Manual Toxicologia edicion 2

Laboratorio de Toxicología

PROGRAMA�DE�APOYO�A�PROYECTOS�PARA��LA�INNOVACIÓN�Y�MEJORAMIENTO�DE�LA�ENSEÑANZA�

41

DETERMINACIÓN DEL MECANISMO DE ACCIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE COMPUESTOS DE ORIGEN NATURAL

OBJETIVO ACADÉMICO Que el alumno sea capaz de determinar el mecanismo de acción mediante el cual un compuesto de

origen natural ejerce efecto antioxidante.

PROBLEMA

Determinar el mecanismo antioxidante de una sustancia química a través de la realización de las

pruebas de: 1. Inhibición de la Xantina oxidasa, 2. Captura del radical superóxido, 3. Captura de

peróxido de hidrógeno y 4. Captura de radical hidroxilo.

REACTIVOS

Xantina (Xan) Solución amortiguadora de carbonatos*

Xantina oxidasa (XO) Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)

Nitroazul de tetrazolio (NAT) Nitrato de cobre (II) (Cu(NO3)2)

Sulfato de amonio y hierro (II) hexahidratado

(Fe(NH4)2(SO4)2 6H2O)

Peróxido de hidrógeno (H2O2)

Ácido hexenóico Ácido sulfúrico (H2SO4)

Naranja de xilenol (NX) Butil hidroxitolueno (BHT)

Vainillina Ácido ferúlico

Alopurinol

*Ver APÉNDICE II MATERIAL POR EQUIPO DE 6 PERSONAS

12 Tubos Eppendorf de 1.5 mL 1 gradilla para tubos Eppendorf

1 micropipeta de 100-1000 Pl 1 espátula de cromo níquel

1 micropipeta de 10-100 Pl 1 nave de pesado

1 celda para la región visible (desechable) 2 matraces aforados de 250 mL

1 celda para la región U.V. (cuarzo) 1 pipeta 1 mL

2 matraces aforados de 10 mL 1 pipeta 10 mL

2 vasos de precipitados de 25 mL

BORRADOR, COLE

GIO D

E PROFESORES TOXICOLO

GÍA, FQ U

NAM



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EQUIPO

Balanza analítica Baño María

Espectrofotómetro

DESARROLLO EXPERIMENTAL

A) Ensayo de inhibición de la Xantina oxidasa empleando el sistema Xantina-Xantina oxidasa

(Xan-XO)

1. Los profesores indicarána cada equipo el antioxidante a evaluar.

2. Marcar 3 tubos Eppendorf como control negativo (C-), control positivo (C+), antioxidante, y blanco para

antioxidante.

3. Para los antioxidantes ácido ferúlico, alopurinol y vainillina preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 1,

siguiendo el orden de adición indicado en la columna titulada “reactivo”.

Tabla 1. Preparación de los tubos problema y control

Tubo Reactivo

Control negativo (PL)

Control positivo (PL)

Blanco para antioxidante

(PL)

Antioxidante (PL)

a. Xantina 1.5mM 100 100 100 100 b. EDTA 0.115mM 100 100 100 100 c. Solución amortiguadora

de carbonatos 84 mM pH=10.19

900 600 800 500

d. Solución acuosa de antioxidante 650PM - - 100 100

e. XO* - 300 - 300 VOLUMEN TOTAL 1100 1100 1100 1100

f. Agitar e Incubar ** 20 min 20 min 20 min 20 min * Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C durante 20 min.

4. Para el antioxidante BHT preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 2, siguiendo el orden de adición

indicado en la columna titulada “reactivo”.

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Tabla 2. Preparación de los tubos problema y control para BHT

Tubo Reactivo

Control negativo (PL)

Control positivo (PL)

Blanco para BHT (PL)

BHT (PL)

a. Xantina 1.5mM 100 100 100 100 b. EDTA 0.115mM 100 100 100 100 c. Solución amortiguadora de

carbonatos 84 mM pH=10.19 850 550 800 500

d. Metanol 50 50 - - e. Solución de BHT en

metanol/amortiguador de carbonatos (1:2) 650PM

- - 100 100

f. XO* - 300 - 300 VOLUMEN TOTAL 1100 1100 1100 1100

g. Agitar e Incubar ** 20 min 20 min 20 min 20 min * Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C durante 20 min.

5. Transcurrido el tiempo de incubación leer el contenido de los tubos a 295 nm con celda de cuarzo,

empleando el contenido del tubo Control negativo como blanco para medir el Control positivo. Para

mayor comprensión, leer espectrofotométricamente el contenido de los tubos en el orden numérico

que se indica en la Tabla 3.

Tabla 3. Orden de lectura para la determinación de ácido úrico

Orden de lectura Blanco Muestra a leer

1 Control negativo (-)

2 Control positivo (+)

3 Blanco para antioxidante

4 Antioxidante

6. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del control positivo representa

el 100% de producción de ácido úrico en el sistema Xan-XO de acuerdo a la siguiente fórmula.

% inhibición de la XO = 100 - [(AM) x 100/AC+] En donde: AM= absorbancia de la muestra que contiene antioxidante

BORRADOR, COLE

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A C+= absorbancia del control positivo

7. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como

R1.

