Método de análisis de las micotoxinas y aseguramiento de la

calidad analítica

Rodolfo Rivers., BQ. MSc.Consultor de Inocuidad y Calidad de los Alimentos

FAO/RLC

Micotoxinas

• Substancias producidas por algunos hongos, que puedencontaminar granos básicos y alimentos procesados y almacenados. Son substancias generadas por hongos microscópicos en productosalimenticios que al ser ingeridas son capaces de producirreacciones tóxicas, inducir cancer hepático, causar mutaciones y muerte en animales superiores y representan un riesgo potencialpara la salud humana

Aspergillus flavus

Penicillium expansum

Método de Análisis para micotoxinas (Codex)

• El Codex Alimentarius recomienda aplicar un enfoque basado en criterios de desempeño al que deberáajustarse el método de análisis utilizado

• Se incorporan novedades metodológicas sin tener que volver a examinar o modificar el método especificado

• Los criterios de desempeño establecidos para los diferentes métodos deberían incluir todos los parámetros que aplican los laboratorios

• Los laboratorios tiene libertad de utilizar el método de análisis más adecuado para sus instalaciones.

Selección del método• Seleccionar, la literatura, el informe del laboratorio

interno, los métodos estándar, etc.

• Límite de detección debe ser apropiado para las micotoxinas y la matriz

• Deben ser confiables y repetibles

• Lo ideal sería dar las recuperaciones de 70-120% *

• Debe ser actual

• Deben adecuarse a las instalaciones de laboratorio

* deben cumplir con los criterios de la CE 98/53

Equipos• Procesadora de alimentos• Licuadora.• Baño Maria.• Bomba de aire con adaptador para jeringa de 10 ml• Balanza electrónica• Agitador de tubos Vórtex• Dispensador de 0-50 ml• Cromatógrafo Liquido de alta presión, con detector de

fluorescencia.• Probetas de 50 ml• Embudos de 5 cm. de diámetro• Tubos eppendorf de 2 ml.• Papel filtro Whatman N°1• Filtro de fibra de vidrio• Micropipetas de 10-100 µl y de 100 a 1000 µl• Columnas de inmunoafinidad

Reactivos

• Hexano HPLC

• Benceno HPLC

• Metanol HPLC

• Cloruro de sodio p.a.

• Acido Trifluoracetico (TFA)

• Acetonitrilo HPLC

• Nitrógeno gaseoso

Pasos a seguir

1. Preparación de Reactivos

2. Procedimiento

– Preparación de la muestra

3. Preparación de estándares, curva de calibración y fortificación

4. Detección instrumental

5. Expresión de resultados

Preparation of standards

• Stocks• (1000 µg/ml = 1mg/ml)

• Intermediate• (10 µg/ml)

• Working solutions• (1, 0.1µg/ml or lower)

DetecciónHPLC-FLU.

Preparación para la determinación finalEvaporacion de Solvente

Adición de Solvente

Con volumen definido

Clean-upRemover interferentes de la matriz

Filtración

Extracción10 - 200 g sample

Mezcla y homogenización

Muestra

Columnas de Inmunoafinidad

time [in min]0 2 4 6 8 10 12 14

sig

nal [in

AU

]

5

6

7

8

9

G1

B1

G2

B2

CROMATOGRAMA AFLATOXINAS

Expresión de resultados

• Se construye una curva de calibración para cada estándar de aflatoxina B1, B2, G1 y G2 obteniéndose una ecuación lineal en la cual se interpolan las áreas obtenidas para las muestras, dando como resultado una concentración de aflatoxina de B1, B2, G1 y G2 en la muestra.

• Los resultados se expresan en ng/ml (ppb) de aflatoxina B1, B2, G1 y G2. Una muestra se considerará positiva si la cantidad de aflatoxinas totales analizadas superan los 4 ppb y se informará al cliente su resultado

Aflatoxinastotales

Método Validado

Frutos secos

(nueces, maní, almendras, pistachos y

avellanas)

AflatoxinasB1, B2, G1, G2

AflatoxinasM1

Método Validado

Método Validado

TejidoAnimal

(Hígado)

Leche

Aflatoxin B1Aflatoxin M1

Resultados de métodos analíticos

• Basados en principios de aseguramiento de la calidad

• Validados

• Acreditación según norma ISO 17025

– Son internacionalmente reconocidos

– Considerados de referencia para la

evaluación de conformidad de los productos

de intercambio en el comercio internacional

Objetivos de un Sistema de Calidad

• Prevención: Evitar que se propaguen errores e

ineficiencias

• Detección: Identificar los elementos causantes

de los errores

• Corrección y mejora: Eliminar las causas de

los errores y mejorar los procesos

• Demostrar: Evidenciar objetivamente que se ha

cumplido con los requistos.

Validación de métodos

• Calibración con patrones o materiales de referencia

• Comparación con resultados obtenidos con otros métodos

• Comparación interlaboratorios

• Evaluación de factores que influyen en el resultado

• Identificación de los factores y estimación de la incertidumbre

• Selectividad, repetibilidad, reproducibilidad, robustez, sensibilidad, limite de detección y de cuantificación.

Aseguramiento de la calidad de los ensayos

• Procedimientos de Control de calidad

• Uso regular de MR certificados

• Realizar cartas control

• Participación en interlaboratorios

• Repetición de ensayos con el mismo método o

métodos diferentes

• Repetición del ensayo en la muestra

Norma ISO 17025

• Se aplica a todo los laboratorios independientemente de:

– La cantidad de personal

– La extensión del alcance de los ensayos

• Establece requisitos de:

– Gestión

– Técnicos

ISO 17025

• La incertidumbre debe reportarse con un resultado....

• A petición del cliente (necesidad de estar preparados en un caso se pregunta).

