Manual Sensib

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA POR EL MTODO

DE DISCO DIFUSIN

Serie de NormasTcnicas N 30

Lima - 2002

MI DNI US LT AE SR IO DE

LUDAS ED LANOICA

N OT UTI TSNI

MINISTERIO DE SALUD DEL PERINSTITUTO NACIONAL DE SALUDOrganismo Pblico Descentralizado de Sector Salud

Manual de Procedimientos para la Prueba de Sensibilidad Antimicrobiana por el Mtodo de Disco Difusin

Instituto Nacional de Salud2

MINISTERIO DE SALUDMinistro

Dr. Fernando Carbone Campoverde

Vice-MinistroDr. Oscar Ugarte Ubillz

INSTITUTO NACIONAL DE SALUDJefe

Dr. Luis Fernando Llanos Zavalaga

Sub-JefeDra. Aida Cecilia Palacios Ramrez

Centro Nacional de Laboratoriosde Salud Pblica

Dra. Susana Zurita MacalupDirectora General

Centro Nacional de Alimentaciny Nutricin

Dra. Doris Jhusey SchreiberDirectora General

Centro Nacional de Control de CalidadDra. Rosa Guevara Ormeo

Directora General

Centro Nacional de Produccin de BiolgicosIng. Arnaldo Baquerizo Valladolid

Director General

Programa de Complementacin AlimentariaPara grupos de Mayor Riesgo (PACFO)

Dr. Napolen Chvez VillanuevaDirector General

Oficina Ejecutiva de Informacin CientficaDr. Jorge Barnaby Rodrguez

Comit Editor

PresidenteDra. Aida Palacios Ramrez

Secretario TcnicoDr. Csar Cabezas Snchez

MiembrosDr. Jorge Alarcn VillaverdeQ.F. Zulema Arvalo Chong

Dr. Jorge Barnaby RodrguezDr. Zuo Burstein Rodrguez

Dr. Javier Cieza ZevallosDr. Jos Espinoza Babiln

Lic. Ivn Gmez-Snchez PrietoDr. Eduardo Gotuzzo Herencia

Dr. Alfredo Guilln OneeglioDr. Csar Nquira Velarde

Lic. Margarita Rodrguez GutarraDr. Vctor Surez Moreno

EdicinDr. Leonid Lecca Garca

Sub-Comit Editor

Dr. Vctor Suarez MorenoDr. Carlos Carrillo ParodiDr. Jos Guevara Duncan

Cartula: Frontis del local central deInstituto Nacional de Salud

Esta publicacin se termin de imprimiren Febrero del 2002.

3 Instituto Nacional de Salud


MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA PRUEBA DE SENSIBILIDADANTIMICROBIANA POR EL MTODO DE DISCO DIFUSIN

ELABORACIN:

Rosa Elena Sacsaquispe ContrerasBilogo MicrobilogoLaboratorio de Bacteriologa EspecialCentro Nacional de Laboratorios en Salud PblicaInstituto Nacional de Salud

Jorge Velsquez PomarMdico MicrobilogoInstituto de Investigacin Facultad de MedicinaUniversidad Particular de San Martn de PorresLaboratorio de MicrobiologaHospital Arsobispo Loayza



Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin del INS

COLABORACIN EN LA REVISIN DEL MANUAL:

Instituto Nacional de SaludDr. Vctor Surez MorenoBlga. Microblga. Gladis Ventura EgsquizaBlga. Isabel Arias BustamanteBlga. Susana Daz VelascoBlga. Mara Luz Zamudio Rojas

Instituto de Salud del NioDr. Rito Zerpa Larrauri

Instituto Nacional de Enfermedades NeoplsicasDr. Luis Cuellar Ponce de LenDra. Mara Elena Silva Daz

Hospital Nacional Docente Madre-Nio San BartolomDr. Augusto Valencia RamrezDr. Nazario Silva

Hospital Daniel A. CarrinDr. Jess Chacaltana

Proyecto Viga-MINSADr. Martn Yagui Moscoso

ISBN 9972 - 857 - 18 - 2ISSN 1607 - 4904Hecho el Depsito Legal N 1501012002-0446

Ministerio de Salud, 2002Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jess Mara, Lima, PerTe1f.: 431-0410

Instituto Nacional de Salud, 2002Cpac Yupanqui 1400, Jess Mara, Lima, PerTe1f.: 471-9920 Fax 471-0179e-mail: [email protected] Pgina Web: www.ins.sld.p

Sacsaquispe Contreras, Rosa

Manual de procedimientos para la prueba de sensibilidad antimicrobiana por elmtodo de Disco Difusin / Elaboracin: Rosa Sacsaquispe Contreras y JorgeVelsquez Pomar. -- Lima: Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2002.

68 p. . : il. ; 30 cm. -- (Serie de Normas Tcnicas; 30)

1. TEST DE SENSIBILIDAD MICROBIANA/mtodos 2. TEST DE SENSIBILIDADMICROBIANA/normas 3. MANUALES DE LABORATORIO I. Sacsaquispe Contreras, Rosa II. Velsquez Pomar, JorgeIII. Instituto Nacional de Salud (Per)IV. Per. Ministerio de Salud



CONTENIDOINTRODUCCIN

SECCIN 1 : GENERALIDADES1.1 Objetivo1.2 Campo de aplicacin1.3 Responsabilidades1.4 Documentos de Referencia1.5 Definiciones y abreviaturas

SECCIN 2: MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD2.1 Principales medidas de bioseguridad

SECCIN 3: PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACIN DEL ANTIBIOGRAMA3.1 Valores crticos del antibiograma3.2 Procedimientos de categorizacin3.3 Materiales y equipos3.4 Medios de cultivo y reactivos3.4.1 Medios de cultivo y reactivos necesarios para la prueba3.4.2 Preparacin del Agar Mueller Hinton3.4.3 Preparacin del estndar 0,5 Mc. Farland para el inculo3.4.4 Seleccin de los discos de sensibilidad antibiotica3.5 Inoculacin3.5.1 Preparacin del inculo3.5.2 Inoculacin en placas3.6 Aplicacin de los discos de sensibilidad3.7 Incubacin3.8 Lectura de las placas e interpretacin de los resultados

SECCIN 4: ANTIBIOGRAMA PARA Staphylococcus spp4.1 Medio de cultivo4.2 Inoculo4.3 Discos de sensibilidad antibitica a incluir en el antibiograma4.3.1 Grupo I4.3.2 Grupo II4.3.3 Resistencias naturales4.4 Incubacin4.5 Lectura4.6 Interpretacin de los dimetros crticos4.6.1 Antibiticos y dimetros crticos4.6.2 Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma4.7 Cepa de referencia para el control de calidad interno

SECCIN 5: ANTIBIOGRAMA PARA Enterococcus spp5.1 Medio de cultivo5.2 Inoculo5.3 Discos de sensibilidad antibitica a incluir en el antibiograma5.3.1 Grupo I5.3.2 Grupo II5.3.3 Resistencias naturales5.4 Incubacin5.5 Lectura5.6 Interpretacin de los dimetros crticos5.6.1 Antibiticos y dimetros crticos5.6.2 Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma5.7 Cepa de referencia para el control de calidad interno

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SECCIN 6: ANTIBIOGRAMA PARA Pseudomonas aeruginosa6.1 Medio de cultivo6.2 Inculo6.3 Discos de sensibilidad antibitica a incluir en el antibiograma6.3.1 Grupo I6.3.2 Grupo II6.3.3 Resistencias naturales6.4 Incubacin6.5 Lectura6.6 Interpretacin de los dimetros crticos6.6.1 Antibiticos y dimetros crticos6.6.2 Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma6.7 Cepa de referencia para el control de calidad interno

SECCIN 7: ANTIBIOGRAMA PARA Acinetobacter spp7.1 Medio de cultivo7.2 Inculo7.3 Discos de sensibilidad antibitica a incluir en el antibiograma7.3.1 Grupo I7.3.2 Grupo II7.3.3 Resistencias naturales7.4 Incubacin7.5 Lectura7.6 Interpretacin de los dimetros crticos7.6.1 Antibiticos y dimetros crticos7.6.2 Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma7.7 Cepas de referencia para el control de calidad interno

SECCIN 8: ANTIBIOGRAMA PARA Enterobacteriaceae8.1 Medio de cultivo8.2 Inculo8.3 Discos de sensibilidad antibitica a incluir en el antibiograma8.3.1 Grupo I8.3.2 Grupo II8.3.3 Antibiticos a utilizar en el antibiograma de Salmonella spp y Shigella spp aisladas de coprocultivo8.3.4 Resistencias naturales8.4 Incubacin8.5 Lectura8.6 Interpretacin de los dimetros crticos8.6.1 Antibiticos y dimetros crticos8.6.2 Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma8.7 Deteccin de las enterobacterias productoras de betalactamasa de espectro extendido8.7.1 Test confirmatorio de la presencia de betalactamasas de espectro extendido (segn el NCCLS USA)8.7.2 Tets confirmatorio de la presencia de betalactamasa de espectro extendido (segn el Comit de

Antibiograma de la Sociedad Francesa de Microbiologa)8.7.3 Reporte del antibiograma de las enterobacterias productoras de betalactamasas de espectro extendido8.8 Cepas de referencia para el control de calidad interno

SECCIN 9: ANTIBIOGRAMA DE Streptococcus pneumoniae (NEUMOCOCO)9.1 Medio de cultivo9.2 Inculo9.3 Discos de sensibilidad antibitica a incluir en el antibiograma9.3.1 Grupo I9.3.2 Grupo II

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9.3.3 Resistencias naturales9.4 Incubacin9.5 Lectura9.6 Interpretacin de los dimetros crticos9.6.1 Antibiticos y dimetros crticos9.6.2 Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma9.7 Cepa de referencia para el control de calidad interno

SECCIN 10: ANTIBIOGRAMA PARA Streptococcus spp10.1 Medio de cultivo10.2 Inculo10.3 Discos de sensibilidad antibitica a incluir en el antibiograma10.3.1 Grupo I10.3.2 Grupo II10.3.3 Resistencias naturales10.4 Incubacin10.5 Lectura10.6 Interpretacin de los dimetros crticos10.6.1 Antibiticos y dimetros crticos10.6.2 Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma10.7 Cepa de referencia para el control de calidad interno

SECCIN 11: ANTIBIOGRAMA PARA Haemophilus spp11.1 Medio de cultivo11.2 Inculo11.3 Discos de sensibilidad antibitica a incluir en el antibiograma11.3.1 Grupo I11.3.2 Grupo II11.3.3 Resistencias naturales11.4 Incubacin11.5 Lectura11.6 Interpretacin de los dimetros crticos11.6.1 Antibiticos y dimetros crticos11.6.2 Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma11.7 Cepas de referencia para el control de calidad interno