8. Lavar las puntas de pipeta y tubos Eppendorf empleados con metanol, jabón y agua destilada;

secarlos y entregarlos al profesor. Depositar el agua y metanol empleado para enjuagar en el

contenedor R1

B) Ensayo de captura de radical superóxido (O2x-) empleando el sistema Xantina-Xantina

oxidasa-Nitroazul de tetrazolio (Xan-XO-NAT)

1. Marcar 3 tubos Eppendorf como control negativo (C-), control positivo (C+), y antioxidante.

2. Para los antioxidantes ácido ferúlico, alopurinol y vainillina preparar los tubos de acuerdo a la Tabla

4, siguiendo el orden de adición indicado en la columna titulada “reactivo”.

Tabla 4. Preparación de los tubos problema y control para determinación de captura de radical superóxido (O2

x-)

Tubo Reactivo

Control negativo

(PL)

Control positivo

(PL)

Antioxidante (PL)

a. Xantina 1.5Mm 100 100 100

b. EDTA 0.115Mm 100 100 100 c. Solución amortiguadora de carbonatos 84

mM pH=10.19 600 300 200

d. NAT 0.1 M 300 300 300 e. Solución acuosa de antioxidante 650PM - - 100 f. XO* - 300 300

VOLUMEN TOTAL 1100 1100 1100 g. Agitar e Incubar ** 20 min 20 min 20 min h. Cu(NO3)2 1.3 mM 200 200 200

VOLUMEN TOTAL FINAL 1300 1300 1300 * Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C. 3. Para el antioxidante BHT preparar los tubos de acuerdo a la Tabla 5, siguiendo el orden de adición

indicado en la columna titulada “reactivo”. BORRADOR, C

OLEGIO

DE PROFESORES TOXIC

OLOGÍA, F

Q UNAM



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Tabla 5. Preparación de los tubos problema y control para determinación de captura de

radical superóxido (O2x-) empleando BHT

Tubo Reactivo

Control negativo

(PL)

Control positivo

(PL)

Antioxidante BHT (PL)

a. Xantina 1.5mM 100 100 100

b. EDTA 0.115mM 100 100 100 c. Solución amortiguadora de carbonatos 84

mM pH=10.19 550 250 200

d. Metanol 50 50 - e. NAT 0.1 M 300 300 300 f. BHT en metanol/amortiguador de carbonatos

(1:2) 650PM - - 100

g. XO* - 300 300 VOLUMEN TOTAL 1100 1100 1100

h. Agitar e Incubar ** 20 min 20 min 20 min i. Cu(NO3)2 1.3 mM 200 200 200

VOLUMEN TOTAL FINAL 1300 1300 1300 * Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C. ¤Los profesores indicarán el antioxidante a evaluar 4. Transcurrido el tiempo de incubación leer el contenido de los tubos a 560 nm empleando como

blanco el contenido del tubo etiquetado como control negativo.

5. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del control positivo representa

el 100% de formazán generado en el sistema Xan-XO-NAT de acuerdo a la siguiente fórmula.

% de captura del radical superóxido= 100 - [(AM) x100/A C+] En donde: AM= absorbancia de la muestra que contiene antioxidante A C+= absorbancia del control positivo

6. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como

R1.



contenedor R1.

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C) Ensayo de Captura de peróxido de hidrógeno (H2O2) y radical hidroxilo (x-OH) empleando

el método de FOX2 modificado.

1. Enjuagar con metanol los 5 tubos Eppendorf y marcarlos como blanco, control positivo H2O2,

control positivo x-OH, Captura H2O2 y Captura x-OH.

2. Preparar los tubos de acuerdo a la siguiente tabla, siguiendo el orden de adición indicado en la

columna titulada “reactivo”.

�

Tabla 6. Preparación de los tubos problema y control

Tubo Reactivo

blanco (PL)

Control positivo

H2O2 (PL)

Control positivo x-OH (PL)

Captura H2O2 (PL)

Captura x-OH (PL)

a. FOX-MeOH 900 900 900 - - b. FOX-Antioxidante - - - 900 900 c. Ácido hexenóico - - 40 - 40 d. H2O 100 80 40 80 40 e. H2O2* - 20 20 20 20

VOLUMEN TOTAL 1000 1000 1000 1000 1000 f. Agitar e Incubar ** 10 min 10 min 10 min 10 min 10 min

* Una vez adicionada, se empieza a contar el tiempo. ** Cerrar el tubo, agitar la mezcla por inversión, colocar los tubos en una gradilla e incubarlos en baño maría a 27°C. 3. Transcurrido el tiempo de incubación leer el contenido de los tubos a 560 nm empleando como

blanco el contenido del tubo etiquetado como blanco.

4. Interpretar los resultados obtenidos considerando que la absorbancia del tubo marcado como control

positivo de H2O2 representa el 100% del peróxido de hidrógeno adicionado al sistema y el tubo

marcado como control positivo x-OH representa el 100% del radical hidroxilo generado en el

sistema.

