BIOLOGÍA

AREA

LOCAL

CATEGORIA

INVESTIGACIÓN EXPERIMENTAL

MODALIDAD

Efecto del Carbón Activado y Ácido Indolácetico en el cultivo in vitro de Epidendrum

radicans (Orchidaceae)

4093164

FOLIO DE INSCRIPCIÓN

BACHOS DEL VALLE

PSEUDÓNIMO DE INTEGRANTES

RESUMEN

La necesidad de integrar al adolescente a los problemas ambientales y desarrollar

metodologías que le permitan adquirir disciplina, se forja a través del trabajo en laboratorio.

La formación del alumno la tenemos que enfocar a la problemática que refleja nuestra

biodiversidad, está amenazada por sobreexplotación de los recursos, tenemos muchos

ejemplos, y a nosotros nos interesó las orquídeas, plantas con una belleza tan especial que

genera la depredación de su hábitat. Se tienen que buscar alternativas para regenerar la

abundancia en su lugares de origen por tal motivo en este trabajo se analizó el efecto de

5gL-1

carbón activado (CA) y 5 mgL-1

de ácido indolacético (AIA) en el cultivo in vitro de

Epidendrum radicans, utilizando las sales bales del medio de cultivo Mitra (M). Se

prepararon cuatro tratamientos M, M+CA, M+AIA y M+AIA+ CA con los cuales se

cultivo con inóculos de semillas, hoja, raíz y microestacas.

En la realización del diseño experimental se obtuvo en la germinación de semillas, un

mayor porcentaje de diversos estadios de protocormos en los tratamientos con CA en

comparación con los que no se empleó CA. En el desarrollo de yemas en M+AIA, tiene un

rango de resultados favorables para el desarrollo morfogenético. En raíces, las células del

tejido al contacto con M+AIA, fueron inducidas a la producción de tejido de novo y las

hojas presentaron un mayor porcentaje en la formación de tejido calloso al estar expuestas a

M+AIA+CA.

INTRODUCCIÓN

Las orquídeas pertenecen a la familia Orchidaceae, la cual es la más numerosa de todas las

plantas que producen flores. El cálculo fluctúa entre 17,000 y 35,000 especies agrupadas en

900 géneros aproximadamente, lo que representa un 10% de todas las plantas superiores:

herbáceas y perennes (Murguia y Lee, 2008, citados por Jiménez, 2009).

En México se reconocen actualmente más de 1200 especies y variedades de orquídeas. Las

orquídeas se ubican al sur del trópico de Cáncer, desde las costas del Pacifico y del Golfo,

en altitudes que pueden rebasar los 3500 msnm (Espejo y López-Ferrari, 1998; Hagsater et

al., 2005; Soto, 1998).

Una de las características más interesantes de la familia es su alta proporción de especies

endémicas. Se han registrado 444 especies o variedades que corresponden

aproximadamente al 40% del total de la taxa en el país (Espejo et al., 2002). Lo anterior

convierte a la Orchidaceae en una de las familias más ricas en endemismo entre los países

de América tropical. Sin embargo, la alteración y destrucción del hábitat, así como la

extracción ilegal de especies silvestres para su comercio, han provocado que varias especies

estén consideradas en peligro de extinción (Hagsater et al., 2005).

En los últimos siglos se han extinguido varias especies de orquídeas en México y a partir de

1998 han desaparecido al menos 22 (Hagsater et al., 2005). La Norma Oficial Mexicana

NOM-056-ECOL-2001 incluye a la familia Orchidaceae y a todas sus especies como

amenazadas y en peligro de extinción (SEMARNAT, 2003).

Tradicionalmente, las orquídeas se han propagado de forma asexual mediante la división de

matas, sin embargo se ha demostrado que es posible obtener un gran número de plantas a

partir de la geminación de semillas utilizando métodos de cultivo in vitro (Arditti, 1993). El

cultivo de tejidos vegetales se ha venido utilizando para la producción comercial de

orquídeas, principalmente para los géneros Phalaenopsis, Oncidium, Cymbidium,

Dendrobium, y Paphiopedilum, tal es el caso de Taiwán, donde se ha visto incrementada la

producción de orquídeas del 51 % en 1998 al 85 % para el año 2000 (Pan, 2007).

