Interpolar el resultado de la absorbancia en la grafica de la curva estándar para

obtener el resultado de la concentración de Hb problema.

Intervalos de referencia Hb(g/dL)

Edad Hombres Mujeres

Primera semana de vida 17-21 17-21

1 semana a 2 meses 11-17 11-17

2 a 12 meses 11-15 11-15

1 a 3 años 10-15 10-153 a 8 años 11-15 11-15

8 a 15 años 11-16 11-16

15 años en adelante 14-18 12-16

Actividades   Obtener las concentraciones de cada una de las diluciones indicadas en la tabla No.

empleando la formula indicada. 

Trazar una gráfica de A= f[C] con los datos obtenidos de la tabla No. en papelmilimétrico.

  Interpolar la lectura de absorbancia de la muestra problema con la grafica obtenidade la curva estándar para obtener la concentración de Hb en g/dL.

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RECUENTO DE ERITROCITOS 

El recuento celular es uno de los estudios de rutina mas importantes en la clínica,debido a la información que proporcionan aunado a otras pruebas. Los recuentos celularesanteriormente se realizaban con métodos manuales siendo el corazón de esta prueba los

hemocitómetros o cámaras contadoras, hoy en día se emplean equipos electrónicos que pueden ser semiautomatizados o automatizados. Estos equipos se basan en el principio deimpedancia descubierto por Coulter en 1950 o en la citométria de flujo que proporciona unamayor cantidad de datos.

El principio del recuento celular manual es sencillo y similar para eritrocitos,leucocitos y plaquetas, solo varían la dilución, el diluyente y el área contada. Hasta hace poco el recuento se expresaba en cantidad por mm3, por el volumen obtenido en elhemocitómetro, el cual se me determina mediante medidas lineales, actualmente seexpresan en litros (µL), pues los equipos automatizados cuentan una mayor cantidad decélulas suspendidas en una solución diluyente isotónica.

Recuento manual Hemocitómetro o cámara de conteo 

La cámara de conteo es un aparato de vidrio óptico especial de precisión, se emplea para contar células o partículas en suspensión. Es una placa rectangular gruesa del tamañode un portaobjetos, con dos superficies elevadas separadas por una hendidura en forma deH (Figura 4).

Fig. 4. Cámara de Neubauer y un primer plano de las áreas de conteo como se ven en elmicroscopio. Los cuadros marcados con una W se emplean para contar leucocitos y losque están marcados con una R para eritrocitos.

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Cada superficie cuenta con una cuadricula microscópica de 3X3mm dividida en 9cuadros de 1mm2 de área, los 4 cuadros de las orillas marcados como A, B, C Y D (Figura5 ) se dividen en 16 cuadros de 0.25mm por lado o 0.0625mm2 de área y se emplean paracontar leucocitos. La cuadricula central se divide en 25 cuadros de 0.20mm de lado o0.04mm2 de área, estos a su vez se dividen en 16 cuadros de 0.05mm por lado o 0.0025mm 2 

de área, este cuadro marcado como E se emplea para contar eritrocitos y plaquetas. Elrecuento de eritrocitos se hace en los 4 cuadros de las esquinas y el cuadro central de estácuadriculan marcados como 1, 2, 3, 4 y 5 en la Figura 5.

 Pipeta para diluir los eritrocitos La dilución de la muestra se puede realizar con pipetas de Thoma, dilución en tubo

o mediante el sistema Unopette que son dispositivos automáticos de dilución que surgieronen la década de 1950 y que prácticamente reemplazaron a las pipetas de Thoma.

Las pipetas de Thoma son de cristal y constan de un capilar graduado en 10 partes,se indican únicamente la quinta marca con 0.5 y la decima con 1.0, este capilar va unido auna ampolla que contiene en su interior una bolita de plástico y de color blanco, esteensanchamiento de la pipeta termina en otra porción de capilar mas pequeño que el inicial y pose una línea marcada como 101, la cual indica la capacidad de la pipeta y compensa elvolumen de diluyente que queda atrapado en el capilar después de la dilución; entonces elvolumen se reparte entre el capilar (1 volumen) y la ampolla (100 volúmenes).

Las marcas iníciales de la pipeta determinan la dilución de la muestra, con lamuestra a la marca de 0.5 se obtiene una dilución 1:200 y aspirando muestra hasta la marca1.0 se obtiene una dilución 1:100 cuando se aspira liquido diluyente hasta la marca de 101.