% de captura de peróxido de hidrógeno (H2O2) = 100 - [(AM) x100/AC+H2O2] En donde: AM= absorbancia del tubo marcado como “Captura de H2O2” AC+H2O2 = absorbancia del tubo marcado como “control positivo H2O2”

% de captura de radical hidroxilo (x-OH) = 100 - [(AM) x100/A C+x-OH ] En donde: AM = absorbancia del tubo marcado como “Captura de x-OH”

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AC+x-OH = absorbancia del tubo marcado como “control positivo x-OH” 5. Una vez obtenidos los resultados desechar el contenido de los tubos en un frasco etiquetado como

R2.



contenedor R2.

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CUESTIONARIO

1. Reporte sus resultados en la Tabla 1

Tabla 1. Resultados por equipo

Prueba Absorbancia

Control

positivo (C+)

Absorbancia de la muestra

antioxidante: ________________

Porcentaje

de actividad

antioxidante*

Inhibición XO

Captura O2x-

Captura H2O2

Captura x-OH

*Calcular el porcentaje de inhibición de XO o Captura de O2x-, H2O2 o x-OH según sea el caso de

acuerdo a las ecuaciones presentadas en cada una de las secciones. 2. De acuerdo a los resultados de la Tabla 1 ¿Cuál es el mecanismo de acción de la muestra de

antioxidante que analizó? Justifique su respuesta.

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

3. Compare las absorbancias de los controles positivos para cptura de H2O2 y x-OH. ¿A qué proceso o

procesos atribuye la diferencia?

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

4. Esquematice con reacciones su respuesta anterior.

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5. Recopile los resultados grupales y repórtelos en la Tabla 2.

Tabla 2. Resultados grupales

Equipo Antioxidante % de inhibición

de la XO

% de Captura

O2x- H2O2 x-OH

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

6. ¿Cuál de los antioxidantes muestra mayor capacidad para inhibir a la XO?

___________________________________________________________________________________

7. ¿Cuál de los antioxidantes muestra mayor capacidad para capturar al radical O2•-?

___________________________________________________________________________________

8. ¿Cuál de los antioxidantes muestra mayor capacidad para capturar al H2O2?

___________________________________________________________________________________

9. ¿A qué atribuye este último hallazgo?

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________

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10. ¿Cuál de los antioxidantes muestra una mayor capacidad para capturar al radical x-OH?

________________________________________________________________________________

11. ¿Considera que el consumo habitual de estos antioxidantes contribuiría a disminuir el estrés

oxidante? Justifique su respuesta.

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________

BIBLIOGRAFÍA

Cadenas, E. Packer L. Handbook of Antioxidants. Marcel Dekker, Inc., New York, 2002. Klaassen, C.D., Watkins, J.B. Manual de Toxicología de Casarett & Doull: la ciencia básica de los

tóxicos. (5ª ed.) McGraw-Hill, México, 2001. Klassen, C.D. Casarett and Doull’s Toxicologia. La ciencia de los venenos. (6a ed.). Ed. Mc Graw

Hill, Interamericana 2001. Jiang, Z.Y., Hunt, J.V., Wolff, S. P. (1991). Ferrous Ion Oxidation in the Presence of Xylenol Orange

for Detection of Lipid Hydroperoxide in Low Density Lipoprotein. Analytical Biochemistry 202, 384-389.

Nourooz-Zadeh, J., Tajaddini-Sarmadi, J., and Wolff S.P. (1994). Measurement of Plasma Hydroperoxide Concentrations by the Ferrous Oxidation-Xylenol Orange Assay in Conjunction with Triphenylphosphine. Analytical Biochemistry 220, 403-409.

Martínez-Flórez, S., González-Gallego, J., Culebras, J. M., y Tuñón, M.ª J. (2002). Los flavonoides: propiedades y acciones antioxidantes. Nutrición Hospitalaria. XVII, 271�278.

Owena, P.L., Johns, T. (1999). Xanthine oxidase inhibitory activity of northeastern north American plant remedies used for gout. Journal of Ethnopharmacology 64, 149�160.

Södergren, E., Nourooz-Zadeh, J., Berglund, L., Vessby, B. (1998) Re-evaluation of the ferrous oxidation in xylenol orange assay for the measurement of plasma lipid hydroperoxides. J. Biochem. Biophys. Methods 37 137-146.

Tsutomu, K., Susumu, T., Hidetaka, N., et al. (2003). A novel and potent biological antioxidant, kinobeon A, from cell culture off sunflower. Life Sciences 74, 87�97.

Wardman, P., (2007). Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosactive species in cells and tissues: Progress, pitfalls, and prospects. Free Radical Biology & Medicine 43, 995�1022.

World Health Organization monographs on selected medicinal plants. Volume 1. 1999, Geneva. Pp 16-32.

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APÉNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Definición del proceso de estrés oxidante.

2. Concepto de radical libre y especies reactivas.

3. Concepto de antioxidante y ejemplos.

4. Reacción de Fenton.

5. Concepto de peroxidación de lípidos.

6. Importancia de la solubilidad de los antioxidantes en agua y metanol en función del procedimiento

experimental, prestar particular atención a las tablas 2 y 5.

7. Analice las reacciones planteadas en el siguiente diagrama y describa o complete lo solicitado en

los incisos 7a-7c

7a. Completar la longitud de onda a la que absorben las especies químicas que se determinan

espectrofotométricamente en las pruebas de inhibición de la Xantina Oxidasa y de captura del

radical superóxido, respectivamente.