El concepto básico de cultivo de tejidos vegetales o propagación in vitro abarca tanto el

cultivo aséptico de tejidos como de células y órganos. Esta técnica consiste en cultivar

inoculo con potencialidad de diferenciación bajo una dieta balanceada de nutrientes y

hormonas. Esta capacidad no es solamente la de regenerar tejidos y órganos, sino también

una planta entera. Al igual que en otros métodos de reproducción asexual, los individuos

descendientes de una planta madre propagada in vitro, son clones, dándose la capacidad de

realizar una selección artificial de los mejores ejemplares. En la propagación por semilla, la

descendencia de cada semilla es heterocigótica ya que cada semilla tiene su propia base

génica.

Se ha denominado como inóculo o explante, al órgano, tejido o fragmento de tejido,

células, etc. excisado del material parental para iniciar el cultivo in vitro. La elección del

explante adecuado constituye el primer paso para el establecimiento de los cultivos. En

general, factores como el genotipo, edad de la planta y su estado fisiológico son de suma

importancia (Abdelnour, at al., 1994)

FACTORES FÍSICOS

Para Abdelnour y colaboradores (1994), el grado de acidez o alcalinidad (pH) del medio de

cultivo es importante y específico para las plantas, al igual que ocurre con el suelo, por lo

que se hace necesario ajustarlo a los requerimientos de las especies. El pH adecuado para

las plantas estará en un rango de 4.5 a 7. Por otro lado la humedad, en condiciones in vitro

es de casi el 100%, y por lo general la planta no desarrolla adecuados sistemas de

regulación hídrica tales como cera, estomas, cutícula, etc. La intensidad y calidad de la luz

es muy bajo (10 W/m2

en comparación de condiciones naturales donde la luz puede

representar hasta 900 W/m2).

FACTORES QUÍMICOS

En el cultivo in vitro las fitohormonas juegan un papel primordial y se deben añadir a los

medios de cultivo según los requerimientos de los diferentes medios y los objetivos que se

persigan, por ejemplo, el uso de reguladores de crecimiento para inducir la formación de

raíces adventicias (Couvillon, 1988), Los más usados son las auxinas, tal como los ácidos

indol-3-acético (AIA), naftalenacético (ANA) e indolbutírico (AIB). Además se ha

reportado el uso de citoquininas para inducir la formación de rizomas en las especies

Vaccinium sp. (Gates, 1985; Morrison et al., 2000). Entre las auxinas, el AIB es más

utilizado, ya que no es tóxico en un amplio rango de concentraciones para un gran número

de especies y químicamente más estable que el AIA, al contacto con el sustrato de

propagación (Couvillon, 1988; Hartmann et al., 2002); Pedrosa (2009), observo que AIA

tiene mejor respuesta fisiológica que BAP para el desarrollo de protocormos de

Epidendrum elongatum en concentraciones de 0.5 mg/l.

Murashige y Skoog (1962), evaluaron diferentes combinaciones de auxinas, citoquininas y

giberelinas y determinaron las relaciones necesarias entre las concentraciones de ellas, para

poder lograr el mantenimiento de los callos sin diferenciar, la diferenciación de brotes o la

diferenciación de raíces. Para ello, tomaron el tejido de la médula del tallo del tabaco,

formado por un parénquima de relleno, poco diferenciado debido a que este tejido no

presenta citoquininas naturales. Hoy en la actualidad este bioensayo de la médula de tabaco

se utiliza para evaluar la presencia de citoquininas naturales en extractos naturales de

plantas.

MORFOLOGIA DE LAS ORQUIDEAS

Morfología del tallo

Las orquídeas se pueden clasificar según la presencia de un tallo o no, en caulescentes y

acaules; las primeras comprenden también a las llamadas orquídeas pseudobulbosas en las

cuales los tallos normalmente herbáceos o casi frutescentes se transforman en órganos

especializados de distinta forma y grosor llamados justamente pseudobulbos o falsos

bulbos, por su semejanza a los verdaderos bulbos. La función que cumplen es la de

almacenar alimento con que sustentar a la planta en tiempo de sequía (Caneva, 1978).

Las orquídeas acaules, no presentan tallo. Muchas especies terrestres están provistas en su

parte más baja de tubérculos subterráneos que sirven como depósito de reserva de alimento

para los nuevos crecimientos; apenas estos se han desarrollado, el tubérculo preexistente se

torna rugoso y muere; es por eso por lo que se pueden observar en la base de la planta tanto

tubérculos hinchados (los nuevos) como arrugados (los viejos) (Barba et al., 2002).

