INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 1 NDICE Captulo 1: Manual de trabajo 1. INTRODUCCIN: TCNICA ANALTICA 2. PROCEDIMIENTO OPERATIVO DE TRATAMIENTO Y CONSERVACIN DE LAS MUESTRAS 3.PROCEDIMIENTOOPERATIVOPARALATINCINDEBACTERIASFILAMENTOSASSOBRE FROTIS FIJOS 4. PROCEDIMIENTO OPERATIVO PARA LA TINCIN DE PROTOZOOS 5. PROCEDIMIENTO OPERATIVO PARA CADA HOJA DE TRABAJO 5.1.- Evaluacin de la calidad de un fango biolgico: Niveles macroscpicos y microscpicos. 5. 2.- Evaluacin del desarrollo de bacterias filamentosas en un fango activo. 5.3.- Evaluacin de la microfauna presente en fangos activos. Valoracin cuantitativa. ndice bitico de Madoni e ndice de Biodiversidad de Shannon-Weaver. 5.4.- Evaluacin total del fango activo: Conclusiones. 6. FICHAS DE RECOGIDA Y ANLISIS DE DATOS MICROBIOLGICOS Captulo 2: Claves identificativas 1. INTRODUCCIN 2. BACTERIAS 3. PROTOZOOS Captulo 3: ndices biticos 1. INTRODUCCIN 2. EL CASO CONCRETO DE LAS AGUAS RESIDUALES 3. NDICE MADONI 4. NDICE DE SHANNON Captulo 4: Concepto "bioindicacin" y algunas notas bioindicadoras 1. INTRODUCCIN: QU ES LA BIOINDICACIN? 2. EL ECOSISTEMA BALSAS 3. GRUPOS BIOINDICADORES EN BALSAS 3.1. Taxonoma 3.2. Bacterias 3.3. Protozoos y Micrometazoos 3.4. Medios de observacin, cultivo y tratamiento de las muestras 3.5. Aplicaciones de la bioindicacin en la mejora del proceso depurador 3.6. Problemas ocasionados por bacterias filamentosas en el fango activo y parmetros asociados INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 2 3.7. Protozoos asociados a distintas circunstancias en la cuba de aireacin Anexo: Recopilacin de imgenes fotogrficas: protozoos en el fango activo INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 3 CAPTULO 1: MANUAL DE TRABAJO. 1. INTRODUCCIN: TCNICA ANALTICA Generalidades El estudio de la microfauna en fangos activos complementa el anlisis fsico-qumico delsistemaynosaportaunavisinmsprofundadelascondicionesdefuncionamiento.El conocimiento de la abundancia, diversidad y estructura de la comunidad de microorganismos es fundamental para evaluar el grado de depuracin y la calidad del efluente, permitindonos preveerlaaparicindeproblemasenelfuncionamientoo,encasodealteracionesya establecidas,atajarlasdesdesuorigen,contribuyendoalatomadedecisionesjuntoalos parmetros operacionales de la EDAR.El informe biolgico establecido consta de 4 "hojas de trabajo" o "fichas de recogida y anlisis de datos microbiolgicos", en las que por una parte se establece una evaluacin de la calidad del fango comondice de fango (IF) (1"Evaluacin macroscpicay microscpica del fangoactivado")y,porotra,serealizaunavaloracindelabiota,tantoenelmbitode bacteriasfilamentosas(2"Evaluacindelasbacteriasfilamentosas")comodeprotozoos (3"Evaluacin de la microfauna"). De la integracin de estas tres hojas de trabajo se obtiene la ltima,enlaqueseextraenconclusionessobrelacalidadprevisibledelaguadesalida,as como la estabilidad biolgica del sistema (4"Evaluacin final del fango activado"). Sesobreentiendequeseposeenunosconocimientosmnimossobreelmanejodel microscopioydemuestrasdefangoactivado.Delamismaforma,serequieredeun adiestramiento suficiente como para reconocer los diferentes grupos funcionales de protozoos. Campo de aplicacin Este sistema est diseado para poder obtener, de una forma lo ms metdica posible, unainformacincomplementariaalosanlisisfsico-qumicos,quepermitamejorarlatoma de decisiones respecto a los parmetros operacionales de una EDAR convencionaly conocer las causas de las alteraciones del proceso que se puedan