XantinaXantinaOxidasa�(XO)

Ácido�úrico

O2 H2O2� +��O2˙Ͳ

2eͲ

Reducción�2eͲ

Azul�de�tetrazolio (NBT)��Formazán

O=��nm

O=��nm

BORRADOR, COLE

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7b. Propósito de la adición secuencial de: xantina, EDTA, solución amortiguadora de carbonatos

pH 10.2, nitroazul de tetrazolio, XO y Cu(NO3)2 en las pruebas de inhibición de la Xantina

Oxidasa y de captura de radical superóxido.

7c. Identificar las especies reactivas de oxígeno, indicando si son radicales o no.

8. Analice las reacciones planteadas en el siguiente diagrama y describa lo solicitado en los incisos

9a-9c

�

�

9a. Propósito de la adición de Naranja de Xilenol y H2SO4 en el reactivo de FOX2.

9b. Propósito de la adición de H2O2.

9c. Propósito de la adición de ácido hexenóico en los tubos de captura de radical OHx-.

9d. Identifique la reacción de Fenton en el diagrama

Método�de�FOX2�modificado

FeII FeIII +�OH˙�+�OHͲ

H2O2 Naranja�de�Xilenol (NX)FeIIIͲNX

+ L(Ácido hexenóico)

FeII FeIII +�OH˙�+�OHͲLOOH NX

FeIIIͲNX

(O=560�nm)

(O=560�nm)

NX�=�Naranja�de�XilenolFeIIIͲNX�=��Complejo�colorido�de�hierro�III�y�Naranja�de�XilenolL=�Lípido�=�Ácido�hexenóicoLOOH�=�Lípido�hidroperóxido�producto�de�la�peroxidación�de�lípidos�en�presencia�de�OH˙

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APÉNDICE II: PREPARACIÓN DE REACTIVOS

Nota: Las soluciones 17 y 18 se deben preparar al inicio de cada sesión. Todo el material de vidrio

para preparar los antioxidantes deberá ser enjuagado previamente con EDTA. Se recomienda que

cada equipo prepare las soluciones acuosas o metanólicas del antioxidante que el profesor les haya

asignado a evaluar.

Xantina 1.5 mM

Pesar 11.3 mg de xantina, agregar Na2CO3 0.4 M hasta solubilizar y aforar a 50 mL con solución

amortiguadora de carbonatos.

Solución amortiguadora de bicarbonato de sodio-carbonato de sodio 84 mM, pH 10.2

Pesar 970 mg de NaHCO3 y 1.01 g de Na2CO3, disolverlos con agua destilada. Ajustar pH a 10.2 y

aforar a 250 mL.

Nitroazul de tetrazolio 0.1 M

Pesar 41 mg de nitroazul de tetrazolio y aforar a 50 mL con agua destilada. Guardar la solución en un

frasco ámbar en el refrigerador.

EDTA 0.1 mM

Pesar 33.6 mg de EDTA, disolver con agua destilada, aforar a 1L.

Xantina oxidasa

La enzima se preparará durante la sesión de laboratorio de acuerdo a la indicación de los profesores.

Nitrato de cobre 1.3 mM (Cu(NO3)2)

Pesar 12.2 mg de Cu(NO3)2 y aforar a 50 mL con agua destilada.

Solución acuosa de vainillina 0.65 mM

Pesar 1 mg de vainillina y aforar a 10 mL con solución amortiguadora de carbonatos pH 10.2

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Solución acuosa de ácido ferúlico 650PM

Pesar 1.3 mg de ácido ferúlico y aforar a 10 mL con solución amortiguadora de carbonatos pH 10.2

Solución acuosa de Alopurinol 650PM

Pesar 2.2 mg de alopurinol y aforar a 25 mL con solución amortiguadora de carbonatos pH 10.2

Solución de BHT en metanol/amortiguador de carbonatos (1:2) 650PM

Pesar 1.4 mg de butil hidroxitolueno y disolver en 5 mL de metanol; aforar a 10 mL con solución

amortiguadora de carbonatos pH 10.2

Solución acuosa de H2O2 250 PM

Tomar 0.1 mL de una solución de peróxido de hidrógeno al 50.4% y aforar a 10 mL con agua destilada;

de esta solución tomar 17 PL y aforar a 10 mL con agua destilada.

Solución metanólica de vainillina 4.4 mM

Pesar 6.7mg de vainillina y aforar a 10 mL con MeOH

Solución metanólica de Ácido ferúlico 4.4 mM

Pesar 8.5 mg de ácido ferúlico y aforar a 10 mL con MeOH

Solución metanólica de Alopurinol 4.4 mM

Pesar 6.0 mg de Alopurinol y aforar a 10 mL con MeOH

Solución metanólica de BHT 4.4 mM

Pesar 9.7mg de BHT y aforar a 10 mL con MeOH

Reactivo de FOX2

Mezclar 33.6 mg de naranja de xilenol, 50.2 mg de Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O y disolver en H2O destilada,

agregar 695 mL de H2SO4 concentrado y aforar a 50 mL con agua destilada.