Las orquídeas también pueden dividirse en monopodiales y simpodiales. Las monopodiales

tienen el eje o tallo principal de crecimiento indefinido, cuyo único punto de crecimiento es

el ápice superior de la planta, el cual continua formando nuevas hojas, provisto en toda su

longitud de raíces adventicias, con inflorescencias siempre laterales en la axila de las hojas

y opuestas a estas (por ejemplo las Vanda), el tallo monopodial es raramente adaptado a la

conservación del agua (Barba y Luna, 1978).

En las orquídeas simpodiales se distinguen dos tipos de ejes: un rizoma o tallo rastrero a

partir del cual se originan a diversos intervalos tallos carnosos o pseudobulbos de

crecimiento definido, esto es completo a cada fin de estación de la base del cual tras un

período, nace un nuevo tallo (Luna y Barba, 1995).

Las orquídeas simpodiales pueden tener inflorescencias laterales (como Dendrobium y

Oncidum) y también terminales (como en Cattleya y Cyprepedium) (Caneva, 1978).

Morfología de las raíces

Las raíces son órganos que pueden estar muy modificados. En las terrestres no se

diferencian mucho de las otras monocotiledóneas. En cambio en las epifitas encontramos

raíces aéreas, que permanecen en el aire o se fijan fuertemente a los troncos sobre los

cuales viven (no parasitariamente) y extraen del sustrato y del agua de lluvia los nutrientes

necesarios para su desarrollo. En general son gruesas, cilíndricas o aplanadas; una

característica importante es que las verdaderas raíces aéreas son total o parcialmente

clorofilaceas y probablemente estén capacitadas para cumplir funciones de asimilación,

análogas a las que cumplen las hojas (Caneva, 1978). Además están cubiertas por una funda

esponjosa llamada velamen, característica de orquídeas epifitas, presentes en algunas

terrestres y litofiticas.

Morfología de las hojas

Por lo que respecta a las hojas, como en la mayoría de la monocotiledóneas en las

orquídeas son simples, paralelinervadas, casi siempre sésiles, alargadas, generalmente

persistentes, pueden ser radicales o terminales, solitarias o en número de dos o más. Varían

mucho según las especies en forma y consistencia, su color generalmente es verde (Caneva,

1978).

En algunas especies donde los pseudobulbos están ausentes las hojas se transforman en

órganos de almacenamiento de alimentos y agua. Debido a la gran cantidad de especies, las

hojas de las orquídeas presentan una enorme variedad de formas desde lanceoladas hasta

triangular pasando por la forma ovalada (Barba et al. 2002).

Simbiosis estricta

En condiciones naturales, las semillas para germinar necesitan asociarse con un hongo

simbionte apropiado que le proporcione azucares simples, los cuales son esenciales para

que se lleve a cabo la germinación (Velásquez, 1997).

Las orquídeas en la naturaleza permanecen en etapa de protocormo hasta que son infectadas

por un hongo simbionte apropiado. Después de la infección los ápices del protocormo

producen las primeras hojas y posteriormente la primeras raíces. (Velásquez, 1997).

Semillas de orquídea

Las semillas de las orquídeas miden entre 0.05 (Anaectochilus imitans) y 6.0 mm de largo

(Epidendrum secundum) por 0.01 (tipo Gastrodia) a 0.93 mm de ancho (Galeola nudifolia)

(Barba, et al., 2002). Y consisten en un embrión indiferenciado incluido dentro de una testa

transparente. No hay endospermo ni cotiledones sino una masa de células con escasa

diferenciación. Algunas veces el embrión falta y la semilla es infértil (Arditti, 1977). Las

células de la cubierta están muertas, vacías y generalmente son transparentes, su pared

puede ser simple, diversamente ornamentada y raramente gruesas (Withner y Kieger,

1985).

Es limitado el número de especies estudiadas, por las características de las semillas de las

orquídeas durante el almacenaje son clasificadas como “ortodoxas” en el sentido de que la

longevidad es mejorada con reducción del contenido de humedad alrededor del 20% al 5%

y disminuyendo la temperatura de almacenaje de 62 oC a 0

oC (Pritchard y Seaton, 1993).