SECCIN 12: ANTIBIOGRAMA PARA Vibrio cholerae12.1 Medio de cultivo12.2 Inculo12.3 Discos de sensibilidad antibitica a incluir en el antibiograma12.3.1 Grupo I12.3.2 Resistencias naturales12.4 Incubacin12.5 Lectura12.6 Interpretacin de los dimetros crticos12.6.1 Antibiticos y dimetros crticos12.6.2 Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma12.7 Cepas de referencia para el control de calidad interno

SECCIN 13: CONTROL DE CALIDAD INTERNO13.1 Control de calidad de los medios de cultivo13.2 Cepas de referencia para controles de calidad13.3 Procedimientos con las cepas de referencia13.4 Lmites de los dimetros de los halos de inhibicin para el control de calidad13.5 Frecuencia de los controles

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13.5.1 Control diario13.5.2 Control semanal13.5.3 Control mensual13.6 Acciones correctivas13.6.1 Accin correctiva inmediata13.6.2 Accin correctiva adicional

SECCIN 14: REGISTROS

ANEXOS

ANEXO A: CLASIFICACIN DE LOS ANTIBITICOS ACTUALMENTE DISPONIBLES ENEL PER (A EXCEPCIN DE LOS ANTIMICOBACTERIANOS)

ANEXO B: RESUMEN DE LAS CONDICIONES Y CARACTERSTICAS PARA EL MTODODE DISCO DIFUSIN

ANEXO C: MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS - RECOMENDACIONESANEXO D: DETECCIN DE BETALACTAMASAS: MTODO DE NITROCEFINANEXO E. TCNICAS PARA LA OBTENCIN DE LA CONCENTRACIN INHIBITORIA

MNIMAANEXO F: CONCENTRACIONES CRTICAS DE LOS ANTIBITICOS PARA SU

CATEGORIZACIN SEGN LOS RESULTADOS DE LA DETERMINACINDE LA CONCENTRACIN INHIBITORIA MNIMA

ANEXO G: MODELO DE REGISTRO DE RESULTADOSANEXO H: CONSERVACIN DE CEPAS BACTERIANAS REFERENCIALES (Escherichia

coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis pseudomonas aeruginosa)

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INTRODUCCION

El diagnstico y tratamiento de un paciente son muy complejos. Desde su llegada a un establecimiento de saludhasta el alta reciben la prestacin de muchos profesionales. Esto a su vez genera diferentes procesos, siendo ellaboratorio uno de los ms importantes. Para que los resultados de laboratorio sean tiles en el manejo del pacien-te, debemos asegurar la confiabilidad y validez de stos. Es necesario entonces, asegurar el cumplimiento adecua-do de todos los pasos involucrados, desde la solicitud del tipo de examen y muestra, su transporte, procesamiento,la emisin de un resultado, y la adecuada interpretacin de ste. De un examen solicitado y mal orientado, seobtendr una muestra inadecuada y por tanto una informacin errada. El control de estos procesos es lo que seconoce como programa de garanta de calidad. Para ello, es necesario contar con Normas que marquen las pautasy estandaricen las tcnicas entre los diferentes laboratorios.

La resistencia bacteriana es un tema de importancia en la salud pblica. Su extensin a nivel mundial, desarrollo deresistencia a nuevos agentes antimicrobianos, as como su presencia en patgenos relacionados con enfermeda-des prevalentes, como son la enfermedad diarreica aguda, las infecciones respiratorias agudas y las infeccionesintrahospitalarias, le dan el carcter de problema prioritario. Por ello, el conocimiento de los perfiles de susceptibili-dad antimicrobiana debe orientar a la elaboracin de esquemas de tratamiento ms eficaces y adems, la informa-cin proporcionada por la vigilancia debe servir de insumo para la elaboracin de un programa de uso racional deantibiticos.

Considerando estos aspectos preliminares, se desprende que la vigilancia de la resistencia antimicrobiana es nece-saria, pero es fundamental asegurar la calidad de los resultados de laboratorio, siendo indispensable por tanto,estandarizar los procedimientos, ello involucra desarrollar normas tcnicas, capacitar al personal de los laboratoriosy supervisar y participar en un programa de control de calidad externo. Por ello, el Instituto Nacional de Salud se haabocado a la ardua tarea de recabar la informacin disponible y validada para sistematizarlas y presentarlas enManuales de Procedimientos que sirvan como instrumentos para estos procesos.

Una de las escuelas de mayor influencia en el rea de evaluacin de la susceptibilidad antimicrobiana es la ameri-cana, que cuenta con la Norma editada anualmente por el National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS). Este Manual que presentamos a continuacin, toma como base estas normas. Tiene un carcter prcticoy permite hacer consultas de acuerdo a la bacteria con la que se esta trabajando. Un elemento importante es que seestablece cuales son los antibiticos que deben ser evaluados para cada bacteria, ubicndolos en dos categoras,siendo la primera la que debe hacerse de manera obligatoria. Con ello aseguramos una evaluacin completa yracional de la susceptibilidad antibitica. Sin embargo, debemos recordar que el reporte de la sensibilidad a algunosantibiticos puede inducir el uso indiscriminado de estos. Por ello, si bien la evaluacin de todos los antibiticos esnecesaria, el reporte de todos o solo algunos de ellos, es decisin de cada hospital, basndose en las estrategias decontrol y uso racional de los mismos. Otro aspecto importante es que, considerando que el clnico es el usuario delos resultados de sensibilidad, se ha realizado un taller para la revisin del Manual con la participacin de losresponsables de la vigilancia de las infecciones intrahospitalarias, junto con los responsables de laboratorio. Cree-mos que esto le da un valor agregado al documento, adems del compromiso de actualizacin peridica.

Confiamos que el presente Manual pueda satisfacer las expectativas de los profesionales interesados y se convier-ta en una herramienta til en el proceso de estandarizacin de los procedimientos de laboratorio.



SECCIN 1

GENERALIDADES

1.1. OBJETIVO

Describir los procedimientos para la determinacin de la susceptibilidad antimicrobiana mediante elmtodo de disco difusin ( Kirby Bauer)

1.2. CAMPO DE APLICACIN

1.2.1. Comprende la determinacin de la susceptibilidad antibitica mediante el mtodo de disco difusin(Kirby Bauer) e interpretacin de los resultados, de las bacterias que a continuacin se sealan :

1.2.1.1. Staphylococcus spp

1.2.1.2. Enterococcus spp

1.2.1.3. Pseudomonas aeruginosa

1.2.1.4. Acinetobacter spp

1.2.1.5. Enterobacterias

1.2.1.6. Streptococcus pneumoniae

1.2.1.7. Streptococcus spp

1.2.1.8. Haemophilus spp

1.2.1.9. Vibrio cholerae

1.2.2. Se aplica en los laboratorios de Microbiologa del Instituto Nacional de Salud (INS), establecimientosde la Red Nacional de Laboratorios en Salud Pblica, Laboratorios de las Fuerzas Armadas y deESSALUD.

1.3. RESPONSABILIDADES

1.3.1. El Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pblica (CNLSP) a travs de su Direccin Ejecutiva deLaboratorios de Referencia, es responsable de autorizar la elaboracin, revisin y actualizacin delpresente Manual, de acuerdo a los procedimientos aprobados por el Instituto Nacional de Salud (INS).

1.3.2. Los Directores de los establecimientos de salud, son responsables de autorizar el aprovisionamientode recursos necesarios para el cumplimiento del presente manual de procedimientos, as como de-signar al personal idneo y calificado para realizar las disposiciones contenidas en el mismo.

1.3.3. El personal de los establecimientos de salud, es responsable de planificar las acciones, organizar,controlar y capacitar al personal para cumplir las disposiciones contenidas en el presente Manual.



1.3.4. Los jefes o responsables de los laboratorios, deben asegurar el control interno de la calidad, laidoneidad del personal, equipos, materiales, reactivos e instalaciones.

1.3.5. El personal mdico, tcnico y operativo, es responsable de seguir las especificaciones contenidas enel presente Manual y aplicar los procedimientos especficos indicados.

1.4. DOCUMENTOS DE REFERENCIA

1.4.1. Instituto Nacional de Salud. MANUAL DE NORMAS DE BIOSEGURIDAD. Serie de Normas Tcni-cas N 18. Diciembre de 1997.

1.4.2. NCCLS. Performance standards for antimicrobial disk Susceptibility Test: Approved Standard. SeventhEdition M2-A7. Vol. 20 N1 2000.

1.4.3. NCCLS. Performance standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Eleventh InformationalSupplement M100-S11. Vol. 21 N1 January 2001.

1.4.4. Comit de lantibiogramme de la Societ Franaise de Microbiologie. Communiqu 2000 2001.

1.4.5 Recomendaciones de la Mesa Espaola de Normalizacin de la Sensibilidad y Resistencia alos Antimicrobianos (MENSURA). 2000

1.5. DEFINICIONES Y ABREVIATURAS

Para los propsitos del presente manual de procedimientos se aplican las siguientes definiciones:

1.5.1 antibitico: Agente biolgico o qumico que inhibe el crecimiento de los microorganismos.

1.5.2 ATCC: American Type Culture Collection.

1.5.3 bioseguridad: Conjunto de medidas preventivas para proteger la salud y la seguridad humana y delambiente, frente a diferentes riesgos producidos por agentes biolgicos, fsicos, qumicos o mecnico.

1.5.4 cepa: Cultivo puro formado por bacterias descendientes de un solo aislamiento.

1.5.5 colonia: Crecimiento visible bacteriano, generalmente en medios slidos, originada por la multiplicacinde una sola bacteria preexistente.

1.5.6 concentracin inhibitoria mnima (CIM): Corresponde a la concentracin ms dbil de un antibiticocapaz de inhibir el crecimiento visible de una cepa bacteriana al cabo de 18 24 horas de incubacin.

1.5.7 crioconservacin: Congelamiento y almacenamiento de clulas vivas a muy bajas temperaturas

1.5.8 disco de sensibilidad: Discos impregnados con algn antimicrobiano usados para determinar lasusceptibilidad antimicrobiana por disco difusin.

1.5.9 escala de Mc. Farland: Estndar de turbidez de sulfato de bario. La escala usada para el inculo delas pruebas de susceptibilidad por el mtodo de disco difusin es 0.5.

1.5.10 esterilizacin: Proceso validado que permite la eliminacin de toda forma de vida microbiana incluyendoendosporas bacterianas. Puede conseguirse por medio de mtodos qumicos, fsicos o gaseosos.



1.5.11 incubacin: Mantenimiento de cultivos bacterianos en condiciones favorables para su desarrollo ymultiplicacin.

1.5.12 inculo: Alcuota de un cultivo bacteriano transferida a un medio de cultivo.