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Solución FOX-MeOH

Mezclar 1 mL del reactivo de FOX2 con 9 mL de MeOH

Solución FOX-Antioxidante

Mezclar 1 mL del reactivo de FOX2 con 9 mL de la solución metanólica de antioxidante

correspondiente.

Solución acuosa de ácido hexenóico 500 PM

Pesar 6.6 mg de ácido hexenóico y aforar a 50 mL con agua destilada, tomar de esta solución 5 mL y

aforar a 10 mL con agua destilada.

APÉNDICE III: DISPOSICIÓN DE RESIDUOS

R1: xantina, xantina oxidasa, EDTA, solución amortiguadora de carbonatos pH 10.2, nitroazul de

tetrazolio, ácido ferúlico, vainillina, butil hidroxitolueno, alopurinol, Cu(NO3)2, azul de tetrazolio,

formazán, ácido úrico, H2O2, metanol.

R2: Naranja de xilenol, sulfato de amonio y hierro (II), H2SO4, ácido hexenóico, H2O, H2O2, vainillina, alopurinol, butil hidroxitolueno, ácido ferúlico metanol.

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DETERMINACIÓN DE MUTÁGENOS AMBIENTALES A TRAVÉS DE LA PRUEBA DE AMES.

OBJETIVO ACADÉMICO

Determinar la presencia de compuestos mutagénicos en muestras de interés o de impacto ambiental

empleando la prueba de Ames

PROBLEMA

Que el alumno obtenga a partir de muestras de interés ambiental, la fracción que contiene los

compuestos de naturaleza orgánica y realice la prueba de Ames para determinar si las fracciones

contienen compuestos con potencial mutagénico.

MATERIAL BIOLÓGICO.

Cultivo nutritivo de 16 horas a 37°C de Salmonella typhimurium, cepa TA98, cuyos marcadores

genéticos son: requerimiento de histidina (His-), sensibilidad al cristal violeta (mutación en rfa),

presencia del plásmido R (resistencia a ampicilina), sensibilidad a la luz U.V. (mutación en uvrB) y

frecuencia de reversión espontanea.

MUESTRA AMBIENTAL POR EQUIPO

Traer por equipo de 6 personas una de las dos muestras siguientes:

a) Colillas de cigarro: Recolectar en una bolsa plástica limpia 20 colillas de cigarro a las que

deberán retirar el papel envolvente y conservar únicamente el algodoncillo del filtro.

b) Residuos de escape automotriz: Recolectar con un algodón el hollín remanente en el escape de

un autobús y guardarlo en una bolsa plástica limpia; si es necesario emplear unas pinzas largas

para tener acceso hasta el lugar en donde el hollín se acumula.

BORRADOR, COLE

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MATERIAL POR EQUIPO (6 personas).

Extracción Prueba de Ames

1 Anillo metálico 1 Agitador “vortex”

1 Embudo de cola corta 1 Mechero Bunsen

1 Embudo de separación 1 Mechero Fisher

1 Matraz de bola de 100 mL 1 Micropipeta 10-100ȝL

1 Probeta de 100 mL 1 Micropipeta 100-1000ȝL

1 Vaso de precipitados de 100 mL 4 Pipetas graduadas 2 mL estériles

1 Vidrio de reloj 8 Puntas desechables estériles para

micropipetas (6 amarillas + 1 azul)

2 Pedazos de papel filtro 7x7cm 1 Vaso de precipitados de 100 mL

1 Parrilla de calentamiento

10 Tubos de ensayo de plástico

desechables de 5 mL estériles

Material para el conteo: 1 Pinzas para tubos de ensayo

1 Plumón indeleble de punto fino 1 Termómetro

1 Lámpara Hielo

1 Lupa 1 Bolsa de plástico para residuos

10 Cajas Petri con medio mínimo E de

Vogel-Bonner

2 Tubos de ensayo 16x150 mm con 15

mL de agar de superficie

1 Tubo Eppendorf

1 Unidad Swinex (Millipore, 0.45 µm)

BORRADOR, COLE

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REACTIVOS

Extracción

Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)

Diclorometano (CH2Cl2)

Dimetilsulfóxido (DMSO)

Prueba de Ames

Hipoclorito de sodio

Solución L-histidina 0.5mM / biotina 0.5 mM

Mezcla fracción S9:

Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 7.4

Solución de MgCl2 6H2O 0.4 M/ KCl 1.65 M

Glucosa 6-fosfato

NADP+

Medio mínimo de Vogel-Bonner (en cajas Petri)

Agar de superficie (15 mL en tubos de ensayo 16x150mm)

EQUIPO

Incubadora

Refrigerador

Rotaevaporador

Lámparas

DESARROLLO EXPERIMENTAL PRIMERA SESIÓN

NOTA 1. Antes de comenzar el trabajo experimental, los encargados de higiene y seguridad deben

verificar que todos los integrantes del equipo porten bata, guantes, cubrebocas y lentes de seguridad.

NOTA 2. Colocar las cajas de Petri con medio mínimo de Vogel-Bonner en la incubadora a 37°C al

inicio de la clase.

BORRADOR, COLE

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EXTRACCIÓN DE MUTÁGENOS A PARTIR DE MUESTRAS AMBIENTALES.