 Líquido diluyente En general vale cualquier solución isotónica que contenga un conservador y un

fijador que no hemolice, aglutine o deforme a los eritrocitos al menos durante un tiempo.Siendo la solución de Hayem la mas empleada para el recuento eritrocitario. Los leucocitosno se lisan pero estos no interfieren en la cuenta debido a su falta de color.

El recuento manual de eritrocitos tiene un error del 10%, el cual puede deberse amúltiples causas, algunas de estas pueden ser:

  Errores de extracción: dilución o hemoconcentración de la muestra. Hemólisis ocoagulación parcial.

  Mala homogenización de la muestra.  Utilización de material mal calibrado, sucio o húmedo. 

Errores en la dilución de la muestra.  Cámara de Neubauer no calibrada, sucia o mojada.

 

Llenado incorrecto de la cámara de Neubauer.  Empleo de cubrehematimétro descalibrado.  Errores del analista durante el recuento y cálculos realizados.

Debido a esto y al empleo de equipos automatizados, el recuento de eritrocitosmanual se realiza en raras ocasiones y además este puede ser substituido por parámetros

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eritrocíticos manuales más exactos, como el microhematocrito y la Hb, pues estos parámetros guardan una estrecha relación. La regla del tres 

Está regla solo es válida para muestras con eritrocitos de morfología normal. Elvalor de la Hb debe ser tres veces el del recuento de eritrocitos y el Hematocrito debe ser

tres veces el valor de la Hb.  Recuento de eritrocitos X 3 = Hb 

Hb X 3 = Hematocrito

Fig. 5. Cuadricula microscópica de la cámara de Neubauer

3mm

1mm

0.2mm

4

A

1

C D

B

3

2

E

5

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DiluciónVolumen

Fundamento La base del recuento manual de eritrocitos es la dilución programada y la

 preparación de la muestra con una solución isotónica, para posteriormente contar loseritrocitos en un volumen determinado por el área contada y la profundidad delhemocitómetro cuando se le coloca un cubreobjetos calibrado y ópticamente plano sobre las

dos superficies elevadas de la cámara.Este principio se expresa mediante la siguiente fórmula para obtener la cuenta totalde eritrocitos por mm3 de sangre:

Eritrocitos/mm3 = N X

 N = Número de células contadasVolumen = lado x lado x profundidad = mm3 Dilución = 1:200 ó 1:100

Material   Boquilla 

Pipeta de Thoma para glóbulos rojos  Cámara de Neubauer  Cubrehemocitómetro  Agitador para pipetas de Thoma 

Microscopio  Sangre con EDTA

Reactivos   Líquido de Hayem

Procedimiento 

1. 

Recolectar 5mL de sangre venosa en un tubo con EDTA, y mezclar por inversióndel tubo.

2.  Con la pipeta en posición horizontal aspirar sangre hasta la marca de 0.5. El excesode sangre se elimina tocando la punta de la pipeta con una gasa.

3.  Limpiar la sangre adherida a las paredes externas de la pipeta con una gasa procurando no tocar la punta de la pipeta.

4.  Introducir la pipeta en forma vertical en el líquido de Hayem y aspirar diluyentehasta la marca de 101. Si se aspira mas diluyente se desecha todo el contenido de la pipeta en un recipiente con cloro y se inicia nuevamente con el paso 2.

5.  Retirar el adaptador de la boquilla obturando con parafilm la punta de la pipeta para

evitar la pérdida de líquido, colocar parafilm en el extremo opuesto a la punta ymanteniendo la pipeta siempre en posición horizontal se coloca en el agitadormecánico durante 3 ó 4 minutos.

6.  Colocar el cubreobjetos sobre las dos superficies elevadas de la cámara para cubrirlas dos cuadriculas.

7.  Desechar de las primeras 4 ó 6 gotas de la pipeta para eliminar el diluyente quequeda en el capilar y que no diluye la muestra.

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2005(0.2mm)2(0.1mm)

8.  Cargar ambos lados de la cámara, manteniendo la pipeta en un ángulo de 45° tocarcon la punta el borde del cubreobjetos donde se junta con la superficie elevada de lacámara. El hemocitómetro se llena por capilaridad, el flujo de llenado debe serconstante y sin que este llene la hendidura en forma de H de la cámara.

