ANEXO I

Medios de Cultivo

NOTA Los medios de cultivo son presentados en orden alfabético, independientemente de su estado físico. Agua Peptonada. Peptona 1,0 g Cloruro de sodio 8.5 g Agua destilada 1,0 L Disolver los componentes de la formulación en un litro de agua y ajustar la solución a pH de 7,0, con solución de hidróxido de sodio 1N; distribuir en matraces o tubos, de acuerdo a los requerimientos de la técnica y esterilizar a 121°C±1°C durante 15 minutos. Después de la esterilización, los volúmenes y el pH de la solución deben ser iguales a los iniciales. Agua Peptonada Alcalina (APW). Peptona 10,0 g Cloruro de sodio 10,0 g Agua destilada 1,0 L Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal forma que después de esterilizar éste sea de 8,5± 0,2. Esterilizar en autoclave 10 minutos a 121ºC.

Principio de acción

Medio utilizado para enriquecimiento selectivo del género Vibrio ya que las condiciones óptimas de desarrollo se favorecen por un pH alcalino. Agua de Peptona amortiguadora. Peptona 10,0 g Cloruro Sódico 5,0 g Fosfato sódico dibásico 3,5 g Fosfato potásico monobásico 1,5 g

Agua destilada 1,0 L Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario. Ajustar el pH, después de la esterilización a 7,0 en caso de ser necesario. Distribuir en recipientes de vidrio con la capacidad necesaria para obtener las porciones necesarias para la prueba. Esterilizar a 121±1°C durante 20,0 minutos. Principio de acción El agua de peptona tamponada al ser un medio nutritivo no selectivo, puede ser utilizada como medio de preenriquecimiento, antes del enriquecimiento selectivo de Salmonella en alimentos. Proporciona condiciones para la recuperación de células dañadas por los procesos de conservación de alimentos. Almidón, agar. Peptona 5,0 g Extracto de carne 3,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Almidón de maíz 10,0 g Agar 20,0 g Agua destilada 1,0 L Suspender homogéneamente el almidón, en 100 mL de agua destilada fría, hasta eliminar cualquier grumo. Por otra parte, disolver los demás ingredientes en 900 mL de agua, calentar y agitar continuamente. Ajustar el pH a 7.2±0,1 y añadir la suspensión de almidón a la solución anterior, agitar continuamente hasta completa homogeneización. Esterilizar a 121°C, durante 15 minutos Principio de acción: Esta prueba se basa en la capacidad que tienen algunos microorganismos de hidrolizar el almidón (polisacárido); este compuesto está constituido por un conjunto de unidades de α-D-glucosa cuya estructura química es una hexosa. Por otra parte, se sabe que el almidón forma un complejo de color azul intenso en presencia de yodo, en ocasiones la coloración es rojiza debido al alto contenido de dextrinas que presenta el almidón, sin embargo los mono y disacáridos no se enlazan con el yodo, por lo tanto no dan coloración azul ni rojiza. Algunos microorganismos contienen enzimas como las α o β amilasas, capaces de hidrolizar el almidón dando como productos de la reacción mono o disacáridos, por lo que al adicionar a estos azúcares la solución de yodo, no aparecerá coloración azul ni rojiza (no confundir con el color de la solución de yodo que es café). Arginina y glucosa, agar.

Peptona 5,0 g Extracto de levadura 3,0 g Triptona 10,0 g Cloruro de sodio 20,0 g Glucosa 1,0 g Clorhidrato de L-arginina 5,0 g Citrato férrico amónico 0,5 g Tiosulfato de sodio 0,3 g Púrpura de bromocresol 0,2 g Agar 13,5 g Agua destilada 1,0 L Suspender los ingredientes en agua destilada y hervir hasta disolución del agar; envasar cantidades de 5,0 mL en tubos de 13 X 100 mm. Ajustar el pH entre 6.8 y 7,0, Esterilizar en autoclave a 121°C durante 10 a 12 minutos. Dejar solidificar el medio inclinando los tubos. Principio de acción: La descarboxilación del aminoácido L-arginina, es realizada por microorganismos que poseen la enzima descarboxilasa y se lleva a cabo cuando se rompe la unión del grupo carboxilo, liberando dióxido de carbono (gas) y formando putrescina, esta última es una diamina que se caracteriza por presentar reacción alcalina. Por otra parte el indicador, púrpura de bromocresol en medio alcalino presenta una coloración púrpura y en medio ácido es amarillo. Por lo tanto si se produce putrescina el medio intensifica el color púrpura por la alcalinidad producida, en caso contrario el medio no cambia de color; finalmente también se podrá observar la fermentación de la glucosa con su respectiva producción de acidez, virando el medio a color amarillo verdoso. ASTEL, agar. (Ver: Soya tripticaseína con 0,6% de extracto de levadura, agar). Baird Parker, agar. Ingredientes del medio base* Peptona de caseína 10,0 g Extracto de levadura 1,0 g Extracto de carne 5,0 g Glicina 12,0 g Cloruro de litio 5,0 g Piruvato de sodio 10,0 g Agar 15,0 g Agua destilada 950,0 mL

Suspender 58,0 g del medio en 950 mL de agua y calentar con agitación constante, dejando hervir durante un minuto, posteriormente esterilizar a 121°C±1,0°C durante 15 minutos. Enfriar y mantener el medio a 45°C. Solución de telurito de potasio: Preparar una solución de telurito de potasio al 1% en agua, esterilizar a 121°C durante 15 minutos. La solución puede ser almacenada por varios meses a una temperatura entre 0 y 5°C. Emulsión de yema de huevo: La preparación de la emulsión de yema de huevo, también se realiza por separado, para lo cual lavar los huevos frescos con agua y jabón, enseguida limpiar los cascarones con una solución de tintura de yodo (solución alcohólica al 2%), o bien sumergirlos en una solución de cloruro mercúrico (1:1000); enjuagar con agua estéril y secar con gasa también estéril. En una campana de flujo laminar o en condiciones asépticas, abrir los huevos y vaciarlos en un separador de claras estéril. Transferir las yemas en una probeta, hasta un volumen de 60,0 mL y completar a 90,0 mL con solución salina isotónica estéril, posteriormente verter la emulsión a un matraz Erlenmeyer que contenga perlas de vidrio estériles y agitar fuertemente para que se forme la emulsión, después se filtra sobre gasa estéril. Preparación del medio: Medio base 95,0 mL Solución de telurito de potasio 1,0 mL Emulsión de yema de huevo 5,0 mL Mezclar perfectamente bien los ingredientes, manteniendo el medio a 45°C, posteriormente repartir en cajas de Petri entre 15,0 y 20,0 mL de este medio, dejar enfriar hasta solidificación del medio. Las cajas pueden almacenarse hasta por 48 h. después de su preparación, conservándolas a una temperatura entre 0 y 5°C. Principio de acción: S. aureus tiene la capacidad de reducir el telurito de potasio (K2O3Te) a telurio metálico (Te), por esta razón las colonias se presentan de color negras metálicas de acuerdo a la siguiente reacción:

Te4+ Te0

Las lecitinas son fosfoglicéridos, cuya estructura corresponde a ésteres de ácidos grasos unidos con el ácido fosfórico, glicerol y colina; son componentes normales de la yema de huevo. Las lecitinas pueden ser hidrolizadas por enzimas denominadas lecitinasas, existen 4 tipos de ellas, la A; B; C y D, siendo la “C” la producida generalmente por las bacterias; los productos de dicha hidrólisis son ácido fosfórico y colina, por esta razón las colonias de S. aureus patógeno, al llevar a cabo la hidrólisis de la lecitina, forma halos transparentes alrededor de la

colonia negra (reducción del telurito), además al romperse las uniones lipoprotéicas, se liberan grasas que son insolubles en el medio provocando una opalescencia alrededor de la colonia. Bilis rojo violeta, agar. Peptona de carne 7,0 g Extracto de levadura 3,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Lactosa 10,0 g Mezcla de sales biliares 1,5 g Rojo neutro 0,03 g Cristal violeta 0,002 g Agar 13,0 g Agua destilada 1,0 L Humectar perfectamente los ingredientes del medio en 750,0 mL de agua, posteriormente ajustar el pH a 7.4±0,1 y esterilizar en matraz durante 30 minutos en baño de vapor. No esterilizar en caso de usarlo al momento. Principio de acción: La bilis de buey que contiene una mezcla de sales biliares y que se encuentra en el medio, inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas, permitiendo el desarrollo de bacterias coliformes cuyo Gram es negativo. Las sales biliares se presentan como derivados del ácido cólico y desoxicólico, su estructura química básica es la del ciclo pentano perhidrofenantreno. Bilis verde brillante, agar. Bilis de buey deshidratada 20,0 g Lactosa 10,0 g Peptona de gelatina 10,0 g Verde brillante 0,0133 g Agar 18,0 g Agua destilada 1,0 L Suspender 40,0 g del medio en un litro de agua destilada, agitando constantemente para ayudar a la humectación, después hervir con agitación constante para evitar que éste se queme. Se esteriliza en matraz a 121°C±1,0°C durante 15 minutos. Principio de acción:

La bilis de buey que contiene el medio, inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas, permitiendo el desarrollo de bacterias coliformes Gram negativas. Las sales biliares son derivados del ácido cólico y desoxicólico, su estructura química básica es la del ciclo pentano perhidrofenentreno. Salmonella, desarrolla bien en este medio y presenta colonias rosas. Sus requerimientos nutricionales se satisfacen con la lactosa y la peptona de gelatina. Bilis verde brillante con lactosa, caldo (Brila). Bilis de buey deshidratada 20,0 g Lactosa 10,0 g Peptona de gelatina 10,0 g Verde brillante 0,0133 g Agua destilada 1,0 L Suspender 40,0 g de medio en un litro de agua destilada, agitar constantemente para ayudar a la disolución. Distribuir el medio de cultivo en tubos de ensayo que contengan campanas de Durham. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Tener cuidado que ninguna campana de Durham presente gas después de la esterilización. Principio de acción: La enzima β-D-galactosidasa presente en las bacterias coliformes, hidroliza a la lactosa presente en el medio de cultivo, produciendo glucosa y galactosa, monómeros que, secuencialmente, son metabolizados hasta ácidos y CO2; este último subproducto se detecta en las campanas de fermentación después de incubar de 24 a 48 h. Este medio de cultivo posee dos inhibidores bacterianos: las sales biliares y el verde brillante. Las sales biliares inhiben el crecimiento de microorganismos Gram positivos y también tienen efecto tóxico sobre algunos microorganismos Gram negativos. Las sales biliares se presentan como derivados del ácido cólico y desoxicólico, su estructura química básica es la de ciclo pentano perhidrofenantreno. El verde brillante es un colorante que inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas y la mayoría de bacilos Gram negativos excepto los coliformes. Incluso suprimen el crecimiento de los microorganismos anaerobios fermentadores de la lactosa como el Clostridium perfringens que daría reacciones falsas positivas. BPLS modificado, agar. Peptona de carne 10,0 g Extracto de levadura 3,0 g Extracto de carne 5,0 g Fosfato monobásico de sodio 0,6 g

Fosfato dibásico de sodio (Na2HPO4) 1,0 g Lactosa 10,0 g Sacarosa 10,0 g Rojo de fenol 0,09 g Verde brillante 0,0047 g Agar 12,0 g Agua destilada 1,0 L Suspender 52,0 g del medio en 750,0 mL de agua, para humectar los polvos insolubles, después adicionar el resto del agua y calentar a ebullición durante un minuto, el pH final debe ser de 6.9. No esterilizar el medio y repartirlo en cajas Petri. Principio de acción: En este medio se pueden distinguir las bacterias que fermentan la lactosa, las cuales presentan colonias que viran el medio a color amarillo por la formación de acidez a partir del azúcar. Las colonias rojas indican que los microorganismos no fermentan la lactosa. Brewer anaeróbico, agar. Peptona de caseína 10,0 g Peptona de soya 5,0 g Cloruro de sodio 5,0 g L-cistina 0,4 g Dextrosa 10,0 g Tioglicolato de sodio 2,0 g Formaldehído sulfoxilato de sodio 1,0 g Azul de metileno 0,002 g Agar 12,6 g Agua destilada 1,0 L Suspender 55,0 g del medio en 750,0 mL de agua para humectar perfectamente bien, posteriormente adicionar el resto del agua, agitar y calentar hasta ebullición durante un minuto o bien hasta que el medio se disuelva por completo. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos; el pH final debe ser de 7.2±0,2. Principio de acción: El tioglicolato de sodio consume el oxígeno ambiental, creando una atmósfera anaeróbica, que es el objetivo de este medio. Además este medio contiene más sustancias reductoras como la cistina, el sulfoxilato y el formaldehído, los cuales garantizan una anaerobiosis suficiente para los microorganismos. El azul de metileno es un indicador para reacciones de óxido reducción.