1. Preparar un sobre doble de papel filtro de aproximadamente 5 x 5 cm de longitud de acuerdo a la

Figura 1.

Figura 1. Elaboración de sobre doble de papel filtro.

2. Colocar el material de estudio en el sobre y depositarlo en un vaso de precipitados de 250 mL,

añadir 100 mL de CH2Cl2, tapar y agitar delicadamente 30 segundos. Macerar durante 30

minutos. (No agitar durante ese tiempo).

3. Filtrar por gravedad el extracto obtenido y recolectarlo en un vaso de precipitados.

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4. Colocar el sobre doble de papel filtro sobre papel periódico en la campana de extracción. Al

finalizar la sesión los responsables de seguridad e higiene deberán colocarlos en una bolsa de

plástico, cerrar y etiquetar como R1.

5. Adicionar al disolvente de extracción del inciso 3 sulfato de sodio anhidro para eliminar la

presencia de agua en la muestra, posteriormente filtrarlo por gravedad a través de algodón y

concentrar in vacuo.

6. Reconstituir el residuo final con 500 µL de DMSO.

PRUEBA DE AMES.

NOTA 3. Antes de montar el área de trabajo es importante asegurarse que ya NO haya disolventes

orgánicos en las mesas.

1. Sanitizar el área de trabajo limpiando con jabón e hipoclorito de sodio.

2. Enseguida sanitizar con etanol al 70%.

3. Adecuar el área de trabajo a un ambiente estéril de acuerdo a la Figura 2.

Figura 2. Área de trabajo ordenada y sanitizada.

4. En la parrilla de calentamiento, fundir con mucha precaución los 15 mL de agar de superficie

contenido en el tubo de ensayo para evitar proyecciones y pérdidas de reactivo.

5. Añadir 1.5 mL de solución L-Histidina/Biotina.

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6. Mantener la mezcla anterior a 45°C en baño maría como indica la Figura 2.

7. Los encargados de seguridad prepararán para todo el grupo la mezcla S9 de acuerdo a las

instrucciones del APÉNDICE I. A los equipos que les corresponda utilizar dicha mezcla se les

proporcionará en tubos Eppendorf 1.3 mL de mezcla S9 para el bioensayo la cual deberá

mantenerse todo el tiempo en baño de hielo.

NOTA 4: Los pasos del 7 al 12 deben hacerse lo más rápido posible para evitar riesgos de

contaminación.

8. Tomar uno o dos tubos de ensaye de plástico estériles, según el tratamiento que se esté

realizando, quitarles la tapa por presión sin tocar los bordes y añadir a cada tubo 2 mL de agar

de superficie previamente tratado en el paso 4. Mantenerlos a 45°C como los muestra la Figura

2.

9. Realizar sólo los tratamientos expuestos en la Tabla 1 o 2 según el equipo correspondiente,

comenzando por el control negativo. CADA REACTIVO DEBE AGREGARSE EN EL ORDEN

INDICADO.

10. Desechar las puntas para micropipetas en la bolsa de residuos colocada a un costado del área de

trabajo y etiquetada como R2.

Tabla 1. Prueba de Ames con la Cepa TA 98 para el equipo A

Tratamientos Control negativo

Reversión espontánea

(por duplicado)

Sin S9 (por duplicado)

CÓDIGO Reactivo

C- RE1 RE2 S/S91 S/S92

1.- Agar de superficie* 2mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL

2.- Cultivo bacteriano - 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL

3.- Mutágeno ambiental - - - 25ȝL 25ȝL

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Tabla 2. Prueba de Ames con la Cepa TA 98 para el equipo B

Tratamientos Control negativo

fracción S9

Sólo mutágeno

(por duplicado)

Con S9

(por duplicado)

CÓDIGO Reactivo

C-S9 M1 M2 C/S91 C/S92

1.- Agar de superficie* 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL

2.- Cultivo bacteriano 100 PL - - 100 µL 100 µL

3.- Mutágeno ambiental - 25ȝL 25ȝL 25ȝL 25ȝL

4.- Mezcla S9** 500 PL - - 500 µL 500 µL

*Mantener siempre a 45°C en baño maría **Mantener siempre en hielo. 11. Sacar de la incubadora dos cajas Petri, etiquetar las cajas en la tapa según el código indicado en

las tablas 1 y 2, para cada tratamiento agregando el número de grupo y equipo.

12. Mezclar el contenido de cada tubo en el agitador “vortex”.

13. Verter el contenido de cada tubo en la caja de Petri con medio mínimo de Vogel-Bonner

correspondiente.

14. Desechar los tubos de plástico en la bolsa de residuos colocada en un costado del área de trabajo

y etiquetada como R2.

15. Distribuir cuidadosa y homogéneamente el agar de superficie realizando movimientos circulares.

16. Dejar solidificar las cajas a temperatura ambiente en una superficie plana durante 10 minutos.

17. Repetir los pasos 7 al 15 para los otros dos tratamientos.

NOTA 5: Recordar en todo momento que se está trabajando con compuestos con posible actividad

mutagénica y con un cultivo bacteriano que no es inócuo.

