INSTITUTO NACIONAL DE CIENC IAS AGRICOLAS

DEPARTAMENTO DE AGROQUIMICA Y NUTRICION DE LAS PLANTAS

Informe Científico Final.

Factibilidad biológica de la micorrización "in vitro" de Papa, Solanum tuberosum,

J’ del Proyecto: Félix Fernández Martín

La Habana, 2003

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1. Introducción El cultivo de la papa, constituye uno de los de mayor consumo a nivel mundial, formando parte de la dieta de más de un billón de personas. Se cultiva a gran escala en más de 130 países (Struik y Wiersema, 1999) y los modos de propagación varían en función de los intereses de los productores, siendo la micropropagación una de las técnicas más empleadas con estos fines. Por lo general, la aplicación de esta última tiene aún determinados problemas que limitan su uso generalizado y no garantizan totalmente las condiciones para el posterior desarrollo de las plántulas derivadas en ambientes naturales. En la última década algunos investigadores han reportado los hongos micorrizógenos arbusculares (HMA) que forman asociación natural con las plantas y que están, obviamente ausentes en los cultivos axénicos, como una posible solución para mejorar la adaptación de las plántulas producidas in vitro (Herman, 1996; Bethlenfalvay y col., 1997; Jackson y col., 1997 y Nowak, 1998). Estos han incrementado el vigor y la supervivencia de una gran variedad de cultivos como: fresa, banano, nuez, aguacate, plátano, piña, uva, frambuesa, café, boniato, agave, etc. Estos micetos juegan un importantísimo papel en la nutrición de los cultivos y contribuyen a la supervivencia y crecimiento de las plantas al reducir el estrés asociado con la nutrición, las relaciones con el agua, la estructura del suelo, el pH, las sales minerales, los metales tóxicos y los patógenos (Vosatka y col., 1999 y Rai, 2001). No obstante, en algunos casos, los efectos beneficiosos sobre el crecimiento solo son observados después que las plantas in vitro están totalmente aclimatadas. Según Hernández - Sebastia y col. (1999) y Rai (2001) los efectos varían con las especies de plantas y los microorganismos utilizados. Por otra parte, autores como Wang y col. (1993) aseguran que el crecimiento y la supervivencia podrían incrementarse durante la aclimatización si los inoculantes fueran introducidos durante el estadio de enraizamiento in vitro. sin embargo, existen serias dificultades relacionadas con el establecimiento de la simbiosis en esta fase debido, primeramente, a los contaminantes que habitan las paredes de los propágulos micorrízicos, al comportamiento del hospedero, el tipo de propágulo micorrízico y por último a la naturaleza obligada de este endófito. (Fortín y col., 2002) Elmeskaoui y col. (1995) desarrollaron un método de cultivo in vitro que permitió que las plantas fueran colonizadas con micelio secundario del hongo, o sea el micelio formado en las raíces previamente colonizadas por esporas germinadas.

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Existen, no obstante, algunos estudios que reportan a los HMA como inoculantes en cultivos monoaxénicos a partir de clamidosporas germinadas con marcados efectos sobre el crecimiento y desarrollo, la producción de embriones y el estado fisiológico de diferentes especies de plantas (Fernández y col., 2002 y Bressan, 2002), modificando las condiciones de cultivo y combinando medios con sustratos para incrementar su similitud con los sistemas naturales. En general la implantación de un sistema de micorrización in vitro, resulta complejo, pues debemos no solo tratar de crecer la plántula, sino también propiciar que haya un correcto crecimiento del simbionte y el establecimiento de la asociación micorrízica (hongo micorrízico arbuscular), por lo tanto, una de las condiciones fundamentales para que se produzca esta interacción es a partir de una fuente de inoculante potente y libre de microorganismo no deseados para lograr con éxito este proceso. Por otra parte, debemos considerar que una vez implantada la simbiosis, resulta necesario el desarrollo de un marcador que permita la detección segura del simbionte en las condiciones naturales, una vez liberada la vitroplantula micorrizada en condiciones de campo. En este sentido se debe contar con una metodología adecuada para la localización de las cepas microbianas en cualquier condición en que se emplee. Tomando en consideración la importancia de los aspectos antes tratados, este trabajo persigue el siguiente objetivo: Evaluar la factibilidad de la inoculación micorrízica durante los estadios in vitro y post in vitro del proceso de micropropagación del cultivo de Solanum tuberosun L. var. Alfa. Para dar cumplimiento al objetivo propuesto se plantearon las siguientes tareas: I. Producción y aislamiento de esporas de hongos micorrizógenos

arbusculares (Glomus clarum y Glomus fasciculatum). II. Evaluación de diferentes metodologías de desinfección de esporas

para ser empleadas en experimentos posteriores de micorrización "in vitro".

III. Micorrización "in vitro" de las plántulas. a. Estudio de selección del medio de cultivo adecuado. b. Estudio de momento de extracción de plantas micorrizadas.

IV. Definición de factores limitantes del proceso de micorrización "in vitro".

V. Estudios comparativos entre las variantes comerciales y la metodología propuesta en condiciones semicontroladas.

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2. Antecedentes.

2. Los Hongos Micorrizógenos Arbusculares (HMA) Micorriza, una de las maravillas naturales más extraordinaria y asombrosa; simplemente la sorprendente asociación que se establece entre ciertos hongos del suelo y las raíces de la mayoría de las plantas, en la cual se crea una unión con dependencia fisiológica íntima y recíproca, con funciones muy estrechas entre ambos simbiontes. La historia de las micorrizas se remonta a unos 400 millones de años, específicamente a los inicios del período Devónico. Las investigaciones filogenéticas y moleculares revelan que los hongos más primitivos que formaban estas asociaciones divergieron de un taxón cercano no micorrízico aproximadamente al mismo tiempo en que surgieron las plantas terrestres, 462-353 millones de años atrás (Simon y col., 1993 y Remy y col., 1994); por lo tanto, es realmente posible que la colonización de la tierra por las plantas y la evolución de toda la flora terrestre haya sido en simbiosis con los hongos micorrizógenos, quienes coevolucionaron hasta lo que son hoy en día (Taylor y col., 1995). El término Micorriza fue propuesto por el botánico Albert Bernard Frank (1881), quien lo formó a partir del vocablo griego “myco”, que significa hongo y del latín “rhiza”, que quiere decir raíz. Los hongos que forman estas asociaciones son los llamados Micorrizógenos y se conocen desde el siglo pasado, pero a pesar de su interés ecológico no se les prestó atención sino hasta los últimos 40 años. Las especulaciones de Frank sobre el posible papel de las asociaciones micorrízicas en la nutrición y el crecimiento de las plantas fueron refutadas por los científicos de la época, y solo hasta el año 1894 pudo demostrar que la colonización del hongo en las raíces producía micelio abundante en la rizosfera, y que esto ayudaba a la absorción de nutrientes y agua del suelo. Según Siqueira y Franco (1988) este fenómeno es de ocurrencia generalizada pudiéndose afirmar que las plantas no tienen raíces, sino micorrizas y que la micorriza es la regla y no la excepción. Tradicionalmente las Micorrizas se han agrupado en: Ectomicorrizas, Ectendomicorrizas y Endomicorrizas. Las primeras se caracterizan por la penetración intercelular del micelio fúngico en la epidermis de la raíz y la formación de la “Red de Harting” y el manto que se desarrolla alrededor de las raíces colonizadas. En cambio, en las Endomicorrizas las hifas del hongo se propagan a través de las raíces y penetran las células corticales sin llegar a colonizar el endodermo ni producir modificaciones morfológicas evidentes en las plantas hospederas. Este grupo es el más difundido en el planeta y está dividido en varios subtipos, de los cuales el más representativo e importante es el Arbuscular por ser el de mayor

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distribución, tanto geográfica como florísticamente (Ferrer y Herrera, 1988). Se encuentra ampliamente distribuido desde los trópicos hasta el ártico, y se han encontrado en Briophytas, Pteridophytas, Angiospermas y Gimnospermas, colonizando más del 95% de las especies vegetales de interés (Azcón - Aguilar y col., 1991 y Smith y Read, 1997). En las zonas templadas son frecuentes tanto las Micorrizas ectótrofas como las Arbusculares, mientras que en los trópicos predominan las de este último grupo (Herrera y col., 1988). Producto de tal coevolución existen plantas que necesitan en mayor o menor grado de esta asociación para captar nutrientes y crecer adecuadamente. Esta dependencia es más marcada en las del tipo arbuscular pues los hongos que la forman no son capaces de completar su ciclo de vida en ausencia de la planta hospedera, por lo que son considerados simbiontes obligados (Siqueira y Franco, 1988). Las Endomicorrizas Arbusculares pertenecen a la Clase Zigomicetes y al Orden Glomales (Fig. 1), el cual está compuesto por 5 familias que conforman los siguientes géneros: Glomus, Paraglomus, Archaeospora, Sclerocystis, Scutellospora, Entrophospora, Gigaspora y Acaulospora (Morton y Redecker, 2001).

Familia: Paraglomaceae Género: Paraglomus

Glo s

Familia: Gigasporaceae Familia: Glomaceae

AcaulosScutell

Fig 1. Clasificación a

Tomado de Morton y

Suborden Glomineae

Orden Glomales

ctual de los hongos que for

Redecker, 2001.

Suborden Gigasporineae

Familia: Archaeosporaceae Género: Archaeospora

Géneros: mus Sclerocysti

Géneros: pora Entrophospora

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Géneros: ospora Gigaspora

Familia: Acaulosporaceae

icorrízica arbuscular (

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2.1. Establecimiento simbiótico

Existen diferentes grados de dependencia entre las especies de plantas y los hongos micorrizógenos que intervienen en la asociación, de los cuales va a depender la intensidad de su desarrollo. Como en otros sistemas biotróficos la penetración de las células del hospedero ocurre sin dañar su integridad y sin provocar respuestas restrictivas por parte de la planta, ocurriendo a través de la invaginación de las paredes del plasmalema, mediante procesos mecánicos y enzimáticos bien localizados y controlados, lo cual evidencia una integración perfecta (alta compatibilidad) entre estos dos organismos (Siqueira y Franco, 1988). Bonfante y Perotto (1992) sugieren tres fases o estadios del establecimiento simbiótico: germinación de las esporas y crecimiento hifal, estimulación del crecimiento hifal e inicio del proceso de colonización y desarrollo fúngico intracelular con formación de arbúsculos. La mayoría de las especies forman esporas en el suelo capaces de germinar en ausencia de señales derivadas del hospedero (Giovannetti, 2000). Estas esporas germinan y crecen en respuesta a diferentes condiciones ambientales y edáficas, pero son incapaces de extender su micelio y completar el ciclo de vida sin establecer una relación funcional con una planta hospedera. La clave evolutiva que despierta todos los procesos desde la germinación hasta la formación de la red de hifas se encuentra en el organismo del hongo, involucrando una secuencia de eventos morfogenéticos representados por la germinación de la espora y el crecimiento micelial, el patrón diferencial de ramificación de las hifas en presencia de las raíces hospederas, la formación de apresorios, la colonización radical, el desarrollo de los arbúsculos, el crecimiento del micelio extrarradical y la formación de esporas (Fig. 2). Evidentemente, la germinación de las esporas de estos hongos no está regulada por su hospedero, a diferencia de lo que sucede con muchos hongos biotrófos patogénicos, lo cual podría considerarse una fuerte desventaja; sin embargo, los hongos micorrizógenos han sobrevivido y evolucionado por más de 400 millones de años, evidencias fósiles y datos de secuencias de DNA han mostrado su naturaleza ancestral (Phipps y Tayor, 1996 y Remy y col., 1994). Esta persistencia indica que los mismos han desarrollado estrategias eficientes que le han permitido la sobrevivencia de sus individuos y poblaciones (Logi y col., 1998).