producir. La abundancia, diversidad y estructuradelacomunidaddemicroorganismossonfundamentalesparaevaluarelgradode depuracinylacalidaddelefluente,permitindonospreverlaaparicindeproblemasenel funcionamientoo,encasodealteracionesyaestablecidas,atajarlasdesdesuorigen, mejorando la toma de decisiones respecto a los parmetros operacionales de la EDAR. INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 4 Fundamento El anlisis se realiza sobre muestras in vivo del fango activado de una EDAR a la que selepuedenrealizartrestiposdeanlisis:sobremuestraviva,sobremuestravivacon colorante o sobre muestra fijada y teida. Interferencias La muestra debe ser lo ms reciente posible y se debe realizar su anlisis cuanto antes. Entodosloscasosesrecomendablerealizarelanlisisantede5horasdesdelatomade muestras,sobretodoparaelcasodelosfangosjvenes(muyinestables).Esadmisibleun tiempo de espera de 24 horas y en muestras de oxidacin toal de incluso 48 horas. 2.PROCEDIMIENTOOPERATIVODETRATAMIENTOYCONSERVACINDE LAS MUESTRAS Preparacin del microscopio. 1.- Realizar ajuste Khler. 2.- Ajuste de anillos para contraste de fases. 3.- Limpieza de objetivos y portaobjetos con solucin ter/etanol 3:1. 4.- Utilizar filtro azul para observar tinciones o resaltar contornos en organismos vivos. 5.- Utilizar filtro verde para contraste de fases y resaltar tinciones Gram y Neisser difciles de determinar. Toma de muestras. 1.- Utilizar botes de plstico limpios de 2.000 mL. 2.- Toma de muestras a profundidad determinada y fija. 3.- Punto de muestreo fijo y en zona de mxima homogeneidad del fango. 4.- El llenado del bote de muestreo debe dejar siempre de su contenido vaco. 6.- Conservar segn protocolo. INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 5 Transporte. El transporte se realizar en nevera, con el bote situado lo ms estable posible, rodeado de material envolvente para evitar la disgregacin del flculo por movimientos bruscos. No es recomendablelarefrigeracinexcesiva,aunquesmantenerunatemperaturaentornoalos 13C. En la medida de lo posible, realizar el transporte mediante envo urgente. Conservacin de muestras. Inmediatamente a la recepcin de las muestras se tomarn tres alcuotas con distintos tratamientos: Alcuota1:Destinadaalacaracterizacindelflculo.Mantenidaatemperatura ambiente y sin airear. Alcuota2:Destinadaalacaracterizacindelamicrofauna(protozoos).Mantenidaa temperaturaambiente,conoxigenacinmediantepiedraporosa(compresordeaire).La oxigenacin debe colocarse en superficie una vez que ha decantado la muestra, de forma que existaoxgenoparaelmetabolismomicrobiano,perosinquesemodifiqueelfangoporla agitacin.Alcuota3:Destinadaalacaracterizacindebacteriasfilamentosas.Mantenidaen frigorfico,sinagitacin.Previamenteserealizarn5-6frotisbacterianosparasutincin posterior. Tratamiento de las muestras. 1.- Muestras in vivo. * Paraobservacin de la muestra sinalterar,aadir directamente unagota (25L) sobre un portaobjetos y colocar encima un cubreobjetos. *Parainmovilizarorganismosyobservarestructurasvisiblessinnecesidaddetincin, colocar la gota sobre el portaobjetos, poner un cubreobjetos y prensar suavemente.2.- Muestras fijadas. * Indicada para el estudio cuantitativo de organismos. *Permitelaobservacindelasestructurasdelosorganismostalycomoestabanenel momento de tomar la muestra y aadir el reactivo de fijacin (Lquido de Bowin).3.- Muestras teidas. * Para resaltar estructuras especficas que no se observan fcilmente en la muestra in vivo. INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 6 Procedimiento operativo. 1.