Metodo de Evaluación de Médula Ósea

7/25/2019 Metodo de Evaluacin de Mdula sea

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2014. Elsevier Espaa, S.L. Reservados todos los derechos202

C A P T U L O 8

Mtodos para el estudio de la mdula seaJ. L. Aguilar i Bascompte y M. Daz-Ricart

CARACTERSTICAS GENERALES DE LA MDULA SEA

La mdula sea es el tejido donde se originan los elementos formes de la sangre. En el nio,ocupa la cavidad esponjosa de prcticamente todos sus huesos, pero con el desarrollo,

parte de ella es reemplazada por tejido graso, por lo que finalmente queda reducida a unaszonas concretas tales como el crneo, el esqueleto axial (columna vertebral) y la epfisis delos huesos largos (v. fig. 2-2). Histolgicamente, la mdula sea presenta una arquitecturaconstituida por cordones de clulas que irradian hacia el interior a partir del endostio. Unafina estructura reticular sirve de soporte a los cordones celulares y a los capilares sinusoides(fig. 8-1). Las caractersticas especiales de las paredes de estos capilares sinusoides permitenel intercambio de sustancias nutritivas y de desecho entre el plasma y las clulas, peroimpiden la salida de estas hacia la circulacin, hasta que sus caractersticas fsicas (dadasprincipalmente por la madurez celular) lo permiten. El medio intercelular (microambientemedular), que est principalmente condicionado por el estroma, constituido a su vez por elsoporte reticular y el sistema vascular, es esencial para la duplicacin de los progenitores y sumaduracin a elementos ms diferenciados y finalmente a clulas sanguneas. Una alteracindel estroma (p. ej., fibrosis medular) imposibilita el desarrollo del tejido hematopoytico, elcual se desarrolla en otros tejidos diferentes a la mdula sea (hgado y bazo, principalmente),dando origen a la llamada metaplasia mieloide. Las clulas que normalmente se hallan en lamdula sea son de varios tipos (cuadro 8-1), pero todas ellas derivan de una nica clulamadre, cuyo nmero permanece siempre constante por el mecanismo de autoduplicacin(compartimento funcional de clulas madre). Un primer grado de diferenciacin da lugara los llamados progenitores comprometidos para una determinada lnea celular, cuya es-

tirpe no es an reconocible morfolgicamente por lo que deben ser explorados mediantemtodos indirectos, como por ejemplo, los cultivos in vitrode mdula sea.El estudio de la mdula sea puede realizarse a nivel morfolgico y funcional: el nivel

morfolgico consiste en el examen microscpico de los precursores hematopoyticos(mielograma) o citolgico de sus cromosomas (citogentica), el nivel funcional, en elestudio de los progenitores mediante cultivos in vitrode mdula sea.

EXAMEN MORFOLGICO DE LA MDULA SEA

La exploracin de la mdula sea es obligada ante cualquier trastorno de origen des-

conocido que altere el nmero y/o la proporcin normal de las clulas sanguneas.Asimismo, debe realizarse siempre que se observen clulas o precursores inmaduros(blastos) en sangre perifrica.

Existen dos procedimientos para explorar la mdula sea:1. Puncin aspirativa.2. Biopsia sea.

Descargado de ClinicalKey.es desde Complejo Hospitalario Dr Arnulfo Arias junio 29, 2016. Para uso personal exclusivamente. No sepermiten otros usos sin autorizacin. Copyright 2016. Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.


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FIGURA 8-1. Esquema de la estructura general de la mdula sea.

DescargadodeClinicalKey.esdesdeComplejoHospitalarioDrA

rnulfoAriasjunio29,2016.Parauso

personalexclusivamente.Nose

permiten

otrosusossinautorizacin.Copyright

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osreservados.


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Manual de tcnicas de laboratorio en hematologa204

Puncin aspirativa de mdula sea (aspirado medular)

Principio

La puncin sea tiene como finalidad primordial realizar un examen morfolgico delos elementos celulares presentes en la mdula sea. Este se realiza normalmente a partirde una extensin del material medular obtenida por aspiracin despus de que se hayapracticado una puncin en el hueso. La puncin sea suele realizarse casi siempre a laaltura del esternn (puncin esternal), aunque en algunos casos es preferible realizarla

en la tuberosidad posterior de la cresta ilaca (fig. 8-2).

Mtodo

1. Se anestesia la piel, el tejido celular subcutneo y el periostio.2. Se realiza una puncin del hueso con aguja no muy gruesa, seguida de una as-

piracin de material medular (0,1-0,3 ml), que se depositar sobre un portaobjetosbien limpio.

3. Se examinan las caractersticas morfolgicas del grumo y su cantidad. De acuerdocon ello, el grumo puede caracterizarse por:

(a) Ser muy escaso o incluso inexistente (puncin blanca).(b) Estar constituido casi exclusivamente por grasa o material necrtico.(c) Ser abundante o incluso muy abundante.(d) Ser de tamao grande, mediano o pequeo.

4. Se extiende el grumo sobre un portaobjetos, ayudndose de otro portaobjetos yse procura aplastarlo suavemente al realizar la extensin (fig. 8-3).

5. Se tie la extensin por el mtodo habitual (May-Grnwald/Giemsa o Wright).6. Se examina la extensin as teida de acuerdo con la siguiente sistemtica:

(a) Cuando la puncin de la mdula sea no da salida a material alguno(ni grumo ni sangre medular) se habla de puncin blanca o seca (dry-tap).

En una primera etapa, la extensin del aspirado medular debe examinarse medianteun objetivo de poco aumento (10 A). Ello permite apreciar la celularidad global y lapresencia, la ausencia o el aumento del nmero de clulas grasas y/o de megacariocitos.Los megacariocitos se encuentran en una proporcin aproximada de 1:2 por campo,aunque este nmero vara de manera importante con la tcnica empleada para realizarla extensin. La celularidad hematopoytica puede ser de tres tipos: normal, aumentada

CUADRO 8-1. Tipos de clulas presentes en la mdula sea

Clulas de tejido seo (osteoblastos y osteoclastos) Clulas de los endotelios vasculares

Clulas soporte o estroma (brocitos y broblastos) Clulas grasas Clulas hematopoyticas:

Clulas de la lnea madurativa eritropoytica (eritroblastos) Clulas de la lnea madurativa granulopoytica (promielocitos, mielocitos

y metamielocitos) Clulas del sistema mononuclear fagoctico Monocitos Histiocitos Megacarioblastos y megacariocitos Linfocitos



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Captulo 8 Mtodos para el estudio de la mdula sea 205

(hipercelularidad) o disminuida (hipocelularidad). La celularidad se valora de maneraprecisa en el grumo aplastado. Debe sealarse, no obstante, que la apreciacin de lacelularidad mediante el aspirado medular, aunque es muy til, tiene a veces un valor

limitado, ya que existen situaciones patolgicas en las que aquella no se correspondecon la que existe realmente. As, por ejemplo, en ciertas aplasias medulares en las que labiopsia sea demuestra una mdula vaca, el aspirado puede presentar una celularidadnormal o incluso abundante. Lo contrario sucede en ciertas leucemias agudas con mdulaempaquetada o en la mielofibrosis primaria con mdula ahogada por la proliferacin defibras de reticulina y/o colgeno, donde no es infrecuente obtener una puncin blancaa pesar de la existencia de una marcada proliferacin celular. En todos estos casos,la celularidad real de la mdula sea solo puede apreciarse con seguridad mediante laprctica de una biopsia sea.

En una segunda etapa, se debe proceder al examen a gran aumento (objetivo 100 A),

lo que permitir observar las caractersticas morfolgicas de las diferentes clulas y rea-lizar un recuento diferencial de las mismas (mielograma). El recuento diferencial de cadatipo celular se efecta de forma similar al de la sangre perifrica, aunque en la prcticasuele suministrarse un recuento global correspondiente a la proporcin existente de lasocho categoras principales de clulas presentes en la mdula sea (v. cuadro 8-1). En lafigura 8-4se muestra un ejemplo de informe de examen de mdula sea o mielograma.

FIGURA 8-2. Zonas de eleccin para realizar el aspirado medular.



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Al iniciar el examen morfolgico de la mdula sea destaca, en primer lugar, el pre-dominio de los precursores granulopoyticos sobre los eritroblsticos. As, las clulas quese ven con mayor frecuencia son mielocitos y metamielocitos neutrfilos, eritroblastos yalgn promielocito (fig. 8-5). La eosinofilia medular es, en general, algo superior a la queexiste normalmente en sangre perifrica y se caracteriza por la presencia de un nmerovariable de mielocitos eosinfilos. Los elementos de la serie eritropoytica pertenecen ensu mayora a eritroblastos policromticos y ortocromticos; son menos abundantes loseritroblastos basfilos y los proeritroblastos, caracterizados por su tamao y la inmadurez

nuclear as como por su elevada basofilia citoplasmtica (fig. 8-6).Al observar estas clulas, se debe consignar no solo su nmero, sino tambin la exis-tencia de posibles alteraciones morfolgicas. As, al analizar los elementos de la serieeritropoytica, es importante considerar las posibles alteraciones de la maduracin(megaloblastosis) o la existencia de signos de diseritropoyesis (binuclearidad, puentesinternucleares o alteraciones de la cromatina) y/o un aumento del nmero de mitosis.