1.5.13 intermedio (i): Categora clnica definida para las pruebas de susceptibilidad in vitro. Esta categoraincluye las cepas bacterianas que pueden ser inhibidas por concentraciones del antibitico superioresa las obtenidas con las dosis habituales, siempre y cuando se puedan aumentar las dosis empleadasy/o que el antibitico se concentre fisiolgicamente en el tejido o lugar infectado.

1.5.14 medio de cultivo: Medio artificial de sustancias nutritivas, que puede ser slido, semislido o lquido,necesarias para el crecimiento y multiplicacin bacteriana in vitro.

1.5.15 microaeroflico: Organismo que crece y se reproduce mejor en la presencia de una tensin de 5%de oxgeno, 10% de anhdrido carbnico y 85% de nitrgeno.

1.5.16 reconstituir: Restablecer la forma original de una sustancia previamente alterada para su conservaciny almacenamiento, mediante la combinacin con un lquido adecuado.

1.5.17 registro: Documento que provee evidencias objetivas de las actividades efectuadas o de los resultadosobtenidos.

1.5.18 resistente (R): Categora clnica definida para las pruebas de susceptibilidad in vitro. Las cepasbacterianas incluidas en esta categora no son inhibidas por las concentraciones sricas del antibiticonormalmente alcanzadas con las dosis habituales del mismo, poseen comnmente mecanismosespecficos de resistencia bacteriana o la eficacia clnica del antibitico frente a la bacteria no ha sidocomprobada.

1.5.19 sensible (S): Categora clnica definida para las pruebas de susceptibilidad in vitro. Implica que unainfeccin debida a la cepa bacteriana estudiada puede ser tratada apropiadamente con la dosis deantibitico recomendada para el tipo de infeccin y la especie infectante, a menos que existancontraindicaciones.

1.5.20 UFC: Unidad formadora de colonias.

SECCIN 2

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

2.1 PRINCIPALES MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

2.1.1 El personal involucrado en los diferentes procesos debe aplicar las medidas de bioseguridad estable-cidas en las Normas de Bioseguridad (Serie Normas Tcnicas N 18-INS), aplicable al personal, usoy desecho de sustancias y materiales, acceso a los locales , y el medio ambiente. Las bacteriasmencionadas en el presente manual corresponden trabajarlas a un nivel de bioseguridad 2.

2.1.2 La principales medidas de bioseguridad incluyen:

2.1.2.1 Ingreso restringido al laboratorio.



2.1.2.2 Utilizar siempre guardapolvo o mandilones de laboratorio en la zona de trabajo.

2.1.2.3 El guardapolvo no debe de salir de la zona del laboratorio, salvo para enviarlo a lavar.

2.1.2.4 No pipetear con la boca.

2.1.2.5 Est prohibido comer, beber, fumar, guardar alimentos, ni aplicarse cosmticos en el laboratorio.

2.1.2.6 En caso de tener cabello largo, recogerlo y cubrirlo.

2.1.2.7 Lavarse las manos luego de quitarse los guantes y antes de salir del laboratorio.

2.1.2.8 Utilizar proteccin para los ojos cuando el procedimiento genere gotas o aerosoles.

2.1.2.9 Utilizar siempre guantes estriles y mascarillas.

2.1.2.10 Las cortaduras o rasguos en las manos y brazos deben protegerse bien.

2.1.2.11 Utilizar zapatos protectores que cubran completamente los pies (no usar sandalias o zapatos abiertos).

2.1.2.12 El procesamiento de las muestras debe realizarse sobre una superficie de trabajo cubierta con papelabsorbente plastificado o papel de filtro.

2.1.2.13 Las superficies de trabajo deben ser descontaminadas por el operador antes y despus de cadaactividad.

2.1.2.14 Los reactivos deben estar etiquetados y almacenados en viales adecuados con tapa rosca.

2.1.2.15 Todos los laboratorios deben tener a disposicin un equipo de primeros auxilios.

2.1.2.16 Informar inmediatamente cualquier accidente al jefe de laboratorio.

2.1.2.17 Debe disponer de un lugar para el lavado de ojos en caso de exposicin accidental a salpicaduras.

2.1.2.18 Todos los desechos del laboratorio deben descontaminarse adecuadamente, antes de eliminarlos ensolucin desinfectante o ser autoclavados a 121C durante 20 minutos, o incinerarse.

2.1.2.19 El material infeccioso debe ser fcilmente identificado como tal y ser esterilizado lo antes posible.

2.1.2.20 Limpiar a diario los pisos con un trapeador limpio y solucin desinfectante.

SECCIN 3

PROCEDIMIENTOS PARA LA REALIZACION DEL ANTIBIOGRAMA

3.1 VALORES CRTICOS DEL ANTIBIOGRAMA

Los valores de las concentraciones y de los dimetros crticos que delimitan las categoras sensible,intermedio y resistente (S, I, R), son el resultado de la integracin de un conjunto de elementos: la



distribucin de las CIM para diversas poblaciones de cepas sensibles y resistentes, las concentracio-nes sricas y tisulares de los antibiticos, la confrontacin de los resultados in vitro y de los resulta-dos clnicos, as como la variabilidad estadstica de los mtodos utilizados.

3.2 PROCEDIMIENTO DE CATEGORIZACIN

3.2.1 Para los principales antibiticos, los valores crticos de las concentraciones bajas (c) y altas (C) y desus dimetros correspondientes (d, D), permiten la categorizacin segn los siguientes criterios (Tabla1):

3.2.2 Por otra parte la lectura interpretativa del antibiograma, fundada en el conocimiento de losantibiofenotipos de sensibilidad y resistencia permite recategorizar un resultado inicialmente S en I o Rdebido al riesgo de fracaso teraputico. Esta lectura interpretativa requiere la identificacin correctade la bacteria y una correcta realizacin del antibiograma.

3.3 MATERIALES Y EQUIPOS

3.3.1 Todos los equipos utilizados en el procesamiento de las muestras clnicas deben estar en condicio-nes ptimas. El correcto funcionamiento de los instrumentos y equipos nos asegura la garanta de lacalidad, as como el mantenimiento de buenas prcticas de seguridad tiene una importante influenciasobre el trabajo y productividad global del laboratorio, pues si un equipo o instrumental se daa por algnmotivo puede haber una interrupcin del ritmo de trabajo y una demora en la emisin de los resultados.

3.3.2 Recomendaciones Generales

3.3.2.1 Cada instrumento tiene sus propias caractersticas y por lo tanto indicaciones especificas de mante-nimiento y su respectivo control de calidad; sin embargo, hay recomendaciones generales que sonaplicables a todo equipo de laboratorio como:

a. Precauciones elctricas:

Todo equipo elctrico debe estar apropiadamente conectado a tierra y no sobrecargar los circuitos,as como debe controlarse al menos una vez al ao o cada vez que se va a conectar un nuevoequipo a la lnea de electricidad.

Los equipos de funcionamiento continuo como estufas, refrigeradoras, congeladores etc debenconectarse a un generador electrgeno de emergencia.

Designar a una persona para que se encargue del mantenimiento preventivo de un determinado equipo.

Tabla 1. Categorizacin

Categoras Concentracin inhibitoria mnima Dimetro del halo de (mg/L) inhibicin (mm)

S CIM c DHI D R CIM > C DHI < d I c < CIM C d DHI < D



El personal de laboratorio debe informar de cualquier choque elctrico con el uso de un aparato.

Los cordones de los equipos deben controlarse en forma regular .

b. Limpieza de las superficies externas:

Uilizar toallas de material suave embebidas con alguna solucin desinfectante como alcohol de70%, desinfectante fenlico correctamente diluido otro desinfectante cualquiera.

Si se usa desinfectante, enjuagar profundamente con agua para retirar los residuos de la solucinde limpieza, sobre todo si se usa hipoclorito de sodio para evitar corrosiones.

c. Actividades dependientes de la Temperatura:

En los equipos que funcionan con regulacin trmica se deben de tener en cuenta las toleranciasrecomendadas para cada equipo: incubadoras ( 1C), baos de agua ( 1C), refrigeradoras (4-8C), congeladores estndar ( 5C), autoclaves empleados en microbiologa 121C/ 15 min ( 1C),y en cabinas de bioseguridad (tener en cuenta que la velocidad del flujo de aire debe estar entre loslmites de tolerancia de 45 55 pies/min). Adems en este ltimo, el flujo de aire, luz UV y el filtrodeben ser verificado cada 6 meses.

3.3.3 Equipos

3.3.3.1 Potenciometro pH metros

3.3.3.2 Incubadoras

3.3.3.3 Refrigeradores

3.3.3.4 Autoclave

3.3.3.5 Cabinas de bioseguridad

3.3.3.6 Bao mara

3.3.3.7 Espectrofotmetro o Fotocolormetro

3.3.3.8 Vortex (digitador para tubos)

3.3.4 Materiales

3.3.4.1 Vernier o Regla

3.3.4.2 Termmetros

3.3.4.3 Pinza punta plana

3.3.4.4 Placas petri



3.3.4.5 Erlenmeyer

3.3.4.6 Hisopos de Algodn

3.3.4.7 Tubos con Tapa Rosca

3.3.4.8 Pipetas

3.4 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

3.4.1 Medios de cultivo y reactivos necesarios para la prueba

3.4.1.1 Agar Mueller Hinton

3.4.1.2 Caldo Mueller Hinton

3.4.1.3 Agar Mueller Hinton con 5% de sangre de carnero

3.4.1.4 Haemophilus test medium (HTM)

3.4.1.5 Discos de sensibilidad antibitica

3.4.1.6 Cloruro de Bario (BaCl2)

3.4.1.7 cido Sulfrico (H2SO4)

3.4.2 Preparacin del Agar Mueller Hinton

3.4.2.1 Preparar el medio a partir de la base deshidratada de acuerdo a las indicaciones del fabricante.

3.4.2.2 Autoclavar y dejar enfriar en bao de agua hasta que alcance los 45C - 50C.

3.4.2.3 Una vez esterilizado y solidificado, medir el pH del agar . El valor del mismo debe encontrarse entre7,2 y 7,4 a temperatura ambiente. Esta medicin puede realizarse:

a. Utilizando un electrodo de superficie

b. Macerando el medio en agua destilada y utilizando un electrodo de inmersin

c. Solidificando el agar con el electrodo del potenciometro

3.4.2.4 Repartir el medio en placas petri (60 ml 70 ml o 25 ml 30 ml, para placas de 150 mm o 100 mmde dimetro interno respectivamente), de manera que el grosor del agar en la placa sea de 4 mm.

3.4.2.5 Realizar las pruebas de esterilidad para cada lote de Mueller Hinton, incubando una o dos placas decada lote a 30C 35C durante 24 horas o ms. Estas placas utilizadas deben ser, luego, descartadas.