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La germinación múltiple puede ser considerada una estrategia adicional de las esporas de HMA para incrementar la probabilidad de una colonización exitosa. El inicio en la germinación de las esporas es marcado por un incremento en la actividad y redistribución de su citoplasma (Fig.3). Además, se suceden movimientos citoplasmáticos que originan acumulación de material cerca del esporóforo. Paralelamente, comienza a estrecharse la pared interna de la espora y se forma el tubo germinativo inicial, el cual, al parecer, digiere las paredes intermedias.

Figura 3. Representación diagramática de los procesos de germinación de una

azigospora de la especie de HMA Gigaspora margarita. (Siqueira y col. , 1985)

Seguidamente ocurre una intrusión del citoplasma en la zona de germinación. La pared del tubo germinativo se continúa con la capa más interna de la pared de la espora y su crecimiento es producto de la síntesis de Novo y la deposición de nuevo material en la pared. Según Siqueira y col. (1985), la emergencia del tubo germinativo es el resultado, aparentemente, de una presión física.

2.3. Funcionalidad de los HMA. La penetración y el establecimiento del hongo en las raíces promueve modificaciones en la fisiología, bioquímica y nutrición de la planta, ejerciendo un gran efecto sobre su comportamiento. Las modificaciones observadas han sido las siguientes: aumento del núcleo, de la masa citoplasmática y del número de varios organelos, incrementos en el grado de vacuolación de las células corticales, en la cantidad y diferenciación de tejidos vasculares, aumentos de la tasa fotosintética, de la síntesis de proteína, clorofila, sustancias del crecimiento y metabolitos secundarios, aumentos en la actividad de varias enzimas y favorecimiento de la absorción, translocación y utilización de nutrientes minerales y agua (Siqueira y Franco, 1988). Estas modificaciones son de gran importancia para entender las

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respuestas de las plantas a la micorrización y para el control del desarrollo del hongo en las raíces. La naturaleza y magnitud de estas alteraciones son difíciles de evaluar pues dependen de la relación de compatibilidad entre los componentes del sistema (hongo - suelo - planta). El incremento en los niveles de absorción de fósforo por parte de la planta ha sido el efecto nutricional más estudiado debido a que limita el crecimiento vegetal en la mayoría de los suelos (Vestberg y Estaun, 1994). Su accesibilidad a las raíces absorbentes es un problema, pues aunque esté presente en grandes cantidades, su difusión es reducida, además puede interactuar con coloides, o participar en reacciones de precipitación con aluminio, hierro y calcio, todo lo cual contribuye al desarrollo de zonas de agotamiento alrededor de las raíces absorbentes (Trimble y Knowles,1995). Sin embargo, en los últimos años ha quedado claro el positivo rol de las micorrizas en la absorción del resto de los elementos esenciales (macro y micronutrientes) y no solo sobre los que se mueven en el suelo por mecanismos de difusión (George, 2000 y Rivera y col., 2001). Este incremento en la eficiencia en la absorción de los nutrientes por las plantas micorrizadas, conlleva a disminuciones en las necesidades de fertilizantes orgánicos o minerales en comparación con las necesidades de las plantas no micorrizadas, para mantener iguales o inclusive mayores niveles de rendimiento. La funcionalidad de los HMA ha sido discutida por muchos investigadores durante la última década (Gianinazzi y col., 1990; Arias y Cargeeg, 1992; Varma y Schuepp, 1995; Lovato y col., 1996 y Hindav y col., 1998), quienes plantean que pueden contribuir al crecimiento y a la supervivencia de las plantas por reducción del estrés asociado no solo con la nutrición, sino también con la toma de agua, la aireación, la estructura del suelo, el pH, las sales, los metales tóxicos y los patógenos (Sylvia y Williams, 1992). Estos hongos modifican las relaciones con el agua de las plantas nativas (Nelsen, 1987). La conductancia estomática, la tasa de transpiración y el potencial de agua de la hoja son frecuentemente mayores en las plantas micorrizadas bajo condiciones de estrés por sequía (Subramanian y col., 1995), permitiendo a las plantas colonizadas por el hongo mantener mayores valores de tasa fotosintética y contenido de agua que las plantas no micorrizadas. No obstante, los mecanismos involucrados en estas modificaciones permanecen aún bajo investigación. Así mismo, los hongos micorrizógenos incrementan la tolerancia de las plantas a los contaminantes del suelo como metales pesados. Según Gervais y col. (2000) pueden aliviar la toxicidad causada por aluminio,

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especialmente si fueron previamente aislados de suelos contaminados (Dodd, 1998). Lovato y col. (1996) también reportaron varias funciones de relevante importancia vinculadas con la biorregulación, la bioprotección y la biofertilización y aún en estudio, la micorrización de plantas micropropagadas. 2.4. Inoculantes micorrízicos. Para realizar el cultivo de los hongos Glomales se han propuesto diversas metodologías, unas más complejas que otras, pero todas con un denominador común: involucran una planta hospedera o explantes de raicillas, ya que estos micetos se asocian con las plantas debido a su condición de simbiontes obligados para cumplimentar su ciclo de vida satisfactoriamente. Lo que diferencia realmente una metodología de otra es el medio en el cual se desarrolla esta simbiosis. Las tecnologías más utilizadas son aquellas que involucran a la planta en un medio o sustrato sólido, empleando materiales que van desde suelo, turba, perlita, vermiculita, arena, arcilla, arcilla calcinada, varios compostas vegetales y forestales y / o mezclas de algunos de ellos (Morton et al., 1993). También se han hecho crecer plantas en medios hidropónicos, poniendo en contacto a las raicillas micorrízicas con una fina película de solución nutritiva que fluye de manera continua y a velocidad constante, aportando todos los requerimientos nutrimentales de la planta. Esta metodología tiene como inconveniente que es preciso ser muy riguroso en el control del pH de la solución, pues al no encontrarse en el suelo, carece por lo tanto de la capacidad de estabilización química o buffer y el mismo puede variar con la entrada al medio de los exudados de la planta. Por otra parte, es necesario preinocular la planta con el hongo deseado, previo al contacto con la solución nutritiva (Elmes et al; 1984 ). Otra importante metodología propuesta para la producción de inoculante micorrízico, lo constituye sin duda el cultivo aeropónico, desarrollado por Hung y Sylvia (1988), el cual se basa en el cultivo de plantas preinfectadas en una cámara oscura, donde sus raicillas colonizadas con el hongo deseado, son irrigadas temporalmente a través de un dosificador de solución nutritiva, creciendo de forma acelerada de 12 a 15 semanas. Posteriormente, las raicillas y propágulos micorrízicos son cosechados o removidos de la cámara, los segmentos radicales cortados a 1 cm, y las esporas aisladas por tamizado, para su posterior uso. Según Sylvia y Jarstfer (1992), se logra un material muy homogéneo y libre de patógenos.

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La técnica más novedosa desde el punto de vista científico, resulta el cultivo dual de raíces y hongos micorrizógenos (cultivo monoaxénico). Estos trabajos iniciaron con el cultivo in vitro de micorrizas por parte de Mosse y Hepper (1975), en raíces de tomate, pero no fueron muy tomados en cuenta, hasta que Mugnier y Mosse, (1987) lograron la producción in vitro usando raíces transformadas por el plásmido RitDNA presente en las bacterias Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes. A partir de entonces se han desarrollado muchos protocolos para el crecimiento in vitro, los cuales se realizan en tres fases, esterilización superficial de esporas y raíces, incubación de placas durante 12 semanas y cosecha de inoculante micorrízico concentrado. Este método resulta muy prometedor para la producción de inoculante micorrízico arbuscular, sin embargo, este tipo de cultivo monoaxénico no es tan sencillo pues debe tomarse en cuenta que cada especie de hongo micorrizógeno y de hecho cada una de las simbiosis, constituyen un sistema con diferentes requerimientos nutricionales, aún en órganos individuales, como es el caso de la raíz. Por otra parte, el hecho de que todavía no están bien establecidos los niveles de atmósferas de CO2 que propician el intercambio gaseoso de la simbiosis, las fuentes de nutrimentos, los requerimientos de cada hongo que se pretenda cultivar, los microorganismos de naturaleza endófita que intervienen en el proceso, etc., apoya la necesidad futura de esfuerzos de investigación profunda en esta metodología tan prometedora. Actualmente, cuando se pretende potenciar la producción de inoculantes micorrízicos arbusculares, el uso de sistemas que involucren sustratos sólidos, suelos o la mezcla de este último con sustancias inertes, presentan una superioridad clara en cuanto a la cantidad de especies y géneros de Glomales que pueden ser cultivados (Fig. 17). Además, otra de las ventajas de la producción de micorrizas en sustratos sólidos y / o suelos, consiste en que se puede almacenar por periodos largos de tiempo de hasta 5 años a temperaturas de 4 oC (Morton, 1993).

2.5. Detección de Esporas de HMA.

Entre las distintas especies de HFMA, y aún entre cepas o ecotipos pertenecientes a una misma especie, existen marcadas diferencias funcionales, lo cual ha conllevado a que numerosos investigadores hayan dedicado su esfuerzo a la caracterización de estos hongos. Para ello se han empleado diversos métodos, constituyendo los primeros o más clásicos aquellos basados en las características morfológicas de las

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esporas y del micelio fúngico, tales como forma, tamaño, color, número y grosor de las paredes (Ruiz-Lozano y Azcón, 2000). La clasificación hasta nivel de género de los hongos formadores de micorrizas arbusculares no presenta dificultades, si se tiene en cuenta que entre las diferentes familias existen marcadas diferencias estructurales que se basan en los procesos de génesis de la espora y sus conexiones hifales (Morton, 1999). La labor taxonómica para la determinación a nivel de especie es una tarea de una juiciosa consulta de claves taxonómicas, ya que esta clasificación se basa, no sólo en los aspectos mencionados anteriormente, sino en la característica subcelular de la pared de la espora, que es la que define la ubicación del microorganismo hasta nivel de especie, siendo ésta difícil de detectar debido a las pequeñas diferencias existentes entre las especies de un mismo género (Morton, 1999). Tomando en consideración las dificultades en la identificación de estos hongos a partir de los métodos clásicos, en la actualidad se ha incrementado el uso de técnicas más avanzadas que incluyen, tanto la detección inmunoquímica, como indicadores bioquímicos que pueden constituir alternativas más rápidas, sensibles y confiables (Sanders y col., 1992; Simon, 1996). La detección inmunoquímica, en general, se basa en la producción de anticuerpos específicos (policlonales o monoclonales) frente a una determinada especie, presuponiendo que ésta contenga grupos antigénicos diferenciados (Hanh y col., 1999). Un Ac reconoce solamente una parte restringida de un antígeno (determinante antigénico). Un antígeno presenta una cantidad definida de epítopos, algunos de los cuales están compartidos con otros antígenos. Estos antígenos se denominan epítopos públicos o genéricos. Existen otros que se encuentran en una sola entidad molecular y son llamados antígenos específicos o privados (Hahn y col., 1999). Los anticuerpos policlonales varían grandemente en su reconocimiento, desde discriminar entre hongos no formadores de micorrizas arbusculares y los formadores, hasta distinguir entre diferentes HFMA a nivel de género y dentro de un mismo género pueden detectar hasta nivel de especie (Hahn y col., 1999). Los estudios basados en el uso de anticuerpos monoclonales muestran un reconocimiento más específico de estos hongos a nivel de especie e incluso se pueden discriminar organismos de una misma especie que hayan sido aislados en diferentes ecosistemas, pero éstas son alternativas de alto costo que requieren contar con infraestructura especializada (Perotto y col., 1992). Recurrir a la utilización de un anticuerpo policlonal o uno monoclonal está en dependencia del interés de cada investigador, de las exigencias