Bismuto sulfito, agar. Extracto de carne de res 5,0 g Mezcla de peptonas 10,0 g Glucosa 5,0 g Fosfato sódico dibásico (anhidro) 5,0 g Sulfato ferroso (anhidro) 0,3 g Sulfito de bismuto 8,0 g Verde brillante 0,025 g Agar 20,0 g Agua destilada 1,0 L pH final 7,6±0,2 Suspender todos los ingredientes en el agua destilada. Calentar hasta su disolución completa, agitando frecuentemente. Ajustar el pH. Enfriar a 45°C y verter en cajas de Petri estériles, distribuyendo de manera homogénea el precipitado propio del medio. El aspecto de las placas es opaco, ce color verde pálido y deben usarse el mismo día de su preparación. Si la coloración es parda, no deben utilizarse. El medio no debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamiento afecta su selectividad. Principio de acción: En este medio el sulfito de bismuto actúa con el verde brillante como agente selectivo para la inhibición de coliformes, permitiendo el desarrollo de Salmonella. Los compuestos de azufre funcionan como sustrato para la producción de ácido sulfhídrico, mientras que la reducción de las sales de bismuto a bismuto metálico tiñe las colonias de un brillo negro o café metálico por la reducción del sulfito a sulfuro, produciendo ácido sulfhídrico. BRILA, caldo (Ver: Bilis verde brillante con lactosa, caldo).

Celobiosa, polimixina B y colistina modificado, agar (mCPC) Solución 1: Peptona 10,0 g Extracto de carne 5,0 g Cloruro de sodio 20,0 g Solución Stock de colorante 1000 X 1,0 mL Agar 15,0 g Agua destilada 0,9 L Ajustar el pH a 7.6, posteriormente hervir hasta que el agar se funda, después esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar entre 48 y 55°C.

Solución stock de colorantes 1000 X: Azul de bromotimol 4,0 g Rojo de cresol 4,0 g Etanol al 95% 100,0 mL Para obtener un color firme del medio, usar una solución colorante stock, en lugar de estar pesando repetidamente los colorantes en polvo. Disolver los colorantes en el alcohol etílico hasta obtener una concentración de 4% (peso/volumen); de esta solución se toma un mililitro y se adiciona a un litro del medio mPCP (solución 1), que se encuentra enfriado entre 48 y 55°C. Solución 2: Celobiosa 10,0 g Colistina 400000 UI Polimixina B 100000 UI Agua destilada 0,1 L Disolver la celobiosa por calentamiento en agua destilada, enfriar y agregar los antibióticos. Esterilizar por filtración y adicionar la solución 2 a la solución 1, mezclar y distribuir en cajas Petri. Principio de acción: La polimixina B, es un antibiótico que inhibe el crecimiento de microorganismos Gram positivos, esto es un antibiótico de espectro reducido. Permite entre otros, el desarrollo del género Vibrio, por ser éstos Gram negativos. Además contiene una alta concentración de cloruro de sodio, en el que desarrollan los microorganismos halotolerantes.

Cianuro, caldo (KCN).

*Cianuro de potasio 0,5 g

Polipeptona 3,0 g

NaCl 5,0 g

KH2PO4 0,225 g

Na2HPO4 5,64 g

Agua destilada 1,0 L

Disolver todos los ingredientes excepto el cianuro de potasio, esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.

Principio de acción. Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como el último eslabón de la cadena respiratoria aerobia, transfirió electrones al oxígeno con formación de agua. El sistema citocromo se encuentra en oganismos aerobios y anaerobios facultativos, lo que posibilita la identificación de aquéllos que carecen de dicha enzima. El cianuro interrumpe el último eslabón de la cadena respiratoria, sin embargo hay microorganismos que generan su energía metabólica por vías alternas. Cuenta Estándar, agar (Ver Métodos estándar, agar). Citrato Simmons, agar. Sulfato de magnesio 0,2 g Fosfato dihidrogenado de amonio 1,0 g Fosfato dipotásico 1,0 g Citrato de sodio tribásico 2,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Azul bromotimol 0,08 g Agar 15,0 g Agua destilada 1,0 L pH 7,0 ±0,2 Disolver 23,0 g en 1 litro de agua destilada. Calentar hasta ebullición para disolver completamente los ingredientes. Distribuír en tubos y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min. Inclinar los tubos después de esterilizar. Enfriar antes de su uso y conservar en refrigeración (4-10 °C). La caducidad es aproximadamente de 6-8 semanas. Se inocula a partir de un cultivo en medio sólido (se recomienda agar Kligler hierro); no se recomiendan las suspensiones en caldo. Estriar SOLO EN EL PICO DE FLAUTA Principio de acción. El agar Citrato de Simmons se recomienda para la diferenciación de la familia Enterobacteriaceae basada en la capacidad de utilizar el citrato como única fuente de carbono. La energía puede ser proporcionada a algunas bacterias en ausencia de fermentación o producción de ácido láctico por la utilización del citrato como única fuente de carbono. Los microorganismos podrán introducir el citrato al citoplasma por una permeasa, donde ocurre un desdoblamiento a través de la enzima citrato oxaloacetato liasa, dando como productos acetato, formato, lactato y/o dióxido de carbono. El medio contiene también sales inorgánicas de amonio.

Un microorganismo que puede utilizar el citrato como fuente de carbono también utiliza las sales de amonio como única fuente de nitrógeno, éstas son degradadas a amoniaco alcalinizando el medio con lo cual se genera el vire del indicador azul de bromotimol de verde a pH neutro a un color azul a pH alcalino, considerándose de esta forma la reacción como positiva. Descarboxilasa (arginina, lisina y ornitina), medio base. Peptona 5,0 g Extracto de levadura 3,0 g Dextrosa (D-glucosa) 1,0 g Púrpura de bromocresol 0,02 g Agua destilada 1,0 L • Se sugiere añadir 20,0 g de cloruro de sodio, en cada litro de medio de cultivo,

cuando se desee identificar Vibrio cholerae; para Vibrio spp. halofílicos, adicionar 15,0 g de cloruro de sodio en cada litro de medio base; para otros géneros y especies de microorganismos seguir la formulación descrita.

• Adicionar 5,0 g del aminoácido de prueba; arginina, lisina y ornitina, en cada litro de medio base.

Como control, usar base sin suplemento (aminoácido). El medio se distribuye en tubos y se esterilizan a 121°C durante 10 minutos; el pH del medio después de esterilizar debe estar en 6.5±0,2 Principio de acción La base de nutrientes de este medio, permite las mejores condiciones de desarrollo de los microorganismos. La descarboxilación del aminoácido que contiene el medio de cultivo y que se realiza por la enzima descarboxilasa que poseen algunos microorganismos, provocan la liberación del grupo carboxilo, quedando el grupo amino en el medio de cultivo, por lo que el medio se alcaliniza, dando una coloración púrpura. La lisina al ser descarboxilada, da como producto la cadaverina, en tanto que la ornitina y arginina, dan como productos finales putrescina. Debido a que la descarboxilación solamente se lleva a cabo en medio ácido (por debajo de pH 6,0), el medio debe acidificarse mediante la fermentación de la glucosa; esto quiere decir que este medio sólo se utiliza para la diferenciación de microorganismos fermentadores de la glucosa y que posean la enzima descarboxilasa. Los microorganismos que son descarboxilasa negativos, pero son fermentadores de la glucosa, ocasionan que el medio se acidifique, por lo que el indicador vira a amarillo. En períodos de incubación muy prolongados, se puede presentar

alcalinización de la superficie del medio, dando por consecuencia un cambio en el color del medio, esto es se intensifica el color violeta. DNA, agar. Ácido desoxirribonucléico (DNA) helicoidal de timo de ternera o equivalente

0,03 g

Agar 1,0 g Solución de cloruro de calcio anhidro 0,01M 0,1 mL Cloruro de sodio 1,0 g Solución de azul de toluidina 0,1M 0,3 mL Solución de Tris-(hidroximetil- aminometano) 0,05M, pH 9,0 100,0 mL Mezclar todos los ingredientes, excepto el azul de toluidina y agitar hasta disolución del ácido desoxirribonucléico, calentar a ebullición. Posteriormente adicionar el azul de toluidina y distribuir en frascos pequeños con tapón de hule; NO ES NECESARIO ESTERILIZAR. Este medio es estable a temperatura ambiente aún después de 4 meses, funciona de manera correcta aún después de fundido varias veces. Principio de acción: Los ácidos nucleicos, están constituidos por azúcar-fosfato-bases nitrogenadas, el azúcar es la β-D-desoxirribosa, que forma uniones éster con el ácido fosfórico, unidas también a bases nitrogenadas como la adenina, guanina, timina y citosina, dando una forma en el espacio de una espiral o helicoidal. Estos ésteres pueden ser hidrolizados por enzimas; en el caso de la hidrólisis del DNA por la nucleasa microcóccica (S. aureus), se producen principalmente mono y dinucléotidos, son productos de la ruptura del azúcar (carbono 3´ y 5´) con el fosfato. Es importante hacer notar que la enzima DNAasa, es más activa sobre el DNA desnaturalizado (por calentamiento) que sobre el DNA original, además es una característica de S. aureus patógeno. Dulcitol rojo de fenol, caldo. Peptona de caseína 10,0 g Extracto de carne 1,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Rojo de fenol 0,018 g Dulcitol 10,0 g Agua destilada 1,0 L pH 7,4±0,2 Pesar con precisión la cantidad descrita en el envase. Rehidratar con el agua destilada. Calentar suavemente la solución. El carbohidrato se puede agregar antes de la esterilización. Ajustar el pH del medio antes de esterilizar. Esterilizar

116-118°C durante 15 min. Es altamente recomendable la esterilización del medio base SIN EL CARBOHIDRATO a 121°C durante 15 min, enfriar el medio base a ±45°C y agregar la solución del carbohidrato esterilizada por filtración en membrana. Distribuir en tubos estériles. Conservar en refrigeración (4-10°C). La caducidad es aproximadamente de 6-8 semanas. Se inocula a partir de un cultivo puro (agar Kligler hierro u otro medio adecuado) de 18 a 24 horas de incubación. Principio de acción Se determina la capacidad de un microorganismo para fermentar un carbohidrato específico en un medio basal y producir ácido o ácido con gas visible. La fermentación es un proceso anaeróbio de oxidación-reducción, en el cual un sustrato orgánico actúa como el aceptor final de electrones. Los productos característicos de la fermentación bacteriana son: a) ácido láctico, b) ácidos acético y fórmico, c) ácido láctico y alcohol etílico, d) etanol, e) acetilmetilcarbinol y CO2, f) ácido succínico a ácido propiónico y CO2, g) CO2 y acetona a alcohol isopropílico y h) ácido butírico a alconol butílico. El indicador de pH utilizado para demostrar la fermentación del hidrato de carbono es el rojo de fenol, ya que la mayoría de los productos finales del metabolismo de carbohidratos son ácidos y generaran un vire del indicador a amarillo. EC, caldo (Escherichia coli, caldo para). Bacto triptosa 20,0 g Bacto lactosa 5,0 g Bacto sales biliares No. 3 1,5 g Fosfato dipotásico 4,0 g Fosfato monopotásico 1,5 g Cloruro de sodio 5,0 g Agua destilada 1,0 L Disolver todos los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar ligeramente para una mejor disolución. Ajustar el pH a 6.9 ± 0,2 (25ªC) y distribuir 10 mL del medio a cada tubo de ensayo, con campanas de Durham. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Se recomienda que antes de abrir la autoclave, se deje bajar la temperatura a 75°C para evitar que se introduzcan burbujas de aire en las campanas de Durham. Principio de acción:

La lactosa es hidrolizada por la enzima β-D-galactosidasa presente en las bacterias coliformes, generándose como subproductos glucosa y galactosa que, secuencialmente, son metabolizados hasta ácidos y CO2; este último se detecta en las campanas de Durham. Cuando la fermentación de lactosa se lleva a cabo a 44.5 °C la prueba positiva indica presencia de Escherichia coli. Las sales biliares inhiben el crecimiento de bacterias Gram-positivas particularmente los bacilos y los estreptococos fecales. La triptona constituye la fuente más importante de nutrimentos y los fosfatos constituyen el sistema regulador del pH. El cloruro de sodio regula el equilibrio osmótico. EC-MUG, caldo (Escherichia coli, caldo con metilumbeliferil glucurónido). Preparar el caldo EC y adicionar 50,0 mg de 4-metilumbeliferil- (MUG) por cada litro medio de cultivo antes de esterilizar (121°C por 15 minutos). Principio de acción:

Alrededor del 97% de las cepas de E. coli (incluidas las no productoras de gas) producen la enzima β -D-glucuronidasa (GUD), la cual escinde al sustrato MUG dando como producto final la 4-metilumbelliferona; este último compuesto es fácilmente detectable cuando se expone a una fuente de luz ultravioleta. Eosina azul de metileno de Levin, agar (EMB-L). Peptona 10,0 g Lactosa 10,0 g Fosfato dibásico de potasio 2,0 g Eosina Y 0,4 g Azul de metileno 0,065 g Agua destilada 1,0 L Disolver la peptona, el fosfato y el agar en un litro de agua, calentar a ebullición hasta la disolución completa. Posteriormente distribuir en porciones de 100 ò 200 mL y esterilizar a no más de 121°C por 15 minutos; el pH debe ser de 7.1 ± 0,2. Fundir el medio antes de su uso y adicionar a cada porción de 100 mL: a) 5 mL de solución de lactosa al 20% b) 2 mL de solución acuosa de eosina al 2% c) 4,3 mL de solución acuosa de azul de metileno al 0,15%. Nota: Cuando se use el producto deshidratado, disolver todos los ingredientes de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Principio de acción El agar eosina azul de metileno es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La acción selectiva se debe a la presencia de los colorantes eosina y azul de metileno, los cuales inhiben el crecimiento de las bacterias Gram-positivas. El medio es diferencial porque permite diferenciar los microorganismos fermentadores de lactosa y productores de una gran cantidad de ácido, de aquellos microorganismos que producen poco ácido, o que no fermentan la lactosa. Las colonias de los microorganismos fermentadores de lactosa productores de gran cantidad de ácido se observan de color verde metálico, esto se debe a la precipitación de los colorantes -sobre la superficie de las colonias e incluso en la superficie del medio de cultivo-, cuando las condiciones son extremadamente ácidas. Eosina azul de metileno, agar (EMB-lactosa sacarosa, agar). Peptona 10,0 g Lactosa 5,0 g Sacarosa 5,0 K2HPO4 2,0 g Eosina Yellow 0,4 g Azul de metileno 0,065 g Agar 13,5 g Agua destilada 1,0 L Humectar y disolver los ingrediente, posteriormente hervir el medio y ajustar el pH a 7.1 ± 0,2, esterilizar a 121ºC durante 15 minutos y finalmente verter en placas. Principio de acción La sacarosa y lactosa permiten distinguir al género Salmonella y Shigella, (porque ambas no fermentan dichos azúcares), de la flora acompañante, por ejemplo Citrobacter, Aeromonas y Proteus las cuales no fermentan la lactosa pero sí la sacarosa; cuando el resto de la flora acompañante son bacterias Gram positivas, éstas son inhibidas por la eosina y el azul de metileno. Entérico de Hektöen, agar. Proteosa peptona 12,0 g Extracto de levadura 3,0 g Lactosa 12,0 g Sacarosa 12,0 g Salicina 2,0 g Sales biliares 9,0 g

Cloruro de sodio 5,0 g Tiosulfato de sodio 5,0 g Citrato férrico amoniacal 1,5 g Azul de bromotimol 0,064 g Fucsina ácida 0,1 g Agar 13.5 g Agua destilada 1,0 L pH final

7,5±0,2

Suspender los ingredientes en el agua destilada estéril, hervir con agitación hasta la disolución completa del agar. No sobrecalentar. Dejar enfriar entre 55 y 60°C, posteriormente distribuir en cajas de Petri estériles en condiciones asépticas. Principio de acción La concentración alta de peptona, disminuye la actividad inhibitoria de las sales biliares en contra de las especies de Shigella. Los carbohidratos adicionales (sacarosa y salicina) mejoran la diferenciación con respecto a la lactosa, y la menor toxicidad del doble indicador mejora la recuperación. Debido a los dos indicadores, azul de bromotimol y fucsina ácida, las colonias lactosa-positivas muestran una diferencia cromática de color amarillo, frente a las colonias lactosa-negativas (colonias azules o verdes). Igual ocurre en el caso de colonias que fermentan lentamente la lactosa y más fácilmente la sacarosa y la salicina, sustancias reaccionantes fácilmente fermentables, lo que impide hallazgos de patógenos falsamente positivos. El incremento en el contenido de lactosa ayuda al reconocimiento principal de los organismos que fermentan la lactosa lentamente. El tiosulfato y el citrato férrico se utilizan para la detección de los organismos productores de ácido sulfhídrico por reducción del tiosulfato. Una mezcla de sales biliares inhibe a una gran parte de la microbiota acompañante. Se recomienda la adición de novobiocina en una concentración de 15,0 mg/mL, lo cual mejora la selectividad del medio inhibiendo a especies de Citrobacter y Proteus. Esculina bilis, agar. Extracto de carne 3,0 g Peptona 5,0 g Sales biliares 40,0 g Citrato férrico amoniacal 0,50 g Esculina 1,0 g Agar 15,0 g Agua destilada 1000,0 mL Disolver por calentamiento el extracto de carne, la peptona y el agar en 400,0 mL de agua destilada.

Por otra parte, se disuelven las sales biliares en 100,0 mL de agua destilada y el citrato férrico amoniacal en otros 100,0 mL de agua destilada. Mezclar todas las soluciones y completar hasta 1000,0 mL con agua destilada. Calentar la mezcla hasta la completa disolución de los ingredientes. Ajustar el pH a 7,4 y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 min. Enfriar a temperatura de 50ºC y añadir 100,0 mL de solución de esculina al 1% esterilizada por filtración. Distribuir asépticamente en tubos de ensayo y dejar solidifcar en posición inclinada. Principio de acción La peptona y extracto de carne proveen de carbono, nitrógeno, minerales, vitaminas y otros factores de crecimiento para que los organismos crezcan. La esculina es hidrolizada por las especies de Listeria para formar esculetina y dextrosa. La esculetina reacciona con la sal de fierro (citrato férrico amoniacal) que contiene el medio para producer un complejo negro a café rojizo que aparece en el medio rodeando las colonias. La Listeria monocytogenes es tolerante a las sales biliares. El agar es el agente solidifante. Extracto de Malta, agar. Extracto de malta 30,0 g Peptona de harina de soya 3,0 g Agar 15,0 g Agua destilada 1,0 L Suspender 33.6 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada y dejar humectar el polvo, calentar y agitar frecuentemente, dejar hervir durante un minuto. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Ajustar el pH a 5.6 ± 0,1. Principio de acción: Se utiliza para la demostración, aislamiento y numeración de hongos y levaduras. A partir del extracto de malta y la harina de soya se observa que éstos favorecen el crecimiento de hongos y levaduras, al igual que a otras bacterias, sin embargo se le confiere selectividad al medio para que desarrollen los hongos y las levaduras, acidificando el medio con una polución de ácido tartárico al 10%, adicionando a cada litro de medio de cultivo, 14 mL del ácido. Fraser base, caldo. Digerido pancreático de caseína 5,0 g Proteosa peptona No. 3 5,0 g Extracto de carne 5,0 g Extracto de levadura 5,0 g Cloruro de sódio 20,0 g

Fosfato disódico 9,6 g Fosfato monopotásico 1,35 g Esculina 1,0 g Acido nalidíxico 0,02 g Acrilflavina HCl 24,0 mg Cloruro de lítio 3,0 g Fraser caldo, suplemento Vial com 10 mL de citrato férrico amoniacal 0,5 g Suspender 55 g de polvo en un 1,0 L de agua destilada. Mezclar para homogeneizar. Calentar con agitación frecuente y hervir durante 1 minuto hasta disolución completa. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Enfriar a temperatura ambiente. Asépticamente añadir 10,0 mL del suplemento para caldo Fraser. Mezclar bien.

Principio de acción Las peptonas, extracto de carne y extracto de levadura proporcionan nitrógeno, vitaminas y minerales. El fosfato de sódio y potasio son los agentes amortiguadores. La diferenciación se ve estimulada por la adición del citrato férrico amoniacal. Debido a que todas las especies de Listeria hidrolizan la esculina, la adición de iones fierro al medio detectará la reacción. Un ennegrecimiento del medio por las bacterias que hidrolizan la esculina da como resultado la formación del 6,7-dihidroxicumarina que reacciona con los iones fierro. La selectividad es propiciada por la presencia del cloruro de lítio, ácido nalidíxico y acrilflavina en la fórmula. La alta tolerancia de Listeria a la sal se utiliza como medio para inhibir el crecimiento de los enterococos. Gelatina, agar (GA). Tripticasa (digerido pancreático de caseína) 10,0 g Cloruro de sodio 10,0 g Gelatina 30,0 g Agar 15,0 g Agua destilada 1,0 L Suspender los ingredientes en el agua y hervir hasta disolución de la gelatina y el agar; ajustar el pH a 7.2±0,2 y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar el medio entre 45 y 50°C y distribuir en cajas de Petri. Principio de acción:

En el caso específico de la determinación de V. cholerae se utiliza este medio de cultivo para purificación de colonias sospechosas provenientes de los medios de cultivo TCBS o mCPC, utilizando el principio de la halofilia o halotolerancia. Gelatina con sal, agar (GS).

Tripticasa (digerido pancreático de caseína) 10,0 g Cloruro de sodio 30,0 g Gelatina 30,0 g Agar 15,0 g Agua destilada 1,0 L Suspender los ingredientes en agua y hervir hasta disolución de la gelatina y el agar; ajustar el pH a 7.2±0,2 y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar el medio entre 45 y 50°C y distribuir en cajas de Petri. Si es necesario para inhibir la diseminación de Vibrio spp, tal como Vibrio alginolyticus, usar entre 25,0 y 30,0 gramos de agar por litro del medio. Principio de acción: En este medio se puede observar si los microorganismos licuan la gelatina o no, en caso afirmativo, se interpreta que el microorganismo contiene enzimas proteolíticas. Por otra parte el medio contiene 3% de cloruro de sodio, lo cual sirve para poner de manifiesto la tolerancia que un microorganismo puede tener a estas concentraciones de sal. Gelatina con sal, caldo (GS). Tripticasa (digerido pancreático de caseína) 10,0 g Cloruro de sodio 30,0 g Gelatina 30,0 g Agua destilada 1,0 L Suspender los ingredientes en agua y calentar si es necesario para ayudar a la disolución del medio; ajustar el pH a 7.2±0,2 y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos en tubos de 13 x 100, Principio de acción: Este medio se utiliza para observar la tolerancia al cloruro de sodio que presentan algunos microorganismos. Hierro y tres azúcares, agar (TSI). Peptona de carne 10,0 g Peptona de caseína 10,0 g

Cloruro de sodio 5,0 g Lactosa 10,0 g Sacarosa 10,0 g Glucosa 1,0 g Agar 13,0 g Rojo de fenol 0,025 g Sulfato ferroso amónico pentahidratado 0,20 g Tiosulfato de sodio 0,20 g Agua destilada 1,0 L Suspender los ingredientes en el agua destilada. Calentar a ebullición agitando ocasionalmente hasta disolución completa. Enfriar a 60°C y ajustar el pH a 7.3 ± 0,2. Distribuir en volúmenes de 3,0 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Inclinar los tubos de manera que el medio de cultivo en el fondo alcance una altura de 3,0 cm. y una profundidad de 4,0 cm. El medio es de color rojo. Principio de acción En esta prueba bioquímica, se pueden observar: a) fermentación de los diferentes azúcares que contiene, b) producción de gas: CO2 e H2 y c) producción de ácido sulfhídrico H2S. En el pico de flauta se encuentra la lactosa (1%), el que puede ser fermentado en condiciones tanto aerobias como anaerobias. Este disacárido lo degrada la β-galactosidasa produciendo glucosa y galactosa; estos 2 últimos azúcares pueden ser metabolizados en condiciones aerobias a través del ciclo de Krebs, dando como productos finales CO2, H2O y energía: pero si el metabolismo se realiza en condiciones anaerobias por la vía de Embden-Meyerhof-Parnas, se obtiene como producto intermedio, ácido pirúvico, llegando finalmente a través del ciclo de Krebs a CO2, H2O y energía. El indicador rojo de fenol, en medio ácido es amarillo y en alcalino es rojo. Por lo tanto el medio antes de la fermentación de los azúcares es de color rojo. La glucosa (0,1%) se detecta en el fondo del tubo (bioquímica) y es metabolizada en condiciones anaerobias siguiendo el ciclo de Embden-Meyerhof-Parnas, dando como productos intermedios ATP y ácido pirúvico y como productos finales: ácidos orgánicos, aldehídos, alcoholes, CO2, H2O y energía. La sacarosa (1%) se pone de manifiesto virando todo el tubo a una coloración amarilla, esto puede traer confusión, cuando se encuentra un microorganismo que no fermenta la lactosa, pero sí la sacarosa, sin embargo el resultado del resto de bioquímicas ayudarán a la interpretación de esta prueba. Otro sistema para la diferenciación es aportado por los indicadores de ácido sulfhídrico presentes en el medio; una sal, el citrato de amonio férrico, y otro producto químico, el tiosulfato de sodio. Ambos indicadores deben estar

presentes. En una primera etapa de la reacción el microorganismo en ambiente ácido reaccionará con el tiosulfato de sodio para generar el ácido sulfhídrico. En la segunda etapa de la reacción este compuesto reaccionará con los iones férricos generando un precipitado negro insoluble debido a la formación del sulfuro ferroso. Este compuesto puede enmascarar el resultado de ambiente ácido, sin embargo para la formación del ácido sulfhídrico existe una condición ácido aunque no sea visible. El TSI es un medio para la diferenciación de Enterobacterias de acuerdo a su capacidad para fermentar la lactosa, sacarosa y/o glucosa, y para producir ácido sulfhídrico. No solamente algunas especies de Proteus, pueden mostrar reacciones similares a Salmonella y/o Shigella, siendo necesario distinguirlas de éstas por su habilidad para degradar la urea. Por esta razón se recomienda realizar al mismo tiempo otra prueba bioquímica como el caldo urea o el agar urea. Hugh Leifson con glucosa 1%, medio. Peptona 2,0 g Extracto de levadura 0,5 g Cloruro de sodio 20,0 g Dextrosa 10,0 g Púrpura de bromocresol 0,015 g Agar 3,0 g Agua destilada 1,0 L Suspender los ingredientes en el agua y hervir hasta que se disuelva el agar; ajustar el pH a 7.4±0,2, posteriormente colocar el medio en tubos y esterilizar a 121°C durante 15 minutos. El medio debe quedar de color verde. Principio de acción El metabolismo de los carbohidratos se lleva a cabo en condiciones aerobias o anaerobias, sin embargo la fermentación es un proceso anaerobio y las bacterias que realizan este proceso por lo general son anaerobias facultativas. Los microorganismos al fermentar un azúcar, hidrolizan el carbohidrato, dando como productos finales, compuestos que contienen entre uno y cuatro carbonos, dependiendo de las diferentes bacterias, siendo el principal intermediario el ácido pirùvico. La más importante vía metabólica para fermentar la glucosa es la de Embden-Meyerhof-Parnas. Al añadir un carbohidrato al medio de cultivo, se puede llevar a cabo la degradación de éste con la subsecuente producción de ácido, lo que se hace evidente por el indicador de pH, púrpura de bromocresol, el que vira a color amarillo. La degradación se lleva a cabo mientras el medio está expuesto al aire