3.4.3 Preparacin del estndar (0,5 Mc. Farland) para el inculo

3.4.3.1 Para estandarizar la densidad del inculo se usa una suspensin de sulfato de bario (0,5 de la escalade Mac Farland) como estndar.



3.4.3.2 Preparacin del estndar de turbidez.

a. Agregar 0,5 ml de una solucin de BaCl2 0,048 M (BaCl22H2O al 1,175% P/V) a 99,5 mL de unasolucin de H2SO4 0,18 M (0,36 N) (1% V/V) en constante movimiento para mantener la suspensin.

b. Verificar la densidad correcta del estndar usando un fotocolormetro espectrofotmetro, cuyaabsorbancia a 625 nm es 0,08 a 0,10 para el estndar 0,5 de Mc. Farland.

c. Distribuir de 4 ml a 6 ml en tubos con tapa de rosca o tapn de jebe, similares a los que se usarnpara preparar el inculo.

d. Ajustar bien las tapas o tapones y conservarlos en la oscuridad a temperatura ambiente y anotar lafecha de preparacin.

e. Antes de ser usado agitar vigorosamente dicho estndar de preferencia, en un agitador mecnico.

f. Verificar mensualmente la densidad de los estndares de sulfato de bario, y reemplazarlo cuando seanecesario.

3.4.4 Seleccin de los discos de sensibilidad antibitica

3.4.4.1 En el presente documento se establece la relacin de los discos de antibiticos que debern serutilizados en los antibiogramas de rutina, segn las diferentes bacterias o grupos bacterianos, ascomo la modalidad del reporte de los mismos por parte de los laboratorios de Microbiologa. Laseleccin de los antibiticos que figuran en esta relacin ha sido realizada teniendo en cuenta lossiguientes criterios:

a. Eficacia clnica documentada.

b. Representatividad de una familia de antibiticos.

c. Disponibilidad de criterios tcnicos fiables para la determinacin in vitro de su eficacia clnica.

d. Estabilidad de la molcula en los discos para antibiograma.

e. Presencia en el mercado nacional.

f. Importancia para la vigilancia de la resistencia bacteriana.

3.4.4.2 Los antibiticos han sido distribuidos para este efecto en dos grupos:

a. Grupo 1: En este grupo se encuentran los antibiticos de base indispensables para orientar eltratamiento de las diferentes infecciones, cuya inclusin en el antibiograma y reporte de los mismoses de carcter OBLIGATORIO (Ver seccin de el agente).

b. Grupo 2: Este grupo rene antibiticos complementarios cuya inclusin en el antibiograma y reportees de carcter OPCIONAL, pues depende de los esquemas de antibioterapia vigentes en cadahospital y de la epidemiologa local de la resistencia bacteriana (Ver seccin de cada agente).



3.5 INOCULACIN

3.5.1 Preparacin del inculo

Puede realizarse de dos formas:

3.5.1.1 Mtodo de desarrollo previo

a. Seleccionar cuatro a cinco colonias bien aisladas, del mismo tipo morfolgico, de un cultivo en placa.

b. Tocar la superficie de cada colonia con una asa de siembra y transferirlo a un tubo que contiene de 4a 5 mL de caldo apropiado (Ej. Caldo Tripticasa soya).

c. Incubar el caldo a una temperatura entre 35C a 37C, hasta que alcance o exceda la turbidez delestndar 0,5 de la escala de Mc. Farland (por lo general de 2 a 6 horas).

d. Ajustar la turbidez del inculo con solucin salina o caldo apropiado hasta el tubo 0.5 de la escala deMc. Farland, por comparacin visual con el estndar. Para realizar este paso correctamente usar unaluz apropiada y mirar los tubos contra un fondo blanco con lneas negras como contraste.

e. La suspensin preparada contendr aproximadamente 1 a 2 x 108 UFC/mL para E. coli ATCC 25922.

3.5.1.2 Mtodo directo de inoculacin a partir de colonias aisladas

a. De una placa de cultivo con agar no selectivo e incubada por 18 - 24 h, seleccionar colonias aisladasy preparar una suspensim directa en solucin salina caldo.

b. La suspensin debe ser inmediatamente ajustada a la escala 0,5 de Mc. Farland.

3.5.2 Inoculacin de las Placas

3.5.2.1 Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez del inculo, sumergir un hisopo estril enla suspensin, rotar el hisopo varias veces presionando firmemente sobre la pared interior del tubopor encima del nivel del lquido para remover el exceso de inculo.

3.5.2.2 Inocular la superficie seca de la placa de Mueller Hinton, estriando con el hisopo en tres direccionespara asegurar una distribucin uniforme del inculo (Figura 1). Antes de colocar los discos dejarsecar la placa a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos para que cualquier exceso de humedadsuperficial sea absorbido.

Figura 1. Direcciones en el sembrado del inculo sobre la superficie del agar



3.6 APLICACIN DE LOS DISCOS

3.6.1 Colocar los discos individuales o multidiscos sobre la superficie del agar con la ayuda de una pinzaestril o la punta de una aguja presionando suavemente sobre cada disco para asegurar un contactocompleto con la superficie del agar.

3.6.2 Distribuir los discos uniformemente, de modo que estn a una distancia mnima de 25 mm uno delotro (el dimetro de los discos segn las normas de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) debeser de 6 mm). No deben colocarse ms de 12 discos en una placa de 150 mm, ni ms de 6 en unaplaca de 100 mm de dimetro interno, para evitar la superposicin de las zonas de inhibicin. Undisco no debe ser removido una vez que tom contacto con la superficie del agar debido a quealgunos antibiticos se difunden rpidamente.

3.7 INCUBACIN

3.7.1 Incubar lar placas en posicin invertida a 35C dentro de los 15 minutos posteriores a la aplicacinde los discos.

3.7.2 Las placas de Haemophilus spp y Streptococcus spp, deben ser incubadas en atmsfera del 5% de CO2.

3.7.3 Despus del tiempo recomendado de incubacin (Anexo B) examinar cada placa y medir los dime-tros de los halos de inhibicin alrededor de cada disco. En los casos de Staphylococcus spp yEnterococcus spp el tiempo de incubacin debe prolongarse por 24 horas para una mejor deteccinde la resistencia a Oxacilina y Vancomicina, respectivamente.

3.8 LECTURA DE LAS PLACAS E INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS

3.8.1 Medir los dimetros de las zonas de inhibicin completa (incluyendo el dimetro del disco), usandouna regla o calibrador. Se debe mantener iluminada la parte posterior de la placa petri con una luzreflejada localizada a unos cuantos centmetros sobre un fondo negro. Tener la precaucin de obser-var la placa siguiendo una vertical directa para evitar una lectura errnea de las marcas de la reglapor efecto de paralelismo. En los medios suplementados con sangre, las zonas son medidas en laparte superior de la superficie del agar y retirando la tapa. Tener cuidado de no medir la zona de lahemlisis sino la de inhibicin del crecimiento.

3.8.2 Para Staphylococcus spp o Enterococcus spp, usar luz transmitida ,manteniendo la placa arriba de laluz para examinar un posible ligero crecimiento de cepas resistentes a Oxacilina/Meticilina oVancomicina dentro de los halos aparentes de inhibicin. Cualquier desarrollo dentro de la zona deinhibicin es indicativo de resistencia a Meticilina (Oxacilina) o Vancomicina.

3.8.3 El punto final debe tomarse como el rea que no muestra un crecimiento obvio, visible, que puede serdetectado mediante observacin visual, no incluyendo velo de crecimiento o colonias muy pequeasque puedan ser detectadas solo con mucha dificultad en el borde de la zona. Sin embargo las colo-nias mayores creciendo dentro de la zona clara debern ser subcultivadas, reidentificadas yreensayadas. Algunos Proteus spp, debido a su gran movilidad, pueden presentar un velo de inva-sin o swarming dentro de las zonas de inhibicin de algunos antibiticos. En estos casos el velo delswarming debe ser ignorado al momento de medir los halos de inhibicin.



3.8.4 Cuando se prueban discos de Cotrimoxazol puede arrastrarse sustancias antagnicas que producenun crecimiento con aspecto de niebla dentro de la zona del halo de inhibicin, en estos casos noconsiderar en la lectura un crecimiento del 20% o menos del desarrollo total.

3.8.5 Los dimetros de inhibicin son interpretados basndose en las Tablas N 1 al 9. La sensibilidad dela cepa bacteriana ser reportada como sensible (S), intermedio (I), o resistente (R).

SECCIN 4

ANTIBIOGRAMA PARA Staphylococcus spp

4.1 MEDIO DE CULTIVO

Agar Mueller Hinton

4.2 INCULO

Suspensin directa de la colonia en caldo Mueller Hinton o solucin salina al 0.9 % a partir de uncultivo en agar no selectivo de 18 24 h de incubacin. Ajustar a la turbidez equivalente al estndar0,5 de la escala de Mc. Farland.

4.3 DISCOS DE SENSIBILIDAD ANTIBITICA A INCLUIR EN EL ANTIBIOGRAMA

4.3.1 Grupo I:

4.3.1.1 Oxacilina

4.3.1.2 Penicilina

4.3.1.3 Eritromicina

4.3.1.4 Clindamicina

4.3.1.5 Cotrimoxazol (Trimetoprim/Sulfametoxazol)

4.3.1.6 Vancomicina

4.3.1.7 Gentamicina

4.3.1.8 Ciprofloxacina

4.3.2 Grupo II:

4.3.2.1 Cloramfenicol.

4.3.2.2 Rifampicina.



4.3.2.3 Tetraciclina.

4.3.2.4 Teicoplanina

4.3.2.5 Nitrofurantona(1)

4.3.2.6 Norfloxacina(1)

(1) Disco utilizado exclusivamente en cepas provenientes de infecciones de las vas urinarias

4.3.3 Resistencias Naturales

4.3.3.1 Los estafilococos son resistentes a cido Nalidxico, cido Pipemdico y Aztreonam

4.3.3.2 Staphylococcus saprophyticus es resistente a Fosfomicina y Novobiocina

4.3.3.3 Staphylococcus cohnii y Staphylococcus xylosus son resistentes a Novobiocina y a Lincomicina

4.4 INCUBACIN

35C

4.5 LECTURA

A las 16 18 h. A las 24 h para el disco de Oxacilina

4.6 INTERPRETACIN DE LOS DIMETROS CRTICOS

4.6.1 Antibiticos y dimetros crticos

Tabla 2. Antibiticos y Dimetros Crticos para Staphylococcus spp.