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del trabajo y las condiciones materiales del laboratorio; no obstante, cualquiera de las dos opciones representa una gran ayuda para complementar el trabajo de clasificación que se realiza con las claves taxonómicas (Perotto y col., 1992). Los anticuerpos son utilizados para caracterizar superficies extra e intracelular y para cuantificar constituyentes celulares de las esporas de los HFMA. Por esto, se necesita información detallada sobre las propiedades del (diálogo) hospedero-simbionte y sobre estudios taxonómicos (Hahn y col., 1999). Especialmente en el campo de las endomicorrizas arbusculares, se ha comprobado que existen grandes diferencias en el comportamiento ecológico y los efectos fisiológicos entre diferentes aislados, los cuales son morfológicamente similares pero difieren en sus propiedades inmunoquímicas (Wright y col., 1987). 2.5.1. Algunas características de las técnicas de

inmunodetección IFI y el ELISA. En los años 40-50 del siglo pasado, Coons introdujo las técnicas basadas en la conjugación de anticuerpos con fluorocromos para la detección de la reacción antígeno- anticuerpo, lo que se tradujo en un aumento importante de las posibilidades de aplicación de métodos con base inmunológica para el diagnóstico. La inmunofluorescencia (IF) es esencialmente un método inmunocito e histoquímico de alta sensibilidad que, aplicado a los estudios taxonómicos, ofrece gran versatilidad y niveles de detección en el orden de los microgramos. La fluorescencia es un fenómeno en el cual una luz de corta longitud de onda, como la luz ultravioleta, excita ciertos colorantes conocidos como fluorocromos, provocando que sus electrones más externos alcancen un nivel de alta energía en forma de luz visible, de longitud de onda caracterítica para los diferentes compuestos, que puede ser observada como fluorescencia en microscopios equipados con sistemas de filtro apropiados (Harlow y Lane, 1988). El empleo de los ensayos inmunoenzimáticos en soporte sólido para la detección de la reacción antígeno-anticuerpo ha crecido vertiginosamente a partir del reporte de Engvall y Perlman (1971). Los sistemas tipo ELISA resultan excelentes para el tamizaje de anticuerpos, son métodos relativamente sencillos, de alta sensibilidad y especificidad, con posibilidad de ser automatizados y pueden ser realizados en laboratorios sin grandes recursos técnicos.

Dentro de los soportes sólidos más utilizados se encuentran la placas de microtitulación de 96 pocillos, de cloruro de polivinilo (PVC) o poliestireno (PE), aunque también se han empleado papel de nitrocelulosa y perlas de poliestireno, entre otros. El empleo de uno u

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otro material puede estar en dependencia de la disponibilidad de antígeno y de su capacidad particular de adsorción. Los fabricantes de soportes y placas para ELISA ofertan varios productos, relativos principalmente con la capacidad de adsorción de proteína que posee el polímero en cuestión (Gavilondo, 1995).

2.6. Uso de las HMA en lo sistemas agrícolas. La capacidad de los HMA de aumentar el crecimiento y la sobrevivencia de las plantas ha despertado el interés de los científicos en el mundo entero. Desde hace algunas décadas aumentan las publicaciones científicas acerca del efecto beneficioso de la simbiosis sobre el crecimiento y productividad de los cultivos (Harley y Smith, 1983; Siqueira y Franco, 1988; Fernández, 1999 y Rivera y col. 2003.). En la actualidad, el uso de estos inoculantes microbianos como sustitutos de fertilizantes químicos y plaguicidas ha recibido especial atención en el desarrollo de prácticas de producción agrícola sostenible (O’ Gara, 1996). Uno de los aspectos de más repercusión para el manejo de la simbiosis lo constituye la poca especificidad cepa - cultivo, fenómeno que se fundamenta sobre todo en el poco número de especies y cepas de hongos endomicorrízicos que se asocian con una gran cantidad de especies vegetales y que se expresa en que una especie adecuada o “eficiente” para una condición edáfica dada, establecerá simbiosis eficiente con una gran variedad de cultivos (Ruiz, 2001 y Rivera y col., 2003). Precisamente esta baja especificidad simplifica en grado sumo el manejo productivo de la simbiosis. Indiscutiblemente, esto no significa que no exista en ocasiones algún grado de especificidad o quizás de mayor preferencia entre ambos simbiontes, pero su comportamiento va a estar condicionado en mayor grado por las características físico, químicas y biológicas del sustrato sobre el cual se desarrollen (Rai, 2001) y será dependiente de las diferentes prácticas agronómicas que se lleven a cabo. En correspondencia, la búsqueda de cepas eficientes también constituye un factor importante a tener en cuenta para el manejo de la simbiosis con fines productivos. En los últimos años, en Cuba, se ha logrado encontrar una regularidad en los efectos alcanzados con la inoculación de las especies de HMA (Fernández, 1999; Sánchez, 2001 y Ruiz, 2001) reportándose una importante especificidad suelo - cepa eficiente. Sin embargo, una especie puede ser adecuada o “eficiente” para una condición edáfica o un sustrato determinado y no ser efectiva, lo cual es una consecuencia de las condiciones en que se establezca la simbiosis y en lo fundamental, de la riqueza o disponibilidad de nutrientes del medio (Dodd y Thompson, 1994 y Fernández, 1999).

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En la actualidad se han utilizado satisfactoriamente estos hongos como inoculantes en la mayoría de los sistemas de producción de plantas, empleándose dos vías en lo fundamental: (1) la aplicación directa al sustrato, válida para la producción de posturas, semilleros y adaptación de vitroplantas y (2) el recubrimiento de las semillas, empleado en los cultivos de siembra directa (Fernández, F. 2003).

2.7. La micorrización en los sistemas de producción de vitroplantas.

2.7.1. Acerca del cultivo de tejidos En la última década, los sistemas de producción de vitroplantas han sido la herramienta más poderosa para la clonación y rápida multiplicación de numerosas especies de plantas, fundamentalmente las que revisten mayor importancia económica. El número total de plantas producidas por la vía de cultivo de tejidos, solo en Europa asciende a los 200 millones de unidades al año, de los cuales alrededor de 180 millones se producen en laboratorios comerciales (Lovato y col., 1996). Similares producciones se llevan a cabo en el Este Asiático y en Norte América. Dentro de sus múltiples aplicaciones se encuentran: la micropropagación, el cultivo de meristemos, la embriogénesis somática, la variación somaclonal, la selección in vitro y el cultivo de protoplastos y la hibridación somática (Debergh y Zimmerman, 1991). No obstante las exitosas aplicaciones de estas técnicas, persisten aún numerosos problemas que limitan la distribución de su uso. (Elmeskaoui y col., 1995) Típicamente los explantes asépticos crecen en condiciones de baja intensidad luminosa en pequeños potes o envases, sobre medios de cultivo artificiales que contienen azúcares, sales minerales, vitaminas y reguladores del crecimiento en concentraciones que exceden los niveles encontrados en los ambientes naturales (Leifert y col, 1995 y Nowak, 1998). Según Mc Clelland y Smith (1990); Jeong y col. (1995) y Matthijs y col. (1995), las condiciones de cultivo in vitro no permiten un adecuado intercambio de gases, lo cual produce alteraciones en el desarrollo de los explantes, así como también, modulación o represión de algunas vías metabólicas. Además se observa un mal funcionamiento estomático (Frommel y col., 1991 y Majada y col., 1995) y cutículas que muestran un pobre desarrollo y reducidos contenidos de ácidos grasos (Preece y Sutter, 1991). En los últimos años han tomado auge los estudios referidos a la escasez de aireación reportada en los envases de cultivo. Fujiwara y col. (1987) aseguran que la concentración de CO2 en el interior de los potes

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disminuye drásticamente una o dos horas después que comienza el fotoperiodo y se mantiene baja mientras dura este. Estudios recientes han demostrado que las plantas que son producidas in vitro pueden expresar su capacidad fotosintética si se cultivan sobre un medio libre de azúcar y en presencia de CO2 atmosférico como principal fuente de carbono (Desjardins, 1995a y Nguyen y col., 2001). La transferencia de las plantas de condiciones in vitro a ex vitro es uno de los momentos más críticos del proceso de micropropagación y la causa de los altos costos de producción. La alta mortalidad es observada frecuentemente durante el transplante debido, entre otros factores, a una reducida capacidad fotosintética (Cournac y col., 1991; 1992; Desjardins, 1995b; Preece y Sutter, 1991 y Van Huylenbroeck y Debergh, 1996).