En la serie granulopoytica debe considerarse la posible existencia de clulas inmadu-ras (mieloblastos) y/o alteraciones de la granulacin (desgranulacin o hipergranulacin)o de la segmentacin del ncleo (hipo- o hipersegmentacin).

Al analizar las restantes clulas, importa considerar la presencia de elementos atpicos

(generalmente blastos), clulas no hematolgicas (metstasis carcinomatosa), eosinofilia,basofilia y el aumento de clulas cebadas (mastocitos) o de macrfagos y del nmero delinfocitos o de clulas plasmticas.

Los megacariocitos normales son clulas poliploides que se caracterizan por sugran tamao y la segmentacin nuclear (fig. 8-7). Al realizar el examen morfolgicode la mdula sea, debe observarse detenidamente el aspecto morfolgico de los

FIGURA 8-3. Extensin de aspirado medular.



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FIGURA 8-4. Hoja-dictamen de un examen citolgico de mdula sea realizado a partir de un aspiradomedular.



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FIGURA 8-5. Imagen de unamdula sea normal. Eritroblastos,mielocitos y metamielocitos.Neutrfilos (MGG, 1.000).

FIGURA 8-6. Imagen de unproeritroblasto (MGG, 1.000).

FIGURA 8-7. Imagen de unmegacariocito (MGG, 1.000).



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megacariocitos al objeto de poder hallar alteraciones tales como hipo- o hiper-segmentacin nuclear, alteraciones de la madurez citoplasmtica o la presenciade megacariocitos de tamao muy pequeo y escasa o nula segmentacin nuclear(megacariocitos de aspecto hipoploide).

El recuento diferencial de los elementos celulares presentes en la mdula sea esttambin indicado en el anlisis de la respuesta medular a citostticos, durante la fasede recuperacin de una agranulocitosis o en ciertas formas de dishematopoyesis demecanismo oscuro.

Interpretacin del examen morfolgico del aspirado de mdula sea

El mielograma normal viene detallado en la tabla 8-1, y entre sus principales alteracionespatolgicas destacan: Aumento de la celularidad a expensas de la serie eritropoytica. Constituye

lo que se llama hiperplasia eritroblstica, y se suele observar en casos de hi-perregeneracin medular como respuesta a la prdida perifrica de eritrocitospor hemorragia o hemlisis (anemia regenerativa) o cuando existe una inca-pacidad de los eritroblastos para madurar a eritrocitos (anemias megalobls-ticas y diseritropoyticas). Estas ltimas tienen carcter arregenerativo. En laanemia regenerativa por hemlisis o hemorragia, el aumento del nmero deeritroblastos se realiza a expensas de los ms maduros (eritroblastos ortocrom-ticos) y no se observan alteraciones de la maduracin celular. Por el contrario,en la anemia megaloblstica desaparecen los eritroblastos ortocromticos y dis-minuyen los policromatfilos, por lo que se observa un predominio de eritro-

blastos de gran tamao con intensa disociacin madurativa ncleo-citoplasma

TABLA 8-1. Mielograma segn Wintrobe

Lmites de referencia (%)

Serie neutroflica total 49,2-65 Mieloblastos 0,2-1,5 Promielocitos 2,1-4,1 Mielocitos 8,2-15,7

Metamielocitos 9,6-24,6 Bandas 9,5-15,3 Segmentados 6-12Serie eosinoflica total 1,2-5,3 Mielocitos 0,2-1,3 Metamielocitos 0,4-2,2 Bandas 0,2-2,4 Segmentados 0-1,3Basfilos y mastocitos 0-0,2Serie eritroblstica total 18,4-33,8 Proeritroblastos 0,2-1,3 Eritroblastos basfilos 0,2-1,3

Eritroblastos policromatfilos 17,9-29,9 Eritroblastos ortocromticos 0,4-4,6Linfocitos 11,1-23,1Clulas plasmticas 0,4-3,9Monocitos 0-0,8Megacariocitos 0-0,4Histiocitos y clulas reticulares 0-0,9



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(ncleo inmaduro y citoplasma relativamente bien hemoglobinizado) que sedenominan megaloblastos (v. captulo 17). Existen ciertas formas de anemiaarregenerativa, tales como las diseritropoyesis congnitas o adquiridas, en lasque se observan alteraciones cualitativas de los eritroblastos que afectan tanto

el ncleo (binuclearidad, alteraciones de la cromatina, puentes internucleares) como elcitoplasma (aumento de tamao, hemoglobinizacin irregular, presencia de materialcromatnico o depsitos abundantes de ferritina). Aunque en estas formas de anemiapuedan observarse rasgos megaloblsticos, no deben confundirse con la anemia me-galoblstica genuina, por cuanto esta responde inmediatamente al tratamiento confactores vitamnicos: cido flico o vitamina B

12(v. captulo 17). Aunque el nombre de

diseritropoyesis se aplica de forma ms especfica a las formas congnitas, la presenciade un mayor o menor grado de diseritropoyesis adquirida puede observarse en elcurso de diversas hemopatas, tales como los llamados sndromes mielodisplsicos(anemia refractaria o displasia multilineal) y ciertas leucemias agudas y crnicas.

Finalmente, existe una forma de leucemia aguda llamada eritroleucemia (formaM6 de la clasificacin FAB), en la que es muy caracterstica la hiperplasia de serieroja y su marcada diseritropoyesis.

Aumento de la celularidad a expensas de la serie granulopoytica.Puede observarsecomo fenmeno acompaante en el curso de procesos infecciosos (septicemia), in-flamatorios, hepatopata crnica o metstasis carcinomatosa. De forma caracterstica seobserva un gran aumento de la proliferacin granulopoytica en la leucemia mieloidecrnica (LMC), en la cual las clulas se hallan presentes en todos sus estadios madurativosnormales. Un aspecto celular parecido puede observarse tambin en el curso evolutivode otros sndromes mieloproliferativos crnicos afines a la LMC, tales como la fasehipercelular de la mielofibrosis idioptica, la policitemia vera y la trombocitemia esencial.

Aumento del nmero de linfocitos.La linfocitosis medular debe valorarse siempreen relacin con la clnica general y la celularidad global, ya que puede observarse endos situaciones completamente diferentes: Si se trata de una mdula hipocelular, el diagnstico ms probable es el de aplasia

medular y su confirmacin precisa una biopsia sea. Si se trata de una mdula hipercelular, el diagnstico puede ser una reaccin de

la mdula a estmulo externo, pero si se aprecia infiltracin, lo ms probable esque se trate de una leucemia linftica crnica. Ocasionalmente, puede tratarse

tambin de una infiltracin linfoide de la mdula sea en el curso de un linfoma.El diagnstico diferencial exige no solo una adecuada valoracin clnica, sino laprctica de una biopsia sea.

Aumento del nmero de clulas plasmticas.Puede aparecer como fenmeno secun-dario en el curso de procesos diversos, principalmente infecciones vricas, trastornosinmunes, neoplsicos o de una hepatopata crnica (plasmocitosis reactiva) o constituirel signo morfolgico de un plasmocitoma, enfermedad caracterizada por la proliferacinclonal de clulas plasmticas que infiltran en mayor o menor grado la mdula sea.Las clulas plasmticas del plasmocitoma suelen presentar un tamao superior alde las clulas plasmticas normales, y a veces rasgos de inmadurez (plasmoblastos).

Presencia de macrfagos abundantes o con aspecto morfolgico peculiar.La observacin del nmero y del aspecto morfolgico de los macrfagos que sehallan en la mdula sea puede ser de gran inters diagnstico. As, la cifra de ma-crfagos suele hallarse aumentada en diversas situaciones patolgicas (sndromesinflamatorios, anemia hemoltica autoinmune, hemopatas malignas y metstasisneoplsicas), lo que se traduce en una respuesta medular a la agresin. En otros



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casos, los macrfagos, adems de hallarse aumentados, pueden contener parsitos(leishmania) en su interior, que es un hallazgo fundamental para el diagnsticodel kala-azar (leishmaniosis visceral). Finalmente, en ciertas enfermedades conafectacin especfica del sistema mononuclear fagoctico, los macrfagos puedenadquirir un aspecto peculiar que permite su diagnstico. Tal sucede en las his-tiocitosis malignas y benignas o en las enfermedades acumulativas o tesaurismosis,en las que los macrfagos se hallan repletos de material lipdico sin metabolizar(enfermedad de Gaucher, enfermedad de Niemann-Pick y sndrome del histiocitoazul marino) (fig. 8-8).

Infiltracin medular por blastos leucmicos.Es caracterstica de la leucemia aguda,en la que dicha infiltracin suele ser homognea y monomorfa con desaparicincompleta de la celularidad normal y de los estadios madurativos de todas las seriescelulares hematopoyticas (hiato leucmico). Cuando las caractersticas morfolgicasde los blastos no permiten realizar una catalogacin citolgica, se hace necesaria laprctica de tinciones citoqumicas o el anlisis de marcadores inmunolgicos tipoCD mediante citometra de flujo (tabla 8-2) a partir del material medular obtenidoen la puncin (v. captulos 12 y 13).