ANTIMICROBIANO CONTENIDO DEL DIAMETRO EN mm DISCO R I S

PENICILINASPenicilina 10 unidades 28 - 29Oxacilina (S. Aureus) 1 g 10 11-12 13(Estafilococos coagulasa negativos) 1 g 17 - 18GLICOPEPTIDOSVancomicina 30 g - - 15Teicoplanina 30 g 10 11-13 14AMINOGLUCOSIDOSGentamicina 10 g 12 13-14 15FLUOROQUINOLONASNorfloxacina 10 g 12 13-16 17Ciprofloxacina 5 g 15 16-20 21TETRACICLINATetraciclina 30 g 14 15-18 19MACROLIDOSEritromicina 15 g 13 14-22 23LINCOSAMIDASClindamicina 2 g 14 15-20 21OTROSCloramfenicol 30 g 12 13-17 18Rifampicina 5 g 16 17-19 20Nitrofurantona 300 g 14 15-16 17Trimetoprim/sulfametoxazol 1.25/23.75g 10 11-15 16



4.6.2 Reglas para la lectura e interpretacin del antibiograma

4.6.2.1 Disco de Penicilina:

El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Penicilina es vlido tambin para Ampicilinay Amoxicilina.

4.6.2.2 Disco de Oxacilina:

a. El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Oxacilina es vlido tambin para Dicloxacilinay Cloxacilina.

b. La resistencia a Oxacilina seala una resistencia cruzada a todas las penicilinas (asociadas o no a inhibidoresde betalactamasas), cefalosporinas de todas las generaciones y carbapenems, sin excepcin.

c. Las cepas resistentes a Penicilina y sensibles a Oxacilina son sensibles a las penicilinas asociadas alos inhibidores de betalactamasas, a las cefalosporinas y a los carbapenems.

d. El disco de Oxacilina no debe incluirse en el antibiograma de Staphylococcus saprophyticus pues confrecuencia al utilizar los dimetros crticos vlidos para los otros estafilococos coagulasa negativos,se le clasifica incorrectamente como resistente a este antibitico.

4.6.2.3 Disco de Tetraciclina:

El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Tetraciclina es vlido tambin para Doxiciclinay Minociclina.

4.6.2.4 Disco de Eritromicina:

El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Eritromicina es vlido tambin para laAzitromicina, Claritromicina y Roxitromicina.

4.6.2.5 Disco de Ciprofloxacina:

El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Ciprofloxacina es vlido tambin para laOfloxacina y Levofloxacina.

4.6.2.6 Disco de Vancomicina:

Si se tiene una zona de inhibicin de 14 mm o menos, se recomienda la medicin de la CIM de esteantibitico para descartar una posible sensibilidad disminuida (Ver Anexo E).

4.7 CEPA DE REFERENCIA PARA EL CONTROL DE CALIDAD INTERNO

Staphylococcus aureus ATCC 25923



SECCION 5

ANTIBIOGRAMA DE Enterococcus spp.


Agar Mueller Hinton

5.2 INOCULO

Mtodo del crecimiento o suspensin directa de la colonia.


5.3.1 Grupo I:

5.3.2.1 Ampicilina

5.3.2.2 Gentamicina (disco con contenido de 120 mg)

5.3.2.3 Estreptomicina (disco con contenido de 300 mg)

5.3.2.4 Vancomicina

5.3.2 Grupo II:


5.3.2.2 Rifampicina

5.3.2.3 Cloramfenicol

5.3.2.4 Tetraciclina




5.3.2.8 Ciprofloxacina(1)

5.3.2.9 Levofloxacina(1)

(1) Disco utilizado exclusivamente en cepas provenientes de infecciones de las vas urinarias



5.3.3 Resistencias Naturales

5.3.3.1 Los enterococos son resistentes a oxacilina, cefalosporinas, Clindamicina, y Cotrimoxazol.

5.3.3.2 Los enterococos presentan una resistencia de bajo nivel a los aminoglucsidos, lo cual no suprime lasinergia con los betalactmicos, por tanto deben utilizarse discos con mayores concentraciones deantibitico que las habituales buscando detectar una resistencia de alto nivel que si elimina el efectosinrgico.

5.3.3.3 Enterococcus gallinarum y Enterococcus casseliflavus son resistentes a los glicopptidos.

5.4 Incubacin

35C

5.5 Lectura

A las 16 18 h. A las 24 h para el disco de Vancomicina



ANTIMICROBIANO CONTENIDO DEL DIAMETRO EN MM DISCO R I S

PENICILINAS

Ampicilina 10 g 16 - 17GLICOPEPTIDOS

Vancomicina 30 g 14 15-16 17Teicoplanina 30 g 10 11-13 14AMINOGLUCOSIDOS

Gentamicina 120 g 6 7 9 10

Estreptomicina 300 g 6 7 9 10

FLUOROQUINOLONAS

Ciprofloxacina 5 g 15 16-20 21Levofloxacina 5 g 13 14-16 17Norfloxacina 10 g 12 13-16 17TETRACICLINA

Tetraciclina 30 g 14 15-18 19MACROLIDOS

Eritromicina 15 g 13 14-22 23OTROS

Rifampicina 5 g 16 17-19 20Nitrofurantona 300 g 14 15-16 17

Tabla 3. Antibiticos y dimetros crticos para Enterococcus spp.




5.6.2.1 Disco de Ampicilina:

a. Si la cepa es sensible a Ampicilina lo es tambin a Penicilina, la Amoxicilina, asociaciones de penici-linas e inhibidores de betalactamasas, e Imipenem.

b. En caso de resistencia a Ampicilina, se recomienda la realizacin del test de la nitrocefina para ladeteccin de una penicilinasa. Esta resistencia enzimtica a Ampicilina (test de la nitrocefina positivo)es cruzada con Penicilina y Amoxicilina.

5.6.2.2 Discos de Vancomicina y Teicoplanina:

Si la cepa es intermedia a Vancomicina y/o Teicoplanina, se recomienda la medicin de la CIM deestos antibiticos para descartar una posible resistencia (Ver anexo E)

5.6.2.3 Discos de Gentamicina y Estreptomicina:

Si la cepa es intermedia a Gentamicina y/o Estreptomicina, se recomienda la medicin de la CIM deestos antibiticos para descartar una posible resistencia de alto nivel (Ver anexo E).


El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Tetraciclina es vlido tambin para Doxiciclinay Minociclina.


El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Eritromicina es vlido tambin para Azitromicina,Claritromicina y Roxitromicina.


Staphylococcus aureus ATCC 25923

SECCIN 6

ANTIBIOGRAMA PARA Pseudomonas aeruginosa


Agar Mueller Hinton.

6.2 INOCULO

Mtodo del crecimiento o suspensin directa de la colonia. Ajustar a la turbidez equivalente al estndar0,5 de la escala de Mc. Farland.




6.3.1 Grupo I:

6.3.1.2 Ceftazidima

6.3.1.3 Imipenem y/o Meropenem

6.3.1.4 Gentamicina

6.3.1.5 Amikacina


6.3.2 Grupo II:

6.3.2.2 Aztreonam

6.3.2.3 Cefoperazona/sulbactam

6.3.2.4 Cefepime


6.3.2.6 Ofloxacina(1)

(1) Disco utilizado exclusivamente para infecciones de las vas urinarias

6.3.3 Resistencias Naturales:

Pseudomonas aeruginosa es resistente a Penicilina, Ampicilina, Amoxicilina, cefalosporinas de pri-mera y segunda generacin, Cefotaxima, Ceftriaxona, Kanamicina, Tetraciclina, Cloramfenicol, cidoNalidxico y cido Pipemdico.

6.4 INCUBACIN

35C

6.5 LECTURA

A las 16 18 h.






6.6.2.1 Disco de Ceftazidima:

Si la cepa tiene susceptibilidad intermedia (I) o resistente (R) a Ceftazidima debe informarse tambincomo intermedia (I) o resistente (R) al Aztreonam an cuando el resultado del disco indique sensibi-lidad (resistencia cruzada).

6.6.2.2 Disco de Aztreonam:

Una resistencia aislada del Aztreonam en relacin con una sensibilidad conservada para los otrosbetalactmicos (cefalosporinas y carbapenems) es posible y debe informarse como tal.

6.6.2.3 Discos de carbapenems:

a. Si una resistencia disociada entre Meropenem e Imipenem (sensible a uno y resistente al otro) esdetectada deber verificarse la tcnica y repetirse la prueba. Si la resistencia disociada se confirma,la cepa deber ser enviada al INS.

b. Una resistencia aislada a Imipenem y/o Meropenem en relacin con una sensibilidad conservadapara otros betalactmicos (cefalosporinas, monobactams y combinaciones cefalosporina / inhibidorde betalactamasas) es posible y debe informarse como tal.

6.7 Cepa de Referencia para el control de calidad interno

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853


CEFALOSPORINASCeftazidima 30 g 14 15-17 18Cefepime 30 g 14 15-17 18 LACTAMICO/ INHIBIDOR DE BETALACTAMASACefoperazona/sulbactam* 75 g/30 g 15 16-20 21CARBAPENEMSImipenem 10 g 13 14-15 16Meropenem 10 g 13 14-15 16MONOBACTAMSAztreonam 30 g 15 16-21 22AMINOGLUCOSIDOGentamicina 10 g 12 13-14 15Amikacina 30 g 14 15-16 17QUINOLONASCiprofloxacina 5 g 15 16-20 21Norfloxacina 10 g 12 13-16 17Ofloxacina 5 g 12 13-15 16

* Adaptado a partir de los dimetros crticos de la Cefoperazona segn el NCCLS 2001

Tabla 4. Antibiticos y Dimetros Crticos para Pseudomonas aeruginosa



SECCIN 7

ANTIBIOGRAMA PARA Acinetobacter spp


Agar Mueller Hinton

7.2 INOCULO



7.3.1 Grupo I:

7.3.1.1 Ceftazidima

7.3.1.2 Imipenem o Meropenem

7.3.1.3 Gentamicina

7.3.1.4 Amikacina

7.3.1.5 Ciprofloxacina.

7.3.2 Grupo II:

7.3.2.1 Ampicilina/Sulbactam

7.3.2.2 Aztreonam

7.3.2.3 Cefotaxima o Ceftriaxona

7.3.2.4 Cefepime


7.3.2.6 Ofloxacina(1)

7.3.2.7 Tetraciclina(1)

7.3.2.8 Cotrimoxazol (Trimetoprim/Sulfametoxazol) 1


(1) Disco utilizado exclusivamente para infecciones de las vas urinarias




7.3.3.1 Acinetobacter baumannii y Acinetobacter calcoaceticus son resistentes a Penicilina, Ampicilina,Amoxicilina, cefalosporinas de primera y segunda generacin y a furanos.

