METODOS HISTOLOGICOSTomado Finn

GenneserENRIQUE A. MARTIN ALVA

Doctor en Ciencias BiológicasMagister en Microbiología Clínica

Especialista en Análisis Clínicos y BiológicosC.B.P 3582 R.N.B.E 0090

El arte y la ciencia tienen su punto de encuentro en el

Metodo ( Bulwer)• Comprensión y Conocimiento = Avances Tecnológicos

• Microscopia Electronica, Fraccionamiento Celular , Histoquimica y Tecnologia del Dna

• Tecnologia con Material Vivo y Inerte( Inanimado) , en los dos se empieza con la microscopia.

Límites de Resolución aproximados de algunos sistemas ópticos:• Ojo humano: 0,2 mm.• Microscopio Fotónico: 0,2 µm.• Microscopio electrónico: 0,2 nm

ANALISIS MICROSCOPICO• La luz cambia al pasar por preparado histológico, y corregida con S.L

• Las células y tejidos se ven incoloros , no hay suficiente contraste.

• El ojo puede diferenciar contrastes de luz por tanto se debe modificar la luz ( ¿Cómo? )

• Colorear los preparados histológicos ( Absorción diferencial de la luz ),por tanto se pueden observan distintas estructuras.

PODER DE RESOLUCION (d,δ) Y AUMENTO

• Distancia mínima que debe existir entre dos puntos del objeto para que se visualicen separados

• Calidad de la imagen depende del Poder de resolución d

• Aumento : Relación entre el tamaño de la imagen y del objeto en valores lineales(determinado por el grado de curvatura de su superficie y la distancia focal.) = Aumento Vacio , pues no mejora la calidad• AUMENTO TOTAL: Aumento del objetivo x Aumento del ocular

Factores que determinan el poder de resoluciónFigura 3-3.-Esquema que muestra un objeto (1) que es atravesado por un haz de rayos luminosos (2) los cuales son captados por el objetivo (3). Al formarse el cono de luz proveniente del objeto se determina un ángulo, también llamado de apertura, donde a representa la mitad del mismo. Tomado de Kapitza H G. Microscopy from the very begining (13).

A partir de las observaciones precedentes, nace la definición de apertura numérica (AN), cifra a considerar para determinar el rendimiento de una lente objetivo (13):

AN = n x sen a

Donde a = la mitad del ángulo de apertura del objetivo.(15°)n = el índice de refracción del medio que se encuentra entre el objeto y el objetivo.(Para el aire n = 1 y para el vidrio o aceite n = 1.51)

Otra manera de incrementar la resolución es creando, del lado de la fuente luminosa, un cono amplio con un ángulo mayor. Para ello se emplea otro juego de lentes denominado condensador el cual posee la misma apertura numérica que el objetivo (fig. 3-4).

Figura 3-4.-El objeto (1) es iluminado con un rayo de luz (2) que formará un cono luminoso frente al objetivo. Se colocó otra lente (4) que recoge y condensa la luz antes que ilumine al objeto. Tomado de Kapitza H G. Microscopy from the very begining (13)

Para aumentar aún más la resolución, además de agregar un condensador, otra posibilidad es colocar algún líquido entre la lámina cubreobjeto y el objetivo. Se ha obtenido buenos resultados con ciertos aceites (aceite de cedro) cuyo índice de refracción es igual al del vidrio cubreobjeto, eliminando toda reflexión de los rayos luminosos (fig. 3-5).

Figura 3-5.-A la izquierda el espacio entre el cubreobjeto (5) y el objetivo (3) es ocupado por el aire; a la derecha el espacio es ocupado por un líquido de inmersión (6). Apréciese que el cono de luz y el ángulo a son mayores con inmersión. Modificado de de Kapitza H G. Microscopy from the very begining (13).

• El poder de resolución de un microscopio compuesto de campo claro puede ser calculado de manera razonable mediante la fórmula (13):

• Donde delta= resolución expresada en micrómetros.• lambda = longitud de onda de la luz empleada. • Como la ANobj y la ANcond son iguales, se resume 2AN.