Presencia de metstasis.Una metstasis de clulas carcinomatosas en la mdula seasuele caracterizarse por la aparicin de uno o varios cmulos de dichas clulas endiferentes puntos de la extensin (fig. 8-9). La imagen caracterstica que suministranestos agregados celulares es suficiente para establecer el diagnstico, y ante su sospechanunca est de ms observar cuidadosamente varias de las extensiones practicadas alenfermo, cuando su hallazgo no ha sido posible al analizar la primera de ellas. En otrasocasiones, no obstante, la metstasis medular puede invadir totalmente la mdula sea,sustituyendo incluso la celularidad hematopoytica normal. En tales casos, resulta aveces difcil diferenciar la metstasis de una leucemia, por cuanto las caractersticasmorfolgicas de las clulas carcinomatosas pueden ser muy similares a las de ciertos

blastos leucmicos, en especial los de estirpe monoctica o indiferenciada (es el casodel carcinoma anaplsico de pulmn). La prctica de estudios citoqumicos o demarcadores celulares vuelve aqu a hacerse imprescindible para establecer el diagns-tico diferencial.

Signos de afectacin en pacientes HIV+.En individuos con el sndrome de la in-munodeficiencia adquirida (SIDA) es frecuente la alteracin de la hematopoyesis, que

FIGURA 8-8. Clulas de Gaucher enla mdula sea (MGG, 1.000).



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en sangre perifrica se caracteriza por una leucopenia con linfopenia y disminucinsignificativa de los linfocitos T CD4+ (T colaboradores o inductores). Resulta bas-tante frecuente tambin la plaquetopenia de origen probablemente perifrico. En lamdula sea aunque no puede hablarse de alteraciones especficas s existen signos

bastante constantes. Entre ellos destaca la relativa frecuencia con que se obtienenpunciones blancas (dry-tap)en pacientes HIV+. Ello contrasta con la imagen dela biopsia, caracterizada por una celularidad normal o incluso aumentada. Cuandoes posible obtener material del aspirado, el examen morfolgico del mismo muestrageneralmente una celularidad abundante en la que destacan signos dishematopoyti-cos, especialmente en los precursores eritroides (megaloblastosis y diseritropoyesis) y

TABLA 8-2. Marcadores que pueden ser utilizados en la biopsia medular con la tcnicade inclusin en parafina

Marcador Dilucin Reactividad

CD3 (1:30) Linfocitos TCD4 (1:5) Subpoblacin de linfocitos T (colaboradores)

Monocitos/histiocitosCD5 (1:25) Linfocitos T y subpoblaciones de linfocitos BCD8 (1:10) Subpoblacin de linfocitos T (supresores)CD10 (CALLA) (1:25) Linfocitos B y T inmaduros, linfocitos B del centro

germinal y neutrfilosCD15 (1:25) Neutrfilos, clulas de Reed-SternbergCD20 (1:100) Linfocitos BCD21 (1:100) Clula dendrticaCD23 (1:10) Clula dendrtica y linfocito B activado

CD30 (1:10) Clulas linfoides activadas y clulas de Reed-SternbergCD34 (1:20) Clula progenitora linfoide mieloideCD56 (1:5) Clula natural killer(NK) y clula plasmtica malignaCD68 (1:6.000) Serie monocticaCD79a (1:20) Linfocitos BCD117 (C-kitt) (1:100) Serie mieloide inmadura y mastocitosCD138 (1:5) Clula plasmtica normal y mielomatosaBcl-2 (1:50) Sobreexpresa en linfoma reticularBcl-6 (1:1) Linfocitos B del centro germinalCadena ligera k (1:64.000) Linfocitos BCadena ligera l (1:64.000) Linfocitos BCam 5.2 (1:100) Metstasis epitelial

Ciclina O1 (1:10) Linfoma de clulas del manto y algunos mielomasTricoleucemiaEma (1:100) Clula epitelial y clula plasmticaFactor VIII (1:400) MegacariocitoGlucoforina C (1:200) Serie eritroide inmaduraGranzima B (1:50) Grnulos citotxicos (indica fenotipo activado)LMP-1 (1:100) Virus Epstein-BarrLisozima (1:4.000) Lnea monocticaMieloperoxidasa (1:4.000) Lnea mieloidePGM1 (1:1.000) Lnea monocticaTdT (1:2/1:4) Linfocito inmaduroTIA-1 (1:100) Grnulos citotxicos (linfocito T citotxico; linfocito

NK y neutrfilos)LEX (1:250) Serie eritroide inmadura y megacariocito



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un cierto grado de linfocitosis con plasmocitosis. La observacin de hipoplasia de serieroja, intensa plasmocitosis y aumento del nmero de macrfagos debe hacer pensar enuna infeccin diseminada por citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (VEB),Leishmania donovanio por el bacilo cido-alcohol resistente aMycobacterium aviumintracellulare(MAI) que afecta la mdula sea, lo que obliga a realizar los estudiosmicrobiolgicos pertinentes.

Biopsia sea

Introduccin

La biopsia de mdula sea o biopsia medular (BMO) constituye en la actualidad unprocedimiento de indudable inters diagnstico en hematologa y, en algunos casos,decisivo para el establecimiento definitivo del mismo. As, por ejemplo, es la nicaexploracin que nos permite establecer el diagnstico de extensin de los linfomasy conocer las caractersticas de su patrn invasivo, fundamental para iniciar o con-trolar la conducta teraputica adecuada. En la aplasia medular resulta imprescindible

para conocer su grado de extensin y determinar el pronstico. En el SIDA, el es-tudio de la biopsia de mdula sea puede tambin tener inters clnico cuando lapuncin medular ha resultado blanca (cuadro 8-2). El hecho de que, para estudiarla mdula sea hematopoytica, haya que abordar la profundidad del hueso y lamuestra extrada deba someterse a un proceso relativamente largo de preparacinantes de poder ser observada al microscopio hace que su empleo sea algo mslimitado que la simple puncin y el aspirado medular. No obstante, su utilidaddiagnstica se ha visto en los ltimos aos revalorizada debido sobre todo a treshechos fundamentales:

1. La mayor simplicidad y eficacia del instrumental empleado en la extraccin de

las muestras.2. El perfeccionamiento de los procedimientos histolgicos que atenan el problemade la descalcificacin. A este respecto cabe decir que hoy en da es posible utilizaralgunos marcadores monoclonales en las muestras de biopsia sea incluidas enparafina. Este hecho permite ampliar considerablemente la utilidad diagnsticade este procedimiento en la prctica clnica (v. tabla 8-2).

FIGURA 8-9. Nido de clulasneoplsicas (micrometstasis) (MGG,1.000).



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3. La toma de conciencia de que la mayora de las hemopatas son, en realidad,enfermedades de la mdula sea hematopoytica es fundamental, ya que soloa travs de su estudio morfolgico e histolgico minucioso podr conseguirseun diagnstico correcto. Como se ha indicado ya anteriormente, ello no restaimportancia al estudio del aspirado medular, ni hace que ambas tcnicas seanexcluyentes, sino al contrario, complementarias (tabla 8-3).

La biopsia sea es una tcnica histolgica que informa sobre las caractersticas estruc-

turales de la mdula hematopoytica respecto al tejido, y hace nfasis en la arquitecturade la misma. El aspirado medular, en cambio, es una tcnica citolgica que permitela descripcin minuciosa y detallada de las caractersticas morfolgicas de las clulashematopoyticas.

En la actualidad, la toma de biopsia se hace casi de forma exclusiva por puncintranscutnea mediante un trocar, y se ha abandonado completamente la prctica deuna biopsia quirrgica debido al mayor riesgo que conlleva (sobre todo de hemorragiae infeccin) y por producir mayores molestias al paciente. Dicha tcnica empleaba elllamado mieltomo de Burkhardt que, previa incisin cutnea, actuaba mediante unmotor elctrico que accionaba una fresa dotada de dientes cortantes que despus decortar el cilindro facilitaban su ulterior extraccin mediante una pinza de tornillo. Estatcnica no se utiliza prcticamente en la actualidad, aunque tiene la ventaja de permitirla obtencin de cilindros muy gruesos y no afectarse tanto como los trocares actuales

TABLA 8-3. Utilidad complementaria del aspirado y la biopsia de mdula sea (MO)

Caracterstica Aspirado de MO (citologa) Biopsia de MO (histologa)

Sencillez +++ +Rapidez +++ +Morfologa celular +++ +Celularidad + +++Arquitectura celular +++Fibrosis +++Progenitores

CUADRO 8-2. Alteraciones de la biopsia sea en pacientes HIV positivos

Aumento de la celularidad y del nmero de megacariocitos Signos de mielodisplasia

Eritrocitaria y megacarioctica Granulopoyesis + eritropoyesis Plasmocitosis Inltracin linfoide de aspecto maduro (26% de biopsias) Dilataciones vasculares y proliferacin vascular anmala Granulomas (10% de biopsias) Eritrofagocitosis (6% de pacientes) Aumento de macrfagos con pigmento frrico Parasitosis (leishmaniosis) (6% de los casos) Fibrosis reticulnica grados I o II

HIV, virus de la inmunodeficiencia humana.