El embrión en las orquídeas

El embrión en las orquídeas es una masa indiferenciada de células. Pero en la ontogenia de

ésta masa de células, las diferencias consisten en los conceptos de estado relativamente

primitivo y estado avanzado de las especies correspondientes. Los dos principales tipos de

embrión en las orquídeas son: sin suspensor y con suspensor. Los embriones sin suspensor

son considerados primitivos y se encuentra en Cypripedium y en otros géneros como

Spiranthes, Listera, Neottia, etc. de la tribu Neottieae. Entre los embriones con suspensor,

Swamy en 1949 (citado por Abraham y Vatsala, 1981) reconoció cinco tipos de

suspensores, menciona que el primero está formado por una sola célula, por ej.

Paphiopedilum, Epipactis, Goodyera y Vanilla; el segundo tipo de suspensor es el

haustorial y es confinado exclusivamente a la familia Orchidaceae. Los otros tres tipos se

encuentran en Epidendreae.

La embriogénesis es un proceso relativamente corto desde la polinización hasta la

dehiscencia del ovario, comparado con otros fenómenos concurrentes en la formación del

fruto, ésta última es en promedio de aproximadamente dos semanas. Cuando la cápsula está

lista para la dehiscencia, el tegumento interno del óvulo se degenera parcialmente y el

tegumento externo se degenera totalmente. En la mayoría de las semillas de orquídeas la

cutícula de la epidermis del tegumento interior del óvulo persiste ésta al parecer, tiene el

efecto de impedir la hidratación de la semilla y de éste modo impedir su germinación. El

embrión puede estar limitado y en contacto con una cubierta protectora o puede estar más o

menos aislado en el centro de ésta de acuerdo al desenvolvimiento del tegumento externo

en el curso de la embriogénesis (Withner y Kieger, 1985).

Los embriones de orquídeas son pequeños cuerpos elipsoidales cuando maduran (están

constituidos por 4 o 5 células) pueden medir entre 0.058 y 0.1 mm de ancho por 0.150 y

0.300 mm de largo, ocupan sólo una porción muy pequeña del espacio interno de la semilla

el resto está ocupado por aire (Barba, et al., 2002).

Ante la ausencia de endospermo, al suspensor se le atribuye el papel de la nutrición, que

cuando no está presente es atribuida al contacto del saco embrionario con el embrión; el

embrión está formado por voluminosas células que almacenan sustancias de reserva,

cubierto por la testa por lo anterior, al embrión de las semillas de orquídeas se le considera

en un estadio rudimentario (Harrison y Arditti, 1970; Martínez, 1991).

Las células del embrión varían de tamaño dependiendo de su localización, las de la punta

meristemática son pequeñas, generalmente miden de 8–10 μm de diámetro, las células más

grandes conforman el resto del embrión y se hace referencia a ellas como células basales. A

pesar de que Harrison y Arditti, 1978; Arditti, et al., 1981; Arditti, 1992, mencionan que las

semillas no tienen tejidos de reserva para nutrir al embrión durante la germinación, todas

las células del embrión contienen reservas alimenticias (Martínez, 1991).

Análisis de semillas de Cymbidium han mostrado que contienen 1% de azúcar, 32% de

grasa y ningún almidón. Aunque hay reservas de alimento en el embrión, las semillas que

germinan no parecen ser capaces de utilizarlas (Harrison y Arditti, 1970).

Los lípidos constituyen una gran porción de material de reserva y están presentes como

cuerpos lipídicos. También se pueden observar los cuerpos proteínicos pero se restringen a

células situadas en dos terceras partes del embrión, es decir, en el área micropilar, el

citoplasma es denso por la acumulación de las proteínas y además se encuentran numerosos

glóbulos de aceite. El embrión está unido por medio de varias fibras celulares a la testa.

Está rodeado por un gran espacio de aire interior, lo cual ocasiona que la semilla tenga la

capacidad de flotar, tanto en el aire como en el agua (Abraham y Vatsala, 1981) por lo que

están bien adaptadas a la diseminación por el viento y el agua (Velázquez, 1997).

Morfológicamente las semillas de orquídeas son, ovoides y pesan menos de 15

microgramos. Los frutos producen un gran número de semillas, fluctúan de varios cientos

hasta miles de semillas por cápsula dependiendo de la especie (Barba, et al., 2002).