9.  Colocar el hemocitómetro en la platina del microscopio y dejar reposar de 3 a 5

minutos, para dar tiempo a que las células se distribuyan y se asienten en el fondode las cuadriculas.10. Con el objetivo de 10X se localiza en cuadro central E y se comprueba que las

células estén distribuidas uniformemente.11. Una vez enfocado el cuadro central, con el objetivo de 40X se cuentan los cuadros

marcados del 1-5 mostrados en la Figura 5.12. Se comienza a contar las células contenidas en el cuadro terciario superior izquierdo

marcado como 1 y se sigue el orden establecido de los números marcados en laFigura 5.

13. 

El conteo de las células en los 16 cuadros cuaternarios de cada cuadro terciario serealiza como se muestra en la Figura 6.

14. Se anotan separadamente el número de eritrocitos en cada cuadro terciario contado yse suma el resultado de los 5 cuadros.

15. 

Determinar la cuenta total de eritrocitos/mm3, empleando la fórmula:

Eritrocitos/mm3 = N X N = Eritrocitos contados5 = Cuadros terciarios contados(0.2)2 = área de cuadro terciario0.1 = altura de la cámara200 = dilución de la muestra

Eritrocitos/mm3 = N X 1000010000 = Factor (depende de la dilución empleada)

Fig. 6. Solo se cuentan las células engris, discriminando las células quetocan las líneas triples inferior yderecha, y que están marcadasúnicamente como halos. 

Contadas

No contadas

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16. Lavar las pipetas de Thoma una vez con agua corriente y tres veces con aguadestilada.

17. El hemocitómetro y los cubreobjetos deben limpiarse sumergiendo en agua tibia ynunca secados con gasa o pañuelos para evitar que se rayen. Una vez limpios debendejarse secar al aire antes de guardarse.

Valores de referencia

Recuento de eritrocitos X106/µLEdad Hombres Mujeres

Primera semana de vida1 semana a 2 meses2 meses a 1 año

4,50-6,503,60-5,003,50-5,50

1-3 años 4,00-5,503-8 años 4,10-5,508-15 años 4,10-5,7015 años en adelante 4,30-5,70 4,10-5,40

Actividades  

Realizar las pruebas de hematocrito y hemoglobina además del recuento deeritrocitos.

  Calcular los índices eritrocitarios.  Aplicar la regla del tres para verificar resultados de hemoglobina, hematocrito y

cuenta de eritrocitos, e inclusive para sustituir y corregir la cuenta total deeritrocitos.

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ÍNDICES ERITROCITARIOS 

Los índices eritrocitarios han sido tradicionalmente los parámetros calculados a partir del recuento de eritrocitos, la concentración de hemoglobina y el hematócrito; fueronintroducidos en 1929 por Wintrobe. Estos parámetros son:

 

Volumen corpuscular medio (VCM)  Hemoglobina corpuscular media (HCM)  Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM)Éstos se calculan para determinar el tamaño y el contenido de hemoglobina medios de

los eritrocitos, siendo la base para la clasificación de las anemias y se han empleado endiversas combinaciones para ayudar a distinguir entre deficiencia de hierro y lastalasemias.

Con la introducción de los analizadores automatizados éstos parámetros dejaron deservir solo para clasificar anemias y pasaron a ser parámetros para el control de calidad delos equipos.

Volumen corpuscular medio (VCM) Es el volumen medio de los eritrocitos, expresado en femtolitros (fL), o sea 10 -15 L; para métodos manuales se calcula a partir de la siguiente fórmula:

Hto (%) X 10Recuento de eritrocitos (1012/L)

En los equipos semiautomatizados el VCM se calcula con la misma fórmula perodividiendo el Hto (L/L) entre el recuento de eritrocitos (1012).

En los instrumentos automatizados el VCM está estrechamente relacionado con laobtención del recuento de eritrocitos y del hematócrito, sin embargo no se obtiene a partirde estos parámetros como en los métodos manuales. El VCM es medido directamente, porel paso de las células a través de la abertura de un contador de impedancia o a través del

rayo de luz de un instrumento de dispersión lumínica, los cuales generan un impulsoeléctrico cuya altura es proporcional al volumen celular. La relación del recuento deeritrocitos, el Hto y el VCM en los autoanalizadores está en que el número de impulsosgenerados permite determinar la cantidad de eritrocitos, el análisis de la altura del impulsonos sirve para determinar el VCM y el Hto se obtiene a partir de los dos primeros.

