mGMOP: UN NUEVO PÉPTIDO PARA EL DESARROLLO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES CON PROPIEDADES TERAPÉUTICAS MEJORADAS

Iturraspe, Francisco; Gugliotta A.; Etcheverrigaray, M.; Kratje, R.; Oggero, M.; Ceaglio, N.

UNL, CONICET, FBCB (Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas), CBL (Centro Biotecnológico del Litoral), Ciudad Universitaria, Ruta Nacional 168 - Km 472,4 - C.C. 242 - (S3000ZAA) Santa Fe, Pcia. de Santa Fe, Argentina. E-mail: nceaglio@fbcb.unl.edu.ar

Actualmente, la administración clínica de proteínas recombinantes para el tratamiento de enfermedades presenta ciertas limitaciones, como baja estabilidad o corta vida media en plasma.

Por otro lado, distintas técnicas de glicosilación han sido utilizadas para mejorar las propiedades de estas proteínas. La estrategia implementada en este trabajo fue la fusión de un péptido

denominado mGMOP, derivado del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos humano (hGM-CSF). La secuencia de este péptido consiste en los primeros 7 aminoácidos

de la región N-terminal del hGM-CSF junto con 8 residuos adicionales que han sido agregados con el objetivo de generar 6 sitios potenciales de O-glicosilación. El objetivo de este trabajo

fue estudiar la capacidad de mGMOP de conferir propiedades biológicas mejoradas a un bioterapéutico humano ampliamente utilizado tal como interferón α-2b humano (hIFN-α2b).

INTRODUCCIÓN

MATERIALES Y MÉTODOS

RESULTADOS

1. DISEÑO, PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LAS VARIANTES mGMOP/hIFN-α2b

Se construyeron cinco quimeras mediante fusión del péptido mGMOP al extremo N y/o C del

hIFN-α2b en diferentes proporciones: mGMOP-IFN, mGMOP2-IFN, mGMOP3-IFN,

mGMOP2-IFN-mGMOP y mGMOP3-IFN-mGMOP.

La nueva etiqueta peptídica denominada mGMOP, derivada del factor estimulante de

colonias de granulocitos y macrófagos humano (hGM-CSF), consta de los primeros 7

aminoácidos de la región N-terminal de esta citoquina, junto con 8 residuos adicionales

que confieren 6 sitios potenciales de O-glicosilación.

Figura 1. Diseño y secuencia del péptido mGMOP y la variante mGMOP-IFN.

PSGM: Péptido señal del hGM-CSF.

Figura 2. Variantes de hIFN-α2b construidas con diferentes proporciones de mGMOP.

Las quimeras fueron producidas en condiciones de adherencia y purificadas por

cromatografía de inmunoafinidad utilizando un anticuerpo monoclonal anti-hIFN-α2b.

2. ANÁLISIS DE LOS PERFILES DE MASA MOLECULAR

Al aumentar el número de etiquetas peptídicas GMOPm, la masa molecular se incrementó

y lo hizo en una proporción superior a lo esperable sólo por la contribución de la porción

peptídica.

Figura 3. SDS-PAGE de las variantes de hIFN-α2b. Calle 1, IFN no glicosilado; calle 2, wild-type IFN; calle 3,

mGMOP-IFN; calle 4, mGMOP2-IFN; calle 5, mGMOP3-IFN; calle 6, mGMOP2-IFN-mGMOP; calle 7,

mGMOP3-IFN-mGMOP; calle 8, marcador de masa molecular; calle 9, GMOP-IFN; calle 10, una variante de

IFN altamente N-glicosilada (IFN4N).

3. CONFIRMACIÓN DE LA PRESENCIA DE GLICANOS DE TIPO O

La presencia de O-glicanos fue confirmada mediante reacciones de deglicosilación

enzimática utilizando las enzimas indicadas en la Figura 4A. El éxito de la deglicosilación

fue analizado mediante SDS-PAGE (Figura 4B).

Figura 4. (A) Estructura de O-glicanos más comunes en células eucariotas. (B) SDS-PAGE de variantes

nativas y deglicosiladas de hIFN-α2b. Calle 1, IFN wild type; calle 2, IFN no glicosilado; calles 3 y 4,

mGMOP-IFN nativo y deglicosilado; calles 5 y 6, mGMOP2-IFN nativo y deglicosilado; calles 7 y 8, mGMOP3-IFN

nativo y deglicosilado; calles 9 y 10, mGMOP2-IFN-mGMOP nativo y deglicosilado; calles 11 y 12,

mGMOP3-IFN-mGMOP nativo y deglicosilado.

4. CARACTERIZACIÓN DEL PERFIL DE GLICOISOFORMAS

Las variantes O-glicosiladas presentaron homogeneidad en los patrones de isoformas

comparadas con una proteína altamente N-glicosilada, observándose un enriquecimiento

en la región ácida. Además, se observó que conforme se aumentó el número de etiquetas

peptídicas mGMOP, se produjo la disminución del punto isoeléctrico, lo que podría ser

debido a un mayor contenido de ácido siálico.

Figura 5. Análisis del perfil de glicoisoformas de variantes de hIFN-α2b. Calle 1, IFN wild type; calle 2,

mGMOP-IFN; calle 3, mGMOP2-IFN; calle 4, mGMOP3-IFN; calle 5, mGMOP2-IFN-mGMOP; calle 6,

mGMOP3-IFN-mGMOP; calle 7, una variante de hIFN-α2b altamente N-glicosilada (IFN4N).

5. ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA IN VITRO

La actividad biológica in vitro de IFN-α2b y sus derivados fue evaluada midiendo:

A- el efecto antiviral citoprotector en células MDBK infectadas por el virus de la estomatitis

vesicular (VSV)

B- el efecto antiproliferativo sobre el crecimiento de células de la línea Daudi

Actividad Biológica Específica in vitro (UI/ng)

Variante hIFN-α2b* mGMOP-IFN mGMOP2-IFN mGMOP3-IFN mGMOP2-

IFN-mGMOP

mGMOP3-

IFN-mGMOP

Antiviral 200 ± 20 240 ± 40 170 ± 70 71 ± 15 70 ± 20 50 ± 20

Antiproliferativa 150 ± 20 100 ± 20 30 ± 20 12 ± 6 2 ± 1 8 ± 4

Tabla 1. Actividades específicas antiviral y antiproliferativa in vitro de las variantes de hIFN-2b

* Valor reportado para rhIFN-2b producido en células CHO-K1. [Ceaglio et al. Novel long-lasting interferon alpha

derivatives designed by glycoengineering. Biochimie, (2008) Vol. 90 (3): 437-449]

Todas las variantes de IFN retuvieron en mayor grado la actividad antiviral con respecto a

la antiproliferativa, ambas evaluadas in vitro; aunque en las dos situaciones, en general, se

observó disminución de la actividad en forma concomitante con el número de etiquetas

fusionadas. Sin embargo, es ampliamente conocido que la actividad in vitro generalmente

no refleja la eficacia in vivo de un agente bioterapéutico.

6. ANÁLISIS DE LA ESTABILIDAD TÉRMICA

Se determinó la actividad biológica antiviral residual de las variantes mGMOP luego de ser

sometidas a temperaturas entre 25 °C (control) y 95 °C. Para cada variante se determinó la

temperatura a la que su actividad inicial a 20 °C disminuye al 50% (Tm).

Variante Tm (°C)

mGMOP-IFN 60,8

mGMOP2-IFN 63,8

mGMOP3-IFN 63,8

mGMOP2-IFN-

mGMOP 69,0

mGMOP3-IFN-

mGMOP 67,1

Tabla 2. Valores de Tm para las variantes mGMOP

Figura 6. Análisis de la estabilidad térmica de las variantes

de hIFN-α2b.

Todas las proteínas retuvieron, en promedio, el 100% de actividad biológica antiviral en el

rango de temperaturas entre 25 °C y 55 °C. La incubación a temperaturas mayores provocó

una pérdida gradual de la actividad biológica. Para la variante mGMOP-IFN, se observó una

pérdida total de actividad luego de la incubación a 65 °C. No obstante, el agregado de 2 o

más etiquetas permitió incrementar su estabilidad térmica, obteniéndose una Tm superior.

7. EVALUACIÓN FARMACOCINÉTICA DE LAS NUEVAS VARIANTES DE hIFN-α2b

La evaluación de los parámetros farmacocinéticos de las quimeras mGMOP/IFN en animales de experimentación se realizó con el objetivo de evaluar el efecto de la presencia de los O-

glicanos sobre el tiempo de vida media en circulación y la velocidad de depuración de las mismas. A partir de los resultados obtenidos se graficaron los perfiles farmacocinéticos y se

calcularon los parámetros Cmáx, Tmáx, t1/2, CLapp y AUC.

CONCLUSIONES

Molécula Cmáx

(UI.ml-1)

Tmáx

(h)

t1/2

(h)

AUC

(UI.h.ml-1)

CLapp

(ml.h-1)

mGMOP-IFN

60 ± 20

6,4 ± 0,6

9 ± 1

1500 ±

300

140 ± 20

mGMOP2-IFN

50 ± 10

6 ± 1

10 ± 2

1070 ± 60

190 ± 10

mGMOP3-IFN

90 ± 10

6 ± 1

10 ± 1

2600 ±

100

78 ± 4

mGMOP2-IFN-

mGMOP

110 ± 10

10 ± 1

21 ± 4

4400 ±

300

46 ± 3

mGMOP3-IFN-

mGMOP

140 ± 50

9 ± 1

34 ± 4

5700 ±

600

35 ± 4 Figura 7. Perfiles farmacocinéticos de las quimeras

mGMOP-IFN.

Tabla 3. Parámetros farmacocinéticos de las variantes mGMOP-IFN.

Los perfiles farmacocinéticos resultaron notablemente

mejorados como consecuencia de la estrategia de

O-glicoingeniería aplicada.

El clearance aparente disminuyó de forma concomitante con

el número de etiquetas fusionadas.

Además, las variantes hiperglicosiladas

(mGMOP2-IFN-mGMOP y mGMOP3-IFN-mGMOP) mostraron

un tiempo de vida media 2 y 4 veces mayor, y un clearance 3

y 5 veces menor que la variante con una sola etiqueta

peptídica mGMOP.

Como conclusión general del trabajo, la fusión de múltiples unidades del péptido mGMOP a los extremos amino y/o carboxilo de una proteína constituye una estrategia de glicoingeniería

muy atractiva que permite incrementar el grado de O-glicosilación y, como consecuencia, mejorar las propiedades farmacocinéticas de proteínas con corta vida media en circulación como

hIFN-α2b. El péptido mGMOP constituye una valiosa herramienta para el desarrollo de una plataforma biotecnológica para la producción de proteínas recombinantes terapéuticas con

mejores propiedades biológicas.

Generación de las

líneas

recombinantes

mediante

transducción

lentiviral de células

CHO-K1

Producción en

condiciones de

adherencia

Cuantificación

por ELISA

Sándwich

indirecto

Purificación por

inmunoafinidad

(mAb anti- hIFN-

α2b)

1. Generación de las variantes de hIFN-α2b 2. Perfiles de masa molecular

5. Actividad Biológica in vitro 6. Estabilidad Térmica 7. Farmacocinética

4. Perfiles de glicoisoformas

CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA

3. Presencia de O-glicanos

CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA

SDS-PAGE y

posterior tinción

con Coomasie

Blue

Deglicosilación

enzimática y

evaluación por

SDS-PAGE

Isoelectroenfoque.

Rango de pH: 3,5-

5,5

Evaluación de

Actividad

Antiviral y

Antiproliferativa

Incubación a

diferentes

temperaturas.

Rango: 25-95 °C

Evaluación en

ratas Wistar

por vía

subcutánea