DESCRIPCIÓN DE Epidendrum radicans

Imagen 1

Hierba herbácea terrestre o rupícola, rastrera de hasta 1.5 m de alto. Raíces producidas a

todo lo largo de los tallos y de la base de los keikis (brotes vegetativos que ocasionalmente

se producen en las inflorescencias viejas o en nudos superiores de los tallos), carnosas,

blancas, de 1.5 - 2.5 mm de grosor. Tallos tipo caña, cilíndricos de 20-120 cm de largo, y 3-

5 mm de grosor. Hojas distribuidas a lo largo de cada tallo; vaina tubular, lisa, hasta 5 cm

de largo; lamina articulada, coriácea, ovada a elíptica, el ápice igualmente bilobado, de 3-9

x 1-2.8 cm. (Hágsater et al., 1990)

Inflorescencia terminal, racimosa, del crecimiento maduro y de los keikis, generalmente

florece una sola vez, ocasionalmente produce hasta dos o tres nuevos racimos del

pedúnculo, erecta, de 25-50 cm de largo, sin espata; brácteas del pedúnculo espaciadas,

tubulares, hasta de 9 cm de largo. Bráctea floral muy pequeña, triangular aguda a

acuminada, de 2-5 mm de largo, la inferior frecuentemente más larga, hasta de 15 mm de

largo. Flores sucesivas, hasta 90, generalmente 4-12 abiertas a la vez resupinadas, sin

fragancia perceptible, de color amarillo hasta rojo, generalmente anaranjadas, el labelo

generalmente mas amarrillo a hacia el centro y frecuentemente con algunos puntos rojos.

(Hágsater et al., 1990)

Ovario pedicelado, de sección circular, de 15-36mm de largo. Sépalos extendidos, el dorsal

elíptico, agudo, de 12-18 x 4-7 mm. Pétalos extendidos elípticos, agudos, algo falcados, 12-

17 x 3-6 mm. Labelo adnado a todo lo largo de la columna, trilobado, bicalloso, con una

1 Inflorescencia de Epidendrum radicans

carina central roma, de 8-14 mm de largo total y 12-17 mm de ancho entre los lóbulos

laterales extendidos; lóbulos laterales semiovados, oblicuos, profundamente laciniados;

istmo angosto, lóbulo medio bilobado, laciniado. Columna arqueada, delgada, de 10-13 mm

de largo. Clinandrio algo más cortó que el cuerpo de la columna, el margen eroso. Antera

obovoide, locular. Polinario con 4 polineos obovoides, lateralmante comprimidos,

subiguales; caudiculas suaves, granulosas, con seudotetradas en forma de tejas, más largas

que los polinios, viscidio semilíquido, transparente. Róstelo en un ápice del cuerpo de la

columna, rajado.

Lóbulos laterales del estigma largo y delgado, transversalmente acostillado. Nectario

profundo, penetrando la mitad del ovario revestido interiormente por pelos unicelulares.

Capsula elipsoide-subglobosa, de 23 cm de largo de ca. 1.5 cm de grosor, prevista de

cuellos delgados de ca, 12 mm de largo en la base y el ápice; debido a la floración sucesiva

durante largo tiempo, suelen estar presentes capsulas, flores y botones simultáneamente en

un mismo racimo (Hágsater et al., 1990).

Distribución

México (Veracruz, Oaxaca y Chiapas),

todos los países de América Central

(excepto Belice), y Colombia (la cuenca

del Río Cauca).

Imagen 2

Ecología

Terrestre o litofítica, creciendo por lo general en espacios abiertos entre las hierbas o en las

rocas, sobre todo en carretera muros de contención, en el bosque de pino-encino y bosque

tropical de montaña, de 900 a 2000 m de altitud. Floración durante todo el año, sobre todo a

partir alrededor de octubre y termina en mayo. (Hágsater et al., 1990)

2 Distribución geográfica en México de E radicans

JUSTIFICACIÓN

A principios del siglo XXI es triste ver que el nivel del conocimiento sobre la flora y fauna

de México es insuficiente, tomando en cuenta que los problemas ecológicos que hoy

enfrentamos son la consecuencia de las diversas actividades antropogénicas.

El aumento de la población y el exponencial incremento de sus demandas en insumos,

bienes y servicios; a traído consigo la destrucción de centenares de hectáreas de bosques y

selvas; hogar de fauna y flora endémica de nuestro país.