Este parámetro es el más importante de los tres índices, pues al evaluar el tamaño delos eritrocitos permite clasificar las anemias en microcíticas o macrocíticas. Su valor dereferencia oscila entre 80 a 100 fL.

 Hemoglobina corpuscular media (HCM) Es el peso medio de la hemoglobina en un eritrocito, expresada en picogramos (pg),

o sea 10

-12

 g. Se calcula a partir de la siguiente fórmula:Hb (g/dL) X 10Recuento de eritrocitos (1012/L)

Como en los equipos automatizados este índice es calculado a partir de dos parámetros medidos directamente, lo hace un dato confiable, sin embargo como su cambiosolo se debe a trastornos donde la síntesis de hemoglobina esté muy comprometida, engeneral no se debe considerar en la clasificación de las anemias. Pero su valor si debe

VCM=

HCM=

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emplearse para evaluar la precisión alcanzada por el equipo automatizado. Su valor dereferencia oscila entre 27 y 34 pg.

Concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM) Es la concentración media de Hb en cada eritrocito. Las unidades que deben usarse

son gramos por decilitro, sin embargo siempre se opta por la forma simple del porcentaje.Se calcula de la forma tradicional a partir de la Hb y el Hto con equipos que miden el Hto ycalculan el VCM, mediante la misma fórmula para métodos manuales:

Hb (g/dL) X 100Hto (%)

Mientras que cuando el VCM se mide directamente y el Hto se calcula, se obtiene delrecuento de eritrocitos (RE), VCM y Hb según la siguiente fórmula:

[Hb (g/dL) X 1000][VCM (fL) X RE (1012/L)]

Con la introducción de los contadores automatizados, el valor de la CHCM comoindicador de hipocromía se hizo despreciable, pues al calcular el Hto se elimina elatrapamiento plasmático ocurrido en la columna de eritrocitos en los tubos demicrohematócrito, lo cual aumenta el valor del Hto y exagera la reducción de la CHCM.Por lo cual la CHCM era un indicador real de la hipocromía pero a la vez también unartefacto. Como en los equipos automatizados la CHCM se obtiene a través de un Htocalculado la disminución del VCM nos lleva a una sobreestimación de la CHCMhaciéndolo un índice menos sensible a la progresión de una anemia ferropénica o en lastalasemias, mostrando únicamente un cambio hasta que la síntesis de hemoglobina ya seencuentra muy alterada. Este hecho le resta utilidad a la CHCM, por lo cual hay equiposque cuentan con un equivalente de este parámetro denominado MCHC, el cual es medidomás directamente teniendo una mayor sensibilidad a la deficiencia de hierro, ya que juntocon la CHCM va disminuyendo a medida que se desarrolla la hipocromía.

Los valores de referencia oscilan entre 32 a 36 g/dL.

CHCM=

CHCM=

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Fundamento Los valores del VCM reflejan el tamaño, mientras que la HCM y el CHCM reflejan

la concentración de hemoglobina en las células individuales. Por lo cual el cálculo de estostres índices es útil en el diagnóstico diferencial de los tipos de anemia.

Actividades   Calcular los índices eritrocitarios a partir de los datos obtenidos en la prácticaanterior (Recuento de eritrocitos, Hb y Hto).

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CUENTA TOTAL DE LEUCOCITOS 

Los leucocitos son las células encargadas de la defensa inmunológica del cuerpo,estas células debido a que no poseen color fueron llamados glóbulos blancos y por estemotivo no fueron muy estudiados hasta que en 1887 Paul Erlich desarrollo una tinción

triácida, la cual permitió la clasificación de los leucocitos en base a características nuclearesy citoplasmáticas. Existen dos tipos de leucocitos, los mononucleares (linfocitos ymonocitos) y los polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos y basófilos), cada estirpe confunciones diferentes.

El recuento leucocitario representa el número de leucocitos en 1L de sangre total,sin hacer distinción entre las estirpes leucocitarias (neutrófilos, linfocitos, monocitos,eosinófilos o basófilos).

Si bien los principios generales para el recuento celular manual ya fueron expuestosen la práctica de recuento eritrocitario, en esta práctica nos enfocaremos a explicar el áreacontada, la dilución y el líquido diluyente empleado para la cuenta de leucocitos.