-Agitarconsuavidadlamuestraparahomogeneizarla,sisepretendenobservarlas caractersticas del flculo o realizar un anlisis cuantitativo. 2.- Dejar decantar y tomar la muestra de la porcin sedimentada cuando se quiera estudiar la diversidad de organismos. 3.-Tomarentre25Lconunamicropipetaconpuntadebocaancha,depositarlosenun portaobjetos (previamente desengrasado)y colocar encima un cubreobjetos, generalmente de 18*18. Para recuentos, cambiar la punta de la micropipeta entre rplicas, pues se trata de una fuente de error muy habitual.4.- Proceder al anlisis microscpico de la preparacin utilizando los distintos objetivos. El de 100x u objetivo de inmersin emplea aceite y se utiliza para observar estructuras en detalle. 5.- Observar, al menos, de 2 a 3 preparaciones de la muestra. 6.- Se recomienda como complemento el anlisis de los MLSS, V30 e IVF. 3.PROCEDIMIENTOOPERATIVOPARALATINCINDEBACTERIAS FILAMENTOSAS SOBRE FROTIS FIJOS En el estudio de fangos activos se utilizan dos tipos de preparaciones, dependiendo del objeto de estudio: Preparacionesenfresco,enlasquelosmicroorganismosseencuentranvivosy puedenobservarsedirectamente,empleandoelcontrasteaportadoporelpropiomaterial biolgicooempleandoelcontrastedefasessiesqueelmaterialbiolgicoesdedensidad homognea. Tambin pueden utilizarse diversos colorantes que pongan de manifiesto alguna estructura de inters como la tincin verde de metil actico en protozoos, por ejemplo.Preparacionesfijadas(frotisfijos),sobrelascualesseaadencolorantesque producenunaseriedereaccionesqumicas,cuyasrespuestasnospermitirnconfirmarla identificacin de microorganismos filamentosos.Lastincionesdebacteriasfilamentosasserealizansobreunfrotisfijo.Paraellose toma un portaobjetos, previamente desengrasado con etanol 95 %, y en posicin inclinada se hacenescurrirunasgotasdemuestrabienhomogeneizadasobrel.Dichoportaobjetosse dejar secar al aire en posicin horizontal, sin utilizar ninguna fuente de calor. Interferencias INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 7 Frotis no extendidos. Cristalizaciones y caducidad en los reactivos. Tincin de Gram Generalidades La pared celular que protege a la clula y le da forma y rigidez, tiene una composicin compleja,estandoconstituidaporpeptidoglicano,cidosteicoicosy/oteicurnicos, polisacridos,lipopolisacridos,lpidos,protenasylipoprotenas.Estoscompuestosse asocian entre s de forma diversa dando lugar a dos tipos fundamentales de paredes, lo que se traduce en dos tipos de bacterias, Gram-positivas y Gram-negativas, que responden de forma diferente a la tincin de Gram. Fundamento LareaccindeGramestrelacionadaconlasprincipalesdiferenciasenla composicin qumicay en la ultraestructura de las paredes celulares. Una muestra de clulas fijadassetiesucesivamenteconelcolorantecristalvioletayconunasolucindiluidade yodo.Lapreparacinsetrataluegoconundisolventeorgnico(alcoholoacetona).Las bacteriasGram-positivasresistenladecoloracinypermanecenteidasdeuncolorazul oscuro, las bacterias Gram-negativas son rpida y completamente decoloradas. Instrumental - Pipeta Pasteur - Portaobjetos (75 x 25mm) - Microscopio ptico con objetivo de 100x Reactivos - Solucin I: Cristal violeta + Oxalato amnico- Cristal violeta: 2 g + 20 mL etanol 95 % - Oxalato amnico: 0,8 g + 80 mL agua destilada - Solucin II: Lugol-Yodo (mantener en oscuridad y frasco topacio)- Yodo: 1g + 2 g yoduro potsico + agua destilada 300 mL- Solucin III: Safranina- Safranina al 2,5 % en etanol 95 % INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 8 Procedimiento 1.- Teir un minuto con solucin I 2.