María Cecilia Arango Jaramillo

Principales razones para controlar los microorganismos: Prevenir la transmisión de

enfermedades Evitar el deterioro de los alimentos y

otros materiales Evitar la contaminación en procesos

industriales que requieran cultivos puros, en laboratorios de diagnóstico o investigación.

Impedir la presencia de lama bacterial en las fábricas ( de papel y de azúcar).

Controlar las algas en las piscinas recreacionales y en los sistemas acuáticos de refrigeración.

Prevenir el deterioro bacterial en las pinturas a base de agua.

Controlar las manchas y la podredumbre de origen micótico en las maderas.

Impedir la incidencia de enfermedades en las cosechas agrícolas causadas por patógenos

Erradicar microorganismos de un hospedador que está infectado

DEFINICIONES Y CONCEPTOS

EsterilizaciónEsterilización: eliminación de toda forma de vida, incluídas las esporas.

AsepsiaAsepsia: técnicas empleadas para impedir el acceso de microorganismos al campo de trabajo.

HigienizaciónHigienización: Agente que reduce la población bacteriana hasta niveles seguros para las exigencias de la salud pública.

Condición sanitaria, limpieza.

Se aplica a objetos inanimados y matan el 99% de los microbios en crecimiento.

Tambien se le da el nombre de Sanitización

AntimicrobianoAntimicrobiano: agente que mata o inhibe el crecimiento de los microorganismos (antibacteriano, antifúngico, etc.).

MicrobicidaMicrobicida (GermicidaGermicida): agente que mata formas vegetativas, pero no necesariamente las esporas de un microorganismo (bactericida, fungicida, alguicida, etc.).

MicrobiostáticoMicrobiostático: agente que inhibe el crecimiento de microorganismos (bacteriostático, fungistático, etc.).

DesinfecciónDesinfección: es el proceso de destrucción de los agentes infecciosos.

DesinfectanteDesinfectante: Sustancias químicas que matan las formas vegetativas y no necesariamente las formas de resistencia de los microorganismos patógenos.

Se refiere a sustancias empleadas sobre objetos inanimados.

AntisepsiaAntisepsia: Operaciones o técnicas encaminadas a crear un ambiente que impida el desarrollo de los microorganismos e incluso pueda matarlos.

AntisépticosAntisépticos: Sustancias químicas que previenen el crecimiento o acción de los microorganismos ya sea destruyéndolos o inhibiendo su crecimiento y actividad.

Se refiere a sustancias que se aplican sobre el cuerpo

AntibiosisAntibiosis: fenómeno biológico que detiene o destruye el crecimiento microbiano debido a sustancias producidas por otro ser vivo.

AntibióticosAntibióticos: sustancias producidas por un ser vivo que se oponen a la vida de otro ser vivo.

Agentes terapéuticosAgentes terapéuticos: antimicrobianos empleados en el tratamiento de infecciones.

Agentes quimioterapéuticosAgentes quimioterapéuticos: sustancias químicas empleadas en el tratamiento de enfermedades infecciosas o enfermedades causadas por la proliferación de células malignas.

MUERTE DE LAS POBLACIONES

MICROBIANAS Y CURVAS DE SUPERVIVENCIA

Criterio de muerte de un microorganismo: pérdida irreversible de la capacidad de reproducción en un medio adecuado. También implica destrucción de la célula

Proliferación: desarrollo y crecimiento de los microorganismos y por lo tanto, incremento de su población

Supervivencia: no hay ni muerte ni proliferación, permaneciendo los microorganismos inactivos o inhibidos.

Caso teórico de desinfecciónTiempo Supervivientes Muertes por

unidad detiempo

Totalmuertes

Porcentajetotal demuertes

1. 1.000.000 0 0 0

2. 100.000 900.000 900.000 90,0000%

3. 10.000 90.000 990.000 99,0000%

4. 1000 9.000 999.000 99,9000%

5. 100 900 999.900 99,9900%

6. 10 90 999.990 99,9990%

7. 1 9 999.999 99,9999%

Cuando una población microbiana se expone a un agente letal, la cinética de la muerte es casi siempre exponencial ya que el número de supervivientes disminuye de forma geométrica con el tiempo.