Recuento celular manual  Hemocitómetro 

Se emplea al igual que para los eritrocitos la cámara de Neubauer (Fig. 4). Para elrecuento de leucocitos se emplean los 4 cuadros secundarios (1mm2) ubicados en las 4esquinas del hemocitómetro y que se muestran como A, B, C y D en la Fig. 5. Cada cuadrosecundario está formado por 16 cuadros terciarios que miden 0.0625mm2 de área.

 Pipeta para diluir los leucocitos Similar en tamaño, forma y material a la pipeta de Thoma para eritrocitos, pero esta

 pipeta contiene una bolita plástica de color blanco dentro de la ampolla de mezclado de la pipeta. La pipeta de Thoma para leucocitos esta graduada en 11 volúmenes, unocorresponde al capilar y está marcado con 10 rayas de las cuales solo se indica la quintaraya con 0.5 y la decima con 1.0, los 10 volúmenes restantes corresponden al líquido que permanecerá en la ampolla para la dilución y hasta la marca de 11. Las diluciones que semanejan en estas pipetas son de 1:20 cuando se aspira sangre hasta la marca de 0.5 y de1:10 cuando se aspira sangre hasta la marca de 1.0 y llenando con diluyente hasta la marcade 11.

 Líquido diluyente El líquido empleado para la dilución de los leucocitos debe ser hipotónica y

ligeramente ácida para hemolizar los eritrocitos pero sin dañar los leucocitos y contener uncolorante para hacerlos visibles. La solución más empleada es el líquido de Türk, el cualcontiene ácido acético como hemolizante y violeta de genciana como colorante para losleucocitos.

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DiluciónVolumen

Fundamento La base del recuento manual de leucocitos es la dilución programada y la

 preparación de la muestra con una solución hipotónica ácida, que hemoliza únicamente alos eritrocitos, pero no a las células nucleadas, para posteriormente contar dichas células enun volumen determinado por el área contada y la profundidad del hemocitómetro cuando se

le coloca un cubreobjetos calibrado y ópticamente plano sobre las dos superficies elevadasde la cámara.Este principio se expresa mediante la siguiente fórmula para obtener la cuenta total

de leucocitos por mm3 de sangre:Leucocitos/mm3 = N X

 N = Número de células contadasVolumen = lado x lado x profundidad = mm3 Dilución = 1:20 ó 1:10

Material  

Boquilla  Pipeta de Thoma para glóbulos blancos 

Cámara de Neubauer 

Cubrehemocitómetro  Agitador para pipetas de Thoma  Microscopio  Sangre con EDTA

Reactivos  

Líquido de Türk

Procedimiento 

18. Recolectar 5mL de sangre venosa en un tubo con EDTA, y mezclar por inversióndel tubo.

19. Con la pipeta en posición horizontal aspirar sangre hasta la marca de 0.5. El excesode sangre se elimina tocando la punta de la pipeta con una gasa.

20. Limpiar la sangre adherida a las paredes externas de la pipeta con una gasa procurando no tocar la punta de la pipeta.

21. 

Introducir la pipeta en forma vertical en el líquido de Türk y aspirar diluyente hastala marca de 11. Si se aspira mas diluyente se desecha todo el contenido de la pipetaen un recipiente con cloro y se inicia nuevamente con el paso 2.

22. 

Retirar el adaptador de la boquilla obturando con parafilm la punta de la pipeta paraevitar la pérdida de líquido, colocar parafilm en el extremo opuesto a la punta ymanteniendo la pipeta siempre en posición horizontal se coloca en el agitadormecánico durante 3 ó 4 minutos.

23. Colocar el cubreobjetos sobre las dos superficies elevadas de la cámara para cubrirlas dos cuadriculas.

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20

4 1mm2 20.1mm

24. Desechar de las primeras 4 ó 6 gotas de la pipeta para eliminar el diluyente quequeda en el capilar y que no diluye la muestra.

25. Cargar ambos lados de la cámara, manteniendo la pipeta en un ángulo de 45° tocarcon la punta el borde del cubreobjetos donde se junta con la superficie elevada de lacámara. El hemocitómetro se llena por capilaridad, el flujo de llenado debe ser

constante y sin que este llene la hendidura en forma de H de la cámara.26. 

Colocar el hemocitómetro en la platina del microscopio y dejar reposar de 3 a 5minutos, para dar tiempo a que las células se distribuyan y se asienten en el fondode las cuadriculas.

27. Con el objetivo de 10X se localizan los cuatro cuadros secundarios y se compruebaque las células estén distribuidas uniformemente. En caso contrario se carga otracámara.

28. Se cuentan los leucocitos en cada uno de cuadros marcados como A, B, C y Dmostrados en la Figura 5.

29. 

El conteo de las células en los 16 cuadros que forman cada cuadro secundario serealiza como se muestra en la Figura 7.

30. Se cuentan separadamente el número de leucocitos en cada cuadro secundario y sesuman los resultados. El recuento de cada cuadro no debe variar en más de 10células.

31. Calcular el número de leucocitos/mm3 con la siguiente fórmula:

Leucocitos/mm3 = N X

 N = Número de leucocitos contadasVolumen = lado x lado x profundidad = mm3 Dilución = 1:20 ó 1:10

 No. de leucocitos/mm3 = N X 50

Fig. 7. Solo se cuentan las células engris, discriminando las células quetocan las líneas triples inferior yderecha, y que están marcadasúnicamente como halos. 

Contadas

No contadas

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100

100 + % eritroblastos en cuenta diferencial

50 = Factor32. Los eritroblastos no se lisan por lo cual deben contarse juntamente con los

leucocitos y posteriormente debe corregirse la cuenta total de leucocitos mediante lasiguiente fórmula:

Leucocitos/mm3 = N X

33. 

Si la cuenta de leucocitos es menor de 4000/mm3, es preferible hacer nuevamente lacuenta de leucocitos pero con una dilución 1:10, si por el contrario la cuenta es muyelevada se debe emplear una dilución 1:100 o 1:200 con la pipeta para eritrocitos.

34. Lavar el material empleado como se indico en la práctica para el recuento deeritrocitos.

Valores de referencia Edad Leucocitos X103/µL

 Neonatos 10000-30000Lactantes 7000-17000

 Niños pequeños 6000-15000Escolares 5000-12000Adultos 4500-11000

Actividades   Realizar la cuenta total de leucocitos y efectuar la corrección si se requiere.

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DiluciónVolumen

RECUENTO DE PLAQUETAS 

Las plaquetas son pequeños fragmentos del citoplasma de los megacariocitos, lascuales intervienen en el proceso de hemostasis y en el mantenimiento de la integridadvascular.

Debido al tamaño tan pequeño que poseen las plaquetas son difíciles de cuantificar por medios manuales, ya que estas deben distinguirse de los restos celulares que puedangenerarse durante la preparación de la muestra, además que estas pueden agregarse entre sígenerando cúmulos.

Se pueden emplear dos métodos para su cuantificación, el método directo y métodoindirecto.Método directo 

En este método se cuentan las plaquetas por medio de hemocitómetro y una dilución programada, ya sea por dilución en pipeta de Thoma para eritrocitos o mediante el métodoUnopette y se emplea un microscopio de preferencia con contraste de fases, debido altamaño de las plaquetas este método tiene un error mayor que en el recuento de eritrocitos yleucocitos, por lo que ya no debe optarse por este método. Con analizadores automáticos,con principio de impedancia o dispersión de luz además de hacer el conteo de plaquetastambién evalúan el tamaño y si estas están agregadas, haciéndolo un método muy confiable,a menos que la muestra tenga lisis celular. Hoy en día este método también puede realizarsemediante citométria de flujo, por emplear marcadores de membrana específicos de las plaquetas (CD42b=GpIb, CD41=GpIIb/IIIa y CD61=GpIIIa) lo hace un método muyespecifico pero también muy caro por el empleo de anticuerpos monoclonales unidos afluorocromos.

Método indirecto Esté método se realiza en un frotis de sangre venosa. Se deben contar 1000

eritrocitos y las plaquetas que se observen durante esta cuenta, después se realiza elrecuento de eritrocitos totales y se emplea la siguiente fórmula para obtener la cuenta de plaquetas:

Plaquetas/mm3= X cuenta de plaquetas en el frotis

Este método puede servir como un control para el recuento directo pues en este puede apreciarse la cantidad de plaquetas por campo haciendo un estimado y además comose observan los gránulos de las plaquetas se puede distinguir correctamente de los restoscelulares, por lo cual si se llega a emplear este método para cuantificar las plaquetas debeincluirse la nota en el informe de los resultados.