- Aclarar con agua destilada durante algunos segundos 3.- Aplicar solucin II un minuto 4.- Escurrir el exceso de colorante y aclarar con agua destilada 5.- Decolorar con etanol 95 % gota a gota durante 30 segundos 6.- Lavar con agua destilada 7.- Teir con solucin III durante un minuto 8.- Lavar con agua destilada 9.- Secar por absorcin con papel secante o filtro 10.- Observar al microscopio con objetivo de inmersin (100X) Expresin de resultados Color azul-violeta: Gram + Color rojo-rosa: Gram Respuesta a la Tincin de Gram.(A) Organismo Tipo 021N, Gram negativo; 100x, campo claro.(B) Nocardia spp. Gram positiva; 100x, campo claroB www.grupobioindicacionsevilla.comwww.grupobioindicacionsevilla.com A INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 9 Tincin de Neisser Generalidades Las bacterias almacenan en su interior ciertos compuestos: grnulos de reserva. Entre ellos se encuentran los polifosfatos. La tincin de Neisser pone de manifiesto la presencia de estas sustancias de reserva, consistentes en grnulos de polifosfato (volutina) las cuales no son visibles sin una tincin que los haga reaccionar qumicamente. Fundamento ElingredienteactivodelatincindeNeissereselazuldemetileno,queporsu carctercatinicoseunealossitiosaninicosdelascadenaspolimricasdepolifosfato, colorendolosdeazulvioleta.EstacoloracinsecorrespondeconunareaccinNeisser positiva,lacualtiedemanerauniformealgunosfilamentoscomoelTipo0092oslo algunos puntos de otros filamentos como Nocardia sp. Instrumental - Pipeta Pasteur - Portaobjetos (75 x 25mm) - Microscopio ptico con objetivo de 100x Reactivos -Solucin I: 2 A + B (Mezclar 2 partes de la solucin A y una parte de B (v/v))-A: 0,1 g de Azul de metileno +5 mL etanol 95 % + 5 mL cido actico glacial +100 mL agua destilada -B: 3,3 mL de Cristal violeta al 10 % en etanol al 95 % + 6,7 mL etanol 95 % +100 mL agua destilada -SolucinII:33,3mLdeMarrnBismarck(Crisoidina)al1%ensolucinacuosa+ 66,7 mL de agua destilada Procedimiento 1.- Teir el frotis con solucin I durante 30 segundos 2.- Lavar con agua destilada durante unos segundos 3.- Teir durante 1 minuto con solucin II INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 10 4.- Aclarar con agua destilada 5.- Secar por absorcin con papel secante o filtro 6.- Observar al microscopio con objetivo de inmersin (100X) Expresin de resultados - Color azul-violeta: Neisser +- Color marrn claro amarillento: Neisser - - Color marrn oscuro en el interior del filamento en forma de grnulos: Grnulos N+ Respuesta a la Tincin de Neisser.(A) Organismo Tipo 0092. Neisser positivo; 40x, campo claro.(B) Nocardia spp. Neisser negativo, grnulos Neisser positivo; 100x, campo claro. Tincin de poli-|-hidroxibutirato Generalidades ElcidoPoli-|-hidroxibutirato,constituyeunmaterialdereservaexclusivodelos grupos procariticos.El contenido celular de este material de reserva es, por lo general, relativamente bajo en clulas que estn creciendo activamente. El almacenamiento se produce cuando las clulas tienen una limitacin de nitrgeno, pero disponen an de fuentes de carbono y energa. En tal situacinnohaysntesisdecidosnucleicosniprotenasylamayorpartedelcarbono asimilado se convierte en material de reserva, que puede almacenarse hasta constituir el 50% del peso seco celular. Si a estas clulas se les priva entonces de una fuente externa de carbono yselessuministraunafuenteapropiadadenitrgeno,losmaterialesdereservapuedenser usados para sintetizar cidos nucleicos y protenas. B www.grupobioindicacionsevilla.com www.grupobioindicacionsevilla.com A INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 11 Fundamento LosdepsitosdePHBsetienespecficamenteconnegroSudn.Sonfcilmente visibles al microscopio ptico, como grnulos refringentes de tamao variable repartidos por el citoplasma. Instrumental - Pipeta Pateur - Portaobjetos (75 x 25mm) - Microscopio ptico con objetivo de 100x Reactivos - Solucin I: Negro Sudn B (IV), al 0,33% (p/v) en etanol al 60% - Solucin II: Safranina al 0,5% (p/v) en solucin acuosa Procedimiento -Prepararfrotissobreportaobjetosysecarloscompletamentealairehastasu fijacin. - Teir con solucin I durante 10 minutos. Si se evapora aadir ms colorante (evitar su cristalizacin). - Verter el exceso de colorante, lavar 1 segundo con agua destilada y secar con papel secante o de filtro. - Teir con solucin II durante 15 segundos. Aclarar con agua destilada y secar con papel secante o de filtro. - Examinar a 1000x con aceite de inmersin y en campo claro (sin contrasta de fases). Expresin de resultados - Grnulos de PHB: Grnulos intracelulares negro azulados - Ausencia de grnulos de PHB: Citoplasma rosa, claro o sin teir. INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 12 Respuesta a la Tincin de PHB.(A) Flexibacter sp., Grnulos de PHB en el medio; 100x, contraste de fases.(B) Filamento no identificado, Tincin PHB positiva; 100x, campo claro. Nota: En la siguiente tabla se presentan las referencias para los kits de tincin de Gram y Neisser CASA MICROKIT: 918974616 KIT GRAMCDIGO SDA004 CASA PANREAC KIT GRAM-HUCKER CDIGO 254884.19 CASA MERCK KIT NEISSER -1 a -1 b -2 CD. 1.09238.0100 CD. 1.09239.0100 CD. 1.09240.0100 4. PROCEDIMIENTO OPERATIVO PARA LA TINCIN DE PROTOZOOS Tincin de Noland Tincin de flagelos ReactivosSolucin I: 20 mg de cristal violeta + 80 mg de fenol + 20 ml de formaldehdo al 40 % + 4 ml glicerol Procedimiento 1.- Mezclar una gota de solucin I con una gota de muestra en el portaobjetos 2.- Colocar un porta y observar a 100X bajo aceite de inmersin y campo claro Resultados Los flagelos aparecen teidos de color azul B www.grupobioindicacionsevilla.com A www.grupobioindicacionsevilla.com INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 13 Tincin verde de metilo Tincin diferencial de los ncleos de los protozoos Reactivos - Solucin I: dilucin de verde de metileno al 1% en actico al 1% Procedimiento 1.- Mezclar una gota de solucin con una gota de muestra en el portaobjeto. 2.- Observar a 100X bajo aceite de inmersin y en campo claro. Resultados Aparecen las estructuras nucleares internas coloreadas de verde Tincin de impregnacin de nitrato de plata DadaladificultaddeotrosmtodosdeimpregnacinargnticacomoFernndez- Galiano, puede aplicarse el procedimiento que se expone a continuacin, con una metodologa ms sencilla y que, si bien no tie los mismos elementos, pone de manifiesto el cinetosoma y el argiroma de los ciliados, facilitando su identificacin.En algunos casos puedeser necesario el cultivoprevio del organismo, para tener una poblacinmnimasobrelaquehacerlatincin.Enesoscasossepuedenpescarlos organismos bactervoros con una micropipeta e introducirlos en una infusin de lechuga o en un medio de trigo: 50g de trigo hervidos en 1L de agua destilada, fitrados posteriormente y a losqueseaade1granodetrigo.Estosmediosfavorecenelcrecimientobacteriano,conlo quelosorganismoscapturadosypuestosensuinteriorpuedenalimentarseyaumentarsu poblacin. Reactivos Nitrato de plata al 2% Procedimiento - Realizar un frotis del fango activo sobre un portaobjeto. Una vez secado, comprobar que los protozoos no han estallado - Cubrir el portaobjetos con la solucin del nitrato de plata unos 6-8 minutos - Lavar abundantemente con agua destilada INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 14 - Colocar en un bao de agua destilada, de forma que el portaobjetos quede totalmente cubierto- Situar bajo una fuente de luz intensa (preferiblemente natural) durante varios minutos y esperar a que el portaobjetos se vaya oscureciendo. Debemos realizar entonces controles del microscopioparacomprobarquelaimpregnacinsevarealizandocorrectamente. Aproximadamente en 5 minutos, queda terminada. - Observar a 100x bajo aceite de inmersin y en campo claro Resultados Aparecen las estructuras del argiroma y el cinetosoma coloreados VORTICELLA PARAMECIUMARCELLA DIFLUGGIAVALVA DE OSTRCODO INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 15 5. PROCEDIMIENTO OPERATIVO PARA CADA HOJA DE TRABAJO Comoseexpusoanteriormente,elanlisisbiolgicocompletodeunfangoactivo consta de varios apartados:1. Valoracin macroscpica y microscpica de un fango activo: ndice de Fango (IF). 2. Identificacin y cuantificacin bacteriana (organismos filamentosos). 3. Identificacin y cuantificacin protozoaria. 4. Valoracin general del estado del fango: conclusiones. 1 HOJA DE TRABAJO 5.1.-Evaluacindelacalidaddeunfangobiolgico:Nivelesmacroscpicosy microscpicos.Enestahojasehandefinidounaseriedeparmetrosconsideradosdeinterspara establecer las caractersticas msgenerales de unfango.La valoracin dedichos parmetros permite obtener un estudio simplificado de la muestra en funcin de las caractersticas macro- y microscpicas de sta, lo que genera un valor denominado ndice de fango (IF). ElIFestdirectamenterelacionadoconlosporcentajesdereduccindeSS,DQOy DBOdelaEDAR(Jimnezetal.,2001),proporcionandolaposibilidaddeobtenerun histrico de valores de calidad biolgica de forma rpida, comparable y de protocolo sencillo, a partir de la puntuacin de una serie de caractersticas macroscpicas del fango (observables atravsdelaV30)ymicroscpicas(observablesatravsdeunobjetivode10x).Elvalor final, comprendido entre 0 y 100, define la calidad del fango.La valoracin de las caractersticas macroscpicas del fango activo se realiza a travs del ensayo de la V30, que determina la cantidad de fango activado que decanta en una probeta oconoImhof,tranunaesperade30minutos,siendoavecesinteresantevalorarlaV60y V120.A nivel macroscpico (sobre la V30) se definen: -Turbidez del clarificado Alta: visibilidad muy baja a travs de la probeta Media Baja: visibilidad clara a travs de la probeta -Flculos en suspensin en el clarificado Alta: abundancia de microflculos INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 16 Media: presencia de microflculos Baja: prcticamente ausencia de microflculos -Sedimentabilidad del fango Alta: la mayor parte del fango decanta en los 10 primeros minutos del ensayo y el fango est muy compactado Media: la mayor parte del fango decanta entre 10-20 minutosy se observa un ligero esponjamiento Baja: la mayor parte del fango decanta despus de 20 minutos y se observa un claro esponjamiento -Olor: caracterstica macroscpica del fangoactivado que se define comocorrecto oincorrecto,indicandoesteltimosituacionescomosepticidad,presenciade vertidos, etc.El mximo valor obtenido por las caractersticas macroscpicas es de 30 sobre 100. Siseproduceunlevantamientototalomayoritariodelamantadefangos,seindica como valor macroscpico cero.Anivelorientativoyconrelacinalaturbidez,decomplejaevaluacin,semuestran algunasfotografasquepermitenajustarlostresrangosdeesteparmetro.Laturbidezse