18. Colocar el sobrante de la muestra ambiental en DMSO en el contenedor etiquetado como R3.

19. Fijar las tapas de las cajas Petri a su contraparte con cinta adhesiva e introducirlas de manera

invertida a la incubadora a 37°C por 48 horas.

20. Una vez terminado el tiempo de incubación, guardar las cajas de Petri invertidas en el

refrigerador a 4°C.

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DESARROLLO EXPERIMENTAL SEGUNDA SESIÓN

21. Antes de comenzar el conteo de colonias, verificar que el crecimiento sea homogéneo, es decir,

que las colonias tengan las mismas características, de lo contrario informar al profesor para

recibir instrucciones.

22. Identificar si existe algún tipo de contaminación por hongos u otras bacterias. En caso de que las

cajas presenten estas condiciones, informar al profesor para rechazarlas.

23. Contar el número de colonias revertantes que crecieron en la caja con ayuda de una lámpara y

una lupa, marcándolas con un plumón indeleble de punto fino.

24. Registrar en la Tabla 3 los resultados obtenidos.

25. Una vez terminada la cuenta, recolectar las cajas de Petri y sujetarlas con cinta adhesiva,

colocarlas en la bolsa roja para RPBI y etiquetarlas como R4

NOTA 6. Se considera un resultado positivo cuando el número de revertantes inducidas es igual o

superior al doble del número de colonias revertantes espontáneas.

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CUESTIONARIO 1. Anote el número de revertantes encontradas en la Tabla 3

Tabla 3. Resultados con la cepa TA98

Equipo Muestra: Repetición Control negativo

Control negativo

fracción S9Reversión

espontánea

Sin fracción

S9

Con fracción

S9

Sólo mutágeno

1

1 2

Promedio 2

1 2

Promedio 3

1 2

Promedio 4

1 2

Promedio 5

1 2

Promedio 2. ¿En cuál de las muestras evaluadas, el número de revertantes inducidas es igual o superior al doble

del número de colonias revertantes espontáneas?

___________________________________________________________________________________

3. ¿Considera que logró identificar la presencia de mutágenos en la muestra ambiental evaluada?

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________

4. ¿Qué tipo de mutaciones provocan?

___________________________________________________________________________________

5. ¿Cómo influye la biotransformación en estos procesos?

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________

6. ¿Qué características de solubilidad poseen los xenobióticos presentes en la muestra evaluada?

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___________________________________________________________________________________

7. ¿Qué importancia tiene la concentración de los mutágenos en la muestra con respecto a la

confiabilidad de la prueba?

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________________

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Maron, D. & Bruce, A. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research 113 (1980)173-215.

Cortinas, C. & Ostrosky, P. (Editoras) Manual de métodos para la identificación de mutágenos y carcinógenos químicos ambientales, Volumen 1. Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM. México, 1980. Págs. 31-50.

Calderón-Segura, M. E., Gómez-Arroyo, S., Villalobos-Pietrini, R., Butterworth, F. M., Amador-Muñoz, O. The effects of seasonal weather on the genotoxicity, cytokinetic properties, cytotoxicity and organochemical content of extracts of airborne particulates in Mexico City. Mutation Research 558 (2004) 7–17.

Villalobos-Pietrini, R., Hernández-Mena, L., Amador-Muñoz, O., Munive-Colín, Z., Bravo-Cabrera, J. L., Gómez-Arroy, S., Frías-Villegas, A., Waliszewski, S., Ramírez-Pulido, J., Ortiz-Muñiz, R. Biodirected mutagenic chemical assay of PM10 extractable organic matter in Southwest Mexico City. Mutation Research 634 (2007) 192–204.

APENDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS

1. Concepto de contaminación atmosférica.

2. Posibles compuestos mutagénicos existentes en las muestras seleccionadas.

3. Efectos generales que sobre el organismo tienen los contaminantes ambientales.

4. Características generales de solubilidad de dichos compuestos.

5. Fundamento de la prueba de Ames.

6. Concepto de revertante espontánea.

7. Características generales de las cepas Salmonella typhymurium utilizadas en la Prueba de Ames

y especialmente la cepa TA 98.

8. Utilidad del agar de superficie.

9. Importancia del baño de temperatura a 45°C.

10. Finalidad de colocar en el medio una solución que contenga histidina y biotina.

11. Características de la fracción S9 y su utilidad.

12. Numero de colonias revertantes necesarias para considerar un resultado positivo.

13. Precauciones que se deben considerar para obtener resultados óptimos de la prueba en el

laboratorio.

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APÉNCIDE II: PREPARACIÓN DE REACTIVOS.

a) Sales de Vogel-Bonner 50X.

En 600 mL de agua destilada tibia disolver las sales en el siguiente orden:

MgSO4·7 H2O 10 g

Ácido cítrico·H2O 100 g

K2HPO4 anhídro 500 g

NaHPO4·4 H2O 175 g

Aforar a 1 litro. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente.

b) Bacto-agar

En un matraz de 1 L colocar 15 g de Bacto-agar más 500 mL de agua destilada. Esterilizar en

autoclave el material a anterior 121°C durante 15 minutos

c) Dilución de las sales Vogel-Bonner 50x

En un matraz de 1 L colocar 20mL de las sales de Vogel-Bonner 50x más 500 mL de agua destilada.