So

bre

vivi

ente

s

po

r u

nid

ad d

e vo

lum

en

100%

Lo

gar

itm

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lum

en

Tiempo (horas)

Factores que afectan el control de los microorganismos

El número de microorganismos El tiempo de exposición. La concentración del agente de control Condiciones ambientales locales El tipo de microorganismos La temperatura El estado físico de el microorganismo

El número de microorganismos

A mayor númeromayor número de microorganismos y/o resistenciaresistencia de la población se necesitará mayor mayor tiempotiempo de esterilización.

Para determinar el número de determinar el número de sobrevivientessobrevivientes es necesario conocer el tamaño inicial de la poblacióntamaño inicial de la población.

Para establecer los establecer los procedimientos de procedimientos de controlcontrol hay que considerar dos factores: la tasa de la tasa de mortalidad y el mortalidad y el tamaño de la tamaño de la población inicialpoblación inicial

Disminución progresiva en el número de microorganismos sobrevivientes en función del tiempo de exposición al agente

El tiempo de exposición.

D: tiempo requerido para reducir la población microbiana un 90%

Efecto de la concentración del agente de control

Tiempo (minutos)

L

og

ari

tmo

de

los

s

up

erv

ivie

nte

s p

or

ml

6,04 mg/l

4,62 mg/l

4,25 mg/l

3,48 mg/l

3,76 mg/l

3,96 mg/l

Efecto de diferentes concentraciones de fenol sobre una población de E.coli

Condiciones Ambientales

El calor es más eficaz en un medio ácido que en uno alcalino.

La consistencia del material, acuoso o viscoso, influye marcadamente en la penetración del agente.

Las concentraciones altas de carbohidratos aumentan, por lo general, la resistencia térmica de los organismos.

La presencia de materia orgánica La presencia de materia orgánica extraña reduce notablemente la eficacia extraña reduce notablemente la eficacia de los agentes antimicrobianos de los agentes antimicrobianos ::

No permite que el agente llegue al microorganismos

Se combina con el desinfectante y lo precipita

Se combina con el desinfectante y lo inactiva dejando libres concentraciones tan bajas que no logran el efecto deseado sobre la población microbiana

Desinfección por UVhttp://www.cepis.ops-oms.org/eswww/fulltext/aguabas/ultravio/ultravio.html

La naturaleza del microorganismo

Tipo de microorganismo: las células vegetativas en desarrollo son mucho más susceptibles que las esporas.

Estado fisiológico de las células: las células jóvenes son más vulnerables que las viejas.

Tiempo

La temperatura

L

og

ari

tmo

de

los

s

up

erv

ivie

nte

s p

or

ml

42°C

38°C

35°C

30°C

32.5°C

Efecto de la temperatura en el control de E.coli con fenol a una concentración de 4,62 g/l

El estado físico de el microorganismo

Agenteesterilizante

Escherichiacoli

Esporasbacterianas

Esporasfúngicas

Virus ybacteriófagos

Calor húmedo 1 3.000.000 2-10 1 - 5Calor seco 1 1.000 2 - 10 5Fenol 1 100.000.000 1 - 2 30Formaldehído 1 250 - 2Radiaciónultravioleta

1 2 - 5 5 - 100 5-10

Orahn, Bacteriol.Rev.,9, 1 , 1945

Modo de acción de los agentes microbianos:

Alteran la permeabilidad de la membrana

Dañan las proteínas y los ácidos nucleicos

Para determinar la eficacia antimicrobiana (la muerte de los microorganismos) se utilizan técnicas que descubran a los sobrevivientes es decir, a los capaces de reproducirse; ya que los incapaces de reproducirse están muertos.