En México miles de hectáreas de vegetación son consumidas anualmente sin que se tengan

tareas de preservación o de reintroducción de especies perdidas; la extracción de plantas

silvestres, como, las orquídeas, una familia en la que todas sus especies están catalogadas

como amenazadas y en peligro de extinción; es un fenómeno al cual se le debe de dar un

seguimiento profundo acompañado de propuestas innovadoras.

Ante este complejo paradigma, surge en esta instancia, la necesidad de realizar este trabajo

a través de los procesos integrales, fundamentados en la práctica de la metodología

científica, que provee de una actitud emprendedora, innovadora y de alta calidad humana,

para favorecer el desarrollo de conocimientos que en futuro sean empleados como

herramientas en la preservación del ecosistema.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

¿Qué efecto tendrá la aplicación de acido indolácetico (AIA) en la germinación de semillas

y regeneración de tejidos vegetales de Epidendrum radicans por el método in vitro?

OBJETIVOS

Objetivo general

Determinar el efecto del carbón activado y ácido indolácetico en el cultivo in vitro de

semillas y de tejido vegetativo de Epidendrum radicans.

Objetivos particulares

Establecer el efecto del carbón activado y ácido indolácetico durante la germinación

de semillas y la regeneración de tejido vegetativo de Epidendrum radicans.

Evaluar el efecto del medio de cultivo Mitra en la germinación de semillas,

regeneración en tejido de hojas y raíces, y en la brotación de yemas.

HIPÓTESIS

El uso de medios nutritivos adicionados con reguladores del crecimiento vegetal y carbón

activado inducen diversas respuestas durante el cultivo in vitro de diversos tipos de

inóculos de orquídeas, por lo que se espera que el efecto del ácido indolacético y carbón

activado induzca la germinación de semillas y regeneración en tejido vegetativo.

MATERIAL Y MÉTODOS

Material biológico

Se utilizaron semillas de una cápsula madura indehiscente, tallos con yemas, hojas y raíces

de plantas maduras de Epidendrum radicans.

Medio de Cultivo

Se empleó el medio de cultivo Mitra (M) (Mitra et al. 1976) sin ácido fólico (ver anexo N°

1) sin o con 0.5 mgL-1

de ácido indolácetico (AIA) ó 5 gL-1

de carbón activado (CA),

resultando cuatro tratamientos, incluido el testigo:

1. M (testigo).

2. M+AIA

3. M+CA

4. M+AIA+CA

Para cada tratamiento se preparó un total de 850 ml de medio adicionados con 17 g de

sacarosa y 4.2 g de agar gel, se ajusto el pH a 5.7. El medio, de cada tratamiento, se

distribuyó en cuatro tipos de recipientes de cultivo (Cuadro 2) con un total de 40

recipientes. Los recipientes con medio de cultivo se taparon y colocaron dentro de la

autoclave para su esterilización a 121 ºC y a una presión de 1.5 Kg/cm2, de durante 15

minutos.

Condiciones de asepsia

Para las condiciones de asepsia se efectuó el procedimiento de desinfectación y siembra en

la campana de flujo laminar. Previo al procedimiento, se limpió el cuarto con cloro diluido

Cuadro 1.- Recipientes empleados en el cultivo in vitro de E. radicans.

*25 ml 25 ml 20 ml 15 ml

*: Volumen de medio.

en agua y la campana con etanol al 70%; todo el material quirúrgico se esterilizo en la

autoclave y se flameo con etanol al 70 %.

Desinfestación y siembra del material biológico

Semillas.

La cápsula de E. radicans se lavó con una solución jabonosa y un cepillo de pelo suave,

para posteriormente enjuagarla al chorro de agua y se trasladó dentro de un vaso de

precipitados a la campana de flujo laminar, se cubrió con una solución de hipoclorito de

sodio al 10% v/v de cloro activo (Cloralex®) adicionada con jabón líquido (Vel rosita®) y

se mantuvo, durante 15 minutos, en agitación constante, posteriormente se realizaron tres

enjuagues con agua destilada estéril y por último se sumergió en alcohol etílico al 70 %,

dejándose escurrir a lo largo de 5 segundos, en seguida se incendió con ayuda de un

mechero, alejándose de este hasta que se extinguió el fuego.

Se colocó en una caja Petri estéril y se cortaron los carpelos para extraer las semillas. Con

las pinzas de disección y un bisturí fue esparcida una capa fina de

semillas sobre la superficie del medio de cultivo por recipiente

realizando 10 repeticiones por tratamiento. Se registraron los

estadios de germinación en cada tratamiento a los 30 días de cultivo

para establecer el más eficiente en la germinación de E. radicans.