2.7.2. Las fases in vitro y post in vitro La propagación de plantas a través de las técnicas de cultivo de tejidos consta de dos fases o estadios muy diferentes con requerimientos que varían en función de la especie vegetal de la cual se trate. Tanto la fase in vitro como la ex vitro juegan un importante papel en el proceso. La manipulación exitosa de los medios de cultivo empleados in vitro, así como de los sustratos para la adaptación, estarán en correspondencia con las especies de plantas y sus requerimientos nutricionales. Las plantas que crecen in vitro lo hacen en condiciones que, paradójicamente, le proporcionan cierto estrés fisiológico debido a la fuente de carbono que les es suministrada (en forma de azúcares), lo cual reduce grandemente su necesidad de fotosintetizar. A su vez, estas condiciones asépticas reducen también el estrés relacionado con la presencia de organismos patogénicos (Preece y Sutter, 1991). La combinación de estas situaciones constituye un gran inconveniente para la supervivencia de estas plantas tanto en casas de cultivo como en campo. La fase ex vitro, en particular, constituye la etapa más estresante del proceso. Las condiciones de las casas de cultivo no favorecen una sencilla adaptación de las vitroplantas; en estos ambientes las humedades relativas son sustancialmente más bajas y los niveles de iluminación más altos que en los envases dedicados el cultivo in vitro de las mismas. Según Preece y Sutter (1991) algunas características anatómicas, morfológicas y fisiológicas de las plantas se encuentran modificadas en esta etapa, teniendo en cuenta la fragilidad que presentan cuando son extraídas de los envases de cultivo. Estos autores relacionan una serie de aspectos a tener en cuenta al analizar las posibles modificaciones como los vinculados con la pérdida de agua (cutícula, estomas e hidátodos), así como con las hojas, los tallos, la morfología radical y el

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proceso fotosintético. En consecuencia, se reporta que durante esta fase de aclimatación las plántulas tienen muy baja tasa fotosintética, lo cual dificulta la transformación desde su condición heterotrófica hacia una autotrófica. (Davies y col., 2000)

2.8. Generalidades sobre el cultivo de la papa La papa (Solanum tuberosum L.) es uno de los cultivos no cereales más importantes para la humanidad (Torres, 1991), produciendo más calorías, proteínas, vitaminas y sales minerales por unidad de superficie y de tiempo que los principales cereales y que otras plantas con tubérculos y raíces comestibles; además de su gran versatilidad por ser integrada dentro de los sistemas de cultivo (CIP, 1998). Es cultivada en todo el mundo exceptuando las tierras bajas de los trópicos. Su centro de origen es la región Andina de Suramérica donde ha sido cultivada desde el año 8 000 antes de Cristo. Fue llevada a Europa por los años 1 500, pero lamentablemente solo muy pocas variedades fueron seleccionadas, dejando una estrecha base genética en las especies cultivadas. En las zonas templadas, actualmente se concentra más del 90% de la producción mundial (Rojas, 1996) y muy poco en las regiones tropicales húmedas debido a su propensión a ser infestada por numerosos organismos patógenos y plagas, así como a la dificultad de conservación de los tubérculos; sin embargo presenta una amplia capacidad de adaptación a condiciones variables de clima y suelo, por lo que se planta en más de 130 países, ocupando el 40% aproximadamente del área cultivada a escala mundial. (Struik y Wiersema, 1999) El desarrollo industrial de este cultivo se ha incrementado durante los últimos 50 años, especialmente con respecto a la producción de semillas y los sistemas de multiplicación. La producción de vitroplantas, microtubérculos y minitubérculos se han convertido en tecnologías que son fácilmente adaptables a las posibilidades y necesidades locales. Existen numerosas formas de propagar este cultivo incluso ya sea bajo condiciones asépticas (para rápida multiplicación, mejoramiento genético, obtenerla libre de enfermedades o para almacenarlas por largos períodos de tiempo) o bajo condiciones más o menos naturales (casa de cultivo, campo) (Struik y Wiersema, 1999). De hecho la planta de papa es extremadamente versátil y para su multiplicación pueden emplearse tanto células individuales como tejidos, meristemos, brotes, cortes de tallos, tubérculos, partes de tubérculos, semillas verdaderas de las bayas, etc. El cultivo de la papa en Cuba es uno de los renglones de mayor importancia para la alimentación de la población. El área utilizada para el cultivo es aproximadamente de 15 000 hectáreas (Estévez y col., 2001).

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En nuestro país la papa se cultiva en las zonas occidental y central y en menor medida en la oriental, fundamentalmente en la época de seca (noviembre – diciembre) cuando las temperaturas son más bajas.

2.9. Micorrización de plántulas micropropagadas. En los sistemas de producción de plantas micropropagadas el sustrato de crecimiento se encuentra enriquecido nutricionalmente y por otro lado deficitario de microorganismos, como resultado, las plantas se desarrollan frágiles y susceptibles a cualquier cambio o variación ambiental al que se sometan (Dolcet- San Juan y col., 1996). La transferencia de las plantas de condiciones in vitro a ex vitro es uno de los factores mas críticos dentro de la micropropagación y una de las causas de los altos costos de producción debido a las altas tasas de mortalidad que frecuentemente se reportan (Elmeskaoui y col., 1995). Con el objetivo de incrementar las tasas de crecimiento y sobrevivencia de las plántulas en este estadio se han enfocado las investigaciones hacia el control de las condiciones ambientales, como por ejemplo provocando incrementos en la intensidad luminosa y/o en las concentraciones de CO2 (Desjardins y col., 1990). Otro intento ha sido el de variar las condiciones ambientales durante la multiplicación o el estadio de enraizamiento de las vitroplantas, incluyendo también incrementos en los niveles de iluminación y en las concentraciones de CO2 en los tubos de cultivo, así como disminución de la concentración de sacarosa en los medios (Desjardins y col., 1990 y Hdider y Desjardins, 1994). No obstante, en la actualidad numerosos investigadores aseguran que la introducción de determinados inoculantes microbianos por la vía de la micropropagación podría ser la solución a estos problemas (Dolcet-San Juan y col., 1996; Lovato y col., 1996; Nowak, 1998 y Rai, 2001). Aunque la micropropagación es una técnica establecida para la producción de plantas de alta calidad, Nowak (1998) asegura que si las condiciones de cultivo son bien ajustadas entonces pueden crearse asociaciones artificiales con algún microorganismo en particular o con grupos de ellos. Por otra parte, también plantea que estos individuos no solo pueden actuar como inductores de resistencia al estrés, sino que pueden ocupar micrositios en la rizosfera de las plantas hospederas haciendo a estas inaccesibles al ataque de patógenos.

2.9.1 . Micorrización en condiciones ex vitro En un intento por utilizar este potencial para perfeccionar el cultivo de tejidos de plantas, algunos investigadores han procedido a la inoculación de éstas durante el transplante a la fase adaptativa (Chávez y Ferrera - Cerrato, 1990; Wang y col., 1993; Varma, 1994; Dolcet - San Juan y col., 1996 y Davies y col., 2000).

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Los estudios realizados en esta fase, por lo general, demuestran un incremento importante en las variables de crecimiento y vigor, como altura de las plantas, diámetro del tallo, número de hojas y área foliar así como también en la tasa de sobrevivencia de las plántulas. Dolcet - San Juan y col. (1996) realizaron la inoculación de plantas de nuez micropropagadas y encontraron que de las plantas controles no inoculadas solo sobrevivió el 20 %, mientras que del 60 al 80 % de las plantas previamente inoculadas con Glomus mosseae y G. intraradices sobrevivieron al transplante. Además reportaron cierta dependencia con el genotipo en cuanto a la capacidad adaptativa de las variedades estudiadas. Similares resultados han sido reportados desde hace algunos años por numerosos investigadores en una gran variedad de cultivos: Chávez y Ferrera Cerrato (1987) encontraron incrementos en la masa vegetal (343 %) y en la longitud del estolón (17 %) en plantas de fresa; Guillemin y col. (1992) y Lovato y col. (1996) reportaron mayor área foliar y altos niveles de infección y frecuencia de arbúsculos en vitroplantas de piña y uva previamente inoculadas; así mismo, Vidal y col. (1992) y Azcón-Aguilar y col. (1992) manifestaron incrementos en los porcentajes de sobrevivencia en plantas de aguacate micropropagadas; Declerck y col. (1994) y Noval y col. (1995 y 1997) corroboraron los resultados anteriores al estudiar vitroplantas de piña y banano, respectivamente. Según Ponton y col. (1990) los beneficios de la inoculación dependían del medio de crecimiento o sustrato empleado y del grado de colonización radical (Wang y col., 1993) alcanzado durante el periodo. Como en la mayoría de los casos la estimulación del crecimiento de las plantas fue expresada solo al finalizar la fase de adaptación, Wang y col. (1993) sugirieron el desarrollo de un sistema de cultivo en el cual los hongos micorrizógenos fueran introducidos in vitro, durante el estadio de enraizamiento, para asegurar la sobrevivencia de las plantas durante esta importante fase.

2.9.2 Micorrización en condiciones In vitro La utilización de inoculantes microbianos previos al transplante, en la micropropagación es, para numerosos investigadores, el blanco principal de atención para inducir la resistencia al estrés de las plantas producidas in vitro (Elmeskaoui y col., 1995; Nowak y col., 1995; Balla y col., 1997; Murphy y col., 1997 y Wilhelm y col., 1997). Las respuestas de resistencia inducidas por estos inoculantes han sido mayormente estudiadas en las plantas cultivadas in vivo, sin embargo, tales respuestas para las producidas in vitro solo han sido reconocidas recientemente (Herman, 1996) e identificadas como “Biotización”. Según Nowak (1998), la biotización no es más que la respuesta metabólica de las plantas que crecen in vitro a los inoculantes

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microbianos, induciendo cambios en el desarrollo y la fisiología de las plantas e incrementando la resistencia al estrés de los propágulos derivados. El establecimiento de asociaciones simbióticas pudiera también incluirse en esta categoría (Preininger y col., 1997). Los beneficios que brinda el uso de inoculantes micorrízicos sobre las plántulas en estadios in vitro han sido reportados por algunos autores (Hooker y col., 1994; Elmeskaoui y col., 1995; Nowak, 1998; Hernández - Sebastia y col., 1999 y Rai, 2001). En sentido general las plántulas presentan mayor crecimiento y desarrollo del tallo y las raíces así como, incrementos en el número de hojas y en el área foliar. Se ha demostrado también que las plantas micorrizadas muestran variaciones en el potencial osmótico con respecto a las no micorrizadas, lo cual es reconocido por los autores como una ventaja realmente importante desde el punto de vista de adaptación a las nuevas condiciones. No obstante, el desarrollo y establecimiento de la simbiosis planta - hongo micorrizógeno in vitro constituye, aún en la actualidad, un gran problema. Primeramente por la alta posibilidad de contaminación del inóculo micorrízico, en segundo lugar por el comportamiento del hospedero in vitro y finalmente por la naturaleza obligada del endófito (Rai, 2001).

2.10. Necesidad de esterilización para la germinación de los propágulos La desinfección superficial de los propágulos en general, usados como inoculante, es un requisito de suma importancia para la exitosa formación de la micorriza en condiciones in vitro (Bécard y Piché, 1992). La descontaminación se requiere, tanto para evitar la proliferación de contaminantes, como para asegurar que los microorganismos asociados con las esporas de estos hongos, no influyen en los resultados experimentales (Walley y Germida, 1996). Desde comienzos de siglo ya se realizaban los primeros trabajos sobre desinfección de propágulos micorrízicos, los cuales estaban encaminados a descontaminar hifas de hongos micorrizógenos con el objetivo de promover su recrecimiento en condiciones axénicas. Los estudios de Jones (1924), Niell (1944) y Magrou (1946), aportaron datos interesantes acerca de la temática y reportaron diferentes tratamientos que efectivamente destruían los microorganismos no deseados, pero que también eliminaban a los endófitos. No fue hasta que aparecieron los antibióticos que Tolle (1958) consiguió obtener un pequeño recrecimiento hifal bajo condiciones asépticas. Lamentablemente esta metodología no fue adoptada por otros investigadores, debido probablemente al descubrimiento de Mosse (1953) y Gerdemann (1955), quienes modificaron la base de las investigaciones sobre cultivo axénico, al pasar de las raíces a las esporas.

