María Espino Hernández, Lic., MSc.

Escuela Latinoamericana de Medicina

E-mail: mespino@elacm.sld.cu

Determinación de la susceptibilidad in vitroDeterminación de la susceptibilidad in vitro

Importante función del Laboratorio de Microbiología Clínica

Importante función del Laboratorio de Microbiología Clínica

Monitorear niveles de resistencia

Monitorear niveles de resistencia

Instauración de políticas

terapéuticas

Instauración de políticas

terapéuticas

¿Era post- ¿Era post- Antibiotica?Antibiotica?

Muy pocos fármacos dirigidos al tratamiento de bacterias

multirresistentes

Muy pocos fármacos dirigidos al tratamiento de bacterias

multirresistentes

Pseudomonas aeruginosa

Enterobacterias productoras de BLEE

Estafilococos meticilino resistentes

Pseudomonas aeruginosa

Enterobacterias productoras de BLEE

Estafilococos meticilino resistentes

El desarrollo de nuevas drogas puede durar varios años.

Se necesita preservar la utilidad de los antimicrobianos disponibles a través de un uso óptimo y acertado.

Las combinaciones de antimicrobianos son comúnmente utilizadas en la práctica clínica

No obstante, el riesgo de provocar un efecto contrario al deseado, incrementar la toxicidad y los costos del tratamiento, no es poco frecuente.

Actividad Combinada de AntimicrobianosActividad Combinada de Antimicrobianos

Objetivo: Lograr un efecto terapéutico más rápido e incrementado

Objetivo: Lograr un efecto terapéutico más rápido e incrementado

Técnica del Tablero

Técnica de Curva de Muerte

Métodos de Difusión

E-test

Técnica del Tablero

Técnica de Curva de Muerte

Métodos de Difusión

E-test

GENERAL

Contribuir al conocimiento de la etiología y susceptibilidad de los agentes causales de la sepsis neonatal y a la aplicación adecuada del tratamiento antimicrobiano.

GENERAL

Contribuir al conocimiento de la etiología y susceptibilidad de los agentes causales de la sepsis neonatal y a la aplicación adecuada del tratamiento antimicrobiano.

ESPECÍFICOS

Caracterizar el comportamiento y la etiología de la sepsis neonatal durante el periodo de estudio.

Describir el comportamiento de la resistencia bacteriana a los antimicrobianos utilizados.

Identificar los patrones de resistencia de las cepas aisladas a los ß-lactámicos y aminoglucósidos.

ESPECÍFICOS

Caracterizar el comportamiento y la etiología de la sepsis neonatal durante el periodo de estudio.

Describir el comportamiento de la resistencia bacteriana a los antimicrobianos utilizados.

Identificar los patrones de resistencia de las cepas aisladas a los ß-lactámicos y aminoglucósidos.

Evaluar los resultados del sinergismo in vitro e in vivo, entre las

combinaciones de ß-lactámicos y aminoglucósidos aplicadas como tratamiento a

los pacientes, tomando en cuenta el patrón de susceptibilidad de las cepas.

Evaluar la eficacia del “tablero de damas” como procedimiento para orientar el tratamiento antimicrobiano combinado.

Evaluar los resultados del sinergismo in vitro e in vivo, entre las

combinaciones de ß-lactámicos y aminoglucósidos aplicadas como tratamiento a

los pacientes, tomando en cuenta el patrón de susceptibilidad de las cepas.

Evaluar la eficacia del “tablero de damas” como procedimiento para orientar el tratamiento antimicrobiano combinado.

163 pacientes (selección por expertos) y 533 aislamientos bacterianos.

Tipo de estudioTipo de estudio Investigación analítica prospectiva y estudio retrospectivo longitudinal

de tendencias.

Marco de la investigaciónMarco de la investigación Hospital Docente Ginecobstétrico “América Arias”, Enero 1993 - diciembre 2000.

UniversoUniverso

534 pacientes con sepsis y 1 457 cepas aisladas de hemocultivo.