7.3.3.2 Acinetobacter haemolyticus es resistente a Gentamicina y Amikacina.

7.4 INCUBACIN

35C

7.5 LECTURA

16 18 h




COMBINACION DE LACTAMICO/ INHIBIDOR DE BETALACTAMASAAmpicilina/Sulbactam 10/10 g 11 12-14 15CEFALOSPORINAS

Ceftazidima 30 g 14 15-17 18Ceftriaxona 30 g 13 14-20 21Cefotaxima 30 g 14 15-22 23Cefepime 30 g 14 15-17 18CARBAPENEMSImipenem 10 g 13 14-15 16Meropenem 10 g 13 14-15 16MONOBACTAMSAztreonam 30 g 15 16-21 22AMINOGLUCOSIDOGentamicina 10 g 12 13-14 15Amikacina 30 g 14 15-16 17QUINOLONASCiprofloxacina 5 g 15 16-20 21Norfloxacina 5 g 12 13-16 17Ofloxacina 5 g 12 13-15 16TETRACICLINATetraciclina 30 g 14 15-18 19OTROSCloramfenicol 30 g 12 13-17 18Trimetoprim/sulfametoxazol 1,25/23,75g 10 11-15 16

Tabla 5. Antibiticos y Dimetros Crticos para Acinetobacter spp





El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Tetraciclina no es necesariamente vlidopara Doxiciclina y Minociclina.

7.6.2.2 Actividad del Sulbactam:

a. El Sulbactam, un inhibidor de betalactamasas, posee una actividad intrnseca sobre el Acinetobacter spp.

b. La reciente aparicin en EE.UU. de dimetros crticos para medir la actividad de Ampicilina/Sulbactamsobre Acinetobacter spp. permite incluir esta asociacin entre los antibiticos para el antibiograma deesta especie.

7.6.2.3 Actividad de la Rifampicina:

a) La Rifampicina es utilizada en algunos pases para el tratamiento en asociacin de infeccionesocasionadas por Acinetobacter spp multirresistente.

b) Sin embargo debido a la inexistencia de dimetros crticos en el sistema norteamericano (NCCLS)para medir la actividad de Rifampicina sobre Acinetobacter spp no hemos incluido este antibitico enninguno de los dos grupos de antibiticos para esta especie.

7.7 CEPAS DE REFERENCIA PARA EL CONTROL DE CALIDAD INTERNO

7.7.1 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

7.7.2 Escherichia coli ATCC 35218 (para combinaciones de betalactmicos con inhibidores debetalactamasas).

SECCION 8

ANTIBIOGRAMA PARA Enterobacteriaceae


Agar Mueller Hinton

8.2 INOCULO

Mtodo de crecimiento o suspensin directa de la colonia. Ajustar a la turbidez equivalente al estndar0,5 de la escala de Mc. Farland.




8.3.1 Grupo I:

8.3.1.1 Ampicilina

8.3.1.2 Cefalotina

8.3.1.3 Ampicilina / Sulbactam o Amoxicilina / cido Clavulnico.

8.3.1.4 Cefuroxima


8.3.1.6 Gentamicina

8.3.1.7 Amikacina

8.3.1.8 cido Nalidxico(1)





8.3.2 Grupo II:

8.3.2.1 Cefoxitina

8.3.2.2 Aztreonam

8.3.2.3 Ceftazidima

8.3.2.4 Cefixima

8.3.2.5 Cefoperazona/Sulbactam

8.3.2.6 Cefepime o Cefpirome

8.3.2.7 Imipenem o Meropenem


8.3.2.9 Ofloxacina (1)

(1) Disco utilizado exclusivamente para infecciones de las vas urinarias.



8.3.3 Antibiticos a utilizar en el antibiograma de Salmonella spp y Shigella spp aisladas decoprocultivos:

8.3.3.1 Ampicilina




8.3.3.5 Cefotaxima


8.3.4.1 Las enterobacterias son resistentes a Penicilina, Oxacilina, Macrlidos, Clindamicina y Glicopptidos.

8.3.4.2 Klebsiella spp es resistente a las Aminopenicilinas.

8.3.4.3 Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae y Enterobacter aerogenes son resistentes a lasAminopenicilinas, Aminopenicilinas/Inhibidores de betalactamasas, Cefalosporinas de primerageneracin y Cefuroxima.

8.3.4.4 Serratia marcescens es resistente a las Aminopenicilinas, Aminopenicilinas/Inhibidores debetalactamasas, Cefalosporinas de primera generacin y Cefoxitina.

8.3.4.5 Proteus mirabilis es resistente a Nitrofurantona.

8.3.4.6 Proteus vulgaris es resistente a las Aminopenicilinas, Cefalosporinas de primera generacin,Cefuroxima y Nitrofurantona.

8.3.4.7 Morganella morganii es resistente a las Aminopenicilinas, Aminopenicilinas/Inhibidores debetalactamasas, Cefalosporinas de primera generacin, Cefuroxima y Nitrofurantona.

8.3.4.8 Providentia stuartii es resistente a las Aminopenicilinas, Aminopenicilinas/Inhibidores debetalactamasas, Cefalosporinas de primera generacin, Gentamicina (bajo nivel) y Nitrofurantona.

8.4 INCUBACIN

35C

8.5 LECTURA

15-18 h






PENICILINASAmpicilina 10 g 13 14-16 17CEFALOSPORINASCefalotina 30 g 14 15-17 18Cefuroxima axetil (oral) 30 g 14 15-22 23Cefuroxima sodium (parenteral) 30 g 14 15-17 18Cefoxitina 30 g 14 15-17 18Cefotaxima 30 g 14 15-22 23Ceftriaxona 30 g 13 14-20 21Ceftazidima 30 g 14 15-17 18Cefixima 5 g 15 16-18 19Cefpirome * 30 g 14 15-17 18Cefepime 30 g 14 15-17 18 LACTAMICO/ INHIBIDOR DE BETALACTAMASAAmpicilina/Sulbactam 10/10 g 11 12-14 15Amoxicilina/cido Clavulnico 20/10 g 13 14-17 18Cefoperazona/sulbactam + 75 g/30 g 15 16-20 21MONOBACTAMSAztreonam 30 g 15 16-21 22CARBAPENEMSImipenem 10 g 13 14-15 16Meropenem 10 g 13 14-15 16AMINOGLUCOSIDOSGentamicina 10 g 12 13-14 15Amikacina 30 g 14 15-16 17QUINOLONASAcido nalidxico 30 g 13 14-18 19Norfloxacina 10 g 12 13-16 17Ciprofloxacina 5 g 15 16-20 21Ofloxacina 5 g 12 13-15 16TETRACICLINATetraciclina 30 g 14 15-18 19OTROSCloramfenicol 30 g 12 13-17 18Trimetoprim/sulfametoxazol 1,25/23,75g 10 11-15 16

* Dimetros crticos adaptados del CFA SFM, 2000 2001.+ Adaptado a partir de los dimetros crticos de la Cefoperazona segn el NCCLS 2001



a. El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Ampicilina es tambin vlido para Amoxicilina.

b. Tomar en cuenta las resistencias naturales de las enterobacterias para el reporte.

Tabla 6. Antibiticos y Dimetros Crticos para Enterobacterias



8.6.2.2 Disco de Ampicilina/Sulbactam y Amoxicilina/cido Clavulnico:

a. En enterobacterias no existe una disociacin de resultados para estos discos por lo que debe utilizarseuno solo de ellos en el antibiograma.

b. Tomar en cuenta las resistencias naturales de las enterobacterias para el reporte.

8.6.2.3 Disco de Cefalotina:

a. El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Cefalotina es generalmente vlido para laCefazolina. Tambin es vlido para Cefadroxilo, Cefradina, Cefalexina, Cefaclor y Loracarbef peronicamente de las cepas aisladas de infecciones urinarias.

b. En el caso de Salmonella spp y Shigella spp las Cefalosporinas de primera y segunda generacin noson eficaces clnicamente por lo que deben ser reportadas como resistentes a estos antibiticos ancuando se observe actividad in vitro.

c. Tomar en cuenta las resistencias naturales de las enterobacterias para el reporte.

8.6.2.4 Discos de Aminoglucsidos:

En el caso de Salmonella spp. y Shigella spp los Aminoglucsidos no son eficaces clnicamente porlo que deben ser reportadas como resistentes a estos antibiticos an cuando se observe actividadin vitro.


El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Tetraciclina es vlido tambin para la Doxiciclinay Minociclina.

8.6.2.6 Discos de Cefalosporinas de tercera generacin y Aztreonam:

a. Para Enterobacter spp., Serratia marcescens, Citrobacter freundii, Proteus vulgaris, Morganellamorganii y Providentia stuartii un resultado intermedio o resistente a Cefotaxima, Ceftriaxona,Ceftazidima o Aztreonam obliga a reportar como intermedio o resistente a todo este grupo deantibiticos.

b. El disco de Cefixima no debe utilizarse en el antibiograma de Morganella morganii.

c. Algunas cepas de enterobacterias, principalmente de Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae, sonclnicamente resistentes a las Cefalosporinas de tercera generacin y al Aztreonam debido a laproduccin de betalactamasas de espectro extendido. Este tipo de resistencia puede ser difcil dedetectar en el antibiograma estndar.

8.7 DETECCIN DE LAS ENTEROBACTERIAS PRODUCTORAS DE BETALACTAMASAS DEESPECTRO EXTENDIDO

Algunas cepas productoras de estas enzimas pueden presentar halos de inhibicin lo suficientementegrandes como para ser clasificadas errneamente como sensibles a las Cefalosporinas de tercera



generacin y a Aztreonam. Con el objeto de superar esta dificultad, la tabla 7 seala los dimetrospara Ceftazidima, Cefotaxima, Ceftriaxona y Aztreonam que sern utilizados como test de tamizaje yque permiten sospechar la presencia de estas enzimas: Si la cepa estudiada presenta halos deinhibicin, para al menos uno de estos antibiticos, iguales o inferiores a los dimetros referidos entabla 7 deber realizarse un test confirmatorio de la presencia de betalactamasas de espectroextendido.

Tabla 7. Dimetros crticos de tamizaje para la deteccin de Bectalactamasas de espectro extendido

8.7.1 Test confirmatorio de la presencia de betalactamasas de espectro extendido (segn el NCCLS - USA):

8.7.1.1 Este test requiere el uso de discos habituales de Ceftazidima (30 mg) ,Cefotaxima (30 mg), as comode Ceftazidima/Acido Clavulnico (30/10 mg) y Cefotaxima/Acido Clavulnico (30/10 mg), con los quese realiza un test de disco difusin sin ninguna variante.

8.7.1.2 Si los discos de Ceftazidima/Acido Clavulnico y Cefotaxima/Acido Clavulnico presentan zonas deinhibicin superiores 5 mm a aquellos producidos por los discos de Ceftazidima y Cefotaxima,respectivamente, se considera el test como positivo.