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A partir de entonces han sido numerosos los grupos que han dirigido sus investigaciones en ese sentido con diferentes fines, para los cuales se requiere de la descontaminación de las esporas. El uso de esporas asépticas para los estudios de laboratorio ha permitido dar algunos pasos en las investigaciones sobre el cultivo de hongos micorrizógenos arbusculares bajo condiciones axénicas, lo cual actualmente, constituye una preocupación y representa uno de los retos de la biología moderna (Payró y col.,1998). Las esporas pregerminadas han sido utilizadas no solo con este fin, sino también, con el de obtener cultivos duales con raíces transformadas genéticamente y el de producir plantas micropropagadas micorrizadas in vitro (Payró y col., 1998).

2.10.1. Métodos de esterilización total y parcial Muchos han sido los procedimientos utilizados para esterilizar la superficie de las esporas (Mosse, 1962; Tommerup y Kidby, 1980; Bécard y Fortín, 1988; Paula y Siqueira, 1990; Bécard y Piché, 1992; Colozzi - Filho y col., 1994 y Walley y Germida, 1996). La mayoría de los investigadores prefieren soluciones de Cloramina T(2%) con trazas de surfactante y antibióticos como la estreptomicina y la gentamicina (Walley y Germida, 1996), aunque también se han empleado el hipoclorito de sodio, el formaldehído, etc. (Colozzi-Filho y col., 1994). El éxito en el uso de estas soluciones desinfectantes es altamente dependiente de cómo son manipuladas y sobre qué material. Es conocido que las características de las esporas son dependientes de la especie a la cual pertenezcan, incluyendo el número y grosor de las paredes y los rasgos o caracteres distintivos tenidos en cuenta, todo lo cual influirá en el grado de desinfección que debe ser empleado (Walley y Germida, 1996). El material del hongo que va a ser desinfectado debe ser purificado hasta donde sea posible, pues en muchas ocasiones los contaminantes provienen de esporas viejas o de sus restos (Bécard y Piché, 1992). No obstante, la extracción de esporas del suelo por la técnica de Wet Seiving (Gerdeman y Nicolson, 1963), está sujeta a gradientes de centrifugación que remueven las esporas muertas y otros desechos. Este método aísla las esporas jóvenes y saludables que son, por lo general, más fáciles de desinfectar. Para la descontaminación han sido empleados diversos agentes oxidantes y antibióticos (Mosse,1962; Tommerup y Kidby, 1980; Bécard y Fortín, 1988; Tylka y col., 1991; Colozzi - Filho y col., 1994 y Payró y col., 1998). Entretanto, las informaciones sobre los daños causados a las esporas por estos productos son escasas. Estudios realizados de viabilidad de las esporas después de la descontaminación con productos químicos, pueden ofrecer información valiosa sobre la habilidad de éstas de sobrevivir operaciones de

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laboratorio y al mismo tiempo, esclarecer ciertos aspectos sobre el desarrollo y la sobrevivencia de los HMA en su hábitat natural (Colozzi - Filho y col.,1994). Lamentablemente, algunos de los procedimientos para esterilizar la superficie de las esporas que se reportan rutinariamente, rara vez informan los niveles de descontaminación logrados. En adición, la mayoría de los métodos empleados en la actualidad son de alto impacto y por lo general, destruyen la totalidad de los contaminantes asociados a las paredes de las esporas (Walley y Germida, 1996). Los prolongados tiempos de desinfección y las altas concentraciones de los descontaminantes destruyen no solo la microbiota asociada, sino también bacterias que se encuentran embebidas en dichas paredes (Colozzi - Filho y col., 1994); esto podría influir en que no se logren frecuentemente los porcentajes de germinación deseados, teniendo en cuenta la influencia positiva que pueden tener algunos de ellos en los eventos previos al proceso germinativo.

2.11. Técnicas empleadas para la micorrización in vitro El reto que constituye el cultivo axénico de los hongos endomicorrízicos fue abordado desde comienzos de la década del 70 por Mosse y Hepper (1975), quienes comenzaron a inocular propágulos de hongos endomicorrízicos en plántulas y sobre cultivos de raíces. Otros grupos de investigadores enfrentaron el reto de establecer la simbiosis micorrízica sobre un medio de cultivo axénico (Hayman, 1983; Miller - Wideman y Watrud, 1984; Mugnier y Mosse, 1987; Bécard y Fortín, 1988; Gemma y Koske, 1988; Becard y Piché, 1989; Chabot y col., 1992; Elmeskaoui y col., 1995; Declerck y col., 1996 y 1998 y Pawloska y col., 1999). En los últimos quince años se han realizado un sinnúmero de investigaciones en función de garantizar un desarrollo in vitro exitoso de los propágulos de HMA, no solo con el audaz propósito de lograr su crecimiento en condiciones artificiales, sino también con el fin de garantizar la inoculación de vitroplantas en esta fase de desarrollo del cultivo. Según Vestberg y Staun (1994), los protocolos de inoculación deben ser diseñados para cada especie de planta en particular, teniendo en cuenta la tasa de crecimiento y desarrollo radical y el número de transplantes realizados. La selección de la cantidad (Morandi y col., 1979; Ravolarinina y col., 1989; Guillemin y col., 1992 y Morte y col., 1996) y la calidad del inóculo es un factor importante a tener en cuenta tanto para la micorrización in vitro como in vivo (Vestberg y Ousukainen, 1996). El inóculo no solo debe estar puro sino también producir los efectos biológicos deseados.

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Las hifas, esporas y fragmentos de raíces micorrizadas han sido empleadas como inóculo ya sea para la micorrización in vitro como in vivo, así como también para el establecimiento del hongo micorrízico en el cultivo de raíces, transformadas o no, in vitro (Mosse y Hepper, 1975; Strullu y Romand, 1986; Ravolarinina y col., 1989; Schubert y col., 1990; Elmeskaoui y col, 1995; Azcón - Aguilar y col., 1996; Declerck y col., 1996, Morte y col., 1996 y Hernández - Sebastia y col., 1999). Recientemente Declerck y col., (1998) comenzaron a emplear las vesículas, que producen algunas de las especies de estos hongos en el interior radical, como una efectiva fuente de inóculo. Las técnicas de inoculación publicadas hasta la fecha difieren dependiendo del sustrato o de la naturaleza del inóculo empleado (Rai, 2001). Las plantas obtenidas a través de las técnicas de cultivo de tejidos se producen sobre medios sólidos, semisólidos y líquidos, cuya composición varía dependiendo de la especie de planta que se esté cultivando y de los propósitos del productor; sin embargo, los cultivos duales de raíces y hongos micorrizógenos son establecidos sobre medios sólidos, particularmente sobre medio White modificado (Mínimo) (Pawloska y col, 1999). La selección del medio es muy importante pues algunos tipos de agar contienen inhibidores propios debido a la presencia de trazas de metales pesados. Además, determinadas concentraciones de sulfato de sodio, fósforo y sacarosa en el medio de cultivo son de relevante importancia para el establecimiento del hongo (Bécard y Fortín, 1988 y Elmeskaoui y col., 1995). Los estudios realizados por Bécard y Fortin (1988) y Bécard y Piché (1989) profundizaron en el uso de las raíces transformadas como base para establecer una colonización micorrízica primaria. Esta metodología es, actualmente, un modelo de trabajo para establecer la simbiosis sobre plantas producidas in vitro. Las raíces micorrizadas, infectadas axénicamente son utilizadas como inóculo para, entre otros aspectos, resolver el problema de la contaminación (Elmeskaoui y col., 1995; Declerck y col., 1996, 1998 y Plenchette y col., 1996). Recientemente, una nueva técnica ha sido desarrollada para establecer la simbiosis micorrízica en plantas micropropagadas y evaluar su efecto sobre el crecimiento de las plántulas (Elmeskaoui y col., 1995 y Declerck y col, 1998). En ésta el hongo micorrizógeno se inocula sobre raíces, transformadas o no, cultivadas sobre medio M para establecer un cultivo dual (infección primaria) y luego esta asociación es usada para inocular plántulas micropropagadas creciendo sobre un sustrato artificial, dando como

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resultado un sistema de cultivo tripartita (Elmeskaoui y col., 1995), el cual permite la inoculación directa del hongo en un ambiente axénico. Este sistema es enriquecido con CO2 lo cual favorece el crecimiento de las plántulas. En el cultivo tripartita el CO2 es esencial por dos razones: proporciona las condiciones necesarias para la nutrición autotrófica del carbono y estimula el desarrollo de la colonización micorrízica (Chabot y col., 1992). Otro sistema fue el desarrollado por el grupo de A. Cassell´s (Murphy y col., 1997). Estos autores hicieron crecer vitroplantas de fresa sobre un sustrato inerte (espuma de poliuretano) bajo condiciones fotoautotróficas, con reducida concentración de sacarosa en el medio. A diferencia del método descrito anteriormente en este se emplean como inóculo esporas de hongos micorrízicos colocadas directamente debajo de las plantas y como resultado las plantas micorrizadas tuvieron mejor desarrollo y produjeron mayor número de estolones que los controles no micorrizados. En conclusión, las técnicas que incluyen el cultivo tripartita, o como también se le conoce “hairy - root technology”, tienen gran aceptación en la actualidad, no solo por el significativo rol que han jugado en el establecimiento de los HMA en hospederos transgénicos o no, sino también porque resultan una base adecuada para el entendimiento de los procesos que median la interacción endófito (hongo) - hospedero, el crecimiento y desarrollo del hongo micorrízico en medios de cultivo, la producción de metabolitos secundarios, la tolerancia a metales pesados, la bioprotección, la biorremediación y la actividad promotora del crecimiento (Rai, 2001)

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3. Materiales y Métodos.

Tarea 01. Producción de inoculante Fase I

En el invernadero de especies certificadas de hongos micorrizógenos arbusculares se desarrollo la producción del inoculante micorrízico para ser utilizado posteriormente en los procesos de micorrización de plántulas de papa. Nos planteamos como objetivo específico en este estudio, la obtención de un inoculante líquido para propiciar un manejo fácil y adecuado de los hongos micorrizógenos tanto en los medios de cultivos, como en la fase de adaptación de las vitroplántulas antes mencionadas. Para llevar a cabo este trabajo, se desarrollaron los siguientes pasos:

- Inoculación de las especies micorrízicas Glomus clarum y Glomus fasciculatum individualmente, colocando 10 gramos de cepa pura por debajo de las semillas de Sorghum vulgare en el momento de la siembra, sobre un sustrato estéril de reproducción, arcilla caolinítica.

- Al término del ciclo de vida de la planta, se eliminó la parte aérea, y se obtuvo un sustrato sólido consistente en una mezcla de propágulos micorrízicos (raicillas colonizadas, micelio fúngico y esporas del propio hongo) y el propio soporte inicial, que tuvo las siguientes características micorrízica.:

a. Abundante micelio externo (> 100 mg/g suelo).

b. Adecuada colonización radical ( entre 80 y 87 %).

c. Glomus fasciculatum: 120 esporas.g-1 de sustrato.

Glomus clarum: 300 esporas.g-1 - Posteriormente se procedió a extraer los propágulos micorrízicos por

el método de decantado húmedo y tamizado a través de dos tamices de 400 y 40 um respectivamente, la fracción sólida que se recogió en el tamiz más fino, se centrífugo y luego se decantó la fracción líquida con los propágulos fúngicos.