El poder de resolución de un sistema óptico, depende principalmente de:

• Apertura numérica del objetivo y condensador: La relación apertura/resolución es directamente proporcional; a mayor apertura, mayor resolución. • Longitud de onda de la radiación electromagnética utilizada: La relación longitud de onda/resolución es inversamente proporcional; a menor longitud de onda, mayor resolución.

APERTURA NUMERICA Y PODER DE RESOLUCION d

• NA= n x sen u = Medida de la capacidad del microscopio para agrupar las refracciones de la luz producidas por detalles finos del objeto• El poder de resolución es función de la apertura numérica y de la

longitud de honda λ d = 0.61x λ/NA- Menor d , mayor NA- NA MAX 1.4 o 1.5- 0.61 Constante de pro porcionalidad

Calcular el limite de resolución de los diferentes objetivos del microscopio óptico

10 xLR= λC/NALR= 0,55 µm(0,61) / 0,30LR= 1,12 µm40 xLR= λC/NALR= 0,55 µm(0,61) / 0,65LR= 0,52 µm

100x

LR= λC/NALR= 0,55 µm(0,61) / 1,30LR= 0,26 µm

El Microscopio Compuesto• Los orígenes del microscopio son inciertos; probablemente en Holanda, en la ciudad de Middelburg entre 1590 y 1610, algunas personas relacionadas con el

mundo del espectáculo inventaron tanto el microscopio compuesto como el telescopio. Hans Janssen y su hijo Zacharias, fabricantes de anteojos, se mencionan como posibles inventores. Sin embargo, algunos atribuyen a Galileo Galilei su invención en la primera mitad del siglo XVII, gracias a que él difundió el microscopio y su uso. El microscopio compuesto original consistía en dos o más lentes colocadas en un tubo rígido (17).

• Los primeros usuarios bien conocidos fueron M. Malpighi, de Italia, A. van Leeuwenhoek, de Holanda; Hooke y N. Grew, de Inglaterra. Leeuwenhoek fabricó un microscopio simple (17) (fig. 4-1) y Hooke utilizó un microscopio compuestoSin embargo, el microscopio compuesto sería el instrumento con más futuro. El instrumento de Hooke del año 1665 tenía las partes básicas, dos lentes (una que aumentaba la imagen de la otra), una estructura mecánica, mecanismos de enfoque y un frasco esférico para concentrar la luz (fig. 4-2). Mejoras considerables se han realizado desde entonces.

• Aunque algunos fabricantes como Culpeper y Cuff crearon microscopios apropiados y mejorados por modelos con bases en trípode y la conocida base en herradura; no obstante, el verdadero microscopio útil apareció con la invención de las lentes acromáticas, desarrolladas en Inglaterra por Chester Moore Hall en 1729. El desarrollo de los instrumentos de óptica es inseparable del de la industria del vidrio y la fabricación de las lentes (61). Sin embargo, aún era difícil fabricar lentes acromáticas poderosas y a finales del siglo XVIII Jan y Harmanus van Deyl lo lograron e iniciaron la comercialización de objetivos acromáticos. Las lentes con mayores aperturas numéricas fueron realizadas alrededor de 1890. Un fabricante famoso de microscopios de calidad superior era la firma de Powell y de Lealand, quienes elaboraron objetivos de alto poder, apocromáticos y de inmersión con una apertura numérica de 1,50.

• Otros creadores fueron Ross y Smith. Karl Zeiss Jena realizó objetivos de inmersión diseñados por Ernst Abbe quien fue el fundador de la teoría óptica de las lentes del microscopio y desarrolló el diseño de las mismas basado en un procedimiento matemático riguroso (62). A finales del siglo XIX los microscopios de campo claro fueron modificados para obtener campo oscuro y polarización, detalles que permitieron incrementar el contraste.

• A principios del siglo XX la fabricación de microscopios se concentró en Alemania y en los años sucesivos se desarrolló la fluorescencia, contraste de fase, interferencia, holografía, luz ultravioleta, rayos X, métodos con electrones y protones, microscopios computarizados para la observación, cuantificación y análisis tridimensional. Estos instrumentos abrieron muchas posibilidades en el campo de la microscopía.

• Los fabricantes (Leitz, Zeiss, Olympus, y otros) respondieron a muchas necesidades, haciendo microscopios más efectivos, de uso universal, capaces de utilizar el tipo de radiación (luz visible o no) que revele de la mejor manera posible la naturaleza del espécimen y convierta detalles invisibles de la imagen en un patrón visible que pueda ser analizado

Figura 4-1.-Microscopio de Leeuwenhoek. La lente está instalada entre dos placas de bronce. Lo que se quiere observar se coloca en la punta de un tornillo, de manera que se puede regular en forma precisa la distancia entre el objeto y la lente; el observador tiene que acercar el ojo al instrumento y mirar a través de la lente. Modificado de imágenes. Ministerio de Educación y Ciencia. España (60).

Figura 4-2.-Microscopio utilizado por Hooke. Tomado de Lanfranconi, M. Historia de la Microscopía. (18).

Partes del Microscopio Compuesto Moderno

• Sistema mecánico: Conjunto de piezas que sirven de soporte a las lentes y demás elementos (pie o base, columna, mecanismo de enfoque, platina, revolver, tubo).

• Sistema óptico: Conjunto de lentes responsables del poder de aumento y resolución (objetivos y ocular)

• Sistema de Iluminación: Elementos que producen las radiaciones (luz visible o no) y transmiten, reflejan y regulan tanto la intensidad como la cantidad de rayos que van a incidir sobre el espécimen (lámpara o fuente de iluminación, espejo, condensador y diafragma).

• Accesorios: Son aditivos que permiten extender las capacidades del instrumento (cámaras fotográficas, de video, computadoras, accesorios para dibujar, entre otros).

Figura 4-13.-Trayectoria de la luz en la iluminación Köhler. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (15).

Figura 4-14. Las líneas dibujadas desde el ojo a A y R forman un ángulo, el cual es dos veces más grande que el ángulo de las líneas O-W. De igual manera, la distancia del ojo a la flecha OW es dos veces la distancia del ojo a la flecha AR. La flecha en AR aparece dos veces más grande que la flecha en OW. Las proporciones se mantienen al alejar o acercar la flecha. Tomado de Hogg J. The Microscope: Its History, Construction and Applications (73).

Figura 4-15. Diagrama que representa una lente bi-convexa cercana al ojo y a una flecha pequeña (objeto en estudio) cuyos conos dibujados representan parte de los rayos de luz divergentes emanados de varios puntos. Los rayos emanados del objeto muy cercano, al incidir en la pupila, son aún tan divergentes que no permiten formar una imagen enfocada en la retina; pero al pasar primero por la lente son desviados para formar líneas casi paralelas que si pueden ser captadas por el ojo si éste está a su vez muy cercano a la lente. Tomado de Hogg J. The Microscope: Its History, Construction and Applications (73).

Figura 4-16. Sin la lente colocada en f’g’ el ojo verá la flecha con el ángulo formado por las líneas punteadas b y c, formando la imagen b’c’. Los rayos b’f’ y c’g’ emanados de las extremidades de la flecha son refractados por la lente hacia el ojo en dirección f y g, los cuales crean un ángulo visual mayor que hace que la fecha se vea más grande (d-e). Tomado de Hogg J. The Microscope: Its History, Construction and Applications (73).

Figura 4-17. Esquema simplificado que muestra el trayecto que siguen los rayos emanados del espécimen en estudio y su paso a través de las lentes objetivo y ocular para la formación de las imágenes. La flecha ab corresponde al espécimen, que está colocado un poco por delante del foco (f) del objetivo, el cual forma una imagen real, aumentada e invertida en a’b’. Esta imagen se forma por dentro del foco (f ’) de la lente ocular. El ojo del observador percibirá a través del ocular la imagen virtual, aumentada y derecha a’’b’’ de la imagen real a’b’. Modificado de Langueron M. Précis de Microscopie (11).