Imagen 3

Hojas y raíces.

Los tallos con hojas y raíces fueron lavados con una solución jabonosa y un cepillo de pelo

suave, enseguida se enjuagaron al chorro de agua, las hojas y raíces fueron excisados del

tallo para colocarlas dentro de un vaso de precipitados por separado. Posteriormente se

trasladaron a la campana de flujo laminar donde se les adicionó hasta cubrirlas con alcohol

3 Cultivo de semillas de E. radicans

etílico al 70 % y se mantuvieron en agitación durante 3 minutos, subsiguientemente se

decantó el alcohol y enseguida se vertió una solución de hipoclorito de sodio al 10% v/v de

cloro activo (Cloralex®) adicionado con jabón líquido (Vel rosita®) durante 15 minutos en

agitación constante, se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril y se distribuyeron

los inóculos en cajas Petri.

Con ayuda de un bisturí y unas pinzas de disección, las hojas se cortaron en segmentos de

1cm2

y las raíces de un 1 cm. Se colocaron cuatro segmentos de hojas con la parte abaxial

en contacto con la superficie del medio de cultivo de 10 recipientes

por cada tratamiento.

Tres segmentos de raíces fueron colocados horizontalmente sobre la

superficie del medio de cultivo de 10 recipientes por tratamiento. Se

registraron las respuestas morfogenéticas de cada uno de los inóculos

en los tratamientos a los 30 días de cultivo. Imagen 4

Microestacas

Los tallos lavados en el proceso anterior y ya sin hojas y raíces fueron colocados en toallas

de papel absorbente dentro de una bandeja para eliminar el exceso de agua; posteriormente,

se retiraron las toallas y se limpiaron con algodón empapado en etanol al 70%. El tallo se

disectó transversalmente, con ayuda de un bisturí, al centro de cada entrenudo, quedando

una microestaca con una yema vegetativa, estas se colocaron dentro de un vaso de

precipitados y se cubrieron con una solución de hipoclorito de sodio al 10 % v/v de cloro

activo (Cloralex®) más jabón líquido (Vel rosita®) manteniéndolas durante 15 minutos en

agitación constante, transcurrido el tiempo se enjuagaron tres veces con agua destilada. Al

terminar este procedimiento las microestacas se colocaron en una caja Petri y con la ayuda

de pinzas de disección se prosiguió a remover las brácteas que cubrían las yemas,

sucesivamente eran colocadas en un vaso de precipitados (toda esta serie de procedimientos

se realizaron fuera de la campana de flujo laminar).

Las microestacas contenidas en el vaso de precipitados fueron trasladadas a la campana de

flujo laminar para adicionar otra solución de hipoclorito de sodio al 10 % v/v de cloro

activo (Cloralex®) con una gota (por cada 100 ml de cloro) de jabón líquido (Vel rosita®)

4 Cultivo de hojas de E. radicans

y mantenerlas en agitación constante durante 15 minutos; posteriormente, se enjuagaron

tres veces con agua destilada estéril decantando el exceso de agua y fueron distribuidas en

cajas Petri. Cada microestaca fue colocada verticalmente en el medio de cultivo hasta

quedar justo debajo de la yema. Se registraron a los 30 días de cultivo los siguientes

parámetros de respuesta en las yemas de la microestaca: longitud del brote, numero de

hojas y porcentaje de brotación.

Al termino del sembrado de todo el material biológico los recipientes fueron tapados y

sellados con papel auto adherible (ega pak) y etiquetado con la fecha de siembra, especie

trabajada, medio de cultivo empleado y nombre del quien realizo el sembrado. Ya por

ultimo todas las muestras se transportaron a la cámara de incubación (25 a 28 ºC,

fotoperiodo de 16 horas luz y 8 horas de oscuridad; intensidad de luz 3,500 lux; utilizando

lámparas de luz de día).

Cuadro 2.- Tratamientos empleados para el cultivo in vitro de semillas y

tejido vegetativo de Epidendrum radicans

Inóculos

Medio de cultivo

Semillas Hojas Raíz Yemas

M 1* 1 1 1

M+AIA 2 2 2 2

M+CA 3 3 3 3

M+AIA+CA 4 4 4 4

M: Mitra, AIA: Ácido indolácetico, CA: Carbón activado, *: tratamiento.