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frente a huesos muy duros, como en casos de osteoesclerosis donde la extraccin del

cilindro seo puede ser muy difcil.Material

En nuestro medio, dos son los trocares que han demostrado ser ms tiles:1. Trocar de Tanzer.2. Trocar de Jamshidi.Ambos modelos consisten en una aguja hueca, con un extremo proximal en forma

de T, que permite sujetarlo fcilmente, y un extremo distal cortante; en su interiorse inserta un mandril punzante y los dos van provistos de un expulsor. El trocar deJamshidi se diferencia del de Tanzer en que su extremo distal es algo ms estrecho que el

resto del trocar, por lo que el cilindro seccionado no es comprimido en el interior de laaguja (fig. 8-10). La expulsin del cilindro se hace, en el trocar de Jamshidi, en sentidodistal-proximal. En los ltimos aos han ido apareciendo en el mercado modelos detrocares inspirados en el original de Jamshidi que no han hecho sino mejorarlo, concre-tamente el extremo proximal, realizado con material de plstico y que posee, en general,un diseo muy cuidado, a menudo ergonmico que hace ms idnea su adaptacin a lamano del operador. El estilete o mandril es punzante, suele ser muy afilado y posee treso cuatro facetas que facilitan la penetracin y el ulterior anclaje en la cortical del hueso.El extremo distal de la cnula o aguja es muy cortante (puede tener forma de corona o deboca de pez), lo cual le confiere gran efectividad en el avance a travs del hueso medular.

Recientemente, la mayora de los suministradores de material para el diagnsticoin vitrohan ido incorporando a sus equipos de biopsia sea un sistema capturador delcilindro seo o atrapa muestras. El sistema puede formar parte inherente del propiotrocar o, lo que es ms frecuente, consiste en una pieza adicional. Segn el diseadoresta novedad mejora la calidad tcnica de la extraccin, ya que aumenta el porcentajede xitos en la obtencin de la muestra y evita en todos los casos los movimientos dedeflexin del trocar.

Mtodo

1. Normalmente, se elige como punto de eleccin la cresta ilaca, antero- o pos-terosuperior.2. Tras asepsia cuidadosa de la piel de la zona y anestesia local, se procede a la puncin

con el trocar, provisto de su mandril. En los centros hospitalarios, dotados deservicio de anestesia es posible mejorar la calidad de la extraccin de la biopsia seasi se completa la anestesia local con sedacin endovenosa o con analgesia espinal;

FIGURA 8-10. Trocar de Jamshidi utilizadopara la realizacin de la biopsia sea.



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ambas tcnicas consiguen eliminar el dolor que provoca el avance del trocar enla cavidad medular y que solo con anestesia local no se consigue anular. Los dosprocedimientos requieren la presencia de un anestesista. La sedacin endovenosase efecta con hipnticos tipo midazolam, propofol u opioides como alfentanilo

o remifentanilo (analgsicos -receptores potentes de vida media corta). Lautilizacin de estos frmacos hace necesaria la monitorizacin del paciente.La analgesia espinal se consigue mediante puncin lumbar, utilizando un anestsi-co local (bupivacan a en dosis analgsicas) asociado o no a un opioide liposolubletipo fentanilo o sufentanilo.

3. Se imprimen al trocar movimientos de rotacin y de presin hasta conseguirperforar la cortical del hueso. En este momento, el trocar queda anclado en lacresta ilaca.

4. Se extrae el mandril y se continan los movimientos de rotacin-presin, porlo que el cilindro medular, que va cortndose por el extremo distal del trocar, se

introduce poco a poco en el interior del mismo. La aguja penetra hasta unos 3 cmde profundidad.

5. Antes de proceder a la retirada de la aguja, se imprimen a esta movimientos lateralesalgo enrgicos (deflexin) con el fin de romper la base del cilindro medular quelo mantiene unido al resto del hueso. Seguidamente, se hunde algo ms la agujacon el fin de conseguir que el cilindro seo cortado quede bien introducido en eltrocar y luego se procede a su extraccin. En caso de utilizar los equipos con unsistema de atrapa muestras (especialmente los de pieza adicional, que son los msusuales), una vez finalizado el corte del hueso, se introduce el capturador hasta elfondo, y se imprimen al trocar un par de vueltas de 360 y acto seguido se procedea la extraccin. Como los movimientos de deflexin se evitan en esta modalidad,la tcnica gana en comodidad para el enfermo, as como en seguridad, puesto queno es excepcional que en huesos muy duros la maniobra de deflexin comporteel riesgo de rotura del trocar y la porcin enclavada quede insertada en la crestailaca.

6. El cilindro se obtiene mediante la introduccin del expulsor en el interior deltrocar, al ejercer una ligera presin (fig. 8-11).

7. Procesamiento del cilindro seo:(a) Se introduce la pieza en lquido fijador (Bouin-Holanda) durante 24 h. Se

lava con H2O del grifo un mnimo de 5 min. Si se introduce un fragmento

FIGURA 8-11. Cilindro seoobtenido por puncin con trocar.



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del cilindro seo en formaldehdo como lquido fijador es posible, sobre esamuestra as fijada, efectuar tcnicas de biologa molecular.

(b) Se descalcica la misma con cido ntrico al 10% durante 24 h.(c) Se lava durante 5-10 min con agua del grifo y se sumerge el cilindro en lquidocon capacidad creciente de deshidratacin (tabla 8-4). El cilindro, despus deestos pasos, adopta un aspecto translcido. De no ser as, debe permaneceren el ltimo paso por tolueno 1 h ms.

(d) Se introduce el cilindro as preparado en un bloque de parafina (cuadro 8-3),que permitir la obtencin de cortes de la pieza mediante un micrtomo. Elgrosor de los cortes debera ser de 1-2 (m). Sin embargo, la inclusin enmaterial de plstico presenta algunas ventajas frente a la inclusin en parafina:a) no requiere descalcificacin (de esta manera se evita la accin corrosiva

del cido ntrico y, por tanto, se conserva mejor el tejido medular), y b) laretraccin del cilindro es mnima. En contrapartida, esta tcnica presentatambin algunos inconvenientes:(i) Es relativamente prolongada y requiere gran meticulosidad en su rea-

lizacin.(ii) Una vez realizada la inclusin, no es posible retroceder para recuperar

el cilindro entero.(iii) La polimerizacin que deben sufrir algunos tipos de plstico debido a

su carcter exotrmico (desprendimiento de calor) puede desnaturalizarlos componentes del cilindro seo.

(iv) Requiere un micrtomo especial capaz de cortar piezas muy duras,por tanto, su coste suele ser elevado.

TABLA 8-4. Pauta para deshidratar el cilindro

Lquido Tiempo

Alcohol de 96 45 minAlcohol de 96 (renovado cada vez) 45 minAlcohol de 99 45 minAlcohol de 99 (renovado cada vez) 45 minTolueno 45 minTolueno (renovado cada vez) 1 h

CUADRO 8-3. Inclusin del cilindro en parafina

Inmersin en parana a 60 durante 1 h Inmersin en nueva parana durante 2 h En el molde metlico que servir para realizar el bloque de parana se pone 1 ml

de parafina fundida

Se deposita el cilindro y se coloca encima una pieza de plstico (casete), que lleva elnmero de identificacin de la muestra, la cual se acaba de rellenar con parafina fundida Se deposita la placa fra hasta la solidicacin total (el bloque queda constituido

por el casete ms la parafina slida y la muestra) Los cortes obtenidos del micrtomo se extienden en un bao de agua a 45 C y se

seleccionan cogindolos con portaobjetos que se colocan en estufa a 67 C (30 min)



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(v) La utilizacin de marcadores monoclonales, si bien es posible, es msrestringida que en las muestras incluidas en parafina.

8. Tincin del cilindro seo: para la observacin del conjunto de clulas y trabculasse emplea la tincin de hematoxilina-eosina (cuadro 8-4). Otras tinciones comola impregnacin argntica (cuadro 8-5), que visualiza las fibras de reticulina,o la del tricrmico de Masson (cuadro 8-6), que permite visualizar las fibras decolgeno, son de gran utilidad, junto a la de hematoxilina-eosina, para la mejorinterpretacin y diagnstico de los diferentes trastornos medulares.

Sistemtica para el examen histolgico de la mdula sea y su interpretacin

Antes de empezar el examen histolgico de mdula sea deben tenerse presente algunosaspectos importantes: Solo en un 20%, aproximadamente, de los aspirados y en un 3% de las biopsias se

obtiene material insuficiente para la interpretacin del resultado.