Esterilizar en autoclave el material anterior a 121°C durante 15 minutos

d) Solución de glucosa al 40% p/v

En un matraz de 125 mL colocar 20 g de glucosa más 50 mL de agua destilada. Esterilizar en

autoclave el material anterior a 121°C durante 15 minutos

e) Cajas Petri con Medio mínimo E de Vogel-Bonner

En un matraz de 2 L limpio, seco y esterilizado en autoclave a 121 °C por 15 minutos, añadir los 500

mL de bacto-agar, 500 mL de la dilución de las sales Vogel-Bonner y 50 mL de solución de glucosa al

40% p/v, mezclar perfectamente y distribuir en cajas Petri de 15x100 estelizadas por rayos gamma

hasta cubrir la base (aproximadamente 30 mL/caja). Esta cantidad de medio alcanza para preparar

aproximadamente 33 cajas.

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f) Solución Histidina 0.5 mM/Biotina 0.5 mM

Pesar 0.0077 g de L-histidina, 0.0122 g de D-biotina, disolver con agua destilada y con calentamiento,

aforar a 100 mL. Esterilizar por filtación o autoclave. Almacenar a 4°C en oscuridad.

g) Agar de Superficie

Pesar 0.6 g de Bacto Agar y 0.5 g de NaCl, agregar 100 mL de agua destilada. Alicuotar 15 mL de la

mezcla en tubos de 16x150 mm, cubrirlos con algodón, esterilizar en autoclave y almacenar a

temperatura ambiente

h) Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 7.4 Solución A. Disolver 2.84 g de Na2HPO4 en 100 mL de agua destilada.

Solución B. Disolver 2.76g de NaH2PO4·H2O en 100 mL de agua destilada.

Para el amortiguador pH 7.4, tomar 81 mL de la Solución A y 19 mL de la Solución B. Almacenar a

4°C. Esterilizar la solución final en autoclave.

i) Solución de Cloruros: MgCl2 6H2O 0.4 M/ KCl 1.65 M

Disolver 8.1332 g de MgCl2 6H2O + 12.302 g de KCl en agua destilada, aforar a 100 mL. Esterilizar

en autoclave y almacenar a 4°C.

j) Mezcla fracción S9

Para preparar esta mezcla se requieren dos tubos estériles de 16 x 150 mm y descongelar previamente

la fracción S9 en baño de agua con hielos (4°C). Tomar las alícuotas indicadas en la Tabla 4 y mezclar

siguiendo las instrucciones posteriores. Pesar la glucosa 6P y el NADP+, usando aplicadores de madera

para poder pesar los reactivos, (con una navaja, una de las puntas del aplicador de madera se plana para

poder tomar el reactivo y pesarlo), vaciarlos cada uno a tubos Eppendorf de 1.5 mL.

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Tabla 4. Alícuotas para preparar la mezcla S9

Reactivos Para 1 mL de mezcla S9

Para 8 mLde mezcla S9 (Cantidad recomendada para un grupo)

Amortiguador de fosfatos 0.2 M pH 7.4 Solución de Cloruros: MgCl2 6H2O 0.4 M/ KCl 1.65 M Glucosa-6-fosfato* NADP+* S9

0.9 mL 0.02 mL

0.0013 g 0.0030 g 100 ȝL

7.2 mL 0.16 mL

0.0104 g 0.024 g 0.8 mL

*Antes de iniciar pedir al profesor que proporcione los tubos Eppendorf de 1.5 mL con la glucosa 6P

y el NADP+ pesados en la cantidad correspondiente, empleando para ello aplicadores de madera

desechables.

En un tubo estéril de 16x 150mm, añadir el amortiguador de fosfatos y la solución de cloruros, mezclar

en vortex, tomar una alícuota de 500 PL(con micropipeta) y añadirla en el tubo Eppendorf que contiene

a la glucosa 6P para disolverla y agregarla al resto del tubo de 16 x 150 mm, mezclar nuevamente en el

vortex. Tomar nuevamente otra alícuota de 0.5 mL y añadirla al tubo Eppendorf que contiene el

NADP+ para disolverlo, agregar al resto del tubo de 16 x 150 mm. Mezclar la fracción S9 y tomar la

alícuota correspondiente para añadirla al tubo de 16 x 150 mm, mezclar en vortex perfectamente y

filtrar utilizando una unidad Swinex (Millipore, 0.45 µm), obteniendo el filtrado en otro tubo de

16x150mm ESTÉRIL. Alicuotar 1.3 mL de la mezcla para cada equipo en tubos Eppendorf.

NOTA 6: Tomar en cuenta que la mezcla siempre debe estar en hielo.

APÉNDICE III: DISPOSICIÓN DE RESIDUOS

R1: Sobre doble con muestra ambiental y disolvente CH2Cl2.

R2: puntas para micropipeta y tubos de plástico.

R3: Concentrado de muestra ambiental en DMSO, este extracto puede contener hidrocarburos

aromáticos policíclicos y otros compuestos mutagénicos.

R4: Cajas de Petri con cultivo bacteriano de Salmonella typhimurium, cepa TA98. BORRADOR, C

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