Mecanismos de replicación celular

“Una hebra es el complemento de la otra”

Proceso mediante el cual la secuencia de nucleótidos de una hebra de DNA, es copiada por

apareamiento de bases complementarias (A-T, G-C) en una nueva secuencia de DNA

Se requiere:

- Reconocimiento de cada nucleótido en la hebra molde, por otro nucleótido libre

complementario

- Separación de las hebras de la doble hélice del DNA

- Polimerización catalizada por enzima

Replicación es semiconservativa

Experimento de Meselson-Stahl

a.Células cultivadas en medio donde la única fuente de Nitrógeno, NH4Cl poseía 15N.b.Células se transfirieron a medio con 14N y se obtuvo DNA después de una generación.c.Segunda generación genera don DNA´s híbridos y dos DNA con 14N

Preguntas por resolver

-¿Las hebras de DNA parentales están completamente desenrolladas antes de ser replicadas?

-¿La replicación comienza en lugares aleatorios o en único punto?

- ¿Ocurre en una sola dirección?

Replicación del cromosoma de E. coli

John Cairns demostró la replicación del cromosoma de E. coli en 1963 Marcó radioactivamente el cromosoma con 3H-Timidina Luego aisló los cromosomas lisando las células suavemente Los observó mediante autoradiografía

Se demostró:- E. coli tiene un cromosoma circular de 1,7mm de longitud- Tiene un único origen de replicación- En E. coli cuando se desenrrolla el DNA simultáneamente se da la

replicación

Replicación unidireccional o bidireccional?

John Cairns con una varió el experimento con 3H-Timidina Cultivó E. coli en medio con 3H-Timidina de baja actividad específica Esperó a que las células estuvieran a la mitad de la replicación Pulsó las células con 3H-Timidina de alta actividad específica

Se demostró:- El cromosoma de E. coli efectúa replicación bidireccional

Origen de replicación

Denaturation mapping• Técnica que se basa en la desnaturalización de regiones ricas en T

y A• DNA con loops de replicación son parcialmente desnaturalizados• Se mapean la posición y el avance de las horquillas de replicación• Se demostró la existencia de un origen de replicación

Horquilla de replicación

En la horquilla de replicación, el DNA de las nuevas hebras hermanas es sintetizado por un complejo multienzimático

La polimerización se da por la enzima DNA polimerasa que polimeriza en dirección 5’-3’, descubierta en 1957

No se conoce una enzima que polimerice de 3´a 5´

La horquilla es una estructura asimétrica

- La hebra en dirección 5’-3’ es polimerizada continuamente y se denomina la hebra líder

- La hebra hermana hermana que es sintetizada de forma discontinua se conoce como hebra rezagada

Fragmentos de Okazaki

• Fragmentos de DNA de 1000-2000pb en Procariotes y 100-200pb en Eucariotes

• Se sintetizan en la hebra rezagada en la dirección 5´-3´• La hebra rezagada debe esperar a que la hebra líder exponga la

hebra molde en los cuáles son sintetizados los fragmentos de Okazaki

Inicio de la replicación

Modelo de replicón del inicio de replicación

Replicador: Set de secuencias que son suficientes para dirigir

el inicio de la replicación del DNA

Incluye al origen de replicación

Proteína iniciadora: Reconoce un elemento de DNA en el

replicador que activa la iniciación

Proteínas para abrir la doble hélice

La doble hélice de DNA debe ser abierta al frente de la horquilla de replicación Dos proteínas contribuyen en este proceso: DNA helicasas y Single Strand

DNA-Binding Proteins

DNA Helicasas: Hidrolizan ATP para hacer trabajo mecánico. De esta manera se genera

propulsión cuando están ligadas a hebras sencillas de DNA.

Al encontrar doble hélice la separan a una velocidad de 1000 nucleótidos por segundo.

Single Strand DNA-Binding Proteins: También son conocidas como proteínas desestabilizadoras

de la hélice. Se unen fuertemente a DNA de cadena sencilla sin cubrir las bases. Ayudan a las

DNA helicasa a mantener el DNA abierto.

Adicionalmente impiden la formación de hairpines.

DNA polimerasas

Su función principal es catalizar él ataque nucleofílico del grupo hidroxilo ubicado en la posición 3´ del nucleótido ubicado en la hebra que se está sintetizando al fósforo α del deoxinucleótido 5’ trifosfato

La enzima tiene preferencia estructural por aquellos nucleótidos que son complementarios

Adicionalmente la DNA polimerasa corrige los errores que se puedan generar en la polimerización mediante actividad exonucleasa

DNA polimerasas

Nick translation

Arquitectura de una DNA polimerasa

Resumen del proceso

DNA topoisomerasas

Cada 10 pares de bases se completa un giro alrededor del eje central

Ocurre un problema de torción La polimerasa rompe el enlace fosfodiester para que las dos

secciones del DNA puedan rotar