Cuadro 3.- Inóculos y recipientes en el cultivo in vitro de E. radicans

Semillas Hojas Raíz Yema

RESULTADOS

Semillas

Tres estadios de desarrollo, durante la germinación de las semillas, se observaron

principalmente en los tratamiento M+CA y M+AIA+CA, aunque el primero presenta

mayor porcentaje en el estadio de protocormo con primordio foliar (31%) y protocormo con

dos hojas (3%). En el tratamiento M+AIA y M las semillas alcanzaron principalmente el

estadio de desarrollo de protocormos.

Imagen 5

Hojas

El efecto registrado del CA y AIA en tejido vegetativo de hoja tiene un mayor porcentaje

en el tratamiento en que interactúan CA y AIA, seguido por en el tratamiento en donde solo

se encuentra CA (ver grafica). Por otro lado se puede determinar que el CA es el

componente quien influye en este proceso puesto que el medio al que solo se le añadió AIA

se obtuvo un promedio por debajo al obtenido con CA.

Imagen6

Raíz

Con este

inoculo a los 30 días de

cultivo se obtuvo la

5Protocormos con dos hojas de E. radicans

6 Formación de tejido calloso en tejido de hoja de E radicans.

formación de tejido de novo únicamente en el tratamiento con AIA. El carbón activo

probablemente es un inhibidor de la formación de tejido de novo, puesto que solo se

encontraron resultados en el medio adicionado con AIA.

Imagen7

Microestacas

En este inoculo el mayor porcentaje de brotación de yemas fue en el tratamiento M+AIA,

seguido por el tratamiento M. En los tratamientos M+CA y M+AIA+CA, donde

interactúan el CA y AIA, la respuesta de brotación es más lenta al menos hasta los 30 días

de cultivo.

Sin embargo, la mayor longitud de las yemas desarrolladas se obtuvo en el tratamiento

M+CA seguido por M+AIA (ver grafica)

7 Regeneración de tejido de novo de raíz E radicans.

La contaminación por bacterias se presentó en un rango muy bajo lo que indica que el

método de cultivo es adecuado, sin embargo los inoculos contaminados (raíces y

microestacas) indican que el patógeno proviene del mismo inoculo, por lo cual se indica

que el método de des infestación tendría que mejorarse.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Durante la implementación del diseño experimental de la germinación de las semillas de E.

radicans se obtuvo un mayor porcentaje de diversos estadios en los tratamientos con CA en

comparación con los que no se empleó CA. La adición de 5 gL-1

de CA coincide con lo

registrado por Margara (1998), quien afirma que el carbón activado administrado en bajas

concentraciones a los medios de cultivo, estimula los procesos morfogeneticos en

orquídeas. De igual forma los reportes de Vij et ál. (1994) y Chen et ál. (1999), observaron

que el carbón activado mejora el desarrollo de los protocormos.

Para el desarrollo de yemas en M+AIA, la formación de hasta dos hojas coincide

relativamente con lo estipulado por Pedrosa (1999) al mencionar que el AIA tiene un rango

de resultados favorables para el desarrollo morfogenético. En el caso de raíces, las células

del tejido al contacto con M+AIA, fueron inducidas a la producción de tejido de novo

fenómeno que no se presentó en ningún otro tratamiento. Las hojas presentaron un mayor

porcentaje en la formación de tejido calloso al estar expuestas a M+AIA+CA seguida por

M+CA y M+AIA, siendo las diferencias muy pequeñas en tres tratamientos; esto permite

determinar que la interacción del AIA con CA es apropiado para el desarrollo de tejido

calloso.

CONCLUSIONES

El efecto del AIA y del CA es adecuado para la germinación in vitro de semillas de E.

radicans cuando interactúan durante 30 días con el medio de cultivo Mitra.

El AIA induce la formación de tejido de novo en las raíces de E. radicans en cultivo in

vitro

La brotación de yemas de microestacas se induce en mayor porcentaje con AIA.

El efecto de la interacción de AIA con CA induce un mayor porcentaje de tejido calloso.

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BIOLOGÍA

AREA

LOCAL

CATEGORIA

INVESTIGACIÓN EXPERIMENTAL

MODALIDAD

Efecto del Carbón Activado y Ácido Indolácetico en

el cultivo in vitro de Epidendrum radicans

(Orchidaceae)

4093164

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