MuestraMuestra

APLICAR TRATAMIENTOAPLICAR TRATAMIENTO ANTIMICROBIANO SEGÚNANTIMICROBIANO SEGÚNPROGRAMA DE POLÍTICAPROGRAMA DE POLÍTICA

REEVALUACIÓN DE LA REEVALUACIÓN DE LA TERAPÉUTICATERAPÉUTICA

48-72 horas48-72 horas

HEMOCULTIVOHEMOCULTIVO1ra. Resiembra1ra. Resiembra

16-20 horas16-20 horasincubaciónincubación

AislamientoAislamientoee

identificaciónidentificaciónPrueba de susceptibilidadPrueba de susceptibilidad

y Sinergismoy Sinergismo

RECIEN NACIDORECIEN NACIDOSEPTICOSEPTICO

PACIENTE CON PACIENTE CON SIGNOS CLÍNICOS SIGNOS CLÍNICOS

DE SEPSISDE SEPSIS

Algoritmo clínico-microbiológico para evaluar la eficacia del Algoritmo clínico-microbiológico para evaluar la eficacia del tratamiento antimicrobiano combinadotratamiento antimicrobiano combinado

Microdilución en CMH-CA,

Sinergismo

0,06-64 µg/mL

SUSCEPTIBILIDAD Y SINERGISMO ANTIMICROBIANOSUSCEPTIBILIDAD Y SINERGISMO ANTIMICROBIANO

0,5 McFarland, Dil.1:31

0,5 McFarland, Dil.1:31

35oC 24 h.

35oC, 24 h.

Cálculo de CFI.

(NCCLS, 1993; CLSI, 2006)

CMI (µg/mL)

0,125-128

- Estafilococos resistentes a meticilina, enterococos resistentes a vancomicina

- Enterobacterias resistentes a todos los ß-lactámicos o todos los aminoglucósidos.

- BNF resistentes a penicilinas de amplio espectro.

- Estafilococos resistentes a meticilina, enterococos resistentes a vancomicina

- Enterobacterias resistentes a todos los ß-lactámicos o todos los aminoglucósidos.

- BNF resistentes a penicilinas de amplio espectro.

Amikacina Amikacina Ampicilina Ampicilina Azlocilina Azlocilina CefazolinaCefazolinaCefotaximaCefotaximaCeftriaxonaCeftriaxonaGentamicinaGentamicinaKanamicinaKanamicinaOxacilinaOxacilina

Penicilina GPenicilina GVancomicinaVancomicina

Amikacina Amikacina Ampicilina Ampicilina Azlocilina Azlocilina CefazolinaCefazolinaCefotaximaCefotaximaCeftriaxonaCeftriaxonaGentamicinaGentamicinaKanamicinaKanamicinaOxacilinaOxacilina

Penicilina GPenicilina GVancomicinaVancomicina

Antimicrobianos:Antimicrobianos:

Multirresistencia (CDC, 2006): Multirresistencia (CDC, 2006):

- - Sinergismo (S): Sinergismo (S): CFI CFI 0,5 0,5

- Sinergismo parcial o bajo (SP): 0,5 < Sinergismo parcial o bajo (SP): 0,5 < CFI < 1 CFI < 1

- Indiferencia o adición (I): 1 Indiferencia o adición (I): 1 CFI < 2 CFI < 2

- Antagonismo (A): - Antagonismo (A): CFI CFI 2 2

- - Sinergismo (S): Sinergismo (S): CFI CFI 0,5 0,5

- Sinergismo parcial o bajo (SP): 0,5 < Sinergismo parcial o bajo (SP): 0,5 < CFI < 1 CFI < 1

- Indiferencia o adición (I): 1 Indiferencia o adición (I): 1 CFI < 2 CFI < 2

- Antagonismo (A): - Antagonismo (A): CFI CFI 2 2

Antibiótico 1 (A1) (µg/mL)

Ant

ibió

tico

2 (

A2)

(µ

g/m

L)

Índice de Concentración Fraccionaria Índice de Concentración Fraccionaria Inhibitoria (CFI) Inhibitoria (CFI) (Berenbaum, 1978)(Berenbaum, 1978)

Criterios de interpretación (Berenbaum, 1978; Eliopoulos, 1989)

CMI A1/A2 CMI A2/A1CFI = + CMI A1 solo CMI A2 solo

Tablero de Damas (Tablero de Damas (CheckerboardCheckerboard))

45,8

20,5

13,5

9

4,3

2,6

1,7

1,3

0,8

0,6

0 10 20 30 40 50

ECN (a)

S. aureus

BNF (b)

Enterobacter spp.