(esta degradación puede ser oxidativa o fermentativa), o en ausencia del aire (degradación fermentativa solamente). Para cada carbohidrato, inocular un tubo con un cultivo puro del microorganismo seleccionado como patrón positivo, la inoculación se hace por picadura hasta el fondo de los tubos, después de lo cual un tubo se sella con parafina estéril y otro no se sella. El microorganismo utilizado para la inoculación deberá estar en fase logarítmica de desarrollo. Incubar de 24 a 48 h a temperatura de 35°C ± 2°C de incubación. Una coloración amarilla en ambos tubos, abierto y sellado con parafina, significa una degradación fermentativa, mientras que una coloración amarilla sólo en el tubo abierto, indica que el carbohidrato en cuestión es degradado solamente por vía oxidativa. La degradación oxidativa se presenta sólo o cercanamente en la superficie del medio, mientras que la degradación fermentativa, se presenta en todo el tubo, inclusive en la superficie de éste. Se comprueba finalmente el crecimiento microbiano producido mediante la observación de turbidez, si ésta se observa solamente a lo largo de la línea de la picadura (cepa no móvil) o a lo largo de todo el medio (cepa móvil). Infusión cerebro corazón, caldo. Infusión cerebro corazón, agar (BHI, caldo/ BHI, agar). Infusión de cerebro de ternera 200,0 mL Infusión de corazón de res 250,0 mL Peptona de gelatina 10,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Fosfato dibásico de sodio, dodecahidratado 2,5 g Glucosa 2,0 g Agar bacteriológico a 15,0 g Agua destilada 1,0 L a En caso de requerirse agar infusión cerebro corazón Disolver los ingredientes en el agua y calentar a disolución de los cristales de agar si es necesario, posteriormente distribuir en matraces o tubosde acuerdo a la monografía correspondiente y esterilizar a 121°C±1,0°C durante 15 minutos. En caso de requerirse en cajas de Petri deberá enfriarse a 45°C y verter en condiciones de asepsia. Principio de acción: Los componentes de la infusión de cerebro de ternera y de la infusión de corazón de res hacen del medio BHI un medio de cultivo de enriquecimiento ideal para microorganismos con requerimientos nutricionales exigentes.

Kligler hierro, agar. Extracto de carne 3,0 g Extracto de levadura 3,0 g Peptona 15,0 g Proteosa peptona 5,0 g Lactosa 10,0 g Glucosa 1,0 g Sulfato ferroso heptahidratado ó Citrato de amonio férrico / citrato de amonio

0,2 g 0,5 g

Cloruro de sodio 5,0 g Tiosulfato de sodio 0,3 g Rojo fenol 0,024 g Agar 12,0 g Agua desionizada 1,000 mL pH 7,4±0,2 Disolver los ingredientes en el agua y calentar a disolución de los cristales de agar si es necesario, posteriormente distribuir en tubos de acuerdo a la monografía correspondiente y esterilizar a 121°C±1,0°C durante 15 minutos. Deberá enfriarse a 45°C e inclinar. Principio de acción En esta prueba bioquímica, se pueden observar: a) fermentación de los diferentes azúcares que contiene, b) producción de gas: CO2 e H2 y c) producción de ácido sulfhídrico H2S. En el pico de flauta se encuentra la lactosa (1%), el que puede ser fermentado en condiciones tanto aerobias como anaerobias. Este disacárido lo degrada la β-galactosidasa produciendo glucosa y galactosa; estos 2 últimos azúcares pueden ser metabolizados en condiciones aerobias a través del ciclo de Krebs, dando como productos finales CO2, H2O y energía: pero si el metabolismo se realiza en condiciones anaerobias por la vía de Embden-Meyerhof-Parnas, se obtiene como producto intermedio, ácido pirúvico, llegando finalmente a través del ciclo de Krebs a CO2, H2O y energía. El indicador rojo de fenol, en medio ácido es amarillo y en alcalino es rojo. Por lo tanto el medio antes de la fermentación de los azúcares es de color rojo. La glucosa (0,1%) se detecta en el fondo del tubo (bioquímica) y es metabolizada en condiciones anaerobias siguiendo el ciclo de Embden-Meyerhof-Parnas, dando como productos intermedios ATP y ácido pirúvico y como productos finales: ácidos orgánicos, aldehídos, alcoholes, CO2, H2O y energía. Otro sistema para la diferenciación es aportado por los indicadores de ácido sulfhídrico presentes en el medio; una sal, el citrato de amonio férrico, y otro producto químico, el tiosulfato de sodio. Ambos indicadores deben estar

presentes. En una primera etapa de la reacción el microorganismo en ambiente ácido reaccionará con el tiosulfato de sodio para generar el ácido sulfhídrico. En la segunda etapa de la reacción este compuesto reaccionará con los iones férricos generando un precipitado negro insoluble debido a la formación del sulfuro ferroso. Este compuesto puede enmascarar el resultado de ambiente ácido, sin embargo para la formación del ácido sulfhídrico existe una condición ácido aunque no sea visible. El agar Kligler hierro es un medio para la diferenciación de Enterobacterias de acuerdo a su capacidad para fermentar la lactosa y/o glucosa, y para producir ácido sulfhídrico. No solamente algunas especies de Proteus, pueden mostrar reacciones similares a Salmonella y/o Shigella, siendo necesario distinguirlas de éstas por su habilidad para degradar la urea. Por esta razón se recomienda realizar al mismo tiempo otra prueba bioquímica como el caldo urea o el agar urea Koser citrato de, caldo. NaNH4HPO4 •4H2O 1,5 g

KH2PO4 1,0 g

MgSO4 •7H2O 0,2 g

Citrato de sodio •2H2O 3,0 g

Agua destilada 1,0 L Disolver todos los ingredientes en el agua, si es necesario calentar para ayudar a la disolución, después ajustar el pH final de 6,7 ± 0,2 y distribuir preferentemente en tubos de ensayo con tapa de rosca. Esterilizar a 121°C por 15 minutos. Esta formulación se recomienda en los Métodos de Análisis Oficial de AOAC y en los Métodos Estándares para el Análisis de Agua y Aguas de Desecho (APHA). Principio de acción: En ausencia de carbohidratos fermentables como la glucosa y lactosa, algunos microorganismos son capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono para la obtención de energía. Esta capacidad depende de la presencia de la enzima citrato permeasa, la cual facilita el transporte del citrato dentro de la célula. El citrato es el principal intermediario del ciclo de Krebs y es producido por la condensación del acetilo activo con el ácido oxaloacético. El citrato es hidrolizado por la enzima citrasa, generando como productos ácido oxaloacético y acetato. Estos productos son convertidos enzimáticamente a ácido pirúvico y dióxido de carbono. La presencia de turbidez en el medio de cultivo indica que la prueba es positiva.

Lactosa bilis (2%) verde brillante, caldo. Ver: Bilis verde brillante con lactosa, caldo (Brila). Lactosa verde brillante bilis al 2%, caldo (Brila). Ver: Bilis verde brillante con lactosa, caldo (Brila). Lactosado, caldo. Extracto de carne 3,0 g Peptona 5,0 g Lactosa 5,0 g Agua destilada 1,0 L Disolver los ingredientes en el agua destilada, calentando a 65°C. Distribuir en porciones de 225,0 mL, en frascos de 500 mL de capacidad. Esterilizar a 121±1°C durante 15,0 min. Principio de acción El caldo lactosado se utiliza para la identificación presuntiva de organismos coliformes en leche, agua y alimentos. Por ser un medio nutritivo no selectivo, puede también utilizarse como medio de preenriquecimiento, antes del enriquecimiento selectivo de Salmonella en alimentos. Proporciona condiciones para la recuperación de células dañadas por los procesos de conservación. Lauril sulfato de sodio, caldo. Bacto triptosa 20,0 g Bacto lactosa 5,0 g Fosfato potásico, dibásico 2,75 g Fosfato potásico, monobásico 2,75 g Cloruro de sodio 5,0 g Lauril sulfato de sodio 0,1 g Agua destilada 1,0 L Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentando si es necesario, para ayudar a la disolución; posteriormente ajustar el pH a 6.8 ± 0,2 a 25°C y distribuir en tubos de ensayo conteniendo campanas de Dirham la cantidad necesaria del medio. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C. Antes de abrir el autoclave, dejar bajar la temperatura a 75°C para que no queden burbujas en las campanas de Durham. Preparación de caldo lauril sulfato de sodio de acuerdo con el inóculo utilizado

INOCULO (mL)

CANTIDAD DE MEDIO POR TUBO (mL)

VOLUMEN DE MEDIO MAS INOCULO (mL)

CALDO LAURIL TRIPTOSA REQUERIDO g/L

1 10 o más 11 o más 35,6

10 10 20 71,2

10 20 30 53,4

20 10 30 106,8

100 50 150 106,8

100 35 135 137,1

100 20 120 213,6

Principio de acción Este medio se usa como prueba presuntiva en la detección del grupo coliforme. El lauril sulfato de sodio, es un agente tensoactivo que inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas, debido a los constituyentes de la membrana de éstos, sin embargo sí se pueden desarrollar bacterias Gram negativas. La triptona proporciona nitrógeno, azufre, carbono y algunos minerales que son esenciales para el crecimiento microbiano. Los fosfatos funcionan como amortiguadores del pH en el medio de cultivo y el cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico. La lactosa es utilizada como fuente de carbono por los microorganismos. La fermentación de la lactosa da como productos finales ácido y gas, este último es detectado en las campanas de fermentación (Durham). Leche descremada reconstituida Leche descremada 100,0 g Verde brillante al 0,1% 0,45 mL Agua destilada 1,0 L Diluirla leche descremada reconstituida en el agua destilada. Agitar circularmente hasta disolución. Distribuir en volúmenes de 225,0 mL en matraces Erlenmayer de 500 mL. Esterilizar a 121±1°C por 15 min. Principio de acción La leche por ser un alimento rico en nutrientes (proteínas y azúcares) puede utilizarse para el preenriquecimiento de Salmonella en ciertos alimentos. Para

inhibir la microbiota acompañante se debe adicionar 0,45 mL de una solución de verde brillante al 0,1%. Lisina Hierro, agar (LIA).

Peptona de gelatina 5,0 g Extracto de levadura 3,0 g Glucosa 1,0 g L-Lisina 10,0 g Citrato férrico de amonio 0,5 g Tiosulfato de sodio 0,04 g Púrpura de bromocresol 0,02 g Agar 15,0 g Agua destilada 1,0 L

Disolver los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien; calentar hasta ebullición con agitación frecuente hasta conseguir la disolución completa. Esterilizar en autoclave 12 minutos a 121ºC. Enfriar de 50-60ºC y ajustar el pH de 6,7 ± 0,1. Distribuir en volúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Los tubos se enfrían en posición inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 3 cm y una parte inclinada de 2 cm.

Principio de acción La lisina puede ser descarborxilada por los microorganismos y transformarla en la amina cadaverina. Esto produce un viraje al violeta del indicador de pH púrpura de bromocresol. Puesto que la descarboxilación sólo tiene lugar en medio ácido (pH inferior a 6,0), es necesario que se produzca previamente la acidificación de medio de cultivo, por fermentación de la glucosa. Por este motivo, este medio de cultivo sólo puede utilizarse para la diferenciación de cultivos que fermentan la glucosa. Los microorganismos que no descarboxilan la lisina, pero fermentadores de la glucosa, producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La incubación prolongada puede ocasionar una alcalinización en la zona de la superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al violeta. La formación de HxS produce una coloración negra debida al sulfuro de hierro producido. Las cepas del grupo Proteus-Providencia, con excepción de algunas cepas de Proteus morganii, desamina a la lisina a ácido α-cetocarbónico. Este último forma compuestos pardo-rojizos en la región superficial del medio de cultivo con la sal de hierro y bajo la influencia de oxígeno. Listeria para enriquecimiento (EB) pH 7,3, caldo.