CUADRO 8-4. Desparafinado y tincin de hematoxilina-eosina de los cortes

Desparafinado

Se introduce el portaobjetos con los cortes en: Xileno: 5 min Xileno: 5 min Xileno: 5 min Alcohol absoluto: 5 min Alcohol absoluto: 5 min Alcohol absoluto: 3 min Alcohol de 96: 3 min Alcohol de 96: 3 min Alcohol de 96: 3 minSe lava con agua corriente o agua bidestilada

Tincin de hematoxilina-eosina 1. Hematoxilina de Harris (preparado comercial): 5 min 2. Se lava con agua corriente 3. cido actico al 1%: 4-5 s 4. Se lava con agua corriente 5. Alcohol litiado: 4-5 s. Alcohol de 96 + una punta de cuchara de carbonato de litio 6. Eosina alcohlica: 5 min 7. Se pasa por alcohol de 96 8. Se pasa por alcohol de 96 9. Se pasa por alcohol de 9610. Se pasa por alcohol absoluto11. Se pasa por alcohol absoluto12. Se pasa por alcohol absoluto13. Se pasa por xileno14. Se pasa por xileno15. Se pasa por xileno16. Se pasa por xileno17. Se pasa por xileno18. Se monta la preparacin con DPX de inmediato (sin dejar que se evapore el xileno)



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CUADRO 8-5. Impregnacin argntica (reticulina de Gordon-Sweet)

Solucin A (bao argntico de Wilder)

Nitrato de plata: 1 g. Agua destilada: 10 ml Hidrxido sdico: 0,3 g. Agua destilada: 10 ml

Se toman 5 ml de solucin de nitrato de plata; se aade amonaco gota a gota hastaque el precipitado casi se disuelva. Se precipita de nuevo la solucin con 5 ml de hidrxidosdico y, a continuacin, amonaco gota a gota hasta que la solucin quede clara.

Se completa con agua destilada hasta 50 ml.

Solucin B

Cloruro de oro: 0,02 g Agua destilada: 10 ml

Solucin C

cido oxlico: 0,5 g Agua destilada: 10 ml

Solucin D

Alumbre de hierro: 0,2 g Agua destilada: 10 ml

Solucin E

Tiosulfato sdico: 0,5 g Agua destilada: 10 ml

Solucin F

Permanganato potsico: 0,5 g. Agua destilada: 100 ml cido sulfrico al 3%

Se mezclan 47,5 ml de la primera con 2,5 de la segunda

Solucin G

Formol al 10%: 100 ml

Mtodo

1. Se parte de los cortes desparafinados (v. cuadro 8-4, Desparafinado) 2. Se oxida con permanganato potsico (solucin F) durante 5 min 3. Se lava en agua destilada

4. Se blanquea con cido oxlico durante 1 min 5. Se lava en tres cambios de agua destilada 6. Se trata con mordiente de alumbre de hierro en solucin acuosa al 2% durante 30 min 7. Se lava bien en dos cambios de agua destilada 8. Se trata con el bao argntico de Wilder durante unos segundos 9. Se lava en agua destilada10. Se trata con formol al 10% durante 10 min11. Se lava en agua. Si los cortes aparecen poco impregnados, se repite desde el paso 712. Se contrasta suplementariamente con cloruro de oro al 0,2% durante 5 min13. Se lava en agua destilada14. Se fija con tiosulfato sdico durante 10 min

15. Se lava con agua destilada16. Se deshidrata y se monta (siguiendo los pasos 7 a 18 del cuadro 8-4)



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La biopsia es el nico examen que ofrece una imagen en perspectiva de la situacinde la cavidad medular. El aspirado realiza el anlisis de las clulas de un punto con-creto de la mdula y, por tanto, nunca puede ofrecer una visin global del estado dela celularidad hematopoytica ni de la arquitectura medular.

La relacin celularidad/grasa vara con la edad y mientras en una persona joventodas las cavidades medulares contienen un predominio de clulas sobre la grasa, enindividuos adultos sucede lo contrario; este hecho es especialmente evidente en losancianos.

La mdula sea subcortical es ms pobre en clulas que la situada en otras regiones.

La biopsia no debe repetirse en el mismo sitio hasta pasado ms de 1 mes y no puedeutilizarse para realizar otros estudios que no sean de ndole histoqumica. La mdula sea hematopoytica est albergada entre la cortical sea y las trabculas

del hueso esponjoso (fig. 8-12).En la lectura de una BMO hemos de considerar los siguientes apartados:

Trabculas seas:derivan de la cortical. En la superficie externa se observan losconductos vasculares de Havers y el periostio. Es importante valorar siempre el grosorde estas trabculas, que puede hallarse aumentado o disminuido. En el interior delas mismas podemos observar los osteocitos; se pueden ver adosados a las trabculasseas los osteoblastos, que son clulas encargadas de la sntesis sea endostal. Los

osteoclastos o clulas encargadas de la reabsorcin sea se observan rara vez en el

CUADRO 8-6. Tricrmico de Masson

1. Se parte de los cortes desparafinados (v. cuadro 8-4, Desparafinado) 2. Solucin de cido pcrico o Bouin: 30 min

3. Se lava en agua corriente hasta que se decolora 4. Hematoxilina de Gills II o de Harris: 5 min 5. Se lava en agua corriente 6. Solucin de Ponceau-Fucsina: 5 min 7. Se lava en agua corriente 8. Solucin de cido fosfomolbdico: 10 min 9. Solucin de verde luz o azul de anilina: 5 min10. Se lava en agua corriente11. Se deshidrata y se monta (siguiendo los pasos 7 a 18 del cuadro 8-4)

FIGURA 8-12. Imagen de unabiopsia sea normal (HE, 400).



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hueso normal, y se trata de clulas de gran tamao polimorfonucleadas y albergadasen huecos de la trabcula sea, llamadas lagunas de Howship. Entre las trabculas seencuentran las clulas hematopoyticas, separadas entre s por clulas grasas (cavidadmedular).

Cavidad medular:Se encuentra entre las trabculas y en ella debe valorarse funda-mentalmente lo siguiente: Vascularizacin. Los vasos medulares contribuyen en gran manera a mantener

el armazn del estroma medular. Pueden ser de cuatro tipos: arteriolas, vnulas,capilares arteriales y sinusoides medulares.

Celularidad hematopoytica. Est constituida por las tres series hematopoyticas:eritropoytica, granulomonocitopoytica y trombocitopoytica. Tambin seobservan algunas clulas plasmticas y linfocitos. Los linfocitos pueden aparecer deforma dispersa, junto al resto de las clulas hematopoyticas o formando folculos(ms frecuentes en el anciano) de pequeo o mediano tamao, que se sitan hacia

el centro de la cavidad. Estos folculos se diferencian de los de los ganglios linfticosen que carecen de centro folicular claro.

Clulas grasas. Son relativamente abundantes y se encuentran junto a las clulashematopoyticas. El contenido en adipocitos del hueso medular aumenta con laedad. Al analizar la celularidad de un cilindro seo, es muy importante establecerla relacin entre la celularidad hematopoytica propiamente dicha y la grasa. En laaplasia medular, la celularidad hematopoytica se halla intensamente disminuidaal ser sustituida total o parcialmente por clulas grasas (relacin celularidad/grasa disminuida). Por el contrario, en los sndromes mieloproliferativos o hiper-regenerativos, las clulas hematopoyticas desplazan las clulas grasas y las hacendesaparecer tambin parcial o totalmente (relacin celularidad/grasa aumentada).

Armazn de reticulina. El armazn de fibras de reticulina constituye un entramadofibrilar que va de la adventicia de las arteriolas medulares al endostio y que, junto a lasclulas del estroma, proporciona el soporte necesario a las clulas hematopoyticas.Este armazn solo puede ser apreciado mediante la impregnacin argntica. Encondiciones normales es prcticamente invisible, pero puede aumentar en la mielofi-brosis primaria, o secundaria, en el curso de diferentes hemopatas o enfermedadesdiversas, con repercusin sobre el tejido hematopoytico (metstasis carcinomatosa).

Interpretacin del examen histolgico de la mdula sea (biopsia sea)

La biopsia de mdula sea (BMO) constituye siempre una prueba, a veces indispensable ycomplementaria, del examen morfolgico de la mdula sea y sangre perifrica. En rea-lidad, cuando se requiere una biopsia sea, su examen nunca debe realizarse de formaindividualizada o independiente, sino siempre junto al examen morfolgico del aspirado(o impronta obtenida del cilindro), el de sangre perifrica y la informacin clnica del pacien-te (fig. 8-13). Su utilidad prctica resulta especialmente evidente en aquellas situacionescaracterizadas por un aspirado insuficiente o sin clulas (aspirado blanco o dry-tap,de laterminologa anglosajona). En estos casos, la prctica de una biopsia sea es obligada parapoder hacer el diagnstico. Fuera de aquellos raros casos de leucemia aguda sin expresi-

vidad perifrica y con mdula empaquetada, la biopsia sea permite distinguir fcilmenteentre una pancitopenia debida a una aplasia de mdula sea de una debida a mielofibrosisidioptica. Ambas situaciones pueden cursar con una expresividad hemoperifrica bas-tante similar, pero su patrn histolgico es diametralmente distinto. Mientras que en laprimera se aprecia una ausencia prcticamente total de la celularidad hematopoyticanormal y sustitucin por clulas grasas (fig. 8-14), en la segunda se aprecia un patrn



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hipo- o hipercelular con desaparicin prcticamente total de las clulas grasas y sustitucinpor una densa trama de fibras de reticulina y colgeno que constituye una imagen muy

caracterstica (fig. 8-15). La tincin de reticulina acaba de confirmar el diagnstico demielofibrosis (fig. 8-16). La biopsia no solo tiene inters diagnstico en hematologa,sino que constituye una herramienta extraordinariamente til para la valoracin inicialde la enfermedad, como sucede en pacientes afectados de linfoma de Hodgkin y otrostipos de linfomas no hodgkinianos o para el seguimiento del curso de la enferme-dad, especialmente despus de iniciar el tratamiento. Un ejemplo de esta situacin lo

FIGURA 8-14. Biopsia sea. Patrnhistolgico hipocelular de un pacientecon aplasia de mdula sea (HE 40).