desglosaenestavaloracindelosmicroflculosensuspensindelclarificado,valorndose ambosdeformaindependiente.Porlotanto,lamedicindirectasobreelclarificadoconun turbidmetro nos proporcionar un valor errneo.Comoreferencia,setomaunobjetoysecolocaenpartetraseradelaprobeta.Sila formadelobjetoseobservaclaramente,lamuestrasedefinecomopocoturbia(turbidez baja).Enestecasoinclusosepuedenapreciarlosdibujosexistentessobreelobjeto.Silos contornosseaprecian,peronoesposibleobservareldibujodelasuperficie,sedefine turbidezmedia.Porltimo,sinoesimposibleobservarningndibujoyloscontornosdel objeto quedan difuminados e incluso no se ven, se habla de turbidez alta.Elconjuntodecaractersticasmicroscpicasrecogidasdurantelaobservacin microscpica se refieren al examen del estado morfolgico y estructural del flculo de fango activo(forma,tamao,estructura,textura,cobertura,etc.)yalexamendelcomponente biticodel"ecosistemafangoactivo",representadoporlaspoblacionesdebacterias filamentosas y de protozoos (principalmente ciliados).Laevaluacindeestascaractersticasproporcionainformacinsobrelaspropiedades dedecantacinycompactacindelfangoactivodurantelafasedeclarificacindellicor INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 17 mezcla,ascomoelnivelyestadodecolonizacindelamicrofauna,aludiendo indirectamente al grado de actividad biolgica del proceso depurador.Procedertalycomoseexponeenelapartado2(subapartado"procedimiento operativo"),procedimientodestinadoalaobservacindelamuestrasinalteracindela estructura flocular ni la disposicin del entramado filamentoso. A nivel microscpico se definen:-Formadelflculo:caractersticaquedefinelamorfologaexternadelflculo comoregularsiaparecedeformaredondeadaeirregularsidifieredeesta configuracin -Tamao del flculo:Pequeo: tamao menor de 150 m Medio: tamao entre 150 y 500 m (incluidos ambos valores) Grande: tamao mayor de 500 m TURBIDEZMEDIAALTABAJA INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 18

-Estructura del flculo: Compacto: no existen prcticamente huecos en la estructura interna del flculo Medio: se detectan algunos huecos Abierta:existenbastanteshuecosdentrodelflculoquerompenlaunidad interna TAMAOS FLOCULARES>500micras150-500micras< 150micrasTAMAO MEDIOTAMAO GRANDETAMAO PEQUEOESTRUCTURASFLOCULARESFLOCULOCOMPACTO;TEXTURA FUERTEFLOCULO ABIERTO;TEXTURA DEBILESTRUCTURAS FLOCULARES INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 19 -Texturadelflculo:caractersticaquealudealgradodecohesinentrelas partculasqueformanelflculo,establecindoselascategoras"fuerte"y"dbil" enfuncinalasustanciaopresenciadedisgregacindelosflculos, respectivamente, tras puncin sobre el cubreobjetos-Cobertura: caracterstica que valora si la unin de todos los flculos presentes en elocularde10Xcubremenosdel10%desusuperficie,del10-50%omsdel 50% -Filamentos en el flculo:Menos de 5 filamentos/flculo Entre 5-20 filamentos/flculo (incluidos ambos valores) Ms de 20 filamentos/flculo-Filamentos en disolucin: caracterstica que cuantifica laexistencia de filamentos libres entre los espacios interfloculares del licor mezcla. Si no son observables ser "baja"(categorabacteriana2).Nota: lacategorabacteriana2 sedefinecomo "abundanciadealgnfilamento; sevenfilamentos en los espacios intefloculares, pero no en todos ellos" -Diversidad de protozoos: Menos de 4 especies De 4-7 especies (incluidos ambos valores) Ms de 7 especies Otrasobservaciones:presencia/ausenciadecrecimientodisperso,presencia/ausencia defibrasorgnicas,presencia/ausenciadepartculasorgnicas,presencia/ausenciade bacterias helicoidales, presencia/ausencia