A 500 mL de caldo soya tripticaseína con extracto de levadura (CSTEL) estéril se le añade asépticamente 5,0 mL de cada una de las siguientes soluciones que integran el medio (solución de acrilflavina, solución de cicloheximida y solución de ácido nalidíxico). El caldo de enriquecimiento así preparado (EB), se distribuye en matraces Erlenmeyer de 500,0 mL estérilies a razón de 250,0 mL.:

Solución de acriflavina Clorhidrato de acriflavina

15,0 mg

Agua destilada 1.0 mL

Solución de ácido nalidíxico Acido nalidíxico (sal sódica) Hidróxido de sodio 0,05N

40,0 mg 10,0 mL

Solución de cicloheximida Cicloheximida Etanol Agua destilada

50,0 mg 4,0 mL 6,0 mL

Precaución: ¡La cicloheximida es una sustancia química altamente tóxica, durante su manejo deben emplearse guantes, lentes de protección y lavarse las manos

Principio de acción Las peptonas y el extracto de levadura son fuente de nitrógeno, vitaminas y minerales. La dextrosa es la fuente de carbohidratos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico del medio. Los fosfatos proveen de capacidad amortiguadora. El piruvato de sodio ayuda a resucitar organismos estresados. El ácido nalidíxico inhibe el crecimiento de organismos gram-negativo. El clorhidrato de acrilflavina suprime el crecimiento de bacterias gram-positivo. La cicloheximida se incorpora para inhibir hongos saprofíticos.

LMP, medio. Cloruro de litio feniletanol-moxolactam (para Listeria). Fenil etanol agar 35,5 g Glicina anhidra 10,0 g Cloruro de litio 5,0 g Soluciòn de moxolactam al 1% disuelto en soluciòn amortiguadora de fosfatos de pH 6,0

2,0 mL

Agua 1,0 L Esterilizar el medio (sin moxolactam) en autoclave a 121 ± 1ºC durante 15 minutos. Enfriar entre 48 y 50ºC y agregar la solución de moxolactam previamente esterilizada por filtración. Distribuir volúmenes de 12 a 15 mL del medio en cajas de Petri estériles. Las placas delgadas facilitan la observación de las colonias.

Mac Conkey, agar.

Proteasa peptona o polipeptona 3,0 g Peptona o gelizante 17,0 g Lactosa 10,0 g Sales biliares No. 3 1,5 g Cloruro de sodio 5,0 g Rojo neutron 0,03 g Cristal violeta 0,001 g Agar 13,5 g Agua destilada 1,0 L Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentar si es necesario para disolver, ajustar el pH a 7.1 ± 0,2 a 25°C y esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45-50°C y vaciar en cajas Petri. Principio de acción El agar Mac Conkey es un medio selectivo y diferencial. La selectividad del medio esta dada por las sales biliares que inhiben el desarrollo de bacterias Gram-positivas. El cristal violeta es un colorante que también inhibe el crecimiento de algunas bacterias Gram-positivas. Finalmente, las peptonas constituyen la principal fuente de nutrimentos. El medio es diferencial porque permite diferenciar los microorganismos fermentadores de lactosa de los que no lo son, mediante el indicador de pH rojo neutro. Cuando la lactosa es fermentada, el medio de cultivo se acidifica, esto provoca el vire del indicador a rojo; por lo que las colonias de los microorganismos fermentadores de lactosa aparecen de color rojo oscuro o rosadas. Las colonias de las bacterias no fermentadoras de lactosa son transparentes, incoloras o ámbar. Manitol rojo de fenol, caldo Peptona de caseína 10,0 g Extracto de carne 1,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Rojo de fenol 0,018 g Manitol 10,0 g Agua destilada 1,0 L pH 7,4±0,2 Pesar con precisión la cantidad descrita en el envase. Rehidratar con el agua destilada. Calentar suavemente la solución. El carbohidrato se puede agregar antes de la esterilización. Ajustar el pH del medio antes de esterilizar. Esterilizar 116-118°C durante 15 min. Es altamente recomendable la esterilización del medio base

SIN EL CARBOHIDRATO a 121°C durante 15 min, enfriar el medio base a ±45°C y agregar la solución del carbohidrato esterilizada por filtración en membrana. Distribuir en tubos estériles. Conservar en refrigeración (4-10°C). La caducidad es aproximadamente de 6-8 semanas. Se inocula a partir de un cultivo puro (agar Kligler hierro u otro medio adecuado) de 18 a 24 horas de incubación. Principio de acción Se determina la capacidad de un microorganismo para fermentar (degradar) un carbohidrato específico en un medio basal y producir ácido o ácido con gas visible. La fermentación es un proceso anaeróbio de oxidación-reducción, en el cual un sustrato orgánico actúa como el aceptor final de electrones. Los productos característicos de la fermentación bacteriana son: a) ácido láctico, b) ácidos acético y fórmico, c) ácido láctico y alcohol etílico, d) etanol, e) acetilmetilcarbinol y CO2, f) ácido succínico a ácido propiónico y Co2, g) CO2 y acetona a alcohol isopropílico y h) ácido butírico a alconol butílico. El indicador de pH utilizado para demostrar la fermentación del hidrato de carbono es el rojo de fenol, ya que la mayoría de los productos finales del metabolismo de carbohidratos son ácidos y generaran un vire del indicador a amarillo. Malonato, caldo. Extracto de levadura 1,0 g Sulfato de amonio 2,0 g Fosfato dipotásico 0,6 g Fosfato monopotásico 0,4 g Cloruro de sodio 2,0 g Malonato de sodio 3,0 g Glucosa 0,25 g Azul de bromotimol 0,025 g Agua desionizada 1,000 mL pH 6,7±0,2 Pesar la cantidad exacta como se indica en el rótulo. Rehidratar en el agua desionizada. Calentar la solución suavemente. Colocar a proximadamente 3,0 mL en tubos de 13 x 100, Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min. Principio de acción Determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el malonato de sodio como única fuente de carbono con la resultante alcalinidad. El malonato es un inhibidor enzimático competitivo de la enzima succinato deshidrogenada. El amonato se une a la enzima y ocupa los sitios activos de tal manera que la enzima no puede combinarse con el sustrato normal, el ácido succínico, cesando de esta manera la función normal del ciclo de Krebs. El resultado final es que los microorganismos no pueden crecer y reproducirse a menos que puedan fermentarn

o utilizar el malonato como única fuente de carbono. Microorganismos que pueden realizar esta actividad metabólica pertenecen al grupo de Klebsiella-Enterobacter. mCPC, agar. Ver: Celobiosa, polimixina B y colistina modificado, agar Métodos Estándar, agar Peptona de caseína 5,0 g Extracto de levadura 2.5 g Dextrosa 1,0 g Agar 15,0 g Agua destilada 1,0 L Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentar hasta ebullición para disolver por completo y ajustar el pH a 7,0 0,2 a 25°C. Distribuir en tubos de ensayo con tapón de rosca o en un matraz, después esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45-50°C y vaciar en cajas Petri. Puede volverse a fundir una sola vez cuando se necesite. Principio de acción La peptona de caseína proporciona aminoácidos y otras sustancias nitrogenadas complejas necesarias para el crecimiento bacteriano. El extracto de levadura proporciona vitaminas del complejo B y la dextrosa es utilizada por los microorganismos como la fuente de carbono y energía. Es un medio general por lo que no contiene inhibidores. MTM, medio. Extracto de carne 3,0 g Peptona 10,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Agar 4,0 g Agua destilada 1,0 L Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 mL en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1ºC durante 15 minutos y ajustar el pH final a 7,4 ± 0,2 con HCl 0,1 N o NaOH 0,1 N. Nitratos, caldo. Nitrato de potasio 1,0 g Cloruro de sodio 0,5 g

Peptona 2,0 g Agua destilada 1,0 L Agregar los ingredientes a un litro de agua, agitar hasta disolución completa. Verter en tubos de 13 x 100 mm con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 minutos. Principio de acción En el presente medio se pretende poner de manifiesto, si el microorganismo tiene reductasas, para lo cual se utiliza como sustrato la sal de nitrato, en caso afirmativo, este sustrato se puede reducir a nitritos (se pueden detectar por una reacciòn de diazoaciòn y copulaciòn) o bien llegar a nitrògeno libre, que se detecta por burbujas en el medio. Oxford, medio base (OXA). Base de agar Columbia 39,0 g Esculina 1,0 g Citrato férrico amónico 0,5 g Cloruro de litio 15,0 g Agua 1,0 L Agregar los ingredientes a un litro de agua y llevar a ebullición hasta disolución completa. Posteriormente esterilizar en autoclave a 121 ± 1ºC durante 15 minutos. Enfriar el medio base a 50ºC y en condiciones asépticas agregar los siguientes suplementos: Un litro de medio Oxford debe contener los siguientes suplementos: Cicloheximida 400,0 mg Sulfato de colistina 20,0 mg Acriflavina 5,0 mg Cefotetan 2,0 mg Fosfomicina 10,0 mg Disolver la cicloheximida, el sulfato de colestina, acriflavina, cefotetán y la fosfomicina en 10 mL de una mezcla 1:1 de etanol:agua. Esterilizar por filtración antes de agregar al medio base. Mezclar y vaciar en cajas Petri estériles. Las placas del medio Oxford se pueden almacenar como máximo dos semanas. Principio de acción: La flora acompañante indeseable se inhibe con el cloruro de litio, acrilflavina, sulfato de colistina, cefotetán, cicloheximida y fosfomicina. L. monocytogenes degrada la esculina presente en el medio de cultivo, dando esculetina, con formación de hierro (III), que producen compuestos complejos negros, que luego tiñen de negro las colonias de L. monocytogenes.

Papa dextrosa, agar. Infusión de papa 200,0 g Dextrosa 20,0 g Agar 15,0 g Agua destilada 1,0 L Se suspenden los ingredientes en el agua destilada, permitiendo la humectación de los polvos, para evitar la formación de grumos que son difíciles de disgregar, calentar el medio hasta ebullición y finalmente esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos. Enfriar el medio de cultivo en baño de agua hasta 45°C ± 1°C, después acidificar a un pH de 3.5±0,1, con ácido tartárico al 10% previamente esterilizado (1.4 mL de ácido tartárico por cada 100 mL de medio de cultivo). Después de adicionar el ácido tartárico al medio de cultivo, medir el pH con un potenciómetro. Principio de acción A partir de los hidratos de carbono contenidos en la infusión de papa, se observa que éstos favorecen el crecimiento de hongos y levaduras, al igual que de otras bacterias, sin embargo se le confiere selectividad al medio para que desarrollen los hongos y las levaduras, acidificando el medio con una polución de ácido tartárico al 10%, adicionando a cada litro de medio de cultivo, 14 mL del ácido. Púrpura de bromocresol para fermentación de carbohidratos, caldo. Proteosa peptona No. 3 10,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Extracto de carne 1,0 g Púrpura de bromocresol 0,02 g Agua destilada 1,0 L Calentar si es necesario para disolver los ingredientes. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 ± 1°C. El pH final debe ser de 6,8 ± 0,2. Posteriormente agregar la solución del carbohidrato que se desee, previamente esterilizada por filtración, para obtener una concentración final de 0,5 %. Principio de acción Este medio sirve para observar la fermentaciòn de azùcares con producciòn de acidez. Nota: Los sistemas bioquímicos comerciales validados pueden usarse como alternativa para las pruebas bioquímicas convencionales.

RM-VP, caldo (prueba de rojo de metilo y Voges Proskauer). Peptona tamponada 7,0 g

Glucosa 5,0 g

K2HPO4 5,0 g

Agua destilada 1000,0 mL Disolver los ingredientes con calentamiento suave si es necesario, distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos de ensayo de 16x150 mm y esterilizar a 121°C por 15 minutos. El pH final debe ser de 6,9 ± 0,2. Principio de acción La glucosa es el principal sustrato utilizado por los microorganismos para la obtención de energía. Los productos finales de la oxidación de la glucosa varían dependiendo de la ruta metabólica y de las enzimas presentes en la bacteria. Por lo tanto se describen a continuación dos vías: Prueba de Rojo de metilo La prueba de rojo de metilo se lleva a cabo para determinar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables los ácidos orgánicos generados por la fermentación de la glucosa. El indicador de pH rojo de metilo a pH de 4.4 tiene un color rojo y a pH de 6,0 o superior, su color es amarillo. Aunque todos los microorganismos entéricos fermentan la glucosa y producen ácidos orgánicos, esta prueba se emplea para diferenciar Escherichia coli de Enterobacter aerogenes Estos microorganismos en las primeras h. de incubación producen ácidos orgánicos. Escherichia coli es capaz de estabilizar y mantener el pH ácido (4,0-4.4) hasta finalizar el periodo de incubación (24-48 h) debido a que produce más ácidos por lo que vence el sistema amortiguador. Por su parte, Enterobacter aerogenes es capaz de convertir estos ácidos en productos neutros como etanol y acetilmetilcarbinol (acetoina) por lo que el pH se eleva aproximadamente a 6. Prueba de Voges-Proskauer Esta prueba determina la capacidad de algunos microorganismos de generar como productos finales del metabolismo de la glucosa, compuestos neutros como el acetilmetilcarbinol (acetoina). La glucosa es metabolizada por algunas bacterias hasta ácido pirúvico, la descarboxilación de dos moléculas de este ácido producen la acetoina, que es un

precursor del 2,3-butanodiol. Tanto la acetoina como el 2,3-butanodiol son compuestos neutros. En presencia de oxígeno atmosférico y álcali, la acetoina como el 2,3-butanodiol reaccionan con el alfa-naftol generando diacetilo este compuesto se condensa con la guanidina presente en el medio de cultivo generando un compuesto de color rojo o rosa (prueba positiva) en un tiempo aproximado de 15 minutos. Si la acetoina no esta presente los reactivos no cambian de color (prueba negativa) Salmonella y Shigella, agar (SS). Extracto de carne 5,0 g Polipeptona 5,0 g Lactosa 10,0 g Sales biliares 8,5 g Citrato de sodio deshidratado 8,5 g Tiosulfato de sodio pentahidratado 8,5 g Citrato férrico 1,0 g Agar 13.5 g Rojo neutro 0,025 g Verde brillante 0,330 mg Agua destilada 1,0 L Suspender los ingredientes en agua destilada estéril y calentar hasta disolución completa. Ajustar el pH a 7,0 ± 0,2. No esterilizar en autoclave. Enfriar a 50°C y distribuir en cajas de Petri estériles en condiciones asépticas. El aspecto del medio fundido es claro y de color rosado. Principio de acción El agar SS es un medio selectivo diferencial para el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras patológicas, alimentos contaminados, etc. Los organismos coliformes, Gram-negativos y la microbiota acompañante son inhibidos por los componentes inhibitorios como el verde brillante, sales biliares. El tiosulfato en combinación con el fierro actúa como indicadores de la producción de ácido sulfhídrico, lo cual se evidencia por el oscurecimiento en el centro de las colonias. Las colonias de coliformes quedan señaladas por la demostración de la degradación de la lactosa a ácido, a cargo del indicador de pH rojo neutro, de tal forma que las colonias de microorganismos lactosa-negativos son incoloras, y las de microorganismos lactosa-positivos son rosadas hasta rojas. Sangre de carnero, agar

Base de agar sangre 95,0 mL Sangre de carnero desfibrinada 5,0 mL Preparar el agar base de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Enfriar a 45 ± 2ºC y agregar asépticamente la sangre de carnero, la cual previamente se debe encontrar a temperatura ambiente (20 - 25°C). Homogeneizar el medio y verter en las cajas Petri estériles de 12 a 15 mL para la prueba de CAMP y de 15 a 20 mL para la prueba de hemólisis. Principio de acción Este medio detecta a los microorganismos que pueden lisar los eritrocitos, pudiendo diferenciar las hemòlisis alfa o beta. Selenito-cistina, caldo. Triptona o polipeptona 5,0 g Lactosa 4,0 g Fosfato sódico dibásico 10,0 g Selenito ácido de sodio 4,0 g L-cistina 0,01 g Agua destilada estéril 1,0 L pH final 25°C 7,0 ± 0,2 Disolver los ingredientes en el agua destilada estéril. Distribuir en volúmenes de 10,0 (tubos de ensayo) o bien, 225,0 mL en (matraces) recipientes estériles, según se requiera. El caldo así preparado es transparente de color ladrillo. De preferencia usarlo el mismo día de su preparación. Si se desea conservar el medio por varios días, puede exponerse al calor en autoclave a 110 ± 1°C durante 5 minutos tomando entonces un color salmón. Precaución: Descartar el medio preparado si se observan grandes cantidades de precipitado rojo debidas al selenito reducido. No se incube por más de 24 h. porque el efecto inhibitorio del selenito disminuye después de 6-12 h. de incubación. El biselenito de sodio es tóxico por inhalación o ingesta. Existe peligro de efectos acumulativos. Cuando se utilice no coma, beba o fume. Después del contacto con la piel, enjuague inmediatamente con abundante agua. En caso de ingestión accidental acuda al médico inmediatamente. Principio de acción El caldo selenito-cistina se utiliza como medio de enriquecimiento de Salmonella a partir de heces, alimentos y otros materiales. El selenito inhibe el crecimiento de bacterias coliformes y enterococos en las primeras 6-12 h. siguientes al inicio de la incubación. La toxicidad del selenito para ciertos microorganismos no es del todo

clara, se sugiere que reacciona con los grupos sulfuro y sulfhidrilo de ciertos componentes celulares esenciales. Proteus y Pseudomonas parecen ser resistentes a sus efectos. La lactosa se adiciona como carbohidrato fermentable para prevenir un incremento en el pH durante la incubación ya que cualquier aumento en el pH puede reducir la actividad selectiva del selenito. El hecho de que Proteus y Pseudomonas, y naturalmente Salmonella, no fermenten la lactosa puede explicar que resistan la inhibición. El efecto de la cistina puede deberse a dos factores: 1) Su capacidad reductora, que disminuye la toxicidad microbiana del selenito y 2) Suministra compuestos azufrados adicionales primordiales para la bacteria, reduciendo de nuevo la actividad inhibitoria del selenito. Sulfuro Indol Movilidad, medio (SIM). Peptona de caseìna 20,0 g Peptona de carne 6,1 g Sulfato de hierro y amonio 0,2 g Tiosulfato de sodio 0,2 g Agar 3,5 g Agua 1,0 L Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 mL en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 minutos. El pH final deberà estar en 7,3 ± 0,2. Principio de acción El presente medio pone de manifiesto: a) si el microorganismo es móvil, esto es que presente flagelos, lo cual se observa si después de incubar existe desarrollo más allá de donde pasó el asa microbiológica al inocular al medio, b) si el microorganismo es capaz de reducir el tiosulfato hasta ácido sulfhídrico, que al estar este último en presencia de sales de hierro, se forma el sulfuro ferroso que es de color negro y c) si el microorganismo es capaz de desdoblar el triptofano que se encuentra en las peptonas, hasta formar el indol, esto implica la eliminación del grupo alquilo, que está constituido por un aminoácido, transformándose esta fracción a ácido pirúvico y amoníaco, gracias a la presencia de la triptofanasa. Sodio lauril sulfato de, caldo. Ver: Lauril sulfato de sodio, caldo. Soya tripticaseína con 0,6% de extracto de levadura, agar (ASTEL). (Listeria). Agar soya tripticaseìna 40,0 g Extracto de levadura 6,0 g Agua 1,0 L

Agitar y calentar a ebullición hasta disolver el agar. Esterilizar a 121 ± 1ºC durante 15 minutos, el pH final serà de 7,3 ± 0,2. Principio de acción Este medio es altamente nutritivo y versátil, es recomendado para uso en general. Debido a la formulación de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adición de suero, etc. Soya tripticaseína con 0,6 % de extracto de levadura, caldo (CSTEL. (Listeria). Caldo soya tripticaseìna 30,0 g Extracto de levadura 6,0 g Agua 1,0 L Agitar hasta disolver los ingredientes. Esterilizar a 121 ± 1ºC durante 15 minutos. El pH final de la solución debe ser 7,3 ± 0,2. Principio de acción Este medio es altamente nutritivo y versátil, es recomendado para uso en general. Debido a la formulación de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adición de suero, etc. Soya tripticaseína, caldo / Soya tripticaséina, agar. Tripticasa o triptosa 17,0 g Fitona 3,0 g Glucosa 2,5 g Cloruro de sodio 2,5 g Agar bacteriológico 15,0 g Agua destilada 1,0 L Disolver los ingredientes en el agua destilada, calentando lentamente hasta su disolución completa. Distribuir porciones de 225,0 mL dentro de matraces de 500 mL y esterilizar en autoclave a 121±1°C durante 15 minutos. En caso de requerirse en cajas de Petri enfriar el agar a 45°C y verter en condiciones de asepsia. El pH final debe ser de 7.3±0,2. Principio de acción

Este medio es altamente nutritivo y versátil, es recomendado para uso en general. Debido a la formulación de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adición de suero, etc. El caldo triptona soya es uno de los medios recomendados por la AOAC para el preenriquecimiento de Salmonella. Soya tripticaseína estéril adicionado con sulfito de potasio, caldo. Caldo soya tripticasa 1,0 L Sulfito de potasio 5,0 g Adicionar al caldo soya tripticaseína el sulfito de potasio por cada 1,0 L de medio, de tal forma que la concentración final del sulfito de potasio sea 0,5%. Esterilizar a 121±1°C por 15 minutos. Principio de acción Este medio es altamente nutritivo y versátil, se recomienda para uso en general. Debido a la formulación de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adición de suero, etc. El caldo triptona soya es uno de los medios recomendados por la AOAC para el preenriquecimiento de Salmonella. El sulfito de potasio actúa como un agente selectivo para inhibir el crecimiento de coliformes, mientras que permiten el desarrollo de Salmonella. Los compuestos de azufre fungen como sustrato para la producción de ácido sulfhídrico. SS, agar. Ver Salmonella Shigella, agar. Sulfito de Bismuto agar. Ver: Bismuto sulfito, agar. Surraco, caldo Sacarosa 0,8 g Urea 0,8 g Azul de timol 4 gotas Base caldo rojo de fenol 1,5 g Agua destilada 100,0 mL Disolver 1.5 g del medio base caldo rojo de fenol en 100 mL de agua destilada, agregar 0,8 g de sacarosa y 4 gotas de azul de timol SI. De esta solución se toman 10 mL en un matraz Erlenmayer de 10 mL. Esterilizar ambas soluciones en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 10 minutos (EVITAR SOBRECALENTAMIENTO). Esterilizar un equipo de microfiltración, agujas y

jeringas. Una vez esterilizado el material y los médios, dejar enfriar. Al matraz con los 10 mL de caldo sacarosa adicionar en condiciones de esterilidad 0,8 g de urea, agitar para disolver completamente. En condiciones de esterilidad tomar el contenido del matraz con una jeringa de 10 mL y pasar por el filtro (ya preparado) al matraz que contiene los 90 mL restantes del medio. Agitar la mezcla estéril y distribuir volúmenes de 3,0 mL en tubos de ensayo de 13 X 100 mm esterilizados previamente. Principio de acción. Medio para la diferenciación de microorganismos, especialmente de la familia Enterobacteriaceae basándose en la producción de ureasa y/o de fermentar la sacarosa. El medio de cultivo está libre de carbohidratos fermentables, si el microorganismo en estudio es capaz de fermentar la sacarosa, se produce vire del indicador a amarillo. Los microorganismos que tienen la capacidad de utilizar la urea, forman amonio, produciendo reacción alcalina en el medio que se manifiesta por un color rosa fuerte por vire de los indicadores rojo de fenol y azul de timol. TCBS, agar. Ver: Tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa, agar. T1N1, agar (tripticasa y sal, agar). Triptona o tripticasa o digerido pancreático de caseína 10,0 g Cloruro de sodio 10,0 g Agar 20,0 g Agua destilada 1,0 L Suspender los ingredientes en el agua y hervir hasta disolución del agar. En caso de desearlo inclinado, distribuirlo en tubos y después de esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos, inclinarlos; el pH final deberá estar en 7.2±0,2. Para el llenado de placas, dejar enfriar el medio a una temperatura entre 45 y 50°C antes de llenar las cajas. Principio de acción Este medio es utilizado para observar la tolerancia de los microorganismos a las diferentes concentraciones de sales, sustituyendo la concentración del cloruro de sodio de esta fórmula por la deseada. Tripticasa y sal, caldo (T1N1, caldo). Triptona o tripticasa o digerido pancreático de caseina 10,0 g Cloruro de sodio 10,0 g Agua destilada 1,0 L

Suspender los ingredientes en el agua y calentar si es necesario. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos; el pH final deberá estar en 7.2±0,2. Principio de acción Este medio es utilizado para observar la tolerancia de los microorganismos a las diferentes concentraciones de sales, sustituyendo la concentración del cloruro de sodio de esta fórmula por la deseada. Triptosa agar / Triptosa caldo. Triptosa (digerido enzimático protéico) 20,0 g Dextrosa 1,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Agar 15,0 g Agua destilada 1,0 L Disolver los ingredientes (para preparación del caldo omitir el agar) en el el agua destilada, mezclar y calentar lentamente hasta su disolución completa. Esterilizar a 121 ± 1ºC durante 15 minutos. Principio de acción. El medio de triptosa es un medio para propósitos generales, no selectivo. La triptosa es una mezcla de un hidrolizado enzimático con propiedades nutricionales distintivas. El medio de triptosa posee péptidos de alto peso molecular adecuado para requerimientos de amino ácidos de cadena larga. Proporciona nitrógeno, amino ácidos y vitaminas. Tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa, agar (TCBS). Peptona de caseína 5,0 g Peptona de carne 5,0 g Extracto de levadura 5,0 g Sacarosa 20,0 g Tiosulfato de sodio pentahidratado 10,0 g Citrato de sodio dihidratado 10,0 g Colato de sodio 3,0 g Bilis de buey 5,0 g Cloruro de sodio 10,0 g Citrato férrico 1,0 g Azul de bromotimol 40,0 mg Azul de timol 40,0 mg Agar 15,0 g Agua destilada 1,0 L

Preparar en un matraz por lo menos tres veces más grande que el volumen requerido de medio. Adicionar los ingredientes en agua destilada tibia y calentar con agitación constante hasta ebullición e inmediatamente retirar del calor. No esterilizar y ajustar el pH a 8.6±0,2 a 25°C; enfriar a 50°C y colocar el medio en cajas Petri. Dejar secar las placas entre 37 y 45°C antes de usarlas. Principio de acción La alta concentración de tiosulfato y citrato, así como la fuerte alcalinidad de este medio, inhiben el crecimiento de la familia Enterobacteriaceae. Las sales biliares y el colato de sodio suprimen primariamente a los enterococos. Cualquier bacteria coliforme que pudiera crecer, no puede metabolizar la sacarosa; solamente unas cuantas especies de Proteus, sacarosa positivas, pueden crecer para formar colonias amarillas, parecidas a las colonias de los vibrios. La mezcla de indicadores azul de timol y azul de bromotimol, cambian a color amarillo cuando hay liberación de ácido, aún en este medio fuertemente alcalino. Se debe incubar a 35°C aeróbicamente durante 18 a 24 h. De acuerdo a las características metabólicas del microorganismo, se presentan las colonias en este medio, como se describen en el siguiente cuadro:

Apariencia de las colonias Microorganismos Amarillas, planas, con diámetro entre 2 y 3 mm

V. cholerae, V. cholerae variedad El Tor

Pequeñas con centro azul verde Vibrio parahemolyticus

Grandes amarillas Vibrio alginolyticus

Azules Pseudomonas y Aeromonas

Muy pequeñas, transparentes Enterobacteriaceae y otros

Tetrationato, caldo. Proteosa peptona o triptona 5,0 g Sales biliares 1,0 g Carbonato de calcio 10,0 g Tiosulfato de sodio pentahidratado 30,0 g Agua destilada 1,0 L Disolver los ingredientes en el agua destilada estéril y ajustar el pH a 7,0±0,1. Distribuir, agitando constantemente en porciones de 10,0 y 225,0 mL, en recipientes estériles, de acuerdo a las necesidades. Guardar en refrigeración. Antes de usar el medio agregar 2,0 mL de una solución de yodo-yoduro de potasio y 1,0 mL de solución de verde brillante al 0,1% por cada 100,0 mL de medio. El medio deberá utilizarse el mismo día.

Principio de acción El caldo tetrationato se recomienda para el enriquecimiento selectivo de Salmonella typhi y otras especies de Salmonella, presentes en heces, ensilados, etc. Las sales biliares estimulan el crecimiento de las bacterias intestinales e inhiben junto con la solución de verde brillante especialmente a la microbiota Gram-positiva. La adición de la solución yodo-yoduro funciona para formar el tetrationato. Los organismos que poseen la enzima tetrationato reductasa se desarrollan bien en este medio, como por ejemplo Salmonella y Proteus, mientras que muchos microorganismos fecales como E. coli y Shigella son inhibidos. Miembros del grupo Proteus, reducen el tetrationato y en consecuencia disminuyen la selectividad. Esta desventaja se puede disminuir adicionando al medio de cultivo 40,0 µg de novobiocina por cada mililitro de medio antes de la adición del yodo-yoduro. Triptona al 1%, caldo (Prueba de indol). Triptona o tripticasa 10,0 g Agua destilada 1,0 L Disolver los ingredientes y si es necesario calentar. Distribuir porciones de 5 mL del medio, en tubos de ensaye de 16 x 150 mm. Esterilizar a 121°C por 15 minutos. El pH final debe ser de 6.9 ± 0,2 Principio de acción La triptona es un compuesto rico en triptofano y por lo tanto se utiliza para la diferenciación de bacterias con base en la prueba de indol. El triptofano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias hasta indol, escatol e indolacétco. La enzima triptofanasa cataliza la reacción de desaminación del triptofano produciendo indol, ácido pirúvico y amoníaco. El ácido pirúvico puede ser catabolizado por las bacterias mediante el ciclo de Krebs hasta CO2 y agua; el amoníaco producido puede ser utilizado por el microorganismo para sintetizar nuevos aminoácidos. El indol puede ser detectado si se combina con el paradimetilaminobenzaldehido, el producto de esta combinación es un una quinona de color rojo. TSI, agar. Ver: hierro y tres azúcares, agar. Urea, caldo. Fosfato monopotásico 9,1 g

Fosfato disódico 9,5 g Extracto de levadura 0,1 g Urea de alta pureza (20%) 20,0 g Rojo fenol 0,01 g Agua desionizada 1,0 L pH 6,8 Pesar la cantidad con precisión según las directivas del rótulo. Rehidratar con el agua desionizada. No calentar la solución, con el calor la urea se descompone. Esterilizar el resto de los componentes del medio (medio base) a 121°C durante 15 minutos y enfriar. Esterilizar la urea por filtración en membrana y agregar al medio base ya estéril y frío. De manera aséptica distribuír aproximadamente 3,0 mL en tubos de 13 x 100 con tapón de rosca. Principio de acción El sustrato urea, a menudo se designa como una carbamida. Todas las amidas son hidrolizadas con facilidad. La urea es hidrolizada por una enzima específica, la ureasa (o urea amidohidrolasa), para dar dos moléculas de amoniaco. En solución, la urea se hidroliza a carbonato de amonio como producto final. La ureasa es una enzima constitutiva microbiana importante relacionada con la descomposición de compuestos orgánicos, clasificada como una amidasa. La ureasa actúa en los compuestos a nivel de los puentes C-N, excepto en aquellos que contienen puestes peptídicos. El indicador rojo de fenol virará a un colo rosa-rojo intenso cuando la prueba sea positiva. Urea rápido, caldo. Extracto de levadura 0,1 g Urea 20,0 g Fosfato monopotásico 0,091 g Fosfato disódico 0,095 g Rojo fenol 0,01 g Agua desionizada 1,0 L pH 6,9 Esterilizar por filtración utilizando una membrana de 0,45 µm. Fraccionar en condiciones asépticas 3,0 mL en tubos de 13 x 100 con tapón de rosca estériles. Principio de acción Ver caldo urea. Para la prueba rápida de la urea el indicador virará a color cereza (púrpura rojizo), en caso de ser positiva. Urea y sacarosa, caldo. Ver: Surraco, caldo.

Vassiliadis-Rappaport, caldo. Solución A Triptona 5,0 g Cloruro de sodio 8,0 g Fosfato monobásico de potasio 1,6 g Agua destilada 1,0 L Disolver los componentes en el agua destilada por calentamiento a ±70°C. Solución B Cloruro de magnesio hexahidratado 400,0 g Agua destilada 1,0 L Disolver el cloruro de magnesio en el agua destilada. Como esta sal es muy higroscópica es conveniente disolver el contenido entero de cloruro de magnesio desde un envase recientemente abierto, de tal modo que la concentración de la solución sea de 0,4 g/mL. Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente. Solución C Oxalato de verde de malaquita 0,4 g Agua destilada 100,0 mL Disolver el oxalato de verde de malaquita en el agua destilada. Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente. Preparación del medio completo Solución A 1000,0 mL Solución B 100,0 mL Solución C 10,0 mL Preparar el medio completo con las proporciones descritas para cada una de las soluciones. Distribuir antes de usar dentro de tubos estériles en cantidades de 10,0 mL. Esterilizar a 115°C durante 15 min. Ajustar el pH si es necesario para que al final de la esterilización sea de 5.2. Almacenar en refrigeración. Principio de acción Este medio se recomienda para el enriquecimiento selectivo durante el aislamiento de Salmonella de alimentos y muestras ambientales. Puede también utilizarse para aislar Salmonella de heces humanas sin el preenriquecimiento utilizando una cantidad de inóculo pequeña. La formulación se desarrolló denotando cuatro características que posee Salmonella cuando se compara con la familia Enterobacteriaceae:

1. Habilidad para sobrevivir a presiones osmóticas relativamente altas 2. Habilidad para multiplicarse a valores de pH relativamente bajos 3. Resistencia ligeramente mayor al verde de malaquita 4. Requerimientos nutricionales relativamente menos estrictos Puede utilizarse novobiocina para inhibir el crecimiento de Proteus. Verde brillante, agar. Extracto de levadura 3,0 g Polipeptona (proteosa peptona No. 3) 10,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Lactosa 10,0 g Sacarosa 10,0 g Rojo de fenol 0,08 g Agar 20,0 g Verde brillante 0,0125 g Agua destilada 1,0 L Suspender los ingredientes en el agua destilada y calentar a ebullición, hasta disolución completa. Ajustar el pH a 6.9 ± 0,2. Esterilizar en autoclave a 121±1°C durante 15 minutos. Enfriar el medio a 50°C y distribuirlo en cajas de Petri estériles. El aspecto del medio es oscuro color marrón. Principio de acción El medio de cultivo contiene lactosa, cuya degradación a ácido se reconoce por el viraje a amarillo del rojo de fenol, que actúa como indicador de pH. En ambiente alcalino presenta color rojo intenso. La microbiota acompañante Gram-positiva, así como Salmonella typhi y Shigella resultan muy reprimidas por la presencia del verde brillante. Puesto que Salmonella no puede degradar ni la lactosa ni la sacarosa, el contenido en sacarosa permite el reconocimiento de la microbiota acompañante lactosa-positiva débil o lactosa negativa pero sacarosa-positiva. Para la inhibición de Proteus se recomienda la adición de desoxicolato de sodio al 0,2%. La adición de sulfonamidas mejora el aislamiento de Salmonella. Adicionar 1,0 g de sulfonamida o 0,8 g de sulfadiazina por cada litro de medio y esterilizar en la forma habitual. Verde brillante bilis al 2 % lactosa, caldo. Ver: Bilis verde brillante con lactosa, caldo (Brila). Xilosa lisina desoxicolato, agar (XLD). Xilosa 3,75 g L-lisina 5,0 g Lactosa 7,5 g

Sacarosa 7,5 g Cloruro de sodio 5,0 g Extracto de levadura 3,0 g Rojo de fenol 0,08 g Agar 15,0 g Desoxicolato de sodio 2,5 g Citrato férrico amoniacal 0,8 g Tiosulfato de sodio 6,8 g Agua destilada 1,0 L ±0,2 Suspender los ingredientes en el agua destilada, y calentar en baño de agua a 55°C, agitando frecuentemente, hasta disolución completa. Ajustar el pH a 6.9 ±0,2. Enfriar a 50°C y verter en cajas de Petri estériles. No se esterilice. El sobrecalentamiento produce una precipitación, la reactividad del medio puede ser satisfactoria, pero las colonias sueles ser muy pequeñas. Principio de acción Este es un medio selectivo ideal para el aislamiento e identificación presuntiva de Salmonella y Shigella. Basado en la fermentación de la xilosa, la descarboxilación de la lisina y la producción de ácido sulfhídrico para la diferenciación inicial entre Shigella y Salmonella de otras bacterias no patógenas. La Salmonella es reductora de las sales de azufre como el tiosulfato, cuyo producto final es el ácido sulfhídrico, que en presencia de sales de hierro forma el sulfuro ferroso, que es un compuesto de color negro. La fermentación rápida de la xilosa es casi universal entre las bacterias entéricas excepto para los miembros de los géneros Shigella, Providencia y Edwardsiella. La xilosa se incluye al medio de tal forma que las especies del género Shigella pueden identificarse por una reacción negativa. Las especies de Salmonella se diferencian de los fermentadores no patogénicos por la incorporación de lisina al medio. Salmonella consume la xilosa y descarboxila la lisina, alterando el pH hacia la alcalinidad, simulando la reacción presentada por Shigella. Sin embargo, la presencia de los géneros Salmonella y Edwardsiella se diferencia de las de Shigella por un indicador de la producción de ácido sulfhídrico. Por otra parte, la gran concentración de ácido producido por la fermentación de la lactosa y sacarosa, evita que los coliformes lisin descarboxilasa-positivos reviertan el pH a un valor alcalino. Los microorganismos no productores de ácido sulfhídrico no descarboxilan la lisina. El nivel de acidez evita el oscurecimiento de estos microorganismos hasta después de 18-24 h. de incubación. El desoxicolato de sodio se incorpora al medio como un inhibidor de coliformes sin disminuir el desarrollo de Shigella y Salmonella.