FIGURA 8-13. Los tres procedimientos bsicos de laboratorio para el diagnstico de las enfermedades dela sangre: los frotis de sangre perifrica y mdula sea teidos con MGG, y la biopsia de mdula sea teidacon hematoxilina-eosina.



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FIGURA 8-15. Biopsia sea. Patrnhistolgico hipercelular con intensafibrosis en un caso de mielofibrosisidioptica.

encontramos en la leucemia linftica crnica (fig. 8-17), y el linfoma folicular (fig. 8-18).Finalmente, la biopsia sea puede ser tambin de utilidad diagnstica en enfermedadesno hematolgicas como, por ejemplo, tumores malignos primarios y metastsicos,enfermedades granulomatosas y fiebre de origen desconocido, que en ocasiones puedenacompaarse de punciones blancas. Como tcnicas complementarias a la biopsiasea destaca la histoqumica e inmunohistoqumica que emplea anticuerpos mono-clonales. Al igual que sucede con las extensiones de sangre perifrica y mdula sea, loscortes histolgicos de mdula sea pueden ser sometidos a una reaccin inmunohis-toqumica mediante anticuerpos monoclonales (AM) contra determinadas poblaciones

celulares, como por ejemplo para conocer la estirpe celular de una infiltracin linfoidemediante la utilizacin de los AM CD13 (especfico de lnea T) y CD20 (especficode lnea B). La muestra histolgica de leucemia linftica crnica representada en lafigura 8-17puede ser tratada con anti-CD20 y anti-CD3, demostrando, de esta manera,que la infiltracin linfoide es mayoritariamente B (fig. 8-19) con muy escasas clulas T(fig. 8-20), respectivamente.

FIGURA 8-16. Biopsia sea.Tincin mediante el mtodo de laimpregnacin argntica para ponerde manifiesto las fibras de reticulinaen un caso de mielofibrosis idiopticaacompaado de intensa fibrosisreticulnica.



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FIGURA 8-18. Biopsia sea.Afectacin de la mdula sea en unpaciente con linfoma folicular. Patrnhistolgico nodular con abundantesfolculos linfoides de mediano y grantamao, situados en los espaciosintertrabeculares, aunque tambinse aprecia infiltracin linfoideparatrabecular.

FIGURA 8-19. Biopsia sea conmarcada infiltracin linfoide de lnea B,intensamente positiva para elanticuerpo monoclonal anti-CD20.

FIGURA 8-17. Biopsia sea.Afectacin de la mdula sea en unpaciente con leucemia linftica. Patrnhistolgico de infiltracin difusa porlinfocitos de aspecto maduro.



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CULTIVOS DE PROGENITORES HEMATOPOYTICOS

Introduccin

Los cultivos in vitrode progenitores hematopoyticos, desarrollados a principios de losaos setenta, han permitido mejorar considerablemente nuestro conocimiento sobrela hematopoyesis humana. As, han contribuido a demostrar la existencia de una clulamadre pluripotencial (stem-cell)con capacidad de autorreplicacin que, en su proceso

de diferenciacin, se transforma en un progenitor hematopoytico comprometido haciauna lnea celular determinada. Ello puede evidenciarse por su capacidad de producircolonias.

Desde los primeros trabajos hasta hoy, ha habido un incremento en el nmerode precursores hematopoyticos que puede detectarse en un laboratorio, si biense realizan, fundamentalmente, determinaciones de colonias granulomacrofgicas(CFU-GM), eritroblsticas (CFU-E, BFU-E), mixtas (CFU-GEMM) y megacarioc-ticas (CFU-Meg).

El procesamiento de un cultivo consta, bsicamente, de una fase inicial de separacincelular y posterior suspensin de las clulas en un medio de cultivo semislido (metilce-

lulosa o agar, fundamentalmente), al que se aaden distintos factores estimuladores delcrecimiento en funcin de la lnea celular que se investiga. Tras un perodo de incubacin,el examen al microscopio invertido nos permitir la caracterizacin e identificacin delas colonias obtenidas.

Metodologa clsica

Material fungible

Matraces Erlenmeyer de 1 y 2 l. Frascos de cristal de 100 ml de boca ancha. Placas de cultivo Greiner de 30 mm de dimetro. Placas de cultivo Greiner de 150 mm de dimetro. Tubos Falcon estriles de 13 ml. Tubos Falcon estriles de base cnica de 50 ml. Filtros Millipore, 0,22 m, de 25 mm de dimetro.

FIGURA 8-20. Biopsia seacon infiltracin linfoide de lnea T,intensamente positiva para elanticuerpo monoclonal anti-CD3.



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Filtros Corning, 0,22 m, de 200 ml de capacidad. Jeringas de insulina. Jeringas de 20 y 2 ml. Agujas Becton Dickinson, 181/2G. Recipientes Unopettes para recuento de leucocitos 1/20. Pipetas Pasteur de plstico. Pipetas de plstico estriles de 5 y 10 ml.

Reactivos

Metilcelulosa Fluka. Medio Iscove en polvo (IMDM) (con glutamina, sin NaHCO

3) Gibco.

Medio Iscove lquido (IMDM) (con glutamina) Gibco. Medio Hanks sin Ca2+, ni Mg2+ni rojo de fenol.

Ficoll-Hypaque, 1,077 g/cm

3

. Albmina bovina desionizada (BSA). Suero fetal de ternera (FCS). Bicarbonato sdico (NaHCO

3).

Agua destilada estril para cultivos celulares Gibco. 2-mercaptoetanol. Factor estimulador de colonias granulomonocticas recombinante humano:

GM-CSF rh. Interleucina 3 recombinante humana: IL-3 rh. Eritropoyetina recombinante humana: EPO rh.

Instrumental

Cabina de flujo laminar vertical. Incubador de CO

2.

Microscopio invertido. Microscopio convencional. Agitador de tubos Vrtex. Bomba de vaco. Cmara de Neubauer. Pipetas automticas Gilson P-1000, P-200, P-20 y P-10. Pipeteador automtico. Agitador magntico y recogeagitador.

Preparacin de la metilcelulosa

1. Se pesan 20 g de metilcelulosa en papel de aluminio y se deja toda la noche bajola luz ultravioleta.

2. A la maana siguiente, se toma un Erlenmeyer estril de 2 l de capacidad y seaaden 500 ml de agua bidestilada para cultivos celulares dentro de la cabina.Se cubre con un tapn de algodn y gasa estril, y se hierve al bao mara (fuera

ya de la cabina). 3. Cuando el agua hierva, se retira del bao mara y se aade la metilcelulosa dentrode la cabina. Se agita suavemente sin agitador hasta que no se aprecien grumos.

4. Se deja de nuevo al bao mara durante 1 h. 5. Mientras la metilcelulosa hierve, se disuelve un frasco de medio de cultivo Is-

cove en polvo en 500 ml de agua bidestilada especial para cultivos y se agita



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suavemente (si bien posteriormente se filtrar, es mejor realizarlo tambin bajola cabina).

6. Se aaden 3,024 g de NaHCO3al medio resuspendido y se mueve suavemente

sin agitador procurando eliminar todos los agregados de bicarbonato.

7. Se deja bajo la cabina durante 1 h y, a continuacin, se esteriliza con los filtrosCorning.

8. Despus de que la metilcelulosa haya hervido durante 1 h, se aade bajo la cabinaun agitador magntico. Se deja agitando durante 2 h a temperatura ambiente.

9. Pasadas las 2 h, se aade el medio con el bicarbonato filtrado y se deja agitando4 h a temperatura ambiente.

10. Se deja toda la noche agitando en el frigorfico a 4 C.11. A la maana siguiente, se dosifica en frascos estriles de 100 ml de boca ancha.12. Se congela a 20 C procurando que los frascos queden derechos. Se pueden

conservar durante 1 ao.

Dosificacin de los reactivos

Suero fetal de ternera (FCS)

1. Se descomplementa a 56 C durante 30 min al bao mara y se filtra.2. Se dosifican los volmenes de 45 ml en tubos Falcon de 50 ml.3. Se conserva a 20 C.Es necesario probar al menos cuatro lotes diferentes de FCS para asegurar el xito de los

cultivos, pues mientras que unos lotes favorecen el crecimiento, otros lo inhiben por completo.

