Métodos de Ensayo del Lisado de Amebocitos de Limulus (LAL)

Lisado de Amebocitos de Limulus (LAL)

• LAL es un extracto de las células de sangre del cangrejo herradura, Limulus polyphemus

• El reactivo LAL forma un coágulo en la presencia de endotoxina in vitro

Endotoxina

Factor B Factor G

Coagulógeno

Enzima de coagulación

Coagulina

Factor Activado B/G

Enzima de coagulación activada

Factor C Factor Activado C -Glucano

gel-clot/coáguloModified from Iwanaga et al., 1985

*

Cascada de Activación

Métodos de Ensayo de LAL

• Los métodos principales son:• Método de coagulación o gel-clot • Método turbidimétrico• Método cromogénico

El Método Gel-Clot

• Más simple y utilizado con más frecuencia

• El método establecido por la USP y EP

• La sensibilidad de la etiqueta del reactivo LAL () es la concentración mínima de endotoxina que forma un coágulo bajo condiciones standard

Método Gel-clot

= 0.125 EU/ml• El punto final confirma la sensibilidad de la

etiqueta• El error del ensayo es +/- un tubo de dilución

Concentraciones del Standard (EU/ml)

0.25 0.125 0.06 0.03

+ + - -

Método Gel-clot

• El ensayo se puede correr como una prueba de límites (pasa o no pasa a un límite determinado de endotoxina) o como una cuantificación.

Una Prueba de Límites

= 0.125 EU/ml Límite de Endotoxina = 2 EU/ml

Curva 0.25 0.125 0.06 0.03 (EU/ml) ctrl. -Standard + + - - -

+ + - - -

Muestras Prueba Ctrl. + Producto InterpretaciónMuestra A (1:16) + + No Pasa

+ +Muestra B (1:16) - + Pasa

- +Muestra C (1:16) - - Inválida

- -

Cuantificación con Gel-clot

• El punto final es la última dilución de una serie que de un resultado positivo.

• Se multiplica el factor de dilución del punto final por la sensibilidad de la etiqueta del reactivo LAL para obtener la concentración de endotoxina.

Expresión de Diluciones

• Una dilución es expresada como un número de partes en un número total de partes.

• 1:2 significa una parte en un total de dos partes (volúmen igual de muestra y diluyente).

• 1:10 es una parte muestra, nueve partes diluyente.

Máxima Dilución Válida

• La Máxima Dilución Válida (MVD) es la mayor dilución que se le puede hacer al producto y aún detectar el límite de endotoxina con el método de LAL que se esté utilizando.

• El MVD incrementa con la sensibilidad del ensayo.

Cuantificación con Gel-clot

Ejemplo con un lisado de sensibilidad = 0.125 EU/ml (standards omitidos)Diluciones de Muestra1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 ctrl.pp +

+ + + + + - - - + + + + + + - - - +

Control Positivo de 1:1 Producto (0.25 EU/ml)

Cuantificación con Gel-clot

• El punto final es la dilución de 1:16

• La concentración de endotoxina = 16 x 0.125 EU/ml = 2 EU/ml

• Los resultados se reportan como un valor específico - no un rango. e.g., 2 EU/ml, no >1 EU/ml pero <4 EU/ml

Media Geométrica (MG)

• Use la MG para calcular el promedio de los valores.

• Divida la sumatoria de los logaritmos de los puntos finales por el número de réplicas para obtener la media de los logaritmos.

• Tome el antilogaritmo de esta media para obtener la media geométrica.

Ejemplo del Cálculo

Curva Standard: 0.25 0.125 0.06 0.03 (EU/ml) Ctrl - + + - - -

+ + - - - + - - - -

+ + - - -

Puntos Finales: log10

0.125 EU/ml -0.90 Media = -3.31/4 = -0.830.125 -0.90 MG = antilogaritmo (-0.83) 0.25

-0.60 = 0.15 EU/ml0.125 -0.90Suma -3.31

MG para una Cuantificación

Diluciones de la muestra ( 0.125 EU/ml)1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 + + + + + - - + + + + - - -Punto final Concentración de endotoxina log10 1:16 2.0 0.30 1:8 1.0 0Suma 0.30Media = 0.30/2 = 0.15Media Geométrica = antilogaritmo (0.15) = 1.41 EU/ml

Seleccionando la Sensibilidad

• Se debe considerar:• el tipo de muestra que se analizará• límite de endotoxina y • consecuentemente, el MVD

• Haga las pruebas preliminares • Si la interferencia no se puede

sobrepasar, use un reactivo de mayor sensibilidad

Métodos Fotométricos

Métodos Turbidimétricos

• Conforme la coagulina se aglutina, la reacción desarrolla turbidez.

• La velocidad de incremento de turbidez es una función de la concentración de endotoxina.

• Los ensayos de LAL son cinéticos o de punto final.

Método Turbidimétrico Cinético

• El umbral de DO (una DO fija) es utilizado como punto de referencia para la colecta de datos

• Mientras más alta la concentración de endotoxina, más corto el tiempo necesario para alcanzar el umbral de DO

Método Turbidimétrico Cinético

• El tiempo que le toma a una reacción alcanzar el umbral de DO es el “onset time”

• Se construye la curva standard representando una gráfica del log10 del onset time frente al log10 de la concentración de endotoxina

densidadóptica

tiempo

coagulación (fija)coagulación (fija)

tiempo de incubación fija

Umbral de DO

0.25 EU/ml0.125 EU/ml0.0625 EU/ml

0.03125 EU/ml

0.5 EU/ml

Cinética de la Reacción

Curva de Regresion

OnsetOnsettime (s)time (s)

Concentración de Endotoxina (EU/ml)Concentración de Endotoxina (EU/ml)

10001000

20002000

1.00.1

• Los principios son similares a la reacción turbidimétrica.

• La secuencia de los aminoácidos del péptido sintético imita la de coagulógeno, el sustrato natural.

• BOC-Leu-Gly-Arg-CONH - - NO2

• El sustrato intacto carece de color.

Métodos Cromogénicos

Método Cromogénico de Punto Final

• Se mide la intensidad del color amarillo (densidad óptica) después de un período fijo de incubación.

Método Cromogénico Cinético

• Se mide la absorbancia durante todo el período de incubación.

• Se toma nota del onset time.

Seleccione un Método: Gel-clot?

• Costo bajo de reactivos y equipos

• Método establecido por la USP y EP

• Método resistente, menos sensible a interferencias que los otros métodos

Seleccione un Método: Turbidimétrico?

• Más sensible (máxima de 0.001 EU/ml)

• Rango de detección amplio (hasta 100 EU/ml)

• El control de la temperatura en lectores de tubos es muy bueno y el cronometraje de ensayos es preciso

• Opción del uso de microplacas

Seleccione un Método: Cromogénico?

Punto Final:

• sensible (máxima de 0.005 EU/ml)

• el lector de microplacas es de precio moderado y puede ser utilizado para otros ensayos

• opción diazo permite el ensayo de muestras amarillas

Seleccione un Método: Cromogénico?

Cinético:

• es sensible (máxima de 0.005 EU/ml)

• el rango de detección es amplio (hasta 50 EU/ml)

• el lector puede ser utilizado para otros ensayos

Interferencia: Varía Según el Método

Penicilina ClindamicinaGel-clot 1:16 1:32Cromogénico (punto final) 1:10 1:20Turbidimétrico Cinético 1:200 1:100

• Diluciones necesarias para sobrepasar interferencia para dos productos parenterales (concentración inicial: penicilina, 200,000 Unidades/ml; clindamicina, 150 mg/ml).

Interferencia: Varía Según el Método

Penicilina Clindamicina

Gel-clot 640 2,784( = 0.03 EU/ml)

Cromogénico (Punto Final) 4,000 17,400( = 0.005 EU/ml)

Turbidimétrico Cinético 20,000 87,000( = 0.001 EU/ml)

Inhibición y Realce

• Inhibición es una disminución en la sensibilidad del ensayo.

• Un inhibidor conduce a que la cantidad de endotoxina presente se subestime.

• La eliminación de controles positivos (inhibición) del producto puede resultar en un resultado negativo inválido.

Realce

• Es un incremento en la sensibilidad del ensayo y conduce a que la cantidad de endotoxina presente se sobrestime.

• Los controles positivos del producto en ensayos de gel-clot no indican la presencia de realce.

• Los métodos fotométricos indican claramente si hay realce (o inhibición).

Falsos Positivos

• El realce no es un falso positivo!

• Un falso positivo es algo diferente a endotoxina que da un resultado positivo.

Falsos Positivos

• Sólo se puede probar que un resultado positivo es falso en la ausencia de endotoxina.

• Falsos positivos son poco comunes. Tripsina y ß-glucanos son los únicos conocidos.

Sobrepasando Interferencia

• Las muestras frecuentemente interfieren con la reacción de LAL.

• La interferencia puede ser causada por- un efecto de la muestra sobre el reactivo

LAL

- un efecto de la muestra sobre la endotoxina

Causas de Interferencia - pH

• Reactivo LAL tiene una capacidad limitada de tamponación.

• El pH crítico es el de la mezcla muestra/reactivo.

Regulación del pH

• Dilución

• Pyrosol (buffer)

• Ajustar pH de muestra (o dilución de muestra) con NaOH o HCl

Causas de Interferencia - Proteínas

• Pueden enlazar endotoxina.

• Las proteasas pueden desnaturalizar proteínas de la cascada enzimática.

• El tratamiento por calor puede permitir la liberación de endotoxina de la proteína que la enlaza.

• Puede causar también el desenlace.

Para Resolver los Problemas

• Pruebe primero la dilución.

• Use un Pyrotell de una mayor sensibilidad para incrementar el MVD.

• Use un método mas sensible.

• Reconstituya el Pyrotell con Pyrosol.

2005

Associates of Cape Cod, Inc.