- Una vez separado todos los componentes, estos fueron desinfectados superficialmente con sln de Cloramina T( 2%) y Sulfato de Estreptomicina e introducidos en diferentes soluciones estériles osmóticamente protectoras.

Este inoculante líquido fue logrado posteriormente al estudio de diferentes concentraciones de una solución osmótica protectora que por motivos de estar en estos momentos bajo solicitud de patente, no divulgaremos. Una vez lograda las soluciones mas promisorias y con el

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objetivo de demostrar la viabilidad del germoplasma fúngico dentro de estos medios, se montaron en el laboratorio de micorrizas arbusculares del INCA, dos experimentos de almacenamiento y viabilidad de esporas, colocando un número constante de 100 esporas viables dentro de tubos eppendorf, realizándose en cada tratamiento 10 observaciones. Determinaciones: Para cada una de las especies se realizaron dos pruebas, un conteo diario durante 7 días y posteriormente se estudiaron la mejor concentración de Medio Líquido, extendiéndose este procedimiento durante 8 meses, evaluándose en ambos casos, la capacidad de supervivencia de las esporas a través de la determinación visual de la calidad y coloración de las mismas. Fase II En la Universidad de Murcia, (España), se realizó un experimento con inoculantes líquidos de las especies de Glomus clarum y Glomus fasciculatum con el objetivo de conocer la capacidad germinativa y de colonización de este material fúngico almacenado 8 meses en medio líquido, para ello se emplearon cajas de petri con raicillas transformadas de zanahorias, cultivadas en medio Mínimo (Becard & Fortín, 1992) .( Fig. 1). En total se evaluaron 10 cajas de petri por especie de hongo micorrízico, en cada una de ellas se colocaron 50 segmentos de hifas maduras y 50 esporas, previamente lavadas con agua estéril tres veces e incubadas a una temperatura de 28oC, durante 60 días

Fig. 1. Raicíllas transformadas de zanahoria y cultivadas en medio Mínimo (Becard & Fortín, 1992) Determinaciones Se le realizaron observaciones cada 7, 15 y 30 días del porcentaje de germinación, así como la cuantificación de la colonización micorrízica a

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los 7, 15, 30, 40, 50 y 60 días, según el método de Tinción y estimación de el porcentaje de raíz micorrizada utilizada por el laboratorio del INCA ( Fernández, 1999). Fase III Con el objetivo de conocer la viabilidad del inoculante micorrízico frente a mezclas líquidas de fertilizantes comerciales, se procedió a incubar durante una semana, a temperatura ambiente, 0.1 ml del medio líquido de Glomus fasciculatum ( con 100±5 esporas y micelio) con 100 ml de distintas soluciones nutritivas de aplicación común en la agricultura o medios de sostenimiento de plantas. Las soluciones ensayadas contenían ácido nítrico y sulfato ácido de urea a razón de 5 y 2 ml l-1, respectivamente, junto con 20-6-6 (NPK) (25 g l-1, solución I), 10-40-10 (25 g l-1, solución II) y 18-18-18. (25 g l-1, solución III) Determinaciones En este caso de cuantificaron las esporas vivas y muertas, así como la presencia y abundancia de micelio extramátrico. Inmunodetección de esporas de HMA. Obtención de las esporas de Glomus clarum. Las esporas a emplear posteriormente, tanto en el esquema de inmunización como en la prueba de sensibilidad, se recuperaron del inoculante a través de la técnica de tamizado húmedo y decantado, y posteriormente se extrajeron por centrifugación en gradiente de Sacarosa + Tween 80 a 2000g durante 5 minutos (9). Una vez finalizada la centrifugación se procedió a realizar la extracción de las esporas de la interfase agua- sacarosa + Tween 80, auxiliados por una micropipeta. Todas las esporas se colectaron 24 h antes de iniciar los ensayos y se mantuvieron en una solución osmóticamente protectora (solución Ringer: NaCl 7.5 g/L, KCl 0.075 g/L, CaCl2 0.1 g/L y NaH2CO3 0.1 g/L) a una temperatura de 4oC. Proceso de esterilización de las esporas de Glomus clarum. Después de realizada la extracción de las esporas del inoculante, se procedió a su esterilización con empleo de un filtro (malla de acero-40 µm) reutilizable, esterilizable y acoplado a tapas horadadas de los tubos Eppendorf (8).

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Preparación del antígeno. Obtención de proteínas totales. Las proteínas también se obtuvieron a través del procedimiento de sonicación de esporas de G. clarum en un equipo Vibra-Cell®, utilizando como buffer de extracción Tris-HCl 0.61 M pH 8 (ácido cítrico 0.3 M, polivinil pirrolidona (PVP) 4%, polietilenglicol (PEG) 6000). La suspensión obtenida fue centrifugada a 15000g durante 30 minutos a una temperatura de 4°C y el sobrenadante fue almacenado a -20°C, hasta su posterior inoculación en conejos. La concentración de proteínas existente en este antígeno se determinó por el método de Bradford (10). Esquema de inmunización con proteínas totales como antígeno. Se utilizaron 3 conejos hembras de la raza Chinchilla con un peso aproximado de 2.5 Kg., producidos en el Centro Nacional de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). La primera inoculación para todos lo conejos en los tres esquemas de inmunización se realizó con diez pinchazos de 0.2 mL de 1 mL de proteínas totales equivalente a 80 µg/mL de proteínas totales del hongo en igual volumen de adyuvante completo de Freund (*artículo aceptado para publicar), en el lomo del conejo (12) dependiendo del tipo de antígeno utilizado contenido en 1 mL de agua destilada e igual volumen de adyuvante completo de Freund. Las restantes inoculaciones se realizaron a una concentración de 60 µg/mL con igual volumen pero de adyuvante incompleto de Freund. Estudio de especificidad del AcP. Con el objetivo de estudiar la especificidad de los antisueros producidos en este trabajo se utilizaron las especies de hongos Glomales anteriormente mencionadas. Detección de autofluorescencia en esporas de Glomus clarum. Para realizar la determinación de la capacidad de autofluorescencia se montaron las esporas en portaobjetos para fluorescencia, se excitaron con filtros de 280, 480 y 690 nm durante 5 minutos y seguidamente se observaron en un microscopio Olympus de epifluorescencia. Como control negativo se utilizó esporas expuestas a la luz blanca y esporas enfrentadas al conjugado fluorescente. Detección de esporas de Glomus clarum mediante ELISA. Se recubrió la placa de ELISA (FALCON® PRO-BINDTM) con el antígeno a una concentración de 1 µg/mL en tampón de recubrimiento (Na2CO3, 1.59 g/L; NaHCO3, 2.93 g/L; NaN3, 0.20 g/L, pH 9.5), se adicionaron las diluciones del suero por triplicado en tampón PBST-BSA1%. Se usaron

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las siguientes diluciones de AcP: 1/500, 1/1000, 1/3000 y 1/5000, seguidamente se añadieron 50 uL/pozo de IgG conejo-PhoA (SIGMA®) 1/2000, se añadió el sustrato de la enzima, el ρ-nitrofenilfosfato (ρ-NPP), disuelto en tampón dietanolamina pH 9.8, y se paró la reacción con una solución de carbonato de sodio 2M. La placa de ELISA se leyó en un equipo (Reader 230 ORGANON TEKNIKA) a 405 nm (13). Se tomó como criterio de positividad aquellas absorbancias que superaban tres veces el valor del blanco. Para esto se tuvo en cuenta los valores de absorbancia obtenidos con el suero preinmune.

Análisis estadístico.

Los valores de absorbancia obtenidos en el ELISA fueron sometidos a análisis de varianza (ANOVA) en el cual se incluyó el Test de Rangos Múltiples de Duncan, con un nivel de significación de p<0.01. Tarea 02. Las esporas utilizadas se aislaron del inoculante liquido a través de la técnica de Tamizado húmedo y decantado y posterior extracción por centrifugación en gradiente de sacarosa + Tween 80 a 2000 x g durante 5 minutos (Gerdemann y Nicholson, 1963, modificado por Herrera y col., 1995). Una vez obtenida la interfase agua - sacarosa + Tween 80 las esporas se extrajeron empleando una pipeta Pasteur. Este proceso se realizó 24 h antes de comenzar los estudios y tantas veces como fuera necesario. Las esporas fueron mantenidas en solución Ringer a 4 oC.

Desinfección y germinación de esporas de G. clarum

Primera fase Se estudiaron dos metodologías que incluyeron el uso de la Cloramina T (2%) como desinfectante químico combinado con Cefalexina (5%) como antibiótico y diferentes tiempos de exposición al mismo. Uno de los métodos fue propuesto por Barredo y col. (1995) quienes luego de obtenidas las esporas asépticas las incubaban para germinar en medio White modificado y el otro citado por Walley y Germida (1996), en el cual las esporas se colocaban en medio Agar Agua. Los materiales empleados, así como la metodología seguida fueron modificados durante el proceso de la siguiente manera:

la desinfección de las esporas se realizó en tubos Eppendorf sin centrifugación a bajos tiempos (2 y 6 minutos), sustituyendo dos centrifugaciones sucesivas

la manipulación de las esporas y del material desinfectante (Cloramina T y Cefalexina -IMEFA-) se realizó a través de filtros (malla de acero, 40 µm) esterilizables, acoplados a las tapas

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horadadas de los tubos Eppendorf, en sustitución de filtros millipore y membranas de 0.22 µm, empleando jeringas esterilizables de 15 mL.

Las esporas extraídas se colocaron en tubos Eppendorf y se lavaron durante 5 minutos en solución Ringer estéril, agitándose en vórtex para remover las impurezas. Posteriormente se procedió a realizar la desinfección comenzando con la solución de Cloramina T (2%) y empleando tiempos de exposición de 2 y 6 minutos de acuerdo al tratamiento en cuestión. Ambas soluciones (desinfectante y antibiótica) fueron preparadas a partir de la dilución del producto en agua destilada estéril. Una vez finalizado este paso las esporas se lavaron con agua destilada estéril dos veces consecutivas y se les añadió la solución de Cefalexina. Las esporas tratadas se pasaron a placas Petri conteniendo los diferentes medios en estudio empleando micropipeta Gibson de 200 µL y se incubaron durante 25 días a 28oC colocando las placas invertidas. Se inocularon 10 placas por tratamiento a razón de 50 esporas por placa. Para el montaje de este experimento se empleó un Diseño Completamente Aleatorizado con arreglo bifactorial (2x4) y tres repeticiones, en el cual los factores fueron: soluciones desinfectantes y medios de cultivo para incubación.