Albmina bovina (BSA)Es mejor utilizar BSA desionizada.

1. Se filtra y se dosifica en tubos Falcon de 50 ml, a unos volmenes de 20 ml.2. Se conserva a 4 C.

Medio de cultivo

1. Se preparan para cada frasco de 100 ml cinco tubos Falcon cnicos de 50 ml y seaade a cada uno de ellos:(a) 20 ml de la mezcla de metilcelulosa y medio de cultivo con jeringas de 20 ml

sin aguja.(b) 8 ml de FCS previamente descomplementado (al bao mara a 56 C durante

30 min).(c) 4 ml de BSA.

2. Se agita vigorosamente con un Vrtex y se deja reposar unos minutos.3. Se preparan 100 tubos Falcon de 13 ml estriles y se aaden 2 ml por tubo de la

mezcla anterior. La concentracin final de los diferentes componentes ser:(a) Metilcelulosa: 1,1%.(b) FCS: 20%.(c) Albmina bovina: 1%.

4. Se agitan de nuevo, se colocan en gradillas y se conservan a 20 C.2-mercaptoetanol

1. Se prepara una concentracin de 5 mM.2. Se filtra.3. Se dosifica en tubos Eppendorf estriles de 0,5 ml en volmenes de 30l.



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Eritropoyetina recombinante (EPO rh)

1. Se resuspende con agua bidestilada estril para cultivos celulares y se dosifica entubos de Eppendorf de 0,5 ml una concentracin de 500 U/ml.

2. Se conserva a 20 C.

Factor estimulador de colonias granulomonocticas (GM-CSF rh)

1. Se resuspende con agua bidestilada estril para cultivos celulares y se diluye conIMDM +10% BSA hasta conseguir una concentracin de 10.000 ng/ml.

2. Se dosifican volmenes de 30l en tubos Eppendorf de 0,5 ml.3. Se conserva a 20 C.

Interleucina 3 recombinante (IL-3 rh)

1. Se diluye con (IMDM + 10% BSA) hasta conseguir una concentracin nal de1.000 U/ml.2. Se dosifica en volmenes de 30l.3. Se conserva a 70 C.

Medio de dilucin

1. Se prepara en tubos Falcon de 50 ml una mezcla de medio Iscove lquido su-plementado con el 20% de FCS descomplementado.

2. Se agita y se dosifican volmenes de 1,5 ml en tubos Falcon de 13 ml.

3. Se colocan en gradillas y se conservan a 20 C.Medio para el lavado de las clulas

1. Se prepara en tubos Falcon de 50 ml una mezcla de medio Hanks suplementadocon el 10% de FCS descomplementado.

2. Se agita y se dosifica en volmenes de 30 ml.3. Se conserva a 20 C.

Mtodo (cultivo in vitrode clulas hematopoyticas)

Recogida y procesamiento de la muestra

1. Se recoge 1 ml de mdula sea en un tubo de 13 ml que contenga 5 ml de medioIscove lquido y 1.000 U de heparina sdica.

2. Se aaden, a otro tubo de la misma capacidad, 3 ml de ficoll. Se deposita cuida-dosamente con una pipeta Pasteur de plstico la mezcla anterior sobre la capa deficoll. Es necesario que los componentes estn a temperatura ambiente, pues ladensidad del ficoll vara con la temperatura.

3. Tambin podemos partir de una muestra de sangre perifrica. En este caso,se diluyen 10 ml de sangre perifrica anticoagulada con heparina sdica hasta40 ml con solucin de Hanks en un tubo de plstico de 50 ml. Se depositan

10 ml de ficoll en la base del tubo con cuidado para que no se mezcle con lamuestra.4. Se centrifuga a 400 g durante 30 min a 25 C.5. Se recoge la capa de clulas mononucleadas y se efectan tres lavados de 10 min

a 800 g y a 4 C con el medio de lavado.



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6. Despus del ltimo lavado, se resuspende el paquete celular y se efecta el recuentode clulas.

7. Se ajusta la concentracin celular a 5 105cl./ml con el medio de dilucin.

Montaje de cultivo1. Se extraen, para cada muestra, dos tubos de medio de cultivo. Como se conservan

a 20 C, es conveniente sacarlos durante los lavados para que se vayan des-congelando.

2. Se aade a cada tubo:(a) Concentracin final/placa(b) 20 l de EPO rh a 500 U/ml = 4 U/ml(c) 25 l de GM-CSF rh a 10.000 U/ml = 100 ng/ml(d) 25 l de IL-3 rh a 1.000 U/ml = 10 U/ml(e) 25 l de 2-mercaptoetanol a 5 10-3M = 5 10-5M(f) 500 l de suspensin celular 5 105l/ml = 1 105cl./ml

3. Se agita vigorosamente con el Vrtex y se deja reposar unos minutos.4. Se preparan dos placas de Petri para cada tubo, de 30 mm de dimetro, y se

aade, mediante una jeringa de insulina provista de una aguja de 181/2G, 1 mldel contenido del mismo.

5. Se reparte uniformemente por toda la base de la placa procurando que no quedenburbujas de aire.

6. Se colocan las dos placas, y tres con el mismo volumen de agua en el interior deuna placa de Petri de 150 mm de dimetro.

7. Se incuba a 36,5 C al 5% de CO2y al 98% de humedad durante 14 das.Recuento de colonias

El recuento de colonias se efecta los das 7 y 14 de incubacin mediante un micros-copio invertido; se considera como agregado la agrupacin de 20 a 50 clulas y colonia,la agrupacin de ms de 50 clulas. El resultado se expresa en nmero de colonias/105clulas sembradas. CFU-E (unidad formadora de colonias eritroides): aparecen el da siete de incubacin

(D7) y estn constituidas por eritroblastos.

BFU-E (unidad formadora de bursteritroides). CFU-GM (unidad formadora de colonias granulomonocticas). CFU-GEMM (unidad formadora de colonias granulomonocticas, megacariocticas

y eritroides).

Metodologa utilizando medios comerciales

En la actualidad, pueden adquirirse medios semislidos preparados para hacer losestudios del crecimiento de colonias hematopoyticas. Estos medios comercialescontienen metilcelulosa preparada en medio Iscove MDM, suero fetal de ternera,albmina bovina, 2-mercaptoetanol y otros suplementos (p. ej., MethoCult). Es-

te medio debe ser conservado a 20 C en alcuotas, tal y como se ha indicado enapartados anteriores.En el momento de realizar el cultivo, aparte del nmero necesario de clulas, se

aadirn los factores estimuladores (EPO, GM-CSF) de la formacin de las coloniasque se quieran analizar.



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Interpretacin del resultado y utilidad diagnstica de los cultivos

Las colonias obtenidas con esta tcnica son las siguientes: CFU-E, BFU-E, CFU-GM yCFU-Meg.

Las CFU-E aparecen, aproximadamente, tras 7 das de incubacin; estas co-lonias son pequeas agrupaciones de eritroblastos y se caracterizan por su coloranaranjado debido a un ligero acmulo de hemoglobina en sus clulas (fig. 8-21).A medida que avanza el perodo de incubacin, van desapareciendo y proliferanotras de mayor tamao, las BFU-E; estas colonias estn formadas por miles de eri-troblastos en distintos estadios de maduracin y se identifican fcilmente por suaspecto compacto e intensamente coloreado (fig. 8-22). Las CFU-GM aparecenentre los das 10 y 14 y estn constituidas por una mezcla de clulas granuloc-ticas y macrfagos; se identifican fcilmente por su aspecto plano y translcido(fig. 8-23). Finalmente, aunque no muy frecuente, es tambin posible obtener las

denominadas CFU-GEMM que poseen, generalmente, la apariencia de un huevofrito, con una zona central intensamente hemoglobinizada y compacta, rodeadade una regin constituida por clulas ms translcidas. En general, las BFU-E,CFU-GM y CFU-GEMM suelen contarse tras 14 das de incubacin. Los cultivosde progenitores mieloides han demostrado ser tiles para estudiar la potencialidad delos progenitores de sangre de cordn umbilical conservados. Por otro lado, elcrecimiento de colonias eritroides en cultivos en ausencia de EPO se utiliza comocriterio menor en el diagnstico de la policitemia vera.

FIGURA 8-22. Imgenes decolonias obtenidas mediantecultivo de progenitores

hematopoyticos (cultivo invitrode mdula sea o sangreperifrica). BFU-E, unidadformadora de brotes eritroidestardos; CFU-E, unidad formadorade colonias eritroides precoces.

FIGURA 8-21. Unidad formadorade colonias eritroides (CFU-E, 10 10).



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FIGURA 8-23. Cultivo in vitrode mdula sea o sangre perifrica.CFU-GM, unidad formadora decolonias granulomonocticas.

Las colonias de megacariocitos son de menor inters clnico y muestran una aparien-cia caracterstica (fig. 8-24).