de Zoogloea sp., etc. Todas estas observaciones se han de realizar con un objetivo de 10x, con cubreobjetos de 18*18y, al menos, sobre 2 preparaciones distintas de la muestra, que ser homogenizada previamente con suavidad. Con ayuda de una pipeta Pasteur, se toma un pequeo volumen de lasuspensinbiolgica,sedepositasobreunportaobjetosysecolocaencimaun cubreobjetos. El mximo valor obtenido por las caractersticas microscpicas es de 70.Lainformacinquesededucedelasobservacionesmicroscpicas,juntoconla obtenida durante el ensayo de decantacin en probeta o V30, permite otorgar un valor final de INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 20 puntuacinqueevaluarlacalidaddelfango,alencontrarsedichapuntuacindividaen distintas categoras (Tabla 1).Tambin es conveniente realizar el ensayo de los SSLM, SSVLM, V30 e IVF. Tabla 1: Categoras de ndice de Fango.NDICE DE FANGOS 0-20 psimo 21-40 malo 41-60 regular 61-80 bueno 81-100 ptimo A nivel orientativo y con relacin al tamao, estructura y textura, se muestran algunas fotografas que permiten ajustar los rangos de estos parmetros.Desarrollo investigador del IF Paralaelaboracindeestendice,pasoprevioloconstituylaseleccindeaquellos parmetros que definieran y valoraran las caractersticas generales del fango. A continuacin, seestableciunperiododecontrastederesultadosdealgomsdeunaoquepermiti someter a estudio el ndice elaborado. Esta etapa del estudio, adems, posibilit la unificacin decriteriosparaloscomponentesdelgrupo,requisitoindispensableparalaobtencinde resultados comparables.LosparmetrosseleccionadosparaconstituirelIF,denominadoscaractersticas macro-ymicroscpicas,seencuentranrecogidosenlaTabla2juntoconlasdistintas variantesconlasquedichascaractersticasestndefinidas.Lasidentificacionesbacterianas handeefectuarseconbasealmanualMicroorganismosfilamentososenelfangoactivo (EMASESA,1997)yapoyadasendistintosartculosquetrataneltema(Eikelboom,1975; Surez, 1993; Ayuntamiento de Madrid, 1996; Moro, 1998).Traselperododecontrasteyunavezestablecidosloscriteriosgeneralesde valoracin,sepasaunperiododerecopilacindedatosfsico-qumicosendistintas depuradoras,enlasqueelIFseimplantdeformasistemtica.Elobjetivodeestafasedel trabajoloconstituaelestudiodelIFenfuncindelascaractersticasdelinfluenteylas calidades del efluente. El rea de estudio se localiz en cuatro EDAR de la ciudad de Sevilla, quetrabajanamediayaltacargayestndotadasdefangosactivoseneltratamiento biolgico.Encadaunadeellas,ademsdelaaplicacindelIFenelanlisisdelas INTERLABORATORIOS 2006 GRUPO BIOINDICACIN SEVILLA 21 caractersticasdelfango,serecopilaronlosdatosreferentesaSS,DQO,DBO5,NyPtanto delaguadeentradaaladepuradora,comoalasalida.Losanlisisdeestosltimosse realizaron segn los Mtodos Normalizados (APHA, AWWA, WPCF, 1992). Delperiododeestudioenplantaseobtuvieron109datos,loscualesaparecen reflejados en la Tabla 3, y a los que se realiz un anlisis estadstico de correlaciones. En tal estudio se buscaba una posible relacinentreel valor delIFy los parmetros que definen la calidad del efluente (SS, DQO, DBO5, N y P). Tabla 2: Valoracin del IF.CARACTERSTICAS MACROSCPICAS TurbidezAlta Media Baja 0 4,5 9 Flculos en suspensinAlta Media Baja 0 4,5 9 SedimentabilidadAlta Media Baja 9 4,5 0 OlorCorrecto Incorrecto 3 0 CARACTERSTICAS MICROSCPICAS FormaRegular Irregular 4 0 TamaoGrande Medio Pequeo 4 7 0 EstructuraCompacta Media Abierta 18 9 0 TexturaFuerte Dbil 4 0 Cobertura< 10% 10-50% >50% 0 7 3,5 Filamentos en flculos>20 5-20 categora bacteriana 2 Baja< categora bacteriana 2 0 3 Diversidad de Protozoos