E. coli

Enterococcus spp.

Klebsiella spp.

EBH (c) (Grupo B, presuntivo)

C. freundii

P. mirabilis

%

Leyenda: (a): Estafilococo coagulasa negativa; (b): Bacilos gramnegativos no fermentadores; (c): Estreptococo ß-hemolítico

- (Shimabuku et al., 2004; Schrag y Schuchat, 2005; Alonso et al., 2005; Härtel et al., 2008)

Figura 1. Agentes causales de sepsis neonatal. Hospital “América Arias”, Figura 1. Agentes causales de sepsis neonatal. Hospital “América Arias”, 1993-2000. Total: 533 aislamientos.1993-2000. Total: 533 aislamientos.

Tendencia:Tendencia: Incrementos significativos: ß-lactámicos (p 0,001) y amikacina (p 0,05)

Resistencia bacteriana. Hospital “América Arias”, 1993-2000Resistencia bacteriana. Hospital “América Arias”, 1993-2000

Patrones de resistencia principales (grampositivos):Patrones de resistencia principales (grampositivos):

K-G: (51,4 y 48,7%)

K-G-AK: (27,0 y 25,3%)

K-G: (51,4 y 48,7%)

K-G-AK: (27,0 y 25,3%)

SARM (33,9%)

ECNRM (64,8%)

SARM (33,9%)

ECNRM (64,8%)

ß-lactámicos:ß-lactámicos: Aminoglucósidos:Aminoglucósidos:

- Enterococcus faecium (VanA) vancomicina-teicoplanina resistente (CMI128 µg/mL)

- Cuatro aislamientos ECNRM-vancomicina resistente (CMI128 µg/mL)

Patrones de resistencia principales (gramnegativos):Patrones de resistencia principales (gramnegativos):

K-G: (20,7%)

K-G-AK: (28,7%)

K-G: (20,7%)

K-G-AK: (28,7%)

AM-AZ (32,2%)

AM-AZ-KZ-CTX-CRO (33,3%)

AM-AZ (32,2%)

AM-AZ-KZ-CTX-CRO (33,3%)

ß-lactámicos:ß-lactámicos: AminoglucósidoAminoglucósidos:s:

Enterobacterias:Enterobacterias:

K-G: (23,6%)

K-G-AK: (29,2%)

K-G: (23,6%)

K-G-AK: (29,2%)

AM-KZ-CTX-CRO (31,9%)

AM-AZ-KZ-CTX-CRO (40,3%)

AM-KZ-CTX-CRO (31,9%)

AM-AZ-KZ-CTX-CRO (40,3%)

ß-lactámicos:ß-lactámicos: AminoglucósidosAminoglucósidos::

BNF:BNF:

Hospital Docente Ginecobstétrico “América Hospital Docente Ginecobstétrico “América Arias”Arias”..Enero 1993-diciembre 2000.Enero 1993-diciembre 2000.

Combinaciones ensayadas y pacientes Combinaciones ensayadas y pacientes evaluados: 163evaluados: 163

Penicilina G/kanamicinaPenicilina G/kanamicinaPenicilina G/gentamicinaPenicilina G/gentamicinaPenicilina G/amikacinaPenicilina G/amikacinaAzlocilina/amikacinaAzlocilina/amikacinaCefazolina/amikacinaCefazolina/amikacinaCefotaxima/amikacinaCefotaxima/amikacinaCeftriaxona/amikacinaCeftriaxona/amikacinaMeticilina/gentamicinaMeticilina/gentamicinaMeticilina/amikacinaMeticilina/amikacina

Meticilina/kanamicinaMeticilina/kanamicina

Sinérgicas: 56Sinérgicas: 56Parcialmente sinérgicas: 25Parcialmente sinérgicas: 25Indiferentes: 71Indiferentes: 71Antagónicas: 10Antagónicas: 10

Resultados Resultados in vitroin vitro de la interacción de la interacción entre los fármacos probadosentre los fármacos probados

Resultados del sinergismo Resultados del sinergismo in vitro.in vitro.