Se utilizan métodos cuantitativos de siembra en placa en los que los supervivientes se detectan porque forman colonias.

FACTORES FISICOS DE CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

A.- Esterilización por calor húmedo: • Autoclave• Tindalización• Pasteurización• Herbir

B.- Esterilización por calor seco: • Horno• Incineración

Altas Temperaturas

La alta temperatura combinada con un alto grado de humedad es uno de los métodos más efectivos para destruir microorganismos.

El calor húmedo mata los microorganismos porque coagula sus proteínas siendo más rápido y efectivo que el calor seco que los destruye al oxidar sus constituyentes químicos.

Hay que distinguir entre calor húmedo y Hay que distinguir entre calor húmedo y calor seco:calor seco:

La acción letal del calor es una relación de temperatura y tiempo afectada por muchas condiciones.

Las esporas de Clostridium botulinum son destruidas:

En 4 a 20 minutos a 120° C en calor húmedo

En 2 horas de exposición al calor seco.

Bacteriostático

Bactericida

Bacteriolítico

Esterilización por calor húmedo

El calor en forma de vapor a

saturación y a presión

proporciona temperaturas superiores a las que se

obtienen por ebullición.

Autoclave:

El aparato utilizado se llama autoclave autoclave (una olla que

regula la presión interna y el tiempo).

Los autoclaves de laboratorioautoclaves de laboratorio : Presión de vapor de una atmósfera por

encima de la presión atmosférica lo cual corresponde a una temperatura de 120°C.

El tiempo de exposición depende del volumen del líquido, de tal manera que para volúmenes pequeños (hasta unos 3 litros) se utilizan 20 minutos a 120° C; si los volúmenes son mayores debe alargarse el tiempo de tratamiento.

Usualmente 15 minutos a 121°C

No se deben esterilizar en el autoclave:No se deben esterilizar en el autoclave: Sustancias que no se mezclan con el

agua porque no pueden ser alcanzadas por el vapor sobreviviendo los microorganismos que contengan.

Sustancias que se alteran o son destruidas por tratamientos prolongados de calor.

La esterilización comienza cuando se ha alcanzado la temperatura óptima en el interior del aparato (autoclave o estufa)

Según el contenido, un autoclave puede requerir tiempos más largos para alcanzar la temperatura

de esterilización.

Esterilización casera de frascos en olla a presión:

Se llena de agua la olla hasta 1/3 del alto de lo que se vaya a esterilizar

Se colocan los frascos bien lavados se tapa la olla y se deja a fuego vivo Cuando pita se saca el aire para que quede

sólo vapor de agua. Se deja volver a pitar y se baja el calor a

bajo Se dejan cuentan de este momento en

adelante 15 minutos. Se puede apagar el fuego y dejar enfriar

antes de sacar el material

Pasteurización:

Es un proceso que reduce la población microbiana de un líquido.

La leche, nata y ciertas bebidas alcohólicas (cerveza y vino), los jugos, se someten a tratamientos de calor controlado que sólo matan a ciertos matan a ciertos tipos de microorganismos pero no a tipos de microorganismos pero no a todostodos.

La leche pasteurizada no es estéril.

La temperatura seleccionada para la pasteurización se basa en el tiempo tiempo térmico mortal de microorganismos térmico mortal de microorganismos

patógenospatógenos

Es el tiempo más corto necesario para

matar una suspensión de bacterias a una temperatura determinada.

Mycobacterium tuberculosis es el patógeno más resistentes al calor que puede transmitirse por la leche cruda y se destruye en 15 minutos a 60° C.

Coxiella burnetti, agente causal de la fiebre Q, se encuentra a veces en la leche, es más resistente al calor que Mycobacterium tuberculosis por lo que la pasteurización de la leche se realiza:• A 62,8° C durante 30 minutos • A 71,7° C durante 15 segundos

Pasteurización tradicionalPasteurización tradicional: 63 a 65°C por 30 min

Pasteurización FlashPasteurización Flash: el líquido se calienta a 72 o C por 15 seg y rápidamente se enfría. Puede ser adaptada a flujos continuos.

UltrapasteurizaciónUltrapasteurización: 150 o C por 1-3 seg

Tindalización o pasteurización fraccionada:

Calentamiento del material de 80 a 100° C hasta 1 hora durante 3 días con sucesivos períodos de incubación.

Se utiliza cuando las sustancias químicas no pueden calentarse por encima de 100° C sin que resulten dañadas.

Las esporas resistentes germinarán durante los períodos de incubación y en la siguiente exposición al calor las células vegetativas son destruidas.

Esterilización por calor seco:

Horno :

La esterilización seca se logra a 160-170 °C por 2-3 hrs.

El calor seco se utiliza principalmente para esterilizar material de vidrio y otros materiales sólidos estables al calor.

Para el material de vidrio de laboratorio se consideran suficientes dos horas de exposición a 160° C.

Incineración:

La destrucción de los microorganismos por combustión o cremación.

En los laboratorios, las asas de siembra se calientan a la llama de mecheros Bunsen.

La incineración también se utiliza en la eliminación de residuos hospitalarios.

Bajas Temperaturas En general, el metabolismo de las bacterias se

inhibe a temperaturas por debajo de 0° C. No matan a los microorganismos sino que

pueden conservarlos durante largos períodos de tiempo.

Circunstancia aprovechada por los microbiólogos para conservar los microorganismos indefinidamente.

Los cultivos de microorganismos se conservan congelados a -70° C o incluso mejor en tanques de nitrógeno líquido a -196° C.

Para evitar el crecimiento de los microorganismos patógenos y alterantes en la carne:

1. Controlar que las carnes se expidan a la temperatura máximo adecuada: +7 para las canales y los cuartos, +3 para las vísceras, -12 para las carnes congeladas, -18 para las ultracongeladas, +4 para la carne de aves y de conejo.

2. Controlar que el mantenimiento de la cadena del frío

Controlar las condiciones en que se hace la descongelación de la carne.

3.- Radiaciones

A.- Radiaciones ionizantes• Rayos gamma • Rayos catódicos

B.- Radiaciones no ionizantes• Luz ultravioleta

Radiaciones ionizantes

Rayos gamma Las radiaciones gamma tienen mucha mucha

energíaenergía y son emitidas por ciertos isótopos radiactivos como es el Co60.

Son difíciles de controlardifíciles de controlar porque este isótopo emite constantemente los rayos en todas direccionesrayos en todas direcciones.

Estos rayos pueden penetrar penetrar materialesmateriales, por lo que un producto se puede empaquetar primero y después esterilizar.

Rayos catódicos

Radiación con haz de electrones electrones Se usan para esterilizar material

quirúrgico, medicamentos y otros materiales.

Ventaja: el material se puede esterilizar después de empacadodespués de empacado (ya que éstas radiaciones penetran las envolturas) y a la temperatura ambientetemperatura ambiente.

Radiaciones no ionizantes

Luz ultravioleta: Radiaciones con longitudes de onda

alrededor de 265 nm son las que tienen mayor eficacia como bactericidas (200 - 295 nm).

La luz UV tiene poca capacidad para penetrar la materia por lo que sólo los microorganismos que se encuentran en la superficie de los objetos que se exponen directamente a la acción de la luz UV son susceptibles de ser destruídos.

Se usan para reducir la población microbiana en:

Quirófanos Cuartos de llenado asépticos en la

industria farmacéutica Superficies contaminadas en la

industria de alimentos y leche. Bodegas de carne refrigeradas

Ondas ultrasónicas (sonicación) En general, los microorganismos

suspendidos en un líquido y sometidos a la acción de ondas ultrasónicas de altas intensidades (20,000 ciclos/seg.) durante cierto tiempo se destruyen porque se rompe la pared celular y se pierde el contenido de la célula.