• Si la incertidumbre afecta a la interpretación de los resultados.

• Si la incertidumbre afecta a la validez de un resultado

• La Norma dice:

– ¿Qué hay que hacer? (Requisito)

• El laboratorio dice el

– ¿Cómo? (Como se implementa el

requisito)

Acreditación - Certificación

Certificación

Acreditación

Norma ISO 9001:2000Asegura que el sistema de calidad

Este conforme a la normaConcordancia con la norma ISO 9000

Norma ISO 17025Determina la competencia técnica del

Personal, la validez técnica de lasOperaciones

Tiene que demostrar competencia

Validación

Confirmación, mediante el aporte de pruebas objetivas, de que se han cumplido los requisitos para el uso pretendido o una aplicación especifica

Componentes de una validación

• Prueba de la especificidad– perfectamente selectivo para la micotoxina de interés

• Sensibilidad – LOD, LDC

• Exactitud y precisión– de repetibilidad (dentro de un plazo, por ejemplo, de réplicas)– reproducibilidad

• Robustez– llevada a cabo día a día– llevada a cabo entre los laboratorios

Reproducibilidad

• Grado de concordancia entre los resultados de sucesivas mediciones del mismo mesurando realizadas en diferentes condiciones de medición

• El ensayo se realiza sobre el mismo material de ensayo en diferentes condiciones

Repetibilidad

• Grado de concordancia entre los resultados de sucesivas mediciones del mismo mesurando realizadas en las mismas condiciones de medición

• Las mismas condiciones significa resultados obtenidos:– Con el mismo método de ensayo

– Sobre el mismo material de ensayo

– Bajo las mismas condiciones

(mismo operador, mismo equipo, mismo laboratorio y un corto intervalo de tiempo)

Ensayo de Aptitud Interlaboratorio“Proficiency testing”

• Los programas de ensayo de aptitud

organizados externamente por un proveedor de

ensayos interlaboratorio constituyen un medio

independiente por el cual un laboratorio se

puede evaluar objetivamente y demostrar la

veracidad y precisión de los resultados

obtenidos por sus métodos analíticos

Sensibilidad y Rango

• Validación de un rango de concentración que puedan emplearse para el método deLOD - límite de detección (menor);

• sistema y de las muestrasLDC - límite de cuantificación (inferior); 3.3xLOD

0

3

10

blanco

LOD

LOQ

región de alta incertidumbre

Región de cuantificaciónmenos cierto

Región de deteccióncertera

Región de alta seguridadpara la detección y cuantificación

Relación: Concentración, LOD, LOQ

Porque se estima la medición de incertidumbre

• Exige la acreditación (por ejemplo, ISO 17025).

Los clientes y la legislación exige que los laboratorios están acreditados

Para saber si un resultado es la concentración de micotoxinas es muy probable que sea por encima o por debajo de un límite.

Para saber si los resultados de medición de acuerdo con los demás

Robustez

A.- Cambios menores

• Se utiliza la introducción deliberada de variaciones menores razonables y la observación de sus consecuencias.– Operador– Procedencia y edad de los reactivos– Disolventes– Patrones– Extractos de la muestra– Temperatura– pH

Reporte de medición de incertidumbre

• Resultado ± Incertidumbre

• Ej.: “6.5 ± 2.6 µg/kg”

• “8.9 ± 3.2 µg/kg.La mejor estimación de la concentración de ocratoxina A es de 8,9 µg / kg. Sin embargo, la incertidumbre expandida asociada con el resultado abarca el límite legislativo de 10 µg / kg. "

B.- Cambios mayores o importantes

– Diferentes especies

– Diferentes matrices o condiciones de

muestreo

Estabilidad

• parámetro de funcionamiento independiente del

modelo de validación empleado

• Estabilidad del analito en la solución

– Resto del analito (%) = Ci x 100/ Cfresco

• Estabilidad del analito (o los analitos) en la

matriz

– Utilice muestras reales siempre que sea posible. Cuando no disponga de ellas, utilice una matriz enriquecida con el analito.

Exactitud y precisión

• repetibilidad en un rango relevante de concentraciones

• repetibilidad para la recuperación de muestras enriquecidas

• eficacia de la extracción

• repetibilidad para una muestra dada (porejemplo, CV <20%)

Recuperación

• Por pics de micotoxinas en un “blanco” de matriz similar a la estudiada

• Nivel de adición debe ser relevante para las muestras, el límite normativo, y la LDC (por ejemplo, LDC a 100xLOQ

• "El blanco" idealmente debe estar libre de micotoxinas

• La recuperación debe ser de 70-120%

Eficacia de la extracción

• Experimentos de recuperación no demuestran la

eficacia de la extracción para las micotoxinas

producidas naturalmente en una muestra

• A menos que un método estándar se utilize

debe haber una cierta garantía de recuperación

completa

– comparar los resultados con los que utilizan un método estándar

– utilizar una muestra certificada para las pruebas de validación

Web de interés

• http://www.aoac.org

- methods, collaborative studies

• http://www.sigma-aldrich.com

- standards, safety data, certificates of analysis

• http://www.chm.bris.ac.uk/safety

links to safety sites

• Europa Food Safetyhttp://europa.eu.int/pol/food/index_en.htm

• Links to Rapid Alert Systemhttp://europa.eu.int/pol/food/food/rapidalert/index_en.htm

• http://www.iupac.org/

- symposia, links to mycotoxin sites

• http://www.mrc.ac.za/promec/

- standards for sale

• http://ptg.csl.gov.uk

- FAPAS proficiency testing scheme, contaminated test materials

• European Mycotoxin Awareness Network (EMAN) www.mycotoxins.org

Mycotoxicology Newsletterwww.mycotoxicology.org

MUCHAS GRACIAS!!