Interacción ÍndiceCFI

Disminución de CMI (µg/mL) (Media geométrica)

ß-lactámico Aminoglucósido

Sinérgico 0,276 1/8 1/32

Sinérgico parcial 0,664 1/2 1/4

Indiferente 1,097 0 1/128

Antagónico 2 0 0

Tabla 1. Valores de Concentración fraccionaria inhibitoria y Tabla 1. Valores de Concentración fraccionaria inhibitoria y Concentración mínima inhibitoria en las combinaciones ensayadasConcentración mínima inhibitoria en las combinaciones ensayadas

Interacción in vitro (a)

Eficacia clínica del tratamiento (b)

Eficaz No eficaz Total

Sinérgico 51 5 56

Sinérgico parcial 18 7 25

Indiferente 52 20 72

Antagónico 0 10 10

Total 121 42 163

p (a-b)0,001 (3 gl); 2 = 37,32

Tabla 2. Relación entre el sinergismo Tabla 2. Relación entre el sinergismo in vitroin vitro y la eficacia clínica del y la eficacia clínica del tratamientotratamiento

Interacción in vitro (a)

Patrón de susceptibilidad de la cepa a los fármacos combinados (b)

Sensible a uno de los dos

Resistente a los dos

Total

Sinérgico 31 25 56

Sinérgico parcial 11 14 25

Indiferente 35 37 72

Antagónico 0 10 10

Total 77 86 163

Tabla 3. Relación entre el sinergismo Tabla 3. Relación entre el sinergismo in vitroin vitro y la susceptibilidad de las cepas y la susceptibilidad de las cepas a los antimicrobianos de la combinación ensayadaa los antimicrobianos de la combinación ensayada

p (a-b)=0,014 (3 gl); 2 = 10,59

Leyenda: P= penicilina; OX= oxacilina; KZ= cefazolina; CTX= cefotaxima; CRO= ceftriaxona; K= kanamicina; G= gentamicina; AK= amikacina; AM= ampicilina; AZ= azlocilina.

Patrones de 34 cepas bacterianas multirresistentes con las que se obtuvo Patrones de 34 cepas bacterianas multirresistentes con las que se obtuvo sinergismosinergismo in vitro in vitro

15%

15%

15%

6%3%

46%

P-OX-KZ-CTX-CRO-K-G

P-OX-KZ-CTX-CRO-K-G-AK

P-OX-KZ-CTX-CRO-K

P-OX-KZ-CTX-CRO

AM-AZ-KZ-CTX-CRO-K-G-AK

AM-AZ-KZ-CTX-CRO-K-G

15%

15%

15%

6%3%

46%

P-OX-KZ-CTX-CRO-K-G

P-OX-KZ-CTX-CRO-K-G-AK

P-OX-KZ-CTX-CRO-K

P-OX-KZ-CTX-CRO

AM-AZ-KZ-CTX-CRO-K-G-AK

AM-AZ-KZ-CTX-CRO-K-G

No Patrón Agente Causal Total

1 AM-K-G Enterobacter 1

2 AM-AZ-K E. coli 1

3 AM-AZ- K-G BNF 1

4 AM-AZ-KZ-K E. coli 1

5 AM-AZ-KZ-K-G-AK Enterobacter 1

6 AM-AZ-KZ-CTX-CRO-K-G Enterobacter 1

7 P-OX-KZ-CTX-CRO-K-G ECN 2

8 AM-AZ-KZ-CTX-CRO-K-G-AK BNF 2

Tabla 4. Patrones de resistencia de 10 cepas con las que se obtuvo Tabla 4. Patrones de resistencia de 10 cepas con las que se obtuvo antagonismo antagonismo in vitroin vitro

Leyenda: AM= ampicilina; K= kanamicina; G= gentamicina; AZ= azlocilina; KZ= cefazolina; AK=

amikacina; CTX= cefotaxima; CRO= ceftriaxona; P= penicilina; OX= oxacilina

Susceptibilidad de la cepa a los fármacos combinados (a)

Eficacia clínica del tratamiento (b)

Eficaz No eficaz Total

Sensible a uno de los dos 62 15 77

Resistente a los dos 59 27 86

Total 121 42 163

P (a-b)=0,119 (1 gl); 2 = 2,42

Tabla 5. Relación entre la susceptibilidad de las cepas a los antimicrobianos Tabla 5. Relación entre la susceptibilidad de las cepas a los antimicrobianos de la combinación probada y la eficacia clínica del tratamiento de la combinación probada y la eficacia clínica del tratamiento

Tabla 6. Eficacia del Tablero de Damas como procedimiento diagnóstico.Tabla 6. Eficacia del Tablero de Damas como procedimiento diagnóstico.

