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Mejora de Biocatalizadores por ingeniería de proteínas Bioq. Belén Infanzón, MSc Faculta de Ciencias Químicas Departamento de Biotecnología Faculta de Biología Departamento de Microbiología
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Mejora de Biocatalizadores
por ingeniería de proteínas
Bioq. Belén Infanzón, MSc
Faculta de Ciencias Químicas Departamento de Biotecnología
Faculta de Biología Departamento de Microbiología
La catálisis es un proceso que aumenta la velocidad con la que una reacción alcanza el equilibrio. Dado que la velocidad de reacción depende de la energía libre de ac=vación, un catalizador provoca la disminución de la barrera de energía y acelera la etapa catalí=ca. Las enzimas son moléculas que pueden reducir la energía de ac=vación de la reacción y por lo tanto acelerar las reacciones bioquímicas que =enen lugar en la célula.
Usos de los Biocatalizadores
Estrategias para obtener un mejor biocatalizador para aplicaciones a escalas industriales
Bornscheuer et al., Trends Biotechnol. 2002
Introduction
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fact that most enzymes ‘‘have sub-optimal properties for processing conditions’’
(Bommarius & Riebel, 2004). A recent comparison of biocatalytic and traditional
chemocatalytic approaches for manufacture of a key chiral intermediate concluded that
the biocatalytic routes lack the space time yields, process mass intensity (kg output/kg
inputs), and catalytic efficiency required for economical manufacture (Luetz et al.,
2008).
To overcome these drawbacks there are two different pathways. One of them is to
fit the process to the available biocatalysts, by modifying the chemical manufacturing
process to suit the sensitivities of the biocatalyst (i.e., in terms of pH, temperature, and
solvents; (Luetz et al., 2008). The other alternative includes various strategies that may
run in parallel to discover the principal suitability of a given lipase (Bornscheuer et al.,
2002).
These strategies are: (1) screening for new suitable biocatalysts, (2) the use of
physico-chemical methods for biocatalyst improvement, and (3) using recombinant
DNA technology (directed evolution and/or rational protein design) for enzyme
improvement (Bornscheuer et al., 2002).
Figure I.4: Biocatalytic process development strategies (Bornscheuer et al., 2002)
• Incrementar la estabilidad de la molécula
• Incrementar la eficiencia de la reacción
• Incrementar afinidad al sustrato • Modificar el rango de sustrato • Obtener nuevas ac=vidades
catalí=cas • Incrementar la tolerancia a bajas o
altas temperaturas • Incrementar la tolerancia a
condiciones ácidas o alcalinas
Necesidades de modificación de una enzima
Sistemas para mejorar el rendimiento de la enzima
• Modificaciones fisico-‐químicas • Inmovilización • Condiciones del crecimiento en cul=vos • Clonación y sobreexpresión • Inducción de la expresión de genes • Manipulación genéKca de los genes que codifican a la enzima: mutagénesis
Selección de un protocolo de mutagénesis
apropiado, que permi=rá el acceso a
una biblioteca suficientemente
diversa
Diseño un método de cribado eficaz y adecuadamente
de alto rendimiento
(high-‐throughput screening method)
1 2
Los retos para realizar la mutagénesis
Bassegoda et al., 2013
Estrategias de mutagénesis
Se pueden generar bibliotecas de
secuencias mutantes con un número medio
de uno, dos o más errores
por secuencia
Error-‐prone polymerase chain reacKon (epPCR)
Ciclo de Evolución dirigida
Se pueden generar suficiente clones (normalmente 300-‐400 para un si=o). La biblioteca resultante contendrá mutantes con todos los 20 aminoácidos representados en el
si=o elegido
Site-‐saturaKon mutagenesis
Materials and Methods
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M.4.3.2 QuikChange® PCR method
The QuikChange® method allowed generation of mutant variants of P.
barcinonensis EstA in a quick and easy way. An adaptation of the QuikChange®
method (Hogrefe et al., 2002) was used to perform either site-directed mutagenesis, to
switch amino acids, or to delete or insert single or multiple amino acids in a sequence.
This method allows site-specific mutation in virtually any double-stranded plasmid,
generating mutants in four-steps (Figure M.1).
The basic procedure uses a supercoiled, double-stranded DNA (dsDNA) vector
bearing the insert of interest and two synthetic oligonucleotide primers containing the
desired mutation. The oligonucleotide primers (Table M.10), each complementary to
opposite strands of the vector, are extended during temperature cycling by specific
Expand High Fidelity DNA polymerase, which amplifies long DNA fragments.
Incorporation of the oligonucleotide primers generates a mutated plasmid
containing staggered nicks (Figure M.1). Following PCR, the amplified product is
treated with DpnI for template plasmid removal (see 5.4.2) and then transformed into E.
coli competent cells (see details in 5.6.1).
PCR
DpnIdigestion
Template plasmid
Template plasmid
Destruction of the template plasmid
1) 2)
Plasmid carrying the gene (gray) encoding
sequence of the enzyme
Figure M.1: Schematic illustration of the QuikChange PCR method (Stratagene)
1) Designed primers carrying the desired mutations; 2) Mutated gene (or library of genes).
Método Quick-‐ change
Caster
La homología entre las secuencias originales separadas permite el cebado cruzado, y en úl=ma instancia resulta en una biblioteca de
secuencias barajadas o revueltas.
DNA shuffling
• De alto rendimiento • Suficientemente sensible • Reproducible
Estrategias de selección
Estrategias de selección
Kumar and Singh, 2013
• Análisis estructura 3D -‐ pymol
Librería NNK para Y247 de Est23
• Análisis de la secuencia obtenida por la técnica Quick-‐change
Librería NNK para Y247 de Est23
Librería NNK
Cul=vo en placa
Ac=vidad enzimá=ca
Sustrato paranitofenil-‐ octanoato
Evaluación de Ac=vidad enzimá=ca
188 clones 5 clones
Evaluación de Ac=vidad enzimá=ca
113%
Librerías YDSL de LipR
-‐ QC1: GGG -‐ QC2: GGS -‐ QC3: GGA -‐ QC5: AGA
-‐ Librería D-‐NNK
-‐ Librería Y-‐NNK
188 clones 188 clones 5 clones
• Gel de proteínas SDS-‐PAGE 12%: Zimograma y =nción con Coomassie
Wt QC1 QC2 QC3 QC4 QC5
Librerías YDSL de LipR
0
20
40
60
80
100
Bu=rato Heptanoato Oleato
Ac=vidad Rela=
va
The evolu=on of enzyme discovery and protein engineering strategies used to iden=fy desired catalysts
Desaeos • Una integrac ión más estrecha entre la termodinámica y el desarrollo de procesos biocatalí=cos es altamente deseable para el diseño de nuevos procesos.
• Por otra parte, nuestra comprensión sobre la dinámica de proteínas es todavía muy limitada y esto hace que las predicciones sean dieciles basándose en la estructura cuaternaria.
• Se necesitan mejores técnicas para predecir en una etapa temprana de la ingeniería de proteínas que las mutaciones adicionales son posibles.
• El diseño informá=co de nuevas ac=vidades enzimá=cas no es exacto. Todavía se requieren 10-‐20 predicciones y por lo general dan lugar a una enzima con baja ac=vidad.
Gracias por la atención