FIGURA 8-24. Cultivo in vitrode mdula sea o sangre perifrica.CFU-M, unidad formadora decolonias megacariocticas.



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Captulo 8 Mtodos para el estudio de la mdula sea 231.e1

Autoevaluacin

1. El tejido donde se originan las clulas de la sangre es:(a) El bazo.(b) El timo.

(c) Los ganglios linfticos.(d) La mdula sea.(e) El hgado.

Respuesta correcta: d.Respuesta razonada: la mdula sea es el tejido donde se originan los elementos formes de lasangre. En el nio, la mdula sea ocupa la cavidad esponjosa de prcticamente todos sus huesos,pero con el desarrollo, parte de ella es reemplazada por tejido graso, quedando finalmentereducida a unas zonas concretas tales como el crneo, el esqueleto axial (columna vertebral) yla epfisis de los huesos largos.2. La diseritropoyesis es una forma de expresar la siguiente alteracin:

(a) Aumento de eritropoyesis.(b) Eritropoyesis fetal.(c) Maduracin anmala de los eritroblastos.(d) Falta de factores de maduracin nuclear.(e) Ninguna de las anteriores.

Respuesta correcta: c.Respuesta razonada: existen ciertas formas de anemia arregenerativa, tales como las diseritropo-

yesis congnitas o adquiridas, en las que se observan alteraciones cualitativas de los eritroblastosque afectan tanto al ncleo (binuclearidad, alteraciones de la cromatina, puentes internucleares)como al citoplasma (aumento de tamao, hemoglobinizacin irregular, presencia de materialcromatnico o depsitos abundantes de ferritina).

3. La biopsia de mdula sea es un complemento diagnstico en hematologa, especialmentepara establecer el diagnstico diferencial entre:(a) Sndrome inflamatorio crnico y sndrome mielodisplsico.(b) Insuficiencia medular y leucemia aguda.(c) Gammapata monoclonal y mielofibrosis idioptica.(d) Aplasia de mdula sea y mielofibrosis idioptica.(e) Ninguna de las anteriores.

Respuesta correcta: d.Respuesta razonada: la biopsia de mdula sea, o biopsia medular (BM), constituye en la actua-lidad un procedimiento complementario de indudable inters diagnstico en hematologa y, enalgunos casos, decisivo para el establecimiento definitivo del mismo. As, por ejemplo, es la nica

exploracin que nos permite establecer el diagnstico de extensin de los linfomas y conocer lascaractersticas de su patrn invasivo, fundamental para iniciar la conducta teraputica adecuada.4. Un aumento significativo de linfocitos en la mdula sea hipercelular es orientativo de:

(a) Leucemia linftica crnica.(b) Aplasia de mdula sea.(c) Enfermedad de Wilson.(d) Infeccin por HIV.(e) Todas las anteriores.

Respuesta correcta: a.Respuesta razonada: la linfocitosis medular debe valorarse siempre en relacin a la clnica general

y a la celularidad global, ya que puede observarse en dos situaciones completamente diferentes.

5. La potencialidad regenerativa de una mdula sea depende del nmero y funcionalidad delas clulas madre. Para poder conocer si el sistema hematopoytico responde correctamentea los estmulos de las citocinas suele utilizarse el siguiente procedimiento:(a) Anlisis citogentico del aspirado medular.(b) Cultivos in vitrode progenitores hematopoyticos.(c) Estudio inmunofenotpico del aspirado medular mediante anticuerpos monoclonales.



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Manual de tcnicas de laboratorio en hematologa231.e2

(d) Anlisis morfolgico mediante microscopia confocal.(e) Son correctas a y c.

Respuesta correcta: b.Respuesta razonada: los cultivos in vitrode progenitores hemopoyticos, han permitido mejorarconsiderablemente nuestro conocimiento sobre la hemopoyesis humana. As, han contribuidoa demostrar la existencia de una clula madre pluripotencial (stem-cell)con capacidad de auto-rreplicacin que, en su proceso de diferenciacin, se transforma en un progenitor hemopoyticocomprometido hacia una lnea celular determinada.6. En qu procedimiento diagnstico hematolgico se utiliza el microscopio invertido?

(a) Anlisis de la relacin entre linfocitos B y T.(b) Como complemento a la citometra de flujo.(c) En el examen morfolgico y recuentro de colonias hematopoyticas.(d) En el recuento de cromosomas.(e) En todas las anteriores.

Respuesta correcta: c.

Respuesta razonada: un microscopio invertido es un microscopio que est al revs comparadocon uno convencional. La fuente de luz y el condensador estn sobre la plataforma apuntandohacia abajo. Los objetivos y la torrecilla estn debajo de la plataforma apuntando hacia arriba. Lasnicas cosas que estn en disposicin corriente son el tubo binocular o trinocular, as como lamuestra, que es colocada sobre la plataforma o platina mecnica. Con un microscopio invertidose pueden observar cultivos de precursores hematopoyticos bajo forma de colonias que puedenser de tres tipos: granulomonopoyticas, eritroides o de megacariocitos. La observacin se realizaa travs de las bases de diferentes recipientes con espesores y caractersticas pticas variables,utilizndose, en general, material de plstico.7. En la actualidad, los cultivos de mdula sea son especialmente utilizados para:

(a) Analizar la potencialidad de los progenitores hematopoyticos.

(b) El diagnstico diferencial de los sndromes mieloproliferativos.(c) El diagnstico de la policitemia vera.(d) La capacidad funcional de la sangre conservada para transfusin.(e) Son correctas b y c.

Respuesta correcta: c.Respuesta razonada: los cultivos de progenitores mieloides han demostrado ser tiles para es-tudiar la potencialidad de los progenitores de sangre de cordn umbilical conservados. Por otrolado, el crecimiento de colonias eritroides en cultivos en ausencia de EPO se utiliza como criteriomenor en el diagnstico de policitemia vera.8. En general las clulas del tejido hematopoytico se clasifican en tres tipos: clula madre

pluripotente (stem-cell),progenitores y precursores. Los precursores pueden ser identificados

fcilmente mediante:(a) Cultivos in vitrode progenitores hematopoyticos.(b) Anlisis inmunofenotpico mediante citometra de flujo.(c) Fosfatasa alcalina granulocitaria.(d) Examen morfolgico convencional mediante tincin del aspirado de mdula sea con

May-Grnwald/Giemsa (MGG).(e) Todas las anteriores.

Respuesta correcta: d.Respuesta razonada: las clulas que normalmente se hallan en la mdula sea son de variostipos, pero todas ellas derivan de una nica clula madre. Un primer grado de diferenciacinda lugar a los llamados progenitores comprometidos para una determinada lnea celular, cuyaestirpe no es an reconocible morfolgicamente, por lo que deben ser explorados mediantemtodos indirectos, como, por ejemplo, los cultivos in vitrode mdula sea. El estudio de lamdula sea puede realizarse a nivel morfolgico y funcional. El nivel morfolgico consiste enel examen microscpico de los precursores hematopoyticos, que son clulas ya reconociblesmorfolgicamente como pertenecientes a una determinada estirpe celular.



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9. Una puncin blanca es aquella en la que se obtiene el siguiente material aspirado:(a) Sangre medular.(b) Ningn material.(c) Grumos medulares my pequeos.(d) Agregados de plaquetas.(e) Partculas de hueso.

Respuesta correcta: b.Respuesta razonada: cuando la puncin de la mdula sea no da salida a material alguno, onicamente sangre medular sin presencia de grumos, se habla de puncin blanca o seca (dry-tap).Comnmente la puncin seca se ha atribuido a una tcnica defectuosa, pero revisiones de loscasos con este hallazgo mediante biopsia sea y otros datos clnicos y biolgicos han demostradoque puede obedecer a fibrosis, aplasia de mdula sea o, ms raramente, hipercelularidad conmdula empaquetada, casi siempre debida a leucemia aguda. Otros diagnsticos pueden serel carcinoma metastsico y la leucemia de clulas peludas (hairy-cell leukaemia).10. La observacin de la morfologa de las clulas sanguneas puede sugerir la realizacin de un

examen morfolgico de la mdula sea en las circunstancias siguientes:(a) Presencia de precursores mieloides.(b) Anisopoiquilocitosis con cuerpos de Howell-Jolly y eritroblastos circulantes.(c) Desgranulacin de ms del 80% de los polinucleares neutrlos.(d) Marcada anisocitosis plaquetaria con presencia de plaquetas gigantes.(e) Todas las anteriores.

Respuesta correcta: e.Respuesta razonada: al observar las clulas de la mdula sea se debe consignar las posiblesalteraciones morfolgicas de la serie eritropoytica, las posibles alteraciones de la maduracin(megaloblastosis) o la existencia de signos de diseritropoyesis (binuclearidad, puentes internu-cleares o alteraciones de la cromatina), y/o un aumento del nmero de mitosis. En la serie

granulopoytica debe considerarse la posible existencia de clulas inmaduras (mieloblastos) y/oalteraciones de la granulacin (desgranulacin o hipergranulacin) o de la segmentacin delncleo (hiposegmentacin, hipersegmentacin).

Metodo de Evaluación de Médula Ósea

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