Los tratamientos estudiados fueron los siguientes: 1. Cloramina T (2%) + Cefalexina (2 min.) 2. Cloramina T (2%) + Cefalexina (6 min.) 3. Cefalexina (6 min.) 4. Control (Agar Agua + esporas sin desinfectar) 5. Cloramina T (2%) + Cefalexina (2 min.) 6. Cloramina T (2%) + Cefalexina (2 min.) 7. Cefalexina (6 min.) 8. Control (White modificado + esporas sin desinfectar)

Medio Agar Agua

m

Segunda fase Después de evaluada la efectividad de la mezcla de Clorantibiótico como solución desinfectante, se procedió a incoaspectos importantes en el protocolo de trabajo con visrespuesta al objetivo referente a la micorrización in vitro de ppapa, cultivo que manifiesta un alto ritmo de crecimiento condiciones. El primero fue la germinación de las esporas en medio lísegundo la utilización de una atmósfera de CO2 con el princrementar la homogeneidad y rapidez de la germinación,estimular el crecimiento del tubo germinativo. En este nuevo ensayo se mantuvo la desinfección quCloramina T (2%) utilizando como antibiótico una mezcla de

Medio White odificado

amina T y rporar dos tas a dar lántulas de bajo estas

quido y el opósito de así como

ímica con Sulfato de

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Streptomicina y Kanamicina, partiendo de la metodología propuesta por Bécard y Fortín (1988) modificada por St. Arnaud y col., (1996), a la cual se le realizaron algunas variaciones en este trabajo. Primeramente se partió de esporas lavadas previamente aisladas del inoculante por la técnica antes descrita, a las cuales se les adicionó una mezcla de Tween 20 + Cloramina T (2%) durante 10 minutos, seguida de lavados sucesivos con la mezcla de los antibióticos (5 veces) Sulfato de Estreptomicina (1%) + Kanamicina (0.5%) durante 1 ó 2 minutos. Posteriormente las esporas se incubaron durante toda la noche a 4 oC en la solución de antibióticos y pasado este tiempo se les añadió Cloramina T (2%) durante 10 minutos. Para finalizar se lavaron varias veces con agua destilada estéril y se pasaron a solución Ringer. Los antibióticos se filtraron a través de membranas miliporo (Tipo HA, 4.0 cm de diámetro y 0.22 µm de poro). Todo el proceso de desinfección se realizó en un beaker de 250 mL a través de un tamiz de 40 µm de diámetro de poro. Luego de realizada la desinfección de las esporas se procedió a comprobar la eficacia del método y se inocularon 20 esporas por placa (5 en total) sobre un medio rico, Agar Nutriente. Estas se incubaron a 28 oC durante cinco días. A diferencia de los métodos anteriormente descritos en que las esporas germinaron sobre medio sólido, en este se colocaron a germinar en frascos Gerber conteniendo solución Ringer, o sea un medio líquido que facilitaba la posterior inoculación de las mismas. Los frascos con esporas se colocaron dentro de una cámara o jarra de CO2 (BBL®, Gas Pack®) (Fig. 4). Esta cámara incluye un sobre o envoltura que contiene una tableta que combina bicarbonato de sodio y ácido cítrico, la cual al reaccionar con agua es capaz de generar CO2 y producir una atmósfera de aproximadamente 5 - 10 % del gas en cuestión. Las esporas, en estas condiciones, se incubaron durante tres días a 28 oC de temperatura, realizándose con posterioridad evaluaciones de porcentaje de germinación y contaminación.

Determinaciones realizadas Se realizaron las determinaciones correspondientes a % de Germinación y de Contaminación. Se consideró una espora germinada cuando la misma presentaba crecimiento del tubo germinativo y en el caso de la contaminación se consideró el número de esporas contaminadas en una placa con respecto al número total de esporas que se sembraron en cada una.

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Análisis Estadístico

El procesamiento de los resultados se realizó mediante un Análisis de Varianza y posterior Test de Duncan para p≤0.001 en caso de existir diferencias significativas entre las medias.

Figura 4. Cámara de CO2 o Gas Pack® en la cual se colocaron las esporas para acelerar su germinación.

Tareas 03 y 04.

Inoculación con HMA (Glomus clarum) de vitroplantas de papa en estadio de enraizamiento

Material vegetal Se utilizaron vitroplantas de papa común (Solanum tuberosum L. var. Alfa) obtenidas por micropropagación sobre medio MS (Murashige y Skoog, 1962), en estadio de enraizamiento. Las mismas tenían entre 7 y 10 días de subcultivadas, presentando un sistema radical poco desarrollado que oscilaba entre 3 y 5 raíces y unas 4 ó 6 hojas por planta.

Establecimiento del cultivo dual Con el propósito fundamental de lograr un establecimiento exitoso del hongo en las raíces se realizó un experimento que consistió en la inoculación de vitroplantas de papa con esporas germinadas de G.

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clarum, en el cual se diseñó un nuevo medio de cultivo (N) con el que se pretendía garantizar el crecimiento y desarrollo de ambos organismos. El nuevo medio estaba compuesto por una combinación de nutrientes de los medios MS (comúnmente empleado para la micropropagación de este cultivo) y Mínimo (M) (Bécard y Fortín, 1988) mezclado con vermiculita estéril en proporción 1:1, este último se reporta en la literatura como uno de lo más utilizados para el crecimiento in vitro de los hongos micorrizógenos (tabla 1). Se sembraron 3 plantas por frasco y se montaron 5 frascos por tratamiento bajo un Diseño Completamente Aleatorizado. Los tratamientos fueron los siguientes:

1. Medio N + HMA 2. Medio N 3. Medio MS (Control)

Posteriormente, en una segunda fase o repetición se incluyó en los tratamientos el medio M, también como base para el establecimiento del cultivo dual. En este caso se trabajó con igual número de plantas por tratamiento, los cuales son descritos a continuación:

1. Medio N + HMA 2. Medio N 3. Medio M + HMA 4. Medio M 5. Medio MS (Control)

Tabla 1. Composición química de los medios de cultivo.

COMPONENTES MS (mg. L-1) M (mg. L-1) N (mg. L-1)

CuSO4. 5 H2O 0.025 0.13 0.025 MgSO4. 7 H2O 370.00 731.0 370.00 MnSO4. 4 H2O 22.30 - 22.30 ZnSO4. 7 H2O 8.60 2.65 8.60 KNO3 1 900.00 80.00 950.0

NH4NO3 1 650.00 - 82.50 Ca(NO3)2. 4 H2O - 288.0 - KCl - 65.00 - CaCl2. 2 H2O 440.00 - 440.00 CoCl2 0.025 - 0.025 MnCl2. 4 H2O - 6.00 - KH2PO4 170.00 4.80 5.00

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COMPONENTES MS (mg. L-1) M (mg. L-1) N (mg. L-1)

NaFeEDTA - 8.00 - Na2EDTA 37.25 - 37.25 FeSO4. 7 H2O 27.80 - 27.80 KI 0.83 0.75 0.40

H3BO3 6.20 1.50 6.20 NA2MoO4. 2 H2O 0.25 0.0024 0.25

Sacarosa 30 000.00 10 000.00 20 000.00 Glicina 2.00 3.00 3.00 Tiamina hidroclorada

0.10 0.10 0.10

Piridoxina hidroclorada

0.50 0.10 0.10

Ácido nicotínico 0.50 0.50 0.50 Myo inositol 100.00 50.00 50.00 Agar Bacteriológico 10 000.00 10 000.00 2 000.00

El pH de los medios fue ajustado a 5.5 antes de la esterilización. Leyenda: MS: Murashige & Skoog; M: Medio Mínimo y N: Medio Nuevo. Las esporas del hongo micorrizógeno previamente desinfectadas y germinadas se inocularon directamente sobre las raíces empleando micropipeta Finnipipette® de 1000 µL a razón de 100 µL por planta, los cuales aportaban entre 50 y 55 esporas en cada aplicación. Los frascos se colocaron en una cámara de crecimiento durante el tiempo que transcurrieron los ensayos, con un fotoperiodo de 16 horas luz y 8 de oscuridad, 200 - 300 µE.m-2. seg-1 de iluminación y 20 oC de temperatura.

Determinaciones realizadas A los 35 días de la inoculación se muestrearon 12 plantas por tratamiento a las cuales se les realizaron las siguientes determinaciones: largo radical (cm), altura de la planta (cm) y masa fresca foliar y radical (g), así como concentración de clorofila total (µg de clorofila/g masa fresca) utilizando un Espectrofotómetro U.V.visible (CARY 50) y empleando la siguiente expresión matemática: Clorofila Total = (20,2 x Abs. 645 nm) + (8,05 x Abs. 663 nm) x (mL de acetona)

Masa fresca (g)

Abs. = Absorbancia Además se realizaron tinciones a las raicillas de las vitroplantas utilizando la técnica descrita por Elmeskaoui y col. (1995) modificada por el autor, al sustituir el colorante fuchina ácida por azul de tripano, para comprobar la presencia o no de colonización.

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Análisis Estadístico Los datos se procesaron a través de un Análisis de Varianza de clasificación simple y posterior docimación con el Test de Duncan para p ≤ 0.001 en los casos en que existió diferencias significativas entre las medias. Tarea 05.

Inoculación con HMA de vitroplantas de papa en fase de adaptación. Estudio de diferentes cepas, concentrados de especies y sustratos. En este experimento se inocularon vitroplantas de papa común aptas para el transplante con 3 cepas de hongos micorrizógenos (Glomus clarum, G. fasciculatum - Taxter - Gerdemann & Trappe emend. Walker & Koske y G. intraradices Schenck & Smith) procedentes del cepario del INCA y dos concentrados de especies, uno de Selva y otro de Desierto (estos serán los nombres con los cuales se les hará referencia a lo largo del documento) obtenidos en el laboratorio de Bioquímica Ecológica del CINVESTAV, Unidad Irapuato. Se evaluaron asimismo dos sustratos diferentes, uno compuesto totalmente por turba de musgo (Sunshine # 3), utilizado frecuentemente por numerosos laboratorios para la adaptación de vitroplantas, y otro por una combinación de la mezcla antes mencionada y vermiculita en proporción 2:1 con el fin de variar las condiciones nutricionales y así valorar el comportamiento de las cepas y concentrados de especies vinculado con la riqueza del sustrato. El inóculo simple empleado contaba con las siguientes características: G. clarum (140 esporas/g), G. fasciculatum (100 esporas/g) y G. intraradices (60 esporas/g). El transplante de las vitroplantas se realizó a macetas colocando una planta en cada una de estas y un total de 10 macetas por tratamiento. La inoculación se realizó en el momento del transplante a razón de 2g de inóculo por planta. Al cabo de 15 días de transplantadas se le añadió solución nutritiva de Long Ashton, LANS (Hewitt, 1966), con pH ajustado a 5.6 y una concentración de fósforo de 22 ppm en el caso de los tratamientos micorrizados. Se empleó un Diseño Completamente Aleatorizado bajo arreglo bifactorial (6x2) y los factores estudiados fueron las cepas (3 cepas de HMA, 2 concentrados de especies de HMA nativas y 1 control - 6 -) y los sustratos (2).