Se usan en tratamiento de pequeños volúmenes de agua

Filtración Membranas con poros de un tamaño

determinado o materiales filtrantes. El tamaño del poro dependerá del uso al que se va a someter la muestra.

Los microorganismos quedan retenidos en parte por el pequeño tamaño de los poros del filtro y en parte por adsorción a las paredes del poro durante su paso a través del filtro debido a la carga eléctrica del filtro y de los microorganismos.

Debido al pequeño tamaño de los virus, nunca es posible tener certeza de que, por los métodos de filtración que dejan libre de bacterias una solución, se van a eliminar también los virus.

Son difíciles de utilizar en líquidos con muchos sólidos suspendido

Según el tamaño del poro se puede lograr esterilidad o reducción de los microorganismos

En las plantas de tratamiento de agua se logra remover hasta el 90-99% de los microorganismos filtrando el agua previamente floculada y sedimentada

La filtración se utiliza para Emulsiones oleosas, aceites, algunos tipos

de pomadas. soluciones termolábileS: líquidos biológicoslíquidos biológicos

(suero de animales, soluciones de enzimas, algunas vitaminas y antibióticos).

Esterilizar soluciones oftálmicas, soluciones intravenosas, drogas diagnósticas, radiofármacos, medios para cultivos celulares, y soluciones de antibióticos y vitaminas.

Existen tres tipos básicos de filtros:

Filtros profundos o Filtros de profundidad: consisten de un material fibroso o granular prensado, plegado, activado, o pegado dentro de los canales de flujo.

En este tipo de filtros la retención de las partículas se produce por una combinación de absorción y de retención mecánica en la matriz.

Filtros HEPA

Un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air)

Está compuesto por pliegues de acetato de celulosa que retienen las partículas (incluídos los microorganismos) del aire que sale de una campana de flujo laminar.

Membranas filtrantes: tienen una estructura continua, y la retención se debe principalmente al tamaño de la partícula.

Los filtros de membranas son discos de ésteres de celulosa con poros tan pequeños que previenen el paso de los microorganismos

Partículas más pequeñas al tamaño del poro quedan retenidas en la matriz del filtro debido a efectos electrostáticos.

Estos filtros son desechables.

Los filtros de membrana se utilizan en: La esterilización de líquidos En el análisis microbiológico de aguas ya

que concentran los microorganismos existentes en grandes volúmenes de agua.

Filtros de membrana de nitrocelulosa

Electron micrograph Schleicher and Schuell

Millipore

PVDF membrane.

Electron micrograph

Filtro de microfibras de vidrio. Electron micrograph Whatman

Filtros de huella de nucleación (Nucleoporo): son películas muy delgadas de policarbonato que son perforadas por un tratamiento conjunto con radiación y sustancias químicas.

Son filtros con orificios muy regulares que atraviesan la membrana verticalmente.

Funcionan como tamices, evitando el paso de toda partícula con un tamaño mayor al del poro.

Desecación

La desecación de las células vegetativas microbianas paraliza su actividad metabólica.

Este proceso se utilizaba ampliamente antes del desarrollo de la refrigeración.

El tiempo de supervivencia de los microorganismos después de desecados depende de muchos factores, entre ellos la especie especie microbiana. microbiana. • En general, los cocos Gram (-) son más

susceptibles a la desecación que los cocos Gram (+).

• Las endoesporas bacterianas son muy resistentes a la desecación pudiendo permanecer viables indefinidamente.

Presión osmótica La pared celular de las bacterias las

protege de cambios en la presión osmótica del medio.

Pero si la presión osmótica externa es alta el organismo puede morir.

Altas concentraciones de sal interrumpen los procesos de transporte a través de la membrana y desnaturalizan las proteínas.