Verdaderos positivos (VP)= 37; Falsos positivos= 70; Verdaderos negativos (VN)= 51; Falsos negativos (FN)= 5

ParámetroParámetro Valor (%)Valor (%) ICIC (95%) (95%)

Sensibilidad 88,10 86,85 – 89,35

Especificidad 42,15 41,68 – 42,62

Valor predictivo positivo 34,58 34,06 – 35,10

Valor predictivo negativo 91,07 90,13 – 92,01

Razón de verosimilitud positiva 1,52 1,52

Razón de verosimilitud negativa 0,28 0,28

Paciente con sepsis grave por Paciente con sepsis grave por microorganismo multirresistentemicroorganismo multirresistentePaciente con sepsis grave por Paciente con sepsis grave por

microorganismo multirresistentemicroorganismo multirresistente

Sensibilidad: 88,10%Sensibilidad: 88,10%

Valor Predictivo Negativo: 91,07%Valor Predictivo Negativo: 91,07%

Sensibilidad: 88,10%Sensibilidad: 88,10%

Valor Predictivo Negativo: 91,07%Valor Predictivo Negativo: 91,07%

Método: “Tablero de Damas”Método: “Tablero de Damas”

PRUEBA DE SCREENING VALIOSAPRUEBA DE SCREENING VALIOSA

El panorama epidemiológico de la sepsis neonatal se mantuvo estable durante el

periodo analizado con una mayor incidencia de estafilococos en la sepsis precoz y

la tardía.

La resistencia global a los antimicrobianos fue elevada, y se incrementó

significativamente para cefalosporinas, gentamicina, amikacina y para oxacilina en

cocos grampositivos.

Se encontró una amplia variedad de patrones de resistencia para ß-lactámicos en

bacterias gramnegativas y fueron frecuentes los patrones kanamicina-gentamicina

y kanamicina-gentamicina-amikacina en todas las cepas.

Las combinaciones de fármacos sinérgicas in vitro mostraron una elevada

probabilidad de eficacia para el tratamiento, con independencia del patrón de

susceptibilidad de la cepa y de si ésta fue o no resistente a los dos antibióticos

combinados.

La probabilidad de obtener eficacia clínica con la fusión de antimicrobianos con

sinergismo parcial in vitro, fue la misma que se obtuvo con las combinaciones

cuyo resultado fue indiferente y todos los resultados antagónicos in vitro se

correspondieron con falla clínica del tratamiento in vivo, corroborando así, que el

criterio asumido en este estudio fue adecuado.

El método del tablero de damas fue un buen procedimiento diagnóstico para

predecir los tratamientos ineficaces y para advertir la probabilidad de una

terapéutica eficaz cuando la prueba fue sinérgica.

“Tablero de Damas y Microdilución. Especificaciones Técnicas y Algoritmo

de Trabajo para su aplicación en la práctica Clínico-Microbiológica”

Autor: Prof. María Espino Hernández

Asesores: Prof. Jorge L. Zuazo Silva

Dra. Isabel Martínez Mota

Escuela Latinoamericana de

Medicina, 2008

(Metodología para evaluar combinaciones de fármacos in vitro y su eficacia en el paciente)

Partes componentes:

TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN

INTRODUCCIÓN

ANTECEDENTES y OBJETIVOS

SECCIONES (1 a la 5)

BIBLIOGRAFÍA

ANEXOS (Tablas, esquemas y Figuras)

SECCIONESSECCIONES

11 Selección y preparaciónde los antimicrobianos

22 Métodos

Procedimientos para el control de la calidad33

Comentarios a los procedimientos de microdilución

y el tablero de damas44

55 Algoritmo de trabajo microbiológico