DILUYENTES, SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES. Azul de toluidina, solución 0,1M. Azul de toluidina 3,05 g Agua destilada 100,0 mL En un matraz aforado de 100,0 mL disolver el azul de toluidina y aforar a volumen con el agua. Calcio cloruro, solución 0,01M. Cloruro de calcio anhidro (peso molecular 110,99) 1,199 g Agua destilada 1,0 L Disolver el cloruro de calcio en agua y llevar a un litro. Etanol 70 %. Alochol etílico absoluto

70,0 mL

Agua destilada 100,0 mL Solución de desoxicolato de sodio al 0,5% en agua destilada estéril. Desoxicolato de sodio 0,5 g Agua destilada estéril 99,5 mL Disolver el desoxicolato de sodio en agua destilada estéril. Solución reguladora de Fosfatos pH 7.2, (solución concentrada). Fosfato monobásico de potasio 34,0 g Agua destilada 1,0 L Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7.2, con solución de hidróxido de sodio 1N, aforar con agua a un litro. Esterilizar la solución a 121°C±1,0°C y conservar en refrigeración. Solución de trabajo: Tomar 1.25 mL de la solución anterior (solución concentrada) y transferirlos a un matraz volumétrico de un litro, aforando con agua; después de distribuir en matraces o tubos, los volúmenes especificados en

cada monografía, se debe esterilizar a 121°C±1,0°C durante 15 minutos. Después de la esterilización, los volúmenes finales y el pH, deben ser iguales a los iniciales. Reactivo de Kovac’s. p-dimetilaminobenzaldehído 5,0 g

Alcohol amílico (normal) 75,0 mL

HCI concentrado 25,0 mL Disolver el p-Dimetilaminobenzaldehído en alcohol amílico normal y adicionar lentamente el HCl. Almacenar a 4°C. Para la prueba de indol: Adicionar de 0,2 a 0,3 mL del reactivo anterior, a 5 mL del cultivo de bacterias en caldo triptona. Destapar el tubo e inclinarlo para permitir la entrada de una mayor cantidad de oxígeno ambiental que ayude a la reacción. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo en la superficie del tubo. Principio de acción El triptofano es un aminoácido, que por acción de la triptofanasa lo degrada en indol, escatol y ácido indolacético . Un intermediario importante es el ácido indolpirúvico, que al desaminarse forma el indol. En caso de que se descarboxile el ácido indolacètico, se forma el escatol Prueba del Ortonitrofenil galactósido (ONPG). Reactivos Buffer de fosfato de sodio, 1M, pH 7. o-nitrofenil-β-galactosido (ONPG), 0,75 M Solución fisiológica Tolueno Realizar la prueba a partir de agar-hierro de Kligler (KIA) ó agar triple azúcar hierro (TSI). Emulsificar un asa cargada de desarrollo bacteriano con 0,5 mL de solución fisiológica hasta producir una suspensión abundante. Añadir a dicha suspensión una gota de tolueno y mezclar enérgicamente unos segundos para liberar la enzima de las células bacterianas. Añadir a la suspensión igual cantidad de solución buffer de ONPG y colocar la mezcla en baño de agua a 37ºC. Interpretación. La velocidad de hidrólisis del ONPG a ortonitrofenol puede ser rápida en algunos organismos, produciéndose una reacción que se visualiza por la

aparición de un color amarillo en 5 a 10 minutos. La mayoría de las pruebas son positivas en una hora, sin embargo, las reacciones no se deben interpretar como negativas antes de las 24 horas de incubación. El color amarillo indica que el organismo ha producido ortonitrofenol a partir del sustrato ONPG por acción de la β-galactosidasa.

Principio de acción El ortonitrofenil galactósido (ONPG) es estructuralmente similar a la lactosa, salvo que la glucosa ha sido substituida por el ortonitrofenil.

Por acción de la β-galactosidasa, el ONPG se hidroliza en dos residuos, galactosa y ortonitrofenol. El ONPG es un compuesto incoloro mientras que el ortonitrofenol es amarillo, lo cual es una evidencia de la hidrólisis. Las bacterias fermentadoras de lactosa poseen dos enzimas, permeasa y β-galactosidasa, requeridas para la producción de ácido a partir de la fermentación de lactosa. La permeasa es necesaria para que la molécula de lactosa penetre en la célula bacteriana, donde la β-galactosidasa puede romper la unión galactósido, produciendo glucosa y galactosa. Los no fermentadores de lactosa carecen de ambas enzimas y son incapaces de producir ácido a partir de lactosa. Algunas especies bacterianas aparecen como no fermentadoras de lactosa pues carecen de permeasa pero si tienen β-galactosidasa y dan una prueba de ONPG positiva. Los llamados fermentadores tardíos de lactosa pueden demorar en producir ácido a partir de la lactosa debido a una lenta actividad de permeasa. En estos casos una prueba de ONPG positiva puede proveer una identificación rápida de los fermentadores tardíos.

Reactivo de oxidasa.

N-Tetrametil-p-Fenilendiamina 0,5 g Agua destilada 100,0 mL

Conservar en frasco oscuro a 5-10°C. El reactivo se conserva durante 14 días. Realizar la prueba de oxidasa con cultivos puros de agar soya tripticasa (2% de NaCl) u otro medio que no contenga carbohidratos fermentables. Un método fácil consiste en colocar un círculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas de reactivo de oxidasa. Con un palito aplicador de madera, un mondadientes o una asa de platino estéril, sacar un poco de cultivo de la placa y tocar el papel humedecido, si hay microorganismos oxidasa positivos, el papel se tornará púrpura oscuro o azul en pocos segundos. Las especies patógenas de Vibrio son oxidasa positivas (excepto el V. metschnnikovii). Interpretación. La reacción positiva se observa por la producción de un color azul en un minuto.

Principio de acción

Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como el último eslabón de la cadena respiratoria aerobia, tranfiriendo electrones (hidrógeno) al oxígeno, con formación de agua. El sistema citocromo se encuentra en los microorganismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de oxidasa es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados. La prueba de citocromo oxidasa utiliza el diclorhidrato de Tetrametil-p-Fenilendiamina, que acúa como aceptor artifical de electrones, sustituyendo al oxígeno. La p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en presencia de citocromo oxidasa y oxígeno atmosférico se oxida formando azul de indofenol. Plasma de Conejo.

Emplear plasma de conejo liofilizado rehidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante. El anticoagulante que se debe de utilizar para obtener el plasma es ácido etilendiaminotetracético (EDTA) al 0,1% en plasma rehidratado. Si se utiliza plasma deshidratado, diluir con agua estéril en proporción 1:3. Puede utilizarse plasma de conejo liofilizado adicionado de EDTA. No debe emplearse plasma de sangre citratada. Principio de acción El plasma en presencia de la enzima coagulasa bacteriana, forma un coágulo de fibrina. El mecanismo esta dado porque la protrombina en presencia de sales de calcio y la enzima trombocinasa (tromboplastina), forman la trombina y ésta última al encontrarse frente al fibrinógeno, forma un coágulo de fibrina. La técnica para determinar la coagulasa ligada o factor de agregación, se realiza en un portaobjetos. Es responsable de la absorción del fibrinógeno, el cual precipita sobre los estafilococos, propiciando la agregación de estos microorganismos, observándose una aglutinación celular. En este caso, el factor de agregación, transforma el fibrinógeno en fibrina de manera directa, no toman parte los factores plasmáticos, tampoco se inhibe por los anticuerpos contra la coagulasa libre. La prueba de la coagulasa en tubo, detecta tanto la coagulasa libre como la ligada; la coagulasa libre extracelular, reacciona con una sustancia denominada factor de reacción de la coagulación, que se abrevia CRF, (sustancia termoestable parecida a la trombina), formando un complejo, el cual transforma el fibrinógeno en fibrina, liberando péptidos. En este caso el CRF, reacciona con la coagulasa, sin necesitar iones de calcio para formar el coágulo. Rojo de metilo, reactivo.

Rojo de metilo 0,2 g

Etanol al 95 % 300,0 mL

Agua destilada 200,0 mL Mantener el reactivo en refrigeración cuando no se utilice, el reactivo es estable de 2 a 3 semanas. Prueba de Rojo de metilo Transferir 2.5 mL del cultivo a probar con 48 h. de incubación a un tubo de ensayo. Agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo e interpretar el color de inmediato: Una coloración roja indica producción de acidez por lo que la prueba es positiva. Salina isotónica, solución. Cloruro de sodio 8,5 g Agua destilada 1,0 L Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 121°C±1,0°C durante 15 minutos. Tartárico ácido al 10%. Ácido tartárico 10,0 g Agua destilada 100,0 mL Disolver el ácido en el agua y esterilizar a 121°C durante 15 minutos, o bien por filtración a través de una membrana de 0,45 µm. Tris-(hidroximetilaminometano), solución amortiguadora 0,05M. Tris-hidroximetilaminometano, (peso molecular 121.1), pH 9,0 6,055 g Agua destilada 100,0 mL Disolver el Tris-(hidroximetilaminometano) en un matraz volumétrico de 100,0 mL y llevar a volumen con el agua. Voges-Proskauer, reactivos (VP). VP 1

alfa-naftol 5,0 g

Alcohol absoluto 100,0 g VP 2 Hidróxido de potasio 40,0 g

Agua destilada cbp 100,0 mL Prueba de Voges-Proskauer (VP): Transferir 1 mL del cultivo a probar, con 48 h. de incubación, a un tubo de ensayo. Después adicionar 0,6 mL de la solución VP 1 y 0,2 mL de la solución VP 2. Agitar después de la adición de cada solución. Para intensificar y acelerar la reacción adicionar unos cuantos cristales de creatina y mezclar. Dejar a temperatura ambiente y leer los resultados después de 4 h. de adicionados los reactivos. El desarrollo de una coloración rosa es una prueba positiva. Nitritos, reactivos para la determinación de. Reactivo A Alfa-naftilamina 0,5 g Àcido acètico 5N 100,0 mL Reactivo B Àcido sulfanìlico 1,0 g Àcido acètico 5N 125,0 mL Reactivo C Alfa-naftol 1,0 g Àcido acètico 5N 200,0 mL Solución de sulfato de cadmio al 20% Colocar granallas de zinc en solución de sulfato de cadmio al 20% de 4 a 6 h. Disolver el precipitado de cadmio, adicionando ácido clorhídrico 1N.

TINCIONES

Gram Alcohol-acetona Etanol (95%) 700,0 mL Acetona 300,0 mL Mezclar perfectamente ambos líquidos. Cristal violeta Solución A Cristal violeta 2,0 g Etanol (95%) 20,0 mL Disolver el cristal violeta en el etanol. Solución B Oxalato de amonio 0,8 g Agua 80,0 mL Disolver el oxalato de amonio en el agua. Después de preparar las soluciones A y B, verter una en la otra y agitar hasta que se mezclen perfectamente. Solución de Yodo Yodo 1,0 g Yoduro de potasio 2,0 g Agua 300,0 mL Triturar finamente el yodo y el yoduro de potasio en un mortero, de ser posible en una campana de extracción. Añadir una pequeña cantidad de agua para lavar el mortero, agregar el resto del agua y agitar. Guardar la soluciòn en envases de color ambar. Nota: ¡Evitar el contacto de los reactivos con la piel! Solución de Safranina Safranina 0,25 g Etanol (95%) 10,0 mL Agua 100,0 mL

Disolver la safranina en el etanol, mezclar, agregar el agua y volver a agitar. Filtrar la solución con papel filtro. Técnica de la tinción de Gram: 1. Colocar sobre un porta-objetos una gota de agua y la colonia que se desea

teñir, fijando a calor moderado la preparación. En caso de utilizar un cultivo líquido, omitir la gota de agua y colocar directamente sobre un porta-objetos una gota del cultivo líquido.

2. Adicionar cristal violeta a la preparación y dejarlo durante un minuto 3. Lavar con agua (usar de preferencia una piceta) y dejar escurrir 4. Cubrir la preparación el lugol (solución yodo-yodurada), y dejarlo actuar

durante un minuto. 5. Lavar con agua y decolorar con etanol al 95%, hasta que deje de salir

colorante, (aproximadamente 30 segundos). 6. Inmediatamente después enjuagar con agua y escurrir. 7. Aplicar el colorante de contraste (safranina), esperar durante 30 segundos y 8. Enjuagar con agua, escurrir y dejar secar, para posteriormente hacer la

observación microscópica.

Impronta Húmeda Lactofenol azul algodón Agua destilada 20,0 mL Cristales de fenol QP 20,0 g Ácido láctico 20,0 mL Glicerina 20,0 mL Azul algodón 0,05 g Disolver el fenol en el agua, agregar el ácido y la glicerina y calentar a 70°C y adicionar el colorante. Filtrar. Conservar en frascos de vidrio ámbar perfectamente tapados. Técnica de la impronta húmeda para observación de hongos. 1. Colocar una gota de lactofenol azul de algodón sobre un portaobjetos 2. Utilizando técnica aséptica y con asa micológica tomar una muestra del hongo

(desarrollado sobre la caja de Petri), tratando de no romper las estructuras. 3. Si se tiene un cultivo puro, utilizar un bisturí estéril y cortar una porción muy

delgada del agar en el que se desarrolló el hongo, transferirlo al portaobjetos y calentarlo suavemente para fundir el agar, de esta manera no se rompen las estructuras y se asegura una buena observación.

4. Cubrir la preparación, colocarla en la platina del microscopio. 5. Enfocar con el objetivo de 10X, observar el campo para localizarlo y para

mejorar el detalle cambiar el objetivo de 40X. 6. Hacer esquemas de los microorganismos vistos y registrar las características

observadas. Técnica de la impronta húmeda para observación de hongos (DIUREX) 1. Colocar una gota de lactofenol azul de algodón sobre un portaobjetos 2. Colocar en el último tercio del asa micológica un pedacito de diúrex de 1.5 cm

de largo, enrollándolo ligeramente. 3. En condiciones de asepsia, destapar la caja de Petri que contiene el cultivo del

hongo, introducir el asa con el diúrex y presionar ligeramente sobre una fracción de la colonia, tratando de no romper las estructuras.

4. Depositar la muestra en el portaobjetos que contiene el colorante, extender el diúrex y colocar encima un portaobjetos.

5. Colocar la preparación en la platina del microscopio. 6. Enfocar con el objetivo de 10X, observar el campo para localizarlo y para

mejorar el detalle cambiar el objetivo de 40X. 7. Hacer esquemas de los microorganismos vistos y registrar las características

observadas.