Fundamento La base del recuento manual de plaquetas es la dilución programada y la

 preparación de la muestra con una solución que evite la aglutinación de estas, para posteriormente contar los plaquetas en un volumen determinado por el área contada y la profundidad del hemocitómetro cuando se le coloca un cubreobjetos calibrado yópticamente plano sobre las dos superficies elevadas de la cámara.

Este principio se expresa mediante la siguiente fórmula para obtener la cuenta totalde plaquetas por mm3 de sangre:

Plaquetas/mm3 = N X

Recuento de eritrocitos/mm3 1000

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 N = Número de células contadasVolumen = lado x lado x profundidad = mm3 Dilución = 1:200 ó 1:100

Material   Boquilla 

Pipeta de Thoma para glóbulos rojos  Cámara de Neubauer  Cubrehemocitómetro  Agitador para pipetas de Thoma  Microscopio  Sangre con EDTA

Reactivos   Oxalato de amonio a 1%

Procedimiento 

35. Recolectar 5mL de sangre venosa en un tubo con EDTA, y mezclar por inversióndel tubo.

36. 

Con la pipeta en posición horizontal aspirar sangre hasta la marca de 1.0. El excesode sangre se elimina tocando la punta de la pipeta con una gasa.

37. Limpiar la sangre adherida a las paredes externas de la pipeta con una gasa procurando no tocar la punta de la pipeta.

38. 

Introducir la pipeta en forma vertical en la solución de oxalato de amonio al 1% yaspirar diluyente hasta la marca de 101. Si se aspira mas diluyente se desecha todo

el contenido de la pipeta en un recipiente con cloro y se inicia nuevamente con el paso 2.39. Retirar el adaptador de la boquilla obturando con parafilm la punta de la pipeta para

evitar la pérdida de líquido, colocar parafilm en el extremo opuesto a la punta ymanteniendo la pipeta siempre en posición horizontal se coloca en el agitadormecánico durante 15 minutos.

40. Colocar el cubreobjetos sobre las dos superficies elevadas de la cámara para cubrirlas dos cuadriculas.

41. 

Desechar de las primeras 4 ó 6 gotas de la pipeta para eliminar el diluyente quequeda en el capilar y que no diluye la muestra.

42. Cargar ambos lados de la cámara, manteniendo la pipeta en un ángulo de 45° tocar

con la punta el borde del cubreobjetos donde se junta con la superficie elevada de lacámara. El hemocitómetro se llena por capilaridad, el flujo de llenado debe serconstante y sin que este llene la hendidura en forma de H de la cámara.

43. La cámara cargada se coloca dentro de una caja de Petri cuyo fondo contiene undisco de papel filtro o algodón húmedo para prevenir la evaporación. Se dejasedimentar durante 15-20 minutos.

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10010(0.2mm)2 0.1mm

44. Después de este tiempo se deja reposar 10 minutos más fuera de la caja de petri y secoloca en la platina del microscopio para localizar el cuadro E.

45. Las plaquetas se cuentan en 10 cuadros terciarios mostrados en la Figura 8.

46. El conteo se realiza con el objetivo de 40X. Las plaquetas tienen un aspecto redondou oval y algunas presentan prolongaciones citoplasmáticas y presentan movimientoBrowniano, lo que puede ser útil para distinguirlas de los restos celulares.

47. Calcular el número de plaquetas mediante la siguiente fórmula:

Plaquetas/mm3 = N X N = Plaquetas contadas10 = Número de cuadros terciarios contados(0.2)2 = Área de cada cuadro terciario0.1 = Altura de la cámara100= Dilución de la muestra

Plaquetas/mm3 = N X 25002500 = FactorEste factor variará si cambia el número de cuadros contados.

48. Lavar el material empleado como se indico en la práctica para el recuento deeritrocitos.

Valores de referencia  

150-500 X103/µL

Fig. 8. Se cuenta las plaquetas

contenidas en los 10 cuadrosmarcados en gris en la mismaforma como se explico paraeritrocitos. Si el número de plaquetas contadas es menor a100, se cuentan más cuadrosterciarios hasta registrar por lomenos 100 plaquetas.

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Actividades   Realizar el recuento de plaquetas por el método directo y ajustar el factor si es

necesario.