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Los tratamientos estudiados fueron los siguientes:

1. G. clarum 2. G. fasciculatum 3. G. intraradices 4. Selva 5. Desierto 6. Control 7. G. clarum 8. G. fasciculatum 9. G. intraradices

Sunshine # 3

Sunshine #3 + Vermiculita (2:1)10.Selva 11.Desierto 12.Control

Determinaciones realizadas Al cabo de 35 días de transplantadas se realizaron las siguientes evaluaciones a 5 plantas por tratamiento escogidas al azar:

• Morfoagronómicas: Largo radical (cm), Masas seca foliar, radical, de tubérculos y total (g)

• Fúngicas: Porcentaje de Colonización (%) y Densidad Visual (%), empleando estereomicroscopio (Zeiss, West Germany -5- )

• Fisiológicas: Tasa fotosintética (µmolCO2.m-2.s-1) y Transpiración (µmolH2O.m-2.s-1) utilizando un Analizador portátil de fotosíntesis (LI-6250, LI-COR, Inc. Nebraska, USA), así como se determinó la variable Eficiencia en el uso de agua EUA (%) a partir de la siguiente expresión matemática: EUA= Tasa fotosintética (µmol.m-2.s-1)

Transpiración (µmol.m-2.s-1) • Contenidos nutricionales foliares: macronutrientes P (%), K (%),

Ca (%), Mg (%) y los micronutrientes Mn (ppm), Cu (ppm) y Zn (ppm), empleando para el caso del P el método colorimétrico reportado por Jackson (1970) y para el resto de los elementos Espectrofotómetro de absorción atómica.

Análisis Estadístico Para el procesamiento de la información se utilizó el paquete estadístico “Statistical para Windows”, realizando los Análisis Multivariados de Componentes Principales (Varela, 1998) y Conglomerado Jerárquico de Ligamento Completo (Cluster) con el propósito de realizar una valoración integral de los diferentes tratamientos en estudio (cepas y concentrados de especies de HMA y sustratos) y agruparlos en función de sus efectos. Se realizaron además, los Análisis de Varianza correspondientes a las variables que estuvieron más correlacionadas con la formación de las componentes, utilizando el programa estadístico Statgraphs 4.1, así como transformaciones a los valores de porcentaje pertenecientes a las variables fúngicas Colonización y Densidad Visual, según la expresión 2arcsen√x (Lerch, 1977).

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Resultados y Discusión. Tarea 01. Características del inoculante líquido de Hongos Micorrizógenos Descripción En la Foto 1 y 2 pueden observarse las esporas de Glomus fasciculatum y Glomus clarum respectivamente a los 8 meses de incubación en el medio líquido, en el primer caso, se aprecia la unión esporocárpica que puede reunir hasta 9 esporas en una misma estructura, las dos paredes celulares típicas de la especie y la unión directa del esporóforo sin estrechamiento de paredes en la base del mismo y el aspecto del producto con Glomus fasciculatum, con abundante presencia de mucílago, probablemente debido a la excreción de una glicoproteína soluble del citoplasma de estos hongos llamada Glomalina. así como las características morfológicas del segundo hongo, con las tres capas de pared celular y el típico poro ocluido que enlaza la base del esporóforo con la espora y la hifa de formación.

Foto 1. Diferentes esporas de Glomus fasciculatum. a: Esporas formando esporocarpos. b: Esporas en esporocarpo frente al reactivo de Meztler. d: Doble pared celular de la espora y unión directa del esporóforo sin estrechamiento de las paredes en la base del mismo c: Esporas en esporocarpos. d: Espora individual y unión con el esporóforo. e: Aspecto del LicoMic en las líneas de riego, nótese una gran cantidad de esporas y presencia de mucílago, presumiblemente Glomalina.

a b

d c

e

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Capa externa

Capa intermedia

Capa interna

Fig. 2. Esporas jóvenes de Glomus clarum, contenidas en el LicoMic. A. Diferentes capas de paredes. B. Poro del esporóforo sin ocluir.

Poro sin ocluir

Estabilidad del inoculante micorrízico Líquido Tras realizar ensayos tendentes a seleccionar un soporte líquido, capaz de asegurar la viabilidad del inoculante durante un prolongado período de tiempo, se elaboraron inoculantes a base de las especies anteriormente mencionadas, las cuales tuvieron una estabilidad superior a 8 meses, debido a las peculiaridades del componente liquido utilizado en su elaboración (Tabla 1).

Tabla 1. Número de esporas de Glomus fasciculatum y Glomus clarum viables en el medio líquido (ML) y en agua, durante 8 meses de incubación.

Meses de incubación Tratamientos

1 2 3 4 5 6 7 8

Glomus fasciculatum

(ML) 103a 101a 97a 100a 100a 96.5a 97.5a 98a

Glomus clarum (ML)

100a 101a 100a 103a 102a 100a 101a 99a

Glomus fasciculatum

(Agua) 42b 30b 26.5b 17.5c 17.5b 17.5b 10b 11b

Glomus clarum (Agua)

45b 31b 26.3b 21b 18.2b 15.3b 9.2b 8.5c

Es x 0.12*** 0.15*** 0.26*** 0.31*** 0.14*** 0.09*** 0.25*** 0.31***

La importante pérdida de viabilidad de las esporas de ambas especies en el agua obligó a realizar otro ensayo tendente a conocer con qué

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velocidad se produce la pérdida de viabilidad de las esporas en este medio.

Tabla 2. Número de esporas de Glomus fasciculatum y Glomus clarum viables en medio líquido (ML) durante 164 horas.

Horas de incubación Tratamientos

24 48 72 96 120 144 164

Glomus fasciculatum (ML)

103.5a 104.5a 100.5a 94b 108a 107a 101.5a

Glomus clarum (ML) 100a 101a 100a 102a 100a 101a 100a

Glomus fasciculatum (Agua)

82b 57.5c 48.5c 49.5c 42b 44b 45b

Glomus clarum (Agua) 79c 78b 65b 48c 42b 41b 42b

Es x 0.09*** 0.11*** 0.12*** 0.08*** 0.09*** 0.11*** 0.07***

Los resultados (Tabla 2) mostraron que si bien la pérdida de viabilidad se produce de forma progresiva, durante los dos a tres primeros días de acuerdo a la especies en cuestión, la viabilidad mantiene niveles altos, y durante los días cuatro y cinco, ésta continúa manteniendo niveles aceptables, del orden del 50 %. Pruebas de Germinación. Una vez estudiada la estabilidad de los medios líquidos, se procedió a conocer si estos inoculantes eran capaces de promover una infección y por lo tanto mantener capacidad germinativa luego de 8 meses de incubación.

Tabla 3. Porcentajes de germinación de esporas y micelio de Glomus fasciculatum y Glomus clarum en medio M, incubado a 28oC , durante 60 días.

Días de incubación

7 15 30 Tratamientos

Micelio Esporas Micelio Esporas Micelio Esporas

Glomus fasciculatum (ML)

10 n.s 25 n.s 47 n.s 40 n.s 62 n.s 52 n.s

Glomus clarum (ML) 15 n.s 24 n.s 46 n.s 41 n.s 63 n.s 51 n.s

En la tabla 3 se puede apreciar que las cepas pudieron expresar su capacidad germinativa hasta los 30 días de incubación con independencia de los propágulos fúngicos empleados no detectándose diferencias significativas en ninguno de los momentos estudiados.

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El propágulo fúngico que mayores valores alcanzó fue el micelio extramátrico, coincidiendo con la mayoría de los reportes científicos, no obstante para el caso de las esporas, también se encontraron elevados porcentajes de germinación. Este hecho, pudiera resultar muy interesante, teniendo en cuenta que las esporas de las especies de Glomus, poseen un bajo poder germinativo y pasan por largos períodos de dormancia, sin embargo el hecho de permanecer durante 8 meses en un medio líquido osmóticamente protector, indudablemente genera un fuerte stress en la zona de la pared externa que a nuestro juicio influyo sobre las capacidades germinativas, una vez extraídas de este medio y colocadas con condiciones favorables para la germinación. Los resultados observados en la Tabla 4 y la figura 3, permitieron aseverar que las esporas y micelio no solo germinaron, sino que produjeron una fuerte colonización gradual a partir de los 14 días de iniciado el experimento, siendo muy similar en ambas especies.

Tabla 4. Porcentajes de colonización de raicillas transformadas de zanahoria con las cepas de Glomus fasciculatum y Glomus clarum durante 60 días de

incubación en medio M a 28oC

Días de incubación Tratamientos

7 15 30 40 50 60

Glomus fasciculatum (ML)

0 n. s 12 n.s 24 n.s 35 n.s 46 n.s 56 n.s

Glomus clarum (ML) 0 n.s 5 n.s 11 n.s 32 n.s 57 n.s 62 n.s

40

a b

c d

f e

. Figura 3. (a): Esporas de Glomus fasciculatum germinadas a los 14 días, (b): colonización micorrízica a los 30 días, (c): Esporas de Glomus clarum germinadas a los 14 días, (d): colonización micorrízica a los 30 días, (e y f): Raicillas de zanahoria transformadas y teñidas con azul de tripano a los 15 y 30 días respectivamente, después de comenzada la germinación del micelio de Glomus fasciculatum. Estos resultados vienen a asegurar un alto porcentaje de esporas y micelio viables, cuando el inoculante se incorpore a los medios de cultivo, en consecuencia, cabe concluir que este inoculante puede ser aplicado a los medios de cultivos en condiciones de gran humedad sin afectar a los propágulos micorrízicos. Estabilidad en soluciones fertilizantes. A pesar de la adecuada estabilidad del germoplasma fúngico en las condiciones anteriores, convenía conocer si al utilizarlo mezclado con otras fuentes químicas podían producirse alteraciones importantes en la viabilidad de las esporas.

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Durante el ensayo, en la solución I se observó abundante micelio extramátrico, presencia de agregados de esporas y, a medida que transcurrió el tiempo, la presencia de un mucílago, que presumiblemente pudiera ser excreción de Glomalina, proteína soluble de citoplasma, causante, entre otras cosas, de la formación de agregados en el suelo, microbianos, etc. que atrapan gran número de esporas. El comportamiento de las soluciones II y III se caracterizó por la presencia de esporas siempre dispersas, poca presencia de micelio a las 24 h, y ausencia total de mucílago. La elevada concentración de P y K en estas soluciones podría ser la causa del comportamiento observado. En la Tabla 5 se puede apreciar el comportamiento de las variables viabilidad y mortalidad de esporas de LicoMic en las soluciones fertilizantes. En todos los casos, hubo presencia de esporas durante todo el ensayo, si bien, cabe destacar que la mayor presencia de esporas viables y menor mortalidad aconteció en la solución I, diferente significativamente del resto de las soluciones.

Tabla 5. Presencia de esporas brillantes y con estructura de pared intacta (V, %) y esporas necrosadas (M, %) en distintas soluciones fertilizantes durante 168 horas. Solución Tiempo (h)

0 24 48 72 168

V V M V M V M V M I 100 97.70a 2.34c 97.70a 0 97.70a 0 97.70a 0 II 100 66.70b 33.34b 66.70b 0 66.70b 0 66.70b 0 III 100 62.33c 37.67a 62.33c 0 62.33c 0 62.33c 0

Es x 0.12***

0.25***

0.15***

0.12*** 0

0.22*** 0

0.20*** 0

Es interesante destacar que la mortalidad de esporas en los distintos tratamientos aconteció en las primeras 24 h de contacto con las soluciones fertilizantes. Los altos niveles de N en la solución I no parecen afectar la viabilidad de las esporas, mientras que los altos niveles de P y K, en las soluciones II y III, podrían haber inducido un efecto osmótico causante de la mayor mortalidad de esporas. Sin embargo, cabe pensar que una mayor dilución del LicoMic, a nivel de cuba fertilizante, podría evitar los efