UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ

ESCUELA DE POST GRADO

UNIDAD DE POST GRADO DE LA FACULTAD DE INGENIERIA QUÍMICA

Cátedra:Calidad de Agua, Efluentes Líquidos yContaminación

Catedrático:M. Sc.Salvador Teódulo Ore Vidalón

Alumnos :

GuisellaLahura Romero

Pedro Pablo Arteaga Llacza

HUANCAYO – PERÚ

2012

EVALUACIÓN DE MÉTODOS DE DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES

Y FECALES PARA AGUA POTABLE EN EL DISTRITO DE INGENIO –

HUANCAYO

EVALUACIÓN DE MÉTODOS DE DETECCIÓN DE COLIFORMES TOTALES

YFECALES PARA AGUA POTABLE

1. BASES TEORICAS Y CONCEPTUALES DEL ESTUDIO1.1. MARCO TEORICO

1.1.1. Generalidades sobre la calidad del agua:

El agua es un líquido incoloro, inodoro e insípido que está compuesto

por dosátomos de hidrógeno y uno de oxígeno (H2O).A la presión

atmosférica normal (760mm de mercurio), el punto decongelación del

agua es a los 0°C y su punto de ebullición, a los 100°C.

Suspropiedades físicas se utilizan como patrones para definir, por

ejemplo, escalas detemperatura.Puesto que todas las sustancias son

de alguna manera solubles en agua, se

le conoce frecuentemente como el disolvente universal. El agua se

combina conciertas sales para formar hidratos, reacciona con los

óxidos de los metalesformando ácidos y actúa como catalizador en

muchas reacciones químicasimportantes. Es uno de los agentes

ionizantes más conocidos. El color del agua sedebe a la presencia de

minerales como hierro, manganeso, materia orgánica yresiduos

coloridos de la industria (Contreras 2008).

Existe una gran presión sobre los recursos hídricos a nivel mundial.

Según la UNESCO(2003) el 69% del agua dulce disponible en el

planeta se destina a la agricultura, representael 23% a la industria y

el 8% al consumo doméstico. Diversos aspectos como la

maladistribución temporal y espacial o la degradación determinan la

actual situación que seresume en un gran desequilibrio entre la oferta

existente y la creciente demanda de agua.

En países en desarrollo como el nuestro, enfrentaremos una mayor

competencia por elacceso al agua en las próximas décadas, debido

al crecimiento demográfico, nuevos hábitosde vida y el desarrollo

urbano e industrial sin una adecuada planificación. Es decir que

seprevé un aumento en la demanda hacia las limitadas fuentes de

agua (Delgadillo 2010).

Según la UNESCO (2003) el uso que se hace del agua va en

aumento en relación con la cantidad disponible. Los seis mil millones

de habitantes del planeta ya se han adueñado del 54% del agua

dulce disponible en ríos, lagos y acuíferos subterráneos. En el 2025,

el hombre consumirá el 70% del agua disponible. Esta estimación se

ha realizado considerando únicamente el crecimiento demográfico.

Sin embargo, si el consumo de recursos hídricos percápita sigue

creciendo al ritmo actual, dentro de 25 años el hombre podría llegar a

utilizar más del 90% del agua dulce disponible, dejando sólo un 10%

para el resto de especies que pueblan el planeta.

De otro lado Barkín (2006), en México condujo el trabajo titulado: La

Historia del acceso al Agua Urbana, en el cual analizo la gestión del

agua, señalando que aunque las autoridades nos aseguran que más

de 90% de la población tiene acceso al agua potable y que una parte

un poco menor tiene conexiones al alcantarillado, la realidad es que

el país está sufriendo grandes estragos por su inadecuada

disponibilidad en calidad y cantidad. Un factor que implica ello es la

mala administración del agua que se da en los hogares de la clase

media y alta que impone una carga adicional sobre los pobres por su

falta de su acceso regular o debido a la mala calidad y escasa agua

que reciben.

Por tanto, un agua contaminada es un vehículo eficaz de transmisión

de la mayoría de enfermedades de origen hídrico.

Los microorganismos patógenos intestinales se hallan diseminados a

lo largo y ancho del planeta.Aquellos, cuya presencia ha sido

detectada en el agua para consumo humano, incluyen entre

otros:salmonellas, shiguellas, Escherichiacoli, Vibrio cholerae,

Yersiniaenterocolitica, EntoamebaHistolitica, Giardia y

Balantidiumcoli, y Helicobacterpilori, esta ultima cuya presencia en el

sistema digestivo, produce ulceras y posteriormente cancer.

(Cáceres 2002)

Esta contaminación está relacionada con el vertido de agua de

desecho de origen doméstico e industrial a los cuerpos deagua. En el

caso de los residuos de origen doméstico, la carga contaminante

está representada por altosporcentajes de materia orgánica y

microorganismos de origen fecal. El control de la calidad

microbiológicadel agua de consumo y de desecho, requiere de

análisis dirigidos a determinar la presencia de microrganismos

patógenos; los agentes involucrados en la transmisión hídrica son las

bacterias, virus y protozoos, que puedencausar enfermedades con

diferentes niveles de gravedad, desde gastroenteritis simple hasta

casos fatales dediarrea, disentería, hepatitis o fiebre tifoidea (Arcos

2005).

Por su parte Solsona (2002), menciona que las guías microbiológicas

de la OMS han sido adoptadas en todo el mundo y estas

recomiendan como indicadores de la calidad microbiológica

lossiguientes parámetros:

Escherichiacoli o bacterias coliformes (fecales) termotolerantes: No se

deben detectar en ninguna muestra de 100 ml de agua destinada al

consumo humano.

Bacterias coliformes totales: No deben ser detectables en ninguna

muestra de 100 ml de agua tratada que ingrese al sistema de

distribución. Puede darse una tolerancia de hasta 5% para la ocurrencia

ocasional de organismos coliformes en muestras del sistema de

distribución tomadas en un período de 12 meses, siempre que no haya

presencia de E. coli.

1.1.2. La Problemática de la Calidad del Agua:

En América Latina y el Caribe el 43% de la población rural no tiene

acceso al abastecimiento de agua con una calidad apropiada para el

consumo humano y para usos domésticos como la higiene personal.

Se considera que la diarrea es la primera causa de muerte en niños

de entre menores de 5 años de edad, ya que para el 2004, de las 1,8

millones de personas que mueren cada año debido a enfermedades

diarreicas (incluido el cólera), un 90% de esas personas son niños de

ese grupo de edad, y son procedentes principalmente de países en

desarrollo (OMS, 2004). Para el 2010 1'101,503 personas fallecieron

a causa de enfermedades diarreicas (Guerra y La Fuente 2011).

Los niños menores de 5 años aun no tienen completo el sistema

inmunológico y en los países en desarrollo, la mayor parte de ellos

están afectados por la desnutrición; ya que en general la diarrea es

transitoria, en las personas bien alimentadas, y persistente en las mal

nutridas. Además la infección repetitiva puede aumentar la

desnutrición que, a su vez, incrementa la vulnerabilidad ante nuevas

infecciones.

Las comunidades rurales se encuentran en permanente riesgo de

contraer enfermedades hídricas porque comúnmente viven sin

acceso a agua segura y a servicios de saneamiento. Las poblaciones

que se abastecen directamente de aguas de origen hídrico (ríos,

lagunas, lagos) se encuentran aun en mayor riesgo debido a que la

fuente de agua está expuesta a la contaminación fecal. Las razones

para ello incluyen la carencia de una apropiada disposición de

excretas y factores como la defecación a campo abierto, las letrinas

mal diseñadas y la presencia de animales domésticos y silvestres

que actúan como reservorios de agentes patógenos.

Por tanto se piensa que un 88% de las enfermedades diarreicas son

producto de un abastecimiento de agua insalubre y de un

abastecimiento y una higiene deficientes. Esto quiere decir que una

mejora del abastecimiento de agua reduce entre un 6% y un 21% la

morbilidad por diarrea, si se contabilizan las consecuencias graves.

La mejora del saneamiento reduce la morbilidad por diarrea en un

32%.

Las medidas de higiene, entre ellas la educación sobre el tema y la

insistencia en el hábito de lavarse las manos, pueden reducir el

número de casos de diarrea en hasta un 45%. La mejora de la

calidad del agua de bebida mediante el tratamiento del agua

doméstica, por ejemplo con la cloración en el punto de consumo,

puede reducir en un 35% a un 39% los episodios de diarrea (OMS

2004).

En el Perú, para el 2008, solo el 61% de la población rural tenía

acceso a fuentes mejoradas de agua potable, frente al 90% de la

población urbana y 36% de la población rural tenía acceso a

servicios de saneamiento mejorados frente al 81% de la población

urbana. Este se ve reflejado en la distribución de las causas de

muerte en menores de 5 años, en donde las diarreas representa en

4% para el 2008 (OMS 2010).

En el mes de diciembre del 2010, el agua potable producidapor 22

Empresas Prestadoras de Servicios de Saneamientoregistró 98

millones 857 mil 500 metros cúbicos,representando en términos

porcentuales un incremento de0,3% comparado con el volumen

alcanzado en el mismomes del 2009. Mientras que, aumentó en

5,5% respecto almes de noviembre del 2010.Asimismo, para el

periodo enero-diciembre la producciónacumulada de agua potable

totalizó 1 mil 150 millones137 mil 300 metros cúbicos, cifra superior

en 1,2%, respectoa igual periodo acumulado del 2009 (1 mil 136

millones 926 mil metros cúbicos) (INEI 2011).

La contaminación del agua de los ríos es causadaprincipalmente por

el vertimiento de relaves mineros (partealta y media de la cuenca),

aguas servidas urbanas ydesagües industriales a lo largo de todo su

cauce(generalmente en la parte media y baja de la cuenca).Dicha

contaminación es resultado de la presencia deelementos físicos,

químicos y biológicos, que en altasconcentraciones, son dañinos

para la salud humana y elecosistema. Cabe indicar, que la calidad de

agua también seve afectada por el uso de plaguicidas y pesticidas en

la actividadagrícola. Todo ello, ocasiona un gasto adicional en el

tratamientodel elemento, es decir, cuanto más contaminada esté el

agua,mayor es el costo del proceso para reducir el

elementocontaminante, ya que se debe realizar el respectivo

tratamientopara hacerla potable (INEI 2011).

En el 2009 la EPS Mantaro SAC ha tenido una producción de agua

potable de 5 332 miles de metros cúbicos con una cobertura del 99%

y una producción percápita de 313 Lt/hab/dia (INEI 2011).

Los efectos en la salud de las enfermedades transmisibles por el

agua varíanen severidad desde una leve gastroenteritis hasta casos

graves de disentería,hepatitis, cólera, fiebre tifoidea y diarrea severa.

La diarrea sola esresponsable de la muerte de 1,8 millones de

personas por año a nivel mundial.Se estima que el 88% de las

muertes son atribuibles a la falta de higienesanitaria y agua potable y

con especial incidencia en niños en paísesperiféricos. Una gran

cantidad de enfermedades podría ser prevenida a travésdel acceso

al agua limpia, infraestructura sanitaria adecuada y mejoresprácticas

de higiene(Greenpeace 2009).

Por otro lado el CEDE (2012), sostiene que una vez que la persona

ingiere agua contaminada, la mayoría de los microorganismos se

multiplican en el aparato digestivo y se excretan en las heces.Si no

se dispone del saneamiento adecuado, dichos microorganismos

pueden llegar a las corrientes de agua e infectar a otras personas.

Los que corren mayor riesgo son los lactantes y niños pequeños, así

como las personas que viven en condiciones insalubres, los

enfermos y los ancianos. Los síntomas pueden variar, pero

generalmente incluyen diarrea, que es una de las principales causas

de muerte en nuestros días. A continuación se mencionan algunas

de las causas y síntomas de las enfermedades transmitidas por el

agua más común en la Región:

Tifoidea

Esta enfermedad infecciosa se caracteriza por fiebre continua. Otros

síntomas son diarrea o estreñimiento, cefaleas, dolores musculares y

fatiga. La tifoidea es transmitida por los alimentos o el agua

contaminada por las heces de una personas que padezca la

enfermedad o sea portadora de la misma. Los pescados y mariscos y

la leche son también medios de transmisión importantes, Cualquiera

puede contraer esta enfermedad.

La Hepatitis A

Se trata de una enfermedad vírica sumamente contagiosa que causa

una infección hepática leve. Los síntomas pueden ser fiebre, náusea,

dolores abdominales, pérdida del apetito e ictericia. La transmisión

quizá ocurra por contacto directo de persona a persona, por consumo

de agua o hielo contaminados, o por pescados y mariscos

cosechados en agua contaminada con aguas residuales, o por frutas,

hortalizas u otros alimentos que se comen sin cocinar, si estos se

han contaminado durante su manipulación

Cólera

Es una enfermedad diarreica aguda, causada por infección intestinal.

Es probablemente la más conocida de las enfermedades diarreicas,

ya que la mayoría de las personas han oído hablar de ella. La

infección suele ser leve y sin síntomas, pero puede ser grave. Puede

contraerse de casos activos de la enfermedad o de sus portadores,

simplemente con ingerir alimentos o agua contaminados. También se

sabe que el cólera se transmite por ingestión de pescados y mariscos

crudos. Esta enfermedad no se propaga directamente de una

persona a otra, por lo que no se corre riesgo de contraerla mediante

el contacto social ordinario con una persona infectada.

Criptosporidiosis

El criptosporidio es un parásito que se encuentra comúnmente en

lagos, ríos, arroyos y estanques, especialmente cuando el agua ha

sido contaminada con aguas residuales y desechos de animales. La

infección puede contraerse de varias maneras: al beber agua

contaminada, o comer alimentos crudos o poco cocinados que hayan

sido contaminados con oocistos (una especie de huevo que

constituye la etapa infecciosa del parásito) de criptosporidio; por

contacto directo con las heces animales o seres humanos infectados;

o por transferencia mano-boca de los oocistos presentes en

superficies que hayan sido contaminadas con pequeñas cantidades

de heces de una persona o animal infectados. Los síntomas son

diarrea, náusea, retortijones y fiebre baja. Hasta la fecha no se

conoce ninguna forma segura y eficaz de tratamiento para esta

enfermedad.

La calidad microbiológica del agua puede variar muy rápidamente y

en gran medida. Pueden producirse aumentos repentinos de la

concentración de agentes patógenos que pueden aumentar

considerablemente el riesgo de enfermedades y desencadenar

brotes de enfermedades transmitidas por el agua. Los análisis de la

calidad microbiológica del agua normalmente tardan demasiado para

que sus resultados puedan ser tenidos en cuenta por los

responsables de la adopción de medidas para evitar el suministro de

agua insalubre (OMS 2006).

1.1.3. Indicadores Microbiológicos de la Calidad del Agua:

El diagnóstico de estos microorganismos, requiere laboratorios

especializados y representa varios días de análisis y costos

elevados. Como alternativa a estos inconvenientes, se ha propuesto

el uso de indicadores microbianos que se puedan identificar

mediante el uso de métodos sencillos, rápidos y económicos. El

diagnostico y posterior recuperación de las fuentes de agua naturales

contaminadas, debe hacerse además, teniendo en cuenta las

implicaciones que en términos ecológicos y sanitarios representa la

degradación del recurso. En este sentido, las microalgasperifiticas se

constituyen como buenos indicadores del estado trófico de los

ecosistemas y responden a los disturbios ocurridos modificando su

estructura en cuanto a composición y abundancia se refiere (Arcos

2005).

Las coliformes fecales son un grupo grande de

microorganismos,habitantes usuales de los intestinos de los animales

superiores. Estos microorganismos son defácil identificación

comparados con los microorganismos patógenos, que normalmente

seencuentran en mucho menor número y cuya identificación es

laboriosa. La presencia decoliformes en una muestra no siempre

indica que el agua está contaminada conmicroorganismos

patógenos, sino que, en términos estadísticos, su concentración

puede ydebe servir como parámetro para alertar sobre la existencia

de contaminación fecal y demicroorganismos patógenos (Guimarães

y Litter).

En la presente tabla se incluyen los microorganismos más

representativos causantes de enfermedades de origen hídrico (Tabla

N° 01).

Tabla N° 01: Patógenos y enfermedades de Origen Hídrico

PATÓGENOS ENFERMEDAD CAUSADA

Bacterias:

Compylobacterjejuni Gastroenteritis

Escherichiacoli Gastroenteritis

Legionellapneumophila Enfermedades respiratorias agudas

Salmonella Salmonelosis, tifoidea, paratifoidea

Shigella Disentería bacilar

Vibrio Cholerae Cólera

Yersiniaenterocolítica Gastroenteritis

Protozoarios:

Cryptosporidium Diarrea

Entamoebahystolítica Disentería amebiana

Giardialamlia Diarrea

Noegleriafowleri Meningitis Cefálica

Enterovirus:

Adenovirus Enfermedades respiratorias,

Infecciones en los ojos,

gastroenteritis.

Astrovirus Gastroenteritis

Caicivirus Gastroenteritis

Coxsacklevirus Meningitis, enfermedades

respiratorias, miocarditis

Echovirus Meningitis, diarrea, fiebre,

enfermedades respiratorias

Hepatitis Viral A Infecciones Hepáticas

Norwalk virus Diarrea, Vómitos y fiebre

Poliovirus Meningitis, parálisis

Rotavirus Diarrea, Vómitos

Fuente: Adaptado de Tomasini 2003

1.1.3.1. Coliformes Totales

El grupo coliforme se define como todas las bacterias Gram

negativas en forma bacilar que fermentan la lactosa a

temperatura de 35 a 37 °C, produciendo ácido y gas (CO2) en

24 horas, aerobias o anaerobias facultativas, son oxidasa

negativa, no forman esporas y presentan actividad enzimático

de la B-galactosidasa (Ministerio de salud, 1998). Entre ellos

se encuentran los diferentes Escherichiacoli, Citrobacter,

Enterobacter y Klebsiella. (OPS 1987) mencionado por

(Carrillo y Lozano 2008)

La prueba mas relevante utilizada para la identificación del

grupo Coliformes, es la hidrólisis de la lactosa. El rompimiento

de este disacárido es catalizado por la enzima B-D-

Galactosidasa. Ambos monosacáridos (la galactosa después

es transformada en glucosa por reacciones bioquímicas)

posteriormente son metabolizados a través del ciclo glicolítico

y ciclo del citrato. Los productos metabólicos de estos ciclos

son ácidos y/o CO2. Para la determinación de la B-

Galactosidasa se utilizan medios cromógenos tales como

chromocult. (MANAFI, 1998) mencionado por (Carrillo y

Lozano 2008).

1.1.3.2. Enterobacteraerogenes

Genero de bacterias Gram negativas, anaerobias facultativas,

de la familia de Enterobacterias, muchas son patógenas y son

causa de infecciones oportunistas en huéspedes

comprometidos generalmente hospitalizados, causa infección

del tracto urinario y de tracto respiratorio. (Loessner M, et al.

1993) mencionado por (Carrillo y Lozano 2008).

Se encuentra en el tracto digestivo humano, aunque también

libremente en el suelo y agua; sus colonias son grandes y

mucosas, algunas cepas llegan a formar cápsula, como

fuentede carbono pueden utilizar glucosa y lactosa, no forman

sulfato de hidrogeno. (Shekhar N.C et al. 2007) mencionado

por (Carrillo y Lozano 2008).

Carrillo y Lozano (2008) mencionan que la Escherichiacoli y

Enterobacteraerogenes, son dos bacterias idénticas en

muchas formas superficiales, ambas fermentan lactosa

produciendo ácido y gas, son bacilos Gram negativos pero en

agar EMB, E.coli produce un subproducto del metabolismo de

dicho azúcar que reacciona produciendo un brillo metálico en

la luz reflejada y Enterobacteraerogenes no lo hace, en cuanto

a pruebas bioquímicas se presenta la siguiente comparación:

Tabla N° 02: Pruebas Bioquímicas de detección de E. Coli y E. Aerogenes

Prueba Bioquímica E.coli EnterobacterAerogenes

Producción de Indol + -

Rojo de Metilo + -

VogesProskauer - +

Citrato - +

Lisina descarboxilasa +

Hidrólisis de la esculina +

Utilización de malonato - +

Arginina deshidrolasa +

Fuente: Gamazo .C, et al. 2005 mencionado por (Carrillo y Lozano 2008).

1.1.3.3. Coliformes Fecales

Los coliformes fecales también denominados

coliformestermotolerantes, llamados así porque soportan

temperaturas hasta de 45°C, comprenden un grupo muy

reducido de microorganismos los cuales son indicadores de

calidad, ya que son de origen fecal. En su mayoría están

representados por el microorganismo E. coli pero se pueden

encontrar, entre otros menos frecuentes, Citrobacterfreundii y

Klebsiellapneumoniae estos últimos hacen parte de los

coliformestermotolerantes, pero su origen se asocia

normalmente con la vegetación y solo ocasionalmente

aparecen en el intestino. (HAYES; 1993)mencionado por

(Carrillo y Lozano 2008).

Los coliformes fecales integran el grupo de los coliformes

totales, pero se diferencian de los demás microorganismos

que hacen parte de este grupo, en que son indol positivo, su

rango de temperatura óptima de crecimiento es muy amplio

(hasta 45°C) y son mejores indicadores de higiene en

alimentos y en aguas, la presencia de estos indica presencia

de contaminación fecal de origen humano o animal, ya que las

heces contienen dichos microorganismos, presentes en la flora

intestinal y de ellos entre un 90% y un 100% son E. coli

mientras que en aguas residuales y muestras de agua

contaminadas este porcentaje disminuye hasta un 59%.

(GOMES; 1999) mencionado por (Carrillo y Lozano 2008).

1.1.3.4. Escherichiacoli

Originalmente llamada Bacteriumcomune, fue aislada por

primera vez en 1985 a partir de heces de niños; son bacilos

estrechos de 1,1 a 1,5 µm de diámetro y de 2 a 6 µm de

longitud, se encuentran solos o en parejas, Gram negativos,

móviles por flagelos perítricos o inmóviles, anoxigénicos

facultativos, poseen metabolismo respiratorio y fermentativo.

(LEMINOR, 1994).

Perteneciente a la familia Enterobariaceae, son coliformes

capaces de producir indol a partir de triptófano, en 21 +/- 3

horas a 44 +/- 0.5°C. También poseen la enzima B-

Galactosidasa, que reacciona positivamente en el ensayo del

rojo de metilo y pueden descarboxilar el ácido L- glutámico,

pero no son capaces de utilizar citrato como única fuente de

carbono o de crecer en un caldo con cianuro de potasio

(KCN). (MILLIPORE; 2005).

E. coli es la única especie dentro de las Enterobacterias que

presenta la enzima B-D- Glucoronidasa, que degrada el

sustrato 4-metilumberiferil-p-D-glucorónico (MUG), formando

4-metilumbeliferona, este producto tiene la propiedad de emitir

fluorescencia azul/verde cuando se ilumina con luz ultravioleta.

(MANAFI, 1998).

E.coli presenta características bioquímicas importantes que

permiten la diferenciación con otros coliformes, como ser

positivo para la prueba de indol.

El indol es uno de los productos de degradación metabólica

del aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la

triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el

triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco.

La prueba de indol está basada en la formación de un

complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído

del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo del

reactivo de Kovac's descrito más adelante. El medio de cultivo

utilizado debe ser rico en triptófano (HOPKINS,K.L y HILTON,

A.C. 2000)

Tabla 4. Características de Coliformes Totales y E. coli

COLIFORMES TOTALES E. COLI

Bacterias Gram Negativas Bacterias Gram negativas

No esporulados No esporulados

Anaerobios facultativos Anaerobios facultativos

Fermentadores de la lactosa con

producción de ácido y gas a 36+/- 1°C en

24-48 horas

Fermentadoras de la lactosa con producción de

ácido y gas a 36 +/- 1°C en 24-48 horas y 44.5

+/- 0.2°C en 24 horas

Hábitat: Tracto gastrointestinal de

animales de sangre caliente (bacterias

entéricas) son comunes en otros

ambientes (suelos, vegetales, agua)

Características de heces de animales

homeotermos

Fuente: Memorias seminario internacional: El agua y los riesgos para la salud

1.1.3.5. Salmonella spp.

Bacilo corto (1.2 µm). Gram negativo, no esporulado y

generalmente móvil con flagelos perítricos. El género

Salmonella contiene unas 2000 cepas distintas (denominadas

serovares o serotipos) de acuerdo a sus antígenos O y H.

Salmonella spp se caracteriza bioquímicamente por su

capacidad de fermentar la glucosa con producción de ácido y

gas y por su capacidad de hidrolizar la lactosa y la sacarosa.

Su temperatura óptima de crecimiento, como la de la mayoría

de las bacterias causantes de toxiinfecciones alimentarias esta

próxima a los 37°C; son relativamente fotosensibles y se

destruyen a 60°C en unos 15 – 20 minutos, siendo incapaces

de crecer por debajo de los 7 u 8°C (Doyle; et al.; 1997)

1.1.4. Técnica De Filtración Por Membrana Para Detección De Coliformes

Totales Y Fecales

Carrillo y Lozano (2008) mencionan que para la determinación de

coliformes totales y fecales en agua potable, la legislación

colombiana en la resolución 2115 de 2007, recomienda entre otras

técnicas, la de filtración por membrana.

La técnica de filtración por membrana utiliza un mecanismo mediante

el cual se atrapan en la superficie de una membrana

microorganismos cuyo tamaño es mayor que el tamaño del poro

(0.45 µm); esto gracias a una bomba eléctrica que ejerce una presión

diferencial sobre la muestra de agua haciendo que se filtre. Los

microorganismos de tamaño menor que el específico del poro pasan

la membrana o quedan retenidos en su interior, las bacterias quedan

en la superficie de la membrana y luego esta es llevada a un medio

enriquecido, selectivo o diferencial, quien a través de intercambio

metabólico y una incubación, evidencian el crecimiento de

microorganismos y Unidades Formadoras de Colonia. (APHA -

AWWA - WPCF, 2000).

Esta técnica es altamente reproducible y proporciona resultados

numéricos, es una manera rápida y simple de estimar las

poblaciones bacterianas en el agua, y especialmente útil al evaluar

grandes volúmenes o al realizar diariamente muchas pruebas de

Coliformes (HACH, 2000).

El equipo de soporte del filtro (Fabricado en vidrio, plástico resistente

a autoclave, porcelana o acero inoxidable) consiste en un embudo,

unido a una base por un artefacto de cierre que se mantiene en su

lugar mediante una fuerza magnética. El diseño debe permitir que la

membrana se mantenga con seguridad sobre la placa porosa, sin

que sufra daño mecánico, de manera que todo el líquido pase a

través de la membrana durante la filtración. (APHA, 1992)

1.1.4.1. Filtros de membrana

Se deben utilizar filtros de membrana con un diámetro de poro

que permita una completa retención de las bacterias

coliformes. Solo se emplean filtros en los que se haya

comprobado, mediante una adecuada prueba de control de

calidad y por garantía del fabricante, que permita una

retención de las bacterias coliformes. (APHA, 1992).

Se debe tener en cuenta, que dichos filtros deben ser libres de

químicos susceptibles de inhibir el crecimiento y desarrollo

bacteriano, que posean una velocidad de filtración

satisfactoria, ausencia de influencias significativas sobre el pH

del medio (no mas de +/- 0.2 unidades) y que no produzcan un

aumento en el número de colonias confluentes o expansivas,

en comparación con los filtros de membrana de control (APHA,

1992).

Se recomienda utilizar filtros de membrana preesterilizados

cuyos fabricantes garanticen que la técnica de esterilización

no ha inducido toxicidad ni alterado las propiedades físicas o

químicas de la membrana, si estas se esterilizan en el

laboratorio se deben someter al autoclave por 10 minutos a

121°C. (APHA, 1992).

El mecanismo de acción es muy simple: retienen todas las

partículas que posean un tamaño mayor que los poros, estos

poros quedan formados por los espacios que resultan de la

superposición de las fibras de las distintas capas que forman

la membrana, así algunas partículas de menor tamaño son

retenidas por otros mecanismos como las fuerzas de Van der

Waals o por la suma de partículas retenidas previamente

(PEARCE, 2007)

1.1.4.2. Tipos de filtro de membrana

1.1.4.2.1. Filtros de profundidad

Están elaborados por un material fibroso (papel, asbesto o

fibra de vidrio) dispuesto al azar, de manera que dentro de la

estructura del filtro se crean vías tortuosas donde pueden

quedar retenidos la mayoría de los contaminantes presentes.

Presenta ventajas como la alta capacidad de retención de

partículas sobre su superficie y a través de toda su estructura

y que permiten filtrar grandes volúmenes. Presenta

desventajas en cuanto a que no presentan un tamaño de poro

uniforme y existe la liberación, hacia el material filtrado, de

partículas y microorganismos que hayan crecido dentro del

filtro.(Carrillo y Lozano 2008).

1.1.4.2.2. Filtros de superficie o membrana

Elaborados generalmente de acetato de celulosa o nitrato de

celulosa, contienen poros de tamaño uniforme. Se pueden

saturar rápidamente y la velocidad de filtración a través de

ellos es lenta.(Carrillo y Lozano 2008).

1.1.4.2.3. Membrana de nitrato de celulosa

La nitrocelulosa es un material utilizado de manera habitual

para la fabricación de filtrosde membrana. Estas membranas

son de naturaleza hidrofílica, con una microestructuramuy

uniforme lo que permite excelentes niveles de retención de

partículas y uncomportamiento perfecto en pruebas

microbiológicas. (http://fanoia.com/filterlab/micro-8-

15.pdf)Tienen una estructura de poro muy uniforme,lo que

asegura una excelente retención y un óptimo crecimiento

microbiológico en muestras de agua, bebidas,

fármacos(PEARCE, 2007).

1.1.4.2.4. Membrana de acetato de celulosa

Son de naturaleza hidrofilia, presentan una excelente

estabilidad térmica, permiten gran capacidad de carga y

altasvelocidades de flujo, por lo que resultan apropiados para

la esterilización y clarificación de soluciones acuosas,

alcohólicas y aceites. Las partículas más grandes que el

tamaño del poro son rechazados por la superficie de la

membrana y el remanente permanecen o se concentra allí. El

volumen del fluido y otras partículas finas de menor tamaño

del poro pueden pasar a través de la membrana al sitio de

filtrado (PEARCE, 2007).

Tabla 6. Aplicaciones de los filtros de membrana

Filtros de nitrato de celulosa Filtros de acetato de celulosa

Filtración de aguas Esterilización de muestras de proteínas

Análisis microbiológico Esterilización de fluidos biológicos

Análisis gravimétrico Filtración de alcoholes

Análisis cualitativos de partículas Filtración de aceites

Esterilización de muestras Filtración de muestras de aguas

Determinación de proteínas

Identificación de ácidos nucleicos

Pre filtración de muestras

Clarificación de muestras

Fuente. http://www.fanoia.com/filterlab/micro-8-15.pdf

1.1.5. Medios De Cultivo

Un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes en donde

crecen, y se multiplican los microorganismos, con el objetivo de aislar

diferentes especies de microorganismos que induzcan al desarrollo

de estrategias complementarias de identificación, cuantificación,

caracterización de la microflora (Tortora, G. 1993). De la inocuidad y

de la capacidad de recuperación del medio de cultivo, así como de su

posterior manipulación dependen en gran medida los resultados de

una prueba microbiológica. (Tortora, G. 1993).

Los medios de cultivo se pueden clasificar de la siguiente manera:

Según su estado físico: líquidos, semisólidos y sólidos Según su

finalidad:

No selectivos: contienen los nutrientes suficientes para soportar el

crecimiento de gran variedad de microorganismos.

Selectivo: permite el crecimiento de solo un tipo de microrganismo.

Enriquecido: son medios no selectivos a los que se le agregan

sustancias como sangre, suero, albumina, etc., para

microorganismos exigentes.

Diferenciales: son medios de cultivo que permiten establecer

diferencias entre diferentes tipos de microorganismos. (ISO\TS

11133-2: 2003)

La composición química del medio de cultivo debe proveer

losrequerimientos nutricionales básicos para el crecimiento

demicroorganismos, sin embargo un medio de cultivo debe cumplir

con dos características muy importantes. La selectividad y

laproductividad. Su productividad se refiere a la formulación básica

del medio de tal forma que favorezca el crecimiento de

microorganismos con las características macroscópicas y

microscópicas esperadas. (Tortora, G. 1993).

Además de las características anteriormente mencionadas, existen

otras pruebas de control de calidad que se realizan a los medios de

cultivo, entre ellas podemos encontrar: propiedades bioquímicas

(diferenciales y diagnosticas), propiedades físicas (pH, volumen) y la

especificidad (cuando se trate de medios con características de

diferenciales) (ISO\TS 11133-2: 2003).

1.1.5.1. Medios cromógenos

Basados en sustancias químicas que añadidas al medio dan

un precipitado coloreado que demuestra la presencia de una

enzima especifica, si el microorganismo posee el sistema

enzimático para utilizar el sustrato, se produce un cambio

decolor visible en las colonias. Son medios rápidos, sencillos y

fiables para detectar actividades enzimáticas especificas de

varios organismos. (Tortora, G. 1993).

1.1.5.1.1. Medio Chromocult para Coliformes

Es un agar selectivo para el crecimiento de coliformes totales y

E. coli en muestras de aguas y alimentos. Por la acción

conjunta de peptonas selectivas, piruvato y tampón de fosfatos

se garantiza un rápido crecimiento también de coliformes con

daños sublaterales. El contenido de lauril sulfato inhibe el

crecimiento de bacterias Gram positivas sin tener influencias

negativas sobre el crecimiento de los coliformes. La formación

simultánea de coliformes totales y E. coli se hace posible por

la nueva formación de dos sustratos cromógenos: el sustrato

Salmon - Gal es separado por la enzima p-D-

galactosidasacaracterístico de coliformes y provoca una

coloración roja de las colonias de coliformes. (MERCK, 1998).

La formación de la p-D-Glucoronidasa característica para E.

coli tiene lugar mediante el sustrato X- glucorónido, que al ser

cortado por la encima produce una coloración azul para las

colonias positivas. Ya que E. coli separa tanto Salmon-Gal

como X- Glucorónido, las colonias se tiñen de violeta - azul

oscuro y debido a ellos se pueden diferenciar de los coliformes

restantes que se presentan de color rojo. (MERCK, 1998).

El contenido de triptófano mejora la reacción de indol para la

confirmación adicional de E. coli que se dá con el reactivo de

kovac's y aumenta con ello la confirmación de la reacción

Salmon -Gal y la reacción X-Glucorónido (MERCK, 1998).

1.1.5.2. Ventajas de los medios cromógenos frente a los

convencionales.

La identificación bacteriana se basa generalmente en una

extensa batería de pruebas bioquímicas convencionales, que

permiten determinar sus características de desarrollo y de

metabolismo; estos métodos requieren una colonia

bacterianapura, tomada de una placa de aislamiento primario,

su siembra en diferentes medios y su posterior lectura e

interpretación. En la mayoría de los casos el diagnóstico lleva

tiempo y varios pasos de manipulación.

Los sustratos enzimáticos sintéticos realizan la identificación

de microorganismos por medio de la formación de color que

ponen de manifiesto la presencia de enzimas específicas para

cada especie.

En general se distinguen grupos de compuestos cromogénicos

que han sido usado en reacciones bioquímicas para estudiar

la cinética de enzimas especificas, de acuerdo al principio, que

el sustrato es hidrolizado por la enzima especifica, liberando

un cromóforo, permiten identificar un microorganismo

específico en un tiempo, evitando una cantidad de pasos que

hacen mas tedioso el trabajo de identificación, logrando

visualizar de forma rápida especies diferentes en una misma

muestra analizada. (Moreno. C. 2004)

2.5. VALIDACIÓN Validar es demostrar con un alto grado de

confianza, por medio de evidencia documentada que un

proceso especifico producirá de forma consistente productos

que reunirán las características de calidad predefinidas

(CORTES, 2002; FDA, 1987). Este proceso además ofrece

evidencia de que un método es capaz de servir para su

propósito planteado, para tal fin se deben reflejar las

condiciones reales de ensayo, esto puede conseguirse usando

productos contaminados o productos inoculados con un

número conocido de microorganismos (ENAC, 2002; GTC 84,

2003).

El proceso de validación se inicia con las actividades de pre

validación, las cuales consisten en la recopilación de la

información relacionada con el proceso, en la revisión de las

evaluaciones de riesgos, la calificación técnica a las

instalaciones locativas y a los equipos, existencia de

procedimientos para las tareas u operaciones y el

entrenamiento a los trabajadores. Posteriormente se procede

a elaborar los protocolos en donde se define los objetivos

específicos de las evaluaciones a efectuar, las

responsabilidades de cada una de las áreas involucradas en la

validación, se establecen las variables de

17

interés que se quieren monitorear y el plan de monitoreo

respectivo, además de incluir los criterios de aceptación que

no son otra cosa que la comparación de los resultados con los

niveles permisibles o los resultados esperados. (Estrada C,

1999) A continuación se desarrolla la validación propiamente

dicha en donde se realiza una evaluación de una muestra

representativa, en número de lotes de producción si la

producción es por lotes o en tiempo si esta es continua.

Durante esta fase se recopilan las muestras de las variables

que se desean medir y se realizan los análisis o cálculos

respectivos. Finalmente con los resultados arrojados por el

proceso anterior se hacen las recomendaciones respectivas y

conclusiones, que después de cumplir un plan de acción se

cierran y se procede a declarar el proceso como validado.

(Estrada C, 1999) Para la recuperación e identificación

microbiana, los análisis microbiológicos, son ajustables a

veces, a métodos alternativos a los descritos en la USP por

diversas razones: económicas, de producción, y tiempo. Por

tanto estos métodos requieren ser validados. (USP 31, 2008)

En Los métodos microbiológicos alternativos es importante

tener en cuenta un cierto grado de variabilidad. Cuando se

llevan a cabo pruebas microbiológicas por conteo en placa

convencional, se puede llegar a encontrar resultados con

porcentajes de desviación estándar relativa de 15 a 35 ya que

muchos métodos microbiológicos convencionales están

sujetos a errores de muestreo, de dilución, de incubación y del

operador. (USP 31, 2008). Incluso cuando se haya realizado la

validación, el laboratorio tendrá que verificar periódicamente

que se cumplen los parámetros documentados, utilizando por

ejemplo muestras inoculadas o materiales de referencia

incorporados a las matrices más representativas. (ENAC,

2002). 2.5.1. Parámetros de Desempeño de la Validación Son

las propiedades, características o capacidades del método.

2.5.1.1. Especificidad Capacidad de un método de determinar

inequívocamente un analíto/parámetro en presencia de los

otros componentes de la muestra. La especificidad puede ser

afectada por la presencia de interferentes (como precursores

de síntesis, impurezas, productos de degradación, entre

otros). (OGA-016,2004).

2.5.1.2. Exactitud, es la cercanía de un resultado al valor

verdadero por comparación con los valores de referencia de

un material caracterizado (material de referencia). Los valores

de referencia deberían ser trazables a las normas

internacionales; los materiales de referencia certificados

(MRC) generalmente se aceptan como trazables. Es ideal que

el material de referencia sea de matriz natural lo mas similar

posible a las muestras de interés. (RODRÍGUEZ, 2004).

Usualmente, la exactitud se expresa como el porcentaje de

recuperación de los microorganismos mediante el método de

validación. (USP 31, 2008). 2.5.1.3. Precisión Las dos

medidas más comunes de la precisión, que generalmente se

define en términos de desviación estándar o el coeficiente de

variación (desviación estándar relativa) son la repetibilidad y la

reproducibilidad. La repetibilidad, da una idea de la variabilidad

que se espera cuando un proceso es aplicado por un solo

analista en un equipo durante un periodo corto (análisis por

duplicado). La reproducibilidad, es la que representa la

variabilidad que se obtiene cuando un proceso es analizado

por diferentes analistas, lo cual tiene un valor más amplio. La

precisión intermedia y más útil en casos específicos se obtiene

cuando se evalúa reproducibilidad entre analistas en un mismo

laboratorio. (RODRÍGUEZ, 2004).

2.6. VALIDACIÓN Y SELECCIÓN DE MÉTODOS DE

ENSAYO MICROBIOLÓGICO El análisis microbiológico tiene

como fin proporcionar información confiable acerca de la

inocuidad y calidad sanitaria de una muestra cualquiera. Es

por ello que es indispensable la elección de un método de

ensayo adecuado. Para decidir si un método es apropiado o

no, se debe tener en cuenta: si ese método es aplicable a la

muestra analizar a analizar, la cantidad de muestra necesaria

para el ensayo, si usando esta metodología se puede evaluar

el cumplimiento de las exigencias requeridas para el analíto. El

laboratorio debe elegir los métodos que mejor se adecuen a

sus objetivos y debe documentarlos debidamente.

(GUARNIZO, 2005).

Existen tipos principales de determinaciones propias de las

pruebas microbiológicas, entre las que se incluyen: Pruebas

para determinar si los microorganismos están presentes en

una muestra y pruebas para cuantificar el número de

microorganismos. (USP 31, 2008)

2.6.1. Pruebas cualitativas para detectar la presencia o

ausencia de microorganismos Este tipo de pruebas se

caracteriza por el uso de turbidez en un medio líquido de

crecimiento como evidencia de la presencia de

microorganismos viables en la muestra de la prueba. (USP 31,

2008)

2.6.2. Pruebas cuantitativas para microorganismos

El método de recuento en placa es el ejemplo más común de

esta clase de pruebas que se emplean para estimar el número

de microorganismos viables en la muestra. (USP 31, 2008)

Tabla 8. Parámetros de Validación por tipo de prueba microbiológica

Parámetro Pruebas cualitativas

Pruebas cuantitativas

Exactitud No SiPrecisión No SiEspecificidad Si SiLímite de detección

Si Si

Límite de cuantificación

No Si

Linealidad No SiRobustez Si SiRepetibilidad Si Si

Un laboratorio debe validar los métodos no normalizados, los métodos que diseña

o desarrolla, los métodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, así

como las ampliaciones y las modificaciones de los métodos normalizados, para

confirmar que son aptos para el fin previsto. La validación debe ser tan amplia

como sea necesario para satisfacer las necesidades del tipo de aplicación o del

campo de aplicación dados. El laboratorio debe registrar los resultados obtenidos,

el procedimiento utilizado para la validación y una declaración sobre la aptitud del

método para el uso previsto. (ENAC, 2002).

2.6.3. Métodos normalizados

Son métodos que el laboratorio aplica como ya esta descrito en un procedimiento

o en una norma, en este caso también es necesario anexar o volver a escribir bajo

forma de procedimientos las especificaciones reconocidas que tengan suficiente

información para realizar los ensayos (G-ENAC. 1997) . El laboratorio debe

confirmar que puede operar correctamente los métodos normalizados antes de

introducir los ensayos. Si el método normalizado cambia se debe repetir la

confirmación. 2.6.4. Métodos desarrollados por el laboratorio Elaborados en el

laboratorio y no se encuentran en ningún documento oficial, debe ser una

actividad planificada y debe ser asignada a personal calificado y proveer los

recursos necesarios (G-ENAC. 1997) 2.6.5. Métodos normalizados con

modificaciones Son métodos tomados de una norma, pero con alguna

modificación, tal es el caso de una filtración con membrana utilizando otro medio

de cultivo diferente; aquí se debe realizar lo mismo a como si se estuviera

realizando la validación de un método desarrollado por el laboratorio, debido a que

ya existe una modificación sobre el método normalizado (G-ENAC. 1997).

2.7. PRERREQUISITOS DE LA VALIDACIÓN

2.7.1. Monitoreo ambiental La calidad microbiológica del aire y las superficies de

laboratorio son un indicador de la efectividad de las tareas realizadas según el

programa de limpieza y desinfección.

El programa de muestreo para monitoreo ambiental incluye: Determinación

cuantitativa de microorganismos presentes en el ambiente (recuento total de

determinado tipo de microorganismos, por ejemplo: hongos y levaduras,

mesófilos). Determinación cualitativa dependiendo de los ensayos que realiza el

laboratorio (ejemplo: Enterobacterias, coliformes, Salmonella spp). El laboratorio

debe definir los recuentos máximos de microorganismos que considere aceptable

y disponer de un procedimiento documentado en el que se describan las acciones

a tomar para corregir las situaciones en que sobrepasen estos límites.

Se recomienda realizar como mínimo los siguientes controles microbiológicos,

aunque es importante resaltar que existe variedad de métodos para llevarlos a

cabo: Monitoreo de la calidad del aire por exposición de placas o equipos

muestreadores Monitoreo de la calidad microbiológica de las superficies de

trabajo, por frotación con hisopos o por placas rodac Control de dotación y de

personal (VILLOCH, C.A. 2002)

Se debe limpiar y desinfectar el espacio de ambiente controlado, en el cual se

desarrolla el procedimiento. Este permitirá a la empresa mantener un nivel mínimo

consistente de contaminación, en pisos y mesón de muestras, es importante

siempre tener en cuenta que en las cabinas se exige cero contaminación. Un

método eficiente es la desinfección apropiada mediante un sistema de rotación de

desinfectantes, usando generalmente los de tipo fenólicos, amonios cuaternarios,

aldehídos, peróxidos y haluros. En el caso de algunos equipos que no se pueden

esterilizar por los diversos métodos como: Equipos eléctricos y electrónicos,

balanzas, baterías, etc.; la desinfección de estos equipos debe ser más rigurosa

debido a su potencial de contaminación con un gran número de microorganismos.

(CARLENTON, 1999)

2.7.2. Escala de Mc Farland La escala de Mc Farland, es utilizada como estándar de turbidez en la preparación de

suspensiones de microorganismos. Los estándares de turbidez son preparados por la mezcla de químicos que se precipitan

para formar una solución de turbidez reproducible. Son realizados adicionando ácido sulfúrico a una solución acuosa de

cloruro de bario, del cual resulta la formación de un precipitado de sulfato de bario (ZIMBRO Y POWER, 2003) Esta escala

de turbidez es elaborada con una mezcla de BaCl2 de 0.048 M y H2S04 0.6 M, la turbidez la da el BaCl2, el cual va en

cantidad creciente mientras al ácido sulfúrico va disminuyendo la proporción. (ESCOBAR, 2002) Cada uno de los tubos del

patrón de acuerdo con la turbidez, representa un número de bacterias, para suspensiones de igual turbidez, que ha sido

determinado por recuentos de colonias. De esta forma al comparar una emulsión de bacterias con el tubo del patrón de Mc

farland que más se asemeje se puede saber aproximadamente el numero de bacterias en la emulsión (ESCOBAR, 2002)

2.7.3. Medios de cultivo

Los medios de cultivo seleccionados deberán ser evaluados con la prueba de promoción de crecimiento de bacterias,

mohos y levaduras. Las unidades de promoción de crecimiento deben ser inoculadas con un número menor de 100 UFC. Si

las pruebas de promoción de crecimiento fallan, se debe investigar el origen de cualquier contaminación encontrada durante

la simulación y repetir la prueba. (ROGANTI, 2004) 2.7.3.1. Esterilización del medio de cultivo El medio seleccionado debe

ser esterilizado por uno de los dos métodos primarios, filtración o esterilización por vapor. La esterilización por filtración

requiere que el medio pase por un filtro de 0.22μm a un contenedor previamente esterilizado; este método presenta

dificultad debido a que los medios de cultivo son mezcla de varios materiales naturales y una cantidad considerable de

estos son sólidos no solubles que se encuentran presentes en la mezcla acuosa. (CARLENTON, 1999) El proceso con

vapor (autoclave) emplea la esterilización terminal del medio en un contenedor del cual será dispensado para el envase,

este procedimiento terminal reduce la necesidad de manipulación post-esterilización que puede comprometer la esterilidad

del medio. (CARLENTON, 1999)

Después de la esterilización del medio este debe ser manejado realizando las mismas practicas usadas para las

operaciones de producción rutinarias. Algunas empresas siguen algunos pasos adicionales como la preincubación del

medio antes de empezar la corrida de la prueba, para asegurarse de la esterilidad del medio antes del envase de este.

(CARLENTON, 1999) 2.7.3.2. Incubación Los medios se deben incubar en condiciones adecuadas de modo que se puedan

evidenciar los microorganismos que podrían de otra manera ser difíciles de cultivar. Se deben establecer las condiciones de

incubación de acuerdo con las siguientes pautas generales: La temperatura y el tiempo de incubación debe ser conveniente

para la recuperación de la carga microbiana, en ningún momento deben estar fuera del rango de 20-35°; y se debe

mantener dentro de +/- 2.5°C de la temperatura requerida. (CARLENTON, 1999) 2.7.3.3. Control de autoclave Para verificar

que el proceso de esterilización se realiza en forma adecuada, se realiza un control por cada ciclo introduciendo un vial que

contiene esporas de Bacillus stearothermophilus en el autoclave. (I-DCM 008 “USO Y MANEJO DE BIOINDICADOR EN

PROCESO DE ESTERILIZACIÓN” Codificación correspondiente al Sistema de Gestión de Calidad de INTERPHARM de

COLOMBIA Ltda.) Esta prueba consiste en introducir en el autoclave viales de Bacillus stearothermophilus en posiciones

establecidas, junto con el material que se esta esterilizando en los parámetros normales, cuando finaliza el proceso se

incuba y se determina el crecimiento o no por medio del cambio en el indicador de pH que se encuentra en la ampolleta.

(NTC - 4543, 1998). Adicionalmente el autoclave debe estar calificado (se debe tener en cuenta la ultima fecha de la

calificación del autoclave), para de esta manera asegurar la adecuada distribución de calor para cargas y volúmenes

definidos, usualmente se recomienda que se use un ciclo de autoclave de 121° durante 15 minutos (USP 31, 2008). Para

llevar a cabo la calificación del autoclave existen tres etapas fundamentales: certificación de la instalación (CI), certificación

operativa (CO) y certificación funcional (CF).

En el caso de la certificación de la instalación, se debe registrar toda la información de identificación (nombre del equipo,

descripción, número de modelo e identificación, certificados de compra), ubicación, requisitos de servicios básicos y

cualquier característica de seguridad del equipo (fácil acceso a todos los planos, manuales, listas de repuestos, dirección

del vendedor y numero telefónico de contacto). En cuanto a la certificación operativa: se debe describir toda la información

necesaria en la que conste que todos los componentes del equipo (autoclave), funcionan según lo especificado; esto se

obtiene sometiendo a prueba todos los controles de operación normal, todos los puntos de alarma, todos los interruptores y

dispositivos visualizadores. Para finalizar el proceso de calificación del autoclave, se realiza la certificación funcional, en la

cual se describe el procedimiento necesario para demostrar que el sistema del equipo funciona uniformemente y cumple las

especificaciones exigidas bajo la operación cotidiana (OMS, 1998) 2.7.4. Documentación Es esencial que el programa de

validación este documentado y que la documentación sea mantenida correctamente. Es importante registrar los detalles del

proceso (ej. tiempo, equipo usado) y registrar los cambios que hayan ocurrido. Un registro del mantenimiento puede ser útil

en la ejecución de investigaciones de fallas referentes a un lote específico de fabricación. Los datos de la validación (junto

con datos de pruebas específicas) pueden también determinar la variación prevista en las características del producto o el

equipo (RODRÍGUEZ, 2004). 2.7.5 Desarrollo del protocolo de validación El propósito del protocolo de validación es

demostrar que el proceso es reproducible y está normalizado de manera que los resultados que provee serán comparables

a los de otro proceso en un lugar diferente y viceversa. (RODRÍGUEZ. 2004) El protocolo consta de: Identificación del

proceso que se va a validar Criterios objetivos y que se pueden medir para una validación exitosa Duración de la validación

Turnos, operadores, equipo que se va a usar en el proceso Identificación de servicios para el equipo de proceso y la calidad

de los servicios Consideración del mantenimiento y reparaciones de equipo de fabricación Identificación de los operadores y

calificación del operador requerido Descripción completa del proceso

Cualquier control o condición especial que se coloque en los procesos precedentes durante la validación Parámetros de

proceso que se van a monitorear, y métodos para controlar y monitorear Características de producto o proceso que se van

a monitorear y métodos para monitorear Métodos estadísticos para recolección y análisis de datos

Se deben tener en cuenta las causas de variación controlables en un proceso de validación como son: temperatura,

humedad, variaciones de suministro eléctrico, vibración, contaminantes ambientales, pureza del agua usada en el proceso,

luz, variabilidad de los materiales, desgaste del equipo, factores humanos (entrenamiento, factores económicos, tensión,

etc.) (RODRÍGUEZ. 2004) 2.7.6 Informe Final de Validación Este informe resume y presenta todos los protocolos,

resultados y deriva conclusiones relacionadas con el estado de validación del proceso. Debe ser revisado y aprobado por el

equipo de validación y la administración. (RODRÍGUEZ. 2004)

2.1 ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACION

Antecedentes a nivel internacional

Carrillo y Lozano (2008) realizaron una validación utilizando el agar

Chromocult, como método alternativo en la detección de microorganismos

indicadores de la calidad del agua potable, gracias a su fácil manejo y

rápida recuperación para reducir costos y desarrollar procedimientos con

mayor eficacia y seguridad en el laboratorio INTHERPHARM DE

COLOMBIA Ltda, basados en la USP 31, realizando un análisis que

garantice resultados confiables y la disminución de los riesgos de reanálisis

que aumentan el tiempo de análisis y los costos.

En esta validación Carrillo y Lozano verificaron que el programa de

calibración y mantenimiento de los equipos, estuviera vigente, para de esta

manera poder garantizar el procedimiento realizado y los resultados

obtenidos. Luego realizaron pruebas preliminares en donde se llevo a cabo

la estandarización de los inóculos, realizando diluciones de un cultivo de 24

horas y comparando con el tubo 1 de la escala de Mac farland para E.coli

ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Enterobacteraerogenes

ATCC 13048, posteriormente se estandarizó la técnica filtración por

membrana con tres muestras de tres replicas cada una y después de

obtener los resultados esperados (30 UFC\ml aproximadamente) se realizó

la metodología para la validación de la técnica filtración por membrana,

analizando diez muestras de agua potable diferentes, con tres replicas para

cada una, mediante las cuales se realizaron recuentos de cada uno de los

microorganismos con los cuales fueron contaminadas las muestras de

agua, bajo condiciones alternadas, variando los analistas y los días de

análisis; se llevo acabo el análisis de una prueba estándar (agua estéril

para inyección, inoculada con cada uno de los microorganismos a evaluar

Escherchiacoli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028 y

Enterobacteraerogenes ATCC 13048), una solución de prueba (agua

potable inoculada con los microorganismos utilizados como prueba:

Escherchiacoli ATCC 8739, Salmonella typhimurium ATCC 14028 y

Enterobacteraerogenes ATCC 13048), un control negativo (agua potable

con tiosulfato de sodio al 1% y sin inocular) y una prueba combinando la

muestra de agua con los microorganismos a evaluar (agua potable +

Escherchiacoli ATCC 8739 + Salmonella typhimurium ATCC 14028; agua

potable + Escherichiacoli ATCC 8739 + Enterobacteraerogenes ATCC:

13048; agua potable + Escherichiacoli ATCC 8739 +

Enterobacteraerogenes ATCC 13048 ) de esta manera se obtuvieron, 30

recuentos por día para un total de 300 recuentos por analista, por lo tanto

se obtuvieron 600 datos en total, por los dos analistas, luego de obtener

todos los datos, se procedió a realizar el análisis y se determinaron los

parámetros cuantitativos para la validación del método.

La metodología se llevo a cabo con muestras de agua potable, provenientes

del acueducto de Bogotá que cumplen con las especificaciones descritas

según la resolución 2115 de 2007 Finalmente se logro concluir que el

método es reproducible y repetible, también se logro establecer que el

método es especifico para la demostración de coliformes Fecales, debido a

que para este grupo de microorganismos indicadores se logro obtener un

porcentaje de recuperación superior al 96%, comparado con los otros

microorganismos..

Por su parte Cote (2006),estudiola cloro resistencia de Coliformes en el

agua proveniente de la redde distribución de agua potable del Acueducto de

Bogotá. En este trabajo de investigación, se aisló e identificó las cepas

nativas decoliformes totales y E. coli en el análisis de agua potable de la red

dedistribución del Acueducto de Bogotá durante los días de

muestreoprogramados por el laboratorio de aguas, durante los meses de

Febrero aMayo del 2004 y se realizaron pruebas de clororesistencia, con el

fin dedeterminar si los coliformes totales y E. coli aislados son Cloro

Resistentes bajo las variables manejadas, es decir, que pueden

soportarconcentraciones de Cloro Libre entre 0.2 y 1.0 mg/L, que son

lasconcentraciones mínimas y máximas permitidas por el Decreto 475

de1998 para agua potable. Todo esto con el fin de poder abrir

diferentesalternativas de desinfección, descartar contaminación en la toma

demuestras, verificar la incidencia de la biopelícula de las tuberías de la

redde distribución en la calidad del agua potable.

Se aislaron e identificaron 5 cepas nativas de coliformes totales y E. coli y7

cepas nativas de Enterobacterias durante el análisis del agua de la redde

distribución del Acueducto de Bogotá. El 60% de estas bacteriasresistieron

la acción oxidativa del cloro en todas las concentracionesprobadas con 10

minutos de contacto; bajo condiciones controladas en ellaboratorio.

Asimismo, de las bacterias que fueron resistentes a laspruebas de 10

minutos de contacto, el 66% de éstas presentaronresistencia a todas las

concentraciones probadas, con 15 minutos decontacto; bajo condiciones

controladas en el laboratorio.

Antecedentes a nivel nacional

En el 2006, Schippne estudio la percepción sobre el agua y hábitos de

consumo en la población residente y oyente de Radio Programas del Perú

en Lima, Piura, Arequipa e Iquitos. Así mismo encontró que las personas

cuentan con conocimientos básicos sobre prácticas del cuidado del agua y

podrían hacer algo para evitar la contaminación de las aguas, lo cual indica

que existe una base de recepción favorable. Sin embargo, la problemática

del agua en cuanto a su posible escasez, parece no ser un asunto que

preocupa actualmente a las personas en el Perú, sólo el 36,6% considera

que en el país tenemos escasez de agua. Las personas no vinculan lo

suficiente los problemas del calentamiento global y el cuidado del medio

ambiente con los problemas del agua.

En Meza (2009) se puede encontrar un estudio sobre la educación

ambiental en la educación secundaria de chanchamayo y las actitudes de

los alumnos hacia la conservación del medio ambiente. Según los

resultados se estableció un nivel medio de incorporación de la educación

ambiental en las programaciones y ejecuciones de las áreas curriculares,

pero una actitud indiferente hacia la conservación del medio ambiente en

los estudiantes, y una correlación directa entre ambas variables.

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