8.7.2 Test confirmatorio de la presencia de betalactamasas de espectro extendido (segn el Comitde Antibiograma de la Sociedad Francesa de Microbiologa):

8.7.2.1 Este test requiere el uso de discos habituales de Amoxicilina/Acido Clavulnico (20/10 mg), Ceftazidima(30 mg) y/o Cefotaxima (30 mg) y/o Aztreonam (30 mg) y/o Ceftriaxona, con los que se realiza un testde disco difusin sin ninguna variante.

8.7.2.2 Los discos de Ceftazidima, Aztreonam, Cefotaxima y Ceftriaxona se disponen a 30 mm del disco deAmoxicilina/cido Clavulnico (distancia de centro a centro de los discos).

8.7.2.3 Si una imagen de sinergia aparece entre el disco Amoxicilina/cido Clavulnico y los discos deCeftazidima y/o Aztreonam y/o Cefotaxima y/o Ceftriaxona, se considera el test como positivo.

8.7.3 Reporte de antibiograma de las enterobacterias productoras de betalactamasas de espectroextendido:

Una vez detectadas las cepas productoras de estas betalactamasas de espectro extendido debenser reportadas como resistentes a todas las penicilinas, las cefalosporinas de todas las generaciones(icluyendo los de cuarta generacin) y al Aztreonam, cualquiera que sea el dimetro de los discos deestos antibiticos.

ANTIBIOTICO-CONCENTRACION HALO DE INHIBICION

Aztreonam 30 mg 27 mmCeftazidima 30 mg 22 mmCefotaxima 30 mg 27 mmCeftriaxona 30 mg 25 mm



8.8 Cepas de Referencia para el control de calidad interno

8.8.1 Escherichia coli ATCC 25922.

8.8.2 Escherichia coli ATCC 35218 (para combinaciones de betalactmicos e inhibidores de betalactamasas).

SECCION 9

ANTIBIOGRAMA DE Streptococcus pneumoniae (Neumococo)


Agar Mueller Hinton con un suplemento de 5% sangre de carnero

NOTA: No aplicar ms de 9 discos en las placas de 150 mm, ni ms de 5 en las placas de 100 mm.

9.2 INOCULO

Suspensin directa de la colonia en caldo Mueller Hinton o solucin salina al 0.9% a partir de unaplaca de agar sangre de carnero de crecimiento, incubada 16 18 horas. Ajustar a la turbidez equiva-lente al estndar 0,5 de la escala de Mc. Farland.


9.3.1 Grupo I:

9.3.1.1 Oxacilina


9.3.1.3 Cotrimoxazol (trimetoprim/sulfametoxazol)


9.3.1.5 Vancomicina


9.3.2 Grupo II:

9.3.2.1 Rifampicina


9.3.2.3 Levofloxacina o Esparfloxacina o Moxifloxacina.




9.3.3.1 El Neumococo es resistente a Aztreonam y Pefloxacina.

9.3.3.2 El Neumococo presenta una resistencia de bajo nivel a los aminoglucsidos.

9.4 INCUBACIN

35C en atmsfera de 5% de CO2.

9.5 LECTURA

20 24 h




9.6.2.1 Disco de Oxacilina:

a. Cuando el halo de inhibicin del disco de Oxacilina es igual o superior a 20 mm, la cepa de Neumococoes sensible a Penicilina y a los siguientes antibiticos: Ampicilina, Amoxicilina, Amoxicilina/cido

ANTIMICROBIANO CONTENIDO DEL DISCO DIAMETRO EN mm

R I SPENICILINASOxacilina 1 g - - 20GLICOPEPTIDOSVancomicina 30 g - - 17Teicoplanina* 30 g - - 17QUINOLONASLevofloxacina 5 g 13 14-16 17Esparfloxacina 5 g 15 16-18 19Moxifloxacina 5 g 14 15-17 18TETRACICLINATetraciclina 30 g 18 19-22 23MACROLIDOSEritromicina 15 g 15 16-20 21OTROSCloramfenicol 30 g 20 - 21Rifampicina 5 g 16 17-18 19Trimetoprim/sulfametoxazol 1.25/23.75g 15 16-18 19

* Dimetros crticos adaptados del CFA SFM 2000 20001.

Tabla 8. Antibiticos y Dimetros para Streptococcus pneumoniae



Clavulnico, Ampicilina/Sulbactam, Cefaclor, Cefuroxima, Cefotaxima, Ceftriaxona, Cefixima,Cefepime, Loracarbef, Imipenem y Meropenem.

b. Cuando el halo de inhibicin del disco de Oxacilina es igual o inferior a 19 mm puede tratarse de unacepa de Neumococo sensible, de bajo nivel de resistencia o de alto nivel de resistencia a Penicilina.En estas cepas debe determinarse la CIM de la Penicilina pues no es posible categorizar al Neumocococomo resistente a este antibitico basado nicamente en el resultado del disco de Oxacilina.

c. Tampoco es posible determinar el grado de resistencia a los otros betalactmicos basado nicamen-te en los resultados del disco de Oxacilina, por lo que se recomienda determinar la CIM de ciertosantibiticos que pueden ser eficaces en el tratamiento de infecciones debidas a Neumococo resisten-te a Penicilina (Amoxicilina, Cefuroxima, Cefotaxima, Ceftriaxona, Imipenem y Meropenem).

d. En infecciones severas debidas a Neumococo (meningitis, bacteriemia) se recomienda determinar laCIM de la cepa para Penicilina, Cefotaxima (o Ceftriaxona) y Meropenem. La Vancomicina debetambin estudiarse en estos casos, sea incluyendo el disco de este antibitico en el antibiograma opor determinacin de la CIM.


El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Eritromicina es tambin vlido para Azitromicina,Roxitromicina y Claritromicina.


Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

SECCIN 10

ANTIBIOGRAMA DE Streptococcus spp


Agar Mueller Hinton con 5% sangre de carnero.

NOTA: No aplicar ms de 9 discos en las placas de 150 mm, ni ms de 5 en las placas de 100 mm.

10.2 INOCULO

Suspensin directa de la colonia (a partir de una placa de agar sangre de carnero incubada 16 18 horas). Ajustar a la turbidez equivalente al estndar 0,5 de la escala de Mc. Farland.




10.3.1 Grupo I:

10.3.1.1 Ampicilina o Penicilina G (solo para Estreptococos betahemolticos)


10.3.1.3 Clindamicina



10.3.2 Grupo II:

10.3.2.1 Levofloxacina (solo para estreptococos betahemolticos)

10.3.2.2 Ofloxacina (solo para estreptococos betahemolticos)

10.3.2.3 Cefepime

10.3.2.4 Vancomicina



10.3.3.1 Los Estreptococos son resistentes a Aztreonam y Pefloxacina.

10.3.3.2 Los Estreptococos presentan una resistencia de bajo nivel a los Aminoglucsidos.

10.4 INCUBACIN

35C en atmsfera de 5% de CO2.

10.5 LECTURA

20 24 h






10.6.2.1 Discos de Penicilina - Ampicilina:

a) La interpretacin del resultado de estos discos es solo vlida para los Streptococcus beta - hemolticos.

b) Para el estudio de la sensibilidad a Penicilina del Streptococcus viridans aislado de lquidosnormalmente estriles debe determinarse la CIM.

c) Las cepas sensibles a Penicilina deben ser consideradas sensibles igualmente a: Amoxicilina,Amoxicilina/cido Clavulnico, Ampicilina/Sulbactam, Cefalotina, Cefaclor, Cefazolina, Cefradina,Cefuroxima, Cefotaxima, Ceftriaxona, Loracarbef, Cefepime, Imipenem y Meropenem.


El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Eritromicina es tambin vlido para Azitromicina,Roxitromicina y Claritromicina.

10.6.2.3 Discos de Ofloxacina y Levofloxacina:

La interpretacin del resultado de estos discos es solo vlida para los Streptococcus beta - hemolticos.


Streptococcus pneumoniae ATCC 49619

Tabla 9. Antibiticos y Dimetros Crticos para Streptococcus spp (excepto Neumococo)


PENICILINASAmpicilina (beta hemoliticos) 10 g - - 24Penicilina 10 unidades - - 24CEFALOSPORINASCefotaxima (beta hemolticos)30 g 30 g - - 24Cefotaxima (viridans) 30 g 25 26-27 28Ceftriaxona (beta hemolticos) 30 g - - 24Ceftriaxona (viridans) 30 g 24 25-26 27Cefepime (beta hemolticos) 30 g - - 24Cefepime (viridans) 30 g - 22-23 24GLICOPEPTIDOSVancomicina 30 g - - 17Teicoplanina* 30 g - - 17MACROLIDOSEritromicina 15 g 15 16-20 21LINCOSAMIDASClindamicina 2 g 15 16-18 19QUINOLONASLevofloxacina 5 g 13 14-16 17Ofloxacina 5 g 12 13-15 16OTROSCloramfenicol 30 g 17 18-20 21

* Concentraciones crticas adaptadas del CFA SFM 2000 2001.



SECCIN 11

ANTIBIOGRAMA DE Haemophilus spp.


11.1.1 Haemophilus test medium (HTM). Ver Anexo C para su preparacin.

NOTA: No aplicar ms de 9 discos en las placas de 150 mm, y ni ms de 5 en las placas de 100 mm.

11.2 INOCULO

11.2.1 Suspensin directa de la colonia en caldo Mueller Hinton o solucin salina al 0,9 % a partir de uncultivo en agar chocolate de 20 24 h de incubacin. Ajustar a la turbidez equivalente al estndar 0,5de la escala de Mc. Farland.

NOTA: No preparar inculos densos superiores a 0,5 de la escala de Mc. Farland, especialmente conH. influenzae productores de betalactamasas, que pueden conducir a resultados falsamente resis-tentes a las cefalosporinas.


11.3.1 Grupo I:

11.3.1.1 Ampicilina

11.3.1.2 Ampicilina/Sulbactam o Amoxicilina/cido Clavulnico

11.3.1.3 Cefaclor

11.3.1.4 Cefuroxima

11.3.1.5 Ceftriaxona o Cefotaxima



11.3.2 Grupo II:

11.3.2.1 Cefixima.

11.3.2.2 Cefepime

11.3.2.3 Aztreonam

11.3.2.4 Azitromicina o Claritromicina

11.3.2.5 Levofloxacina o Ciprofloxacina o Moxifloxacina u Ofloxacina

11.3.2.6 Rifampicina


11.3.2.8 Meropenem




Los Haemophilus son resistentes a Clindamicina y Lincomicina.

11.4 INCUBACIN

35C en atmsfera de 5% de CO2

11.5 LECTURA

11.5.1 16 18 h

11.5.2 Al realizar la medicin del halo de inhibicin no considerar la zona de desarrollo dbil o de pequeascolonias que pueden encontrarse cercanas al borde neto del halo.



Tabla 10. Antibiticos y Dimetros Crticos para Haemophilus spp


PENICILINASAmpicilina 30 g 18 19-21 22COMBINACIN DE PENICILINA/ INHIBIDOR DE BETALACTAMASASAmpicilina/Sulbactam 10/10 g 19 - 20Amoxicilina/cido Clavulnico 20/10 g 19 - 20CEFALOSPORINASCefaclor 30 g 16 17-19 20Cefuroxima sdica (parenteral) 30 g 16 17-19 20Cefuroxima sdica (oral) 30 g 16 17-19 20Cefotaxima 30 g - - 26Ceftriaxona 30 g - - 26Cefixima 5 g - - 21Cefepime 30 g - - 26CARBAPENEMSMeropenem 10 g - - 20MONOBACTAMSAztreonam 30 g - - 26MACRLIDOSAzitromicina 15 g - - 12Claritromicina 15 g 10 11-12 13QUINOLONASLevofloxacina 5 g - - 17Ciprofloxacina 5 g - - 21Moxifloxacina 5 g 18Ofloxacina 5 g - - 16TETRACICLINATetraciclina 30 g 25 26-28 29OTROSCloramfenicol 30 g 25 26-28 29Trimetoprim/sulfametoxazol 1,25/23,75g 10 11-15 16Rifampicina 5 g 16 17-19 20





a. El resultado del estudio de sensibilidad con el disco de Ampicilina es tambin vlido para Amoxicilina.

b. Para detectar una posible resistencia a Ampicilina y Amoxicilina por produccin de una betalactamasarecomendamos la realizacin del test de la nitrocefina.

c. Una resistencia a Ampicilina con un test de nitrocefina negativo obliga a informar la cepa como resis-tente a Amoxicilina, Ampicilina/Sulbactam, Amoxicilina/cido Clavulnico, Cefaclor y Cefuroxima, apesar de una aparente actividad in vitro.

11.7 Cepas de referencia para el control de calidad interno

11.7.1 Haemophilus influenzae ATCC 49247

11.7.2 Haemophilus influenzae ATCC 49766

11.7.3 E. coli ATCC 35218 (para combinaciones de betalactmicos e inhibidores de betalactamasas

SECCIN 12

ANTIBIOGRAMA DE Vibrio cholerae


Agar Mueller Hinton

12.2 INOCULO


12.3 DISCOS DE SENSIBILIDAD A INCLUIR EN EL ANTIBIOGRAMA

12.3.1 Grupo I:

12.3.1.1 Ampicilina




12.3.1.5 Adems, pueden incluirse otros antibiticos ausentes en la lista segn necesidades de la vigilan-cia de resitencia antimicrobiana.




12.3.2.1 Son resistentes a Penicilina, Oxacilina, Macrlidos, Clindamicina y Glicopptidos.

12.4 INCUBACIN

35C

12.5 LECTURA

16 18 h



Tabla 11. Antibiticos y Dimetros Crticos para V. cholerae


PENICILINASAmpicilina 10 g 13 14-16 17TETRACICLINATetraciclina 30 g 14 15-18 19OTROSCloramfenicol 30 g 12 13-17 18Trimetoprim/sulfametoxazol 1.25/23.75g 10 11-15 16



Es la clase representativa de la Ampicilina y Amoxicilina.


Los resultados con discos de Tetraciclina pueden ser usados para predecir la sensibilidad a laDoxiciclina.

12.7 Cepas de Referencia para el control de calidad interno

12.7.2 Escherichia coli ATCC 25922

12.7.2.1 Escherichia coli ATCC 35218 (para combinaciones de betalactmicos e inhibidores de betalactamasas).



SECCIN 13

CONTROL DE CALIDAD INTERNO

Incluye la descripcin de las especificaciones que se deben aplicar para verificar la validez yconfiabilidad de los resultados de las pruebas de sensibilidad.

13.1 CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

13.1.1 Apariencia de los medios:

Observar cualquier signo de deterioro, como: evidencias de deshidratacin, cambio de color, escasovolumen, etc.

13.1.2 Control de calidad de desarrollo bacteriano:

Controlar el crecimiento de las bacterias a evaluar y que muestre resultados aceptables en pruebasde sensibilidad. Utilizar cepas referenciales.

13.1.3 Control de esterilidad:

Tomar el 5-10% del total del lote producido, e incubar en estufa de 35C durante 48 h. Luego, obser-var cualquier presencia de contaminacin, si ste fuera significativo (>10% del medio controlado)descartar el lote completo. Adems se debe descartar todo medio utilizado.

13.1.4 Control de pH:

Controlar todo lote preparado (autoclavado) ya fro y a temperatura ambiente.

13.1.5 Control de la profundidad del agar: Medir la profundidad introduciendo un elemento fino y estril, elcual tenga una marca en 3 y 5 mm de uno de sus extremos.

13.1.6 Contenido de calcio y magnesio:

Utilizar la cepa de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

13.1.7 Contenido de timidina:

Realizar pruebas de sensibilidad con Enterococcus faecalis ATCC 29212 y discos de trimeoprim/sulfametoxazol. Se debe obtener un halo 20 mm.

13.2 Cepas de referencia para controles de calidad (Tabla 12)

13.2.1 Staphylococcus. aureus (ATCC 25923)

13.2.2 Escherichia coli (ATCC 25922)

13.2.3 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)

13.2.4 Enterococcus faecalis (ATCC 29212)



13.2.5 Escherichia coli (ATCC 35218)

13.2.6 Haemophilus influenzae (ATCC 49247)

13.2.7 Haemophilus influenzae (ATCC 49766)

13.2.8 Streptococcus pneumoniae (ATCC 49619)

Tabla 12. Cepas referenciales para control de calidad de los discos de sensibilidad

13.3 PROCEDIMIENTOS CON LAS CEPAS DE REFERENCIA

13.3.1 Trabajar segn el procedimiento previamente descrito y usando los mismos materiales y mtodosempleados para evaluar las cepas clnicas.

13.3.2 Conservar las cepas de referencia de trabajo diario en agar tripticasa soja, agar nutritivo (bacterias noexigentes) o en agar chocolate enriquecido (bacterias exigentes) a 4C y 8C, realizar subcultivossemanales, y reemplazar los cultivos de trabajo al menos mensualmente, a partir de los cultivoscongelados, liofilizados o comerciales.

13.3.3 Los cultivos stock pueden ser almacenados a una temperatura 20C (de preferencia a 60C oen nitrgeno lquido) en caldo 50% de suero fetal bovino o TSB con 10-15% glicerol, sangre desfibrinadade carnero o leche descremada.

13.3.4 Antes de evaluar las cepas con los antimicrobianos deben ser subcultivadas en placas de agar paratener colonias aisladas. Si se parte de cultivos congelados o liofilizados, stos deber ser sub-cultivadosantes de ser utilizados como controles de calidad.

CEPA FACTORES A EVALUAR

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Calidad de la prueba de sensibilidad

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Concentracin de cationes pH

Frente a la presencia de doble halo alrededor del disco de imipenem cambiar el lote de Mueller Hinton

Escherichia coli ATCC 25922 Calidad de la prueba de sensibilidad

Escherichia coli 35218 Calidad de la prueba de sensibilidad de los discos que contengan la combinacin de Betalactmicos inhibidores de beta-lactamasas (Clavulanato, Sulbactam o Tazobactam).

Enterococcus faecalis ATCC 29212 Deteccin de altos niveles de inhibidores de trimetoprim y sulfonamidas en el medio Mueller Hinton (timidina) Control de los discos de alta carga de aminoglucsidos.



13.4 LMITES DE LOS DIMETROS DE LOS HALOS DE INHIBICIN PARA EL CONTROL DE CALIDAD

En la Tabla 13 se enumeran los dimetros mnimos y mximos de los halos que deben ser observados enlas pruebas de control de calidad. La eficiencia del sistema debe ser controlada utilizando estos lmites.

Tabla 13. Lmites aceptables (mm) de los Dimetros de los Halos de Inhibicin Lmites de Control en Pruebas de Disco Difusin

ANTIMICROBIANO CONTENIDO Escherichia Staphylococcus Pseudomonas Escherichia EnterococcusDEL DISCO coli aureus aeruginosa coli faecalis

ATCC 25922 ATCC 25923 ATCC 27853 ATCC 5218 ATCC 25212

Amikacina 30 mg 19-26 20-26 18-26 - -Amoxicilina/cido 20/10 mg 19-25 28-36 - 18-22 -clavulnicoAmpicilina 10 mg 16-22 27-35 - - -Ampicilina/sulbactam 10/10 mg 20-24 29-37 - 13-19 -Azitromicina 15 mg - 21-26 - - -Aztreonam 30 mg 28-36 - 23-29 - -Cefaclor 30 mg 23-27 27-31 - - -Cefalotina 30 mg 15-21 29-37 - - -Cefazolina 30 mg 23-29 29-35 - - -Cefepime 30 mg 29-35 23-29 24-30 - -Cefixima 5 mg 23-27 - - - -Cefoperazona 75 mg 28-34 24-33 23-29 - -Cefotaxima 30 mg 29-35 25-31 18-22 - -Cefoxitina 30 mg 23-29 23-29 - - -Ceftazidima 30 mg 25-32 16-20 22-29 - -Ceftriaxona 30 mg 29-35 22-28 17-23 - -Cefuroxima 30 mg 20-26 27-35 - - -Cloranfenicol 30 mg 21-27 19-26 - - -Ciprofloxacina 5 mg 30-40 22-30 25-33 - -Clindamicina 2 mg - 24-30 - - -Doxiciclina 30 mg 18-24 23-29 - - -Eritromicina 15 mg - 22-30 - - -Esparfloxacina 5 mg 30-38 27 33 21-29 - -Estreptomicina 10 mg 12-20 14-22 - - -Estreptomicina 300 mg - - - - 14-19Gentamicina Q 10 mg 19-26 19-27 16-21 - -Gentamicina 120 mg - - - - 16-22Imipenem 10 mg 26-32 - 20-28 - -Kanamicina 30 mg 17-25 19-26 - - -Levofloxacina 5 mg 29-37 25-30 19-26 - -Meropenem 10 mg 28-34 29-37 27-33 - -Acido Nalidxico 30 mg 22-28 - - - -Nitrofurantona 300 mg 20-25 18-22 - - -Norfloxacina 10 mg 28-35 17-28 22-29 - -Ofloxacina 5 mg 29-33 24-28 17-21 - -Oxacilina 1 mg - 18-24 - - -Penicilina 10 unidades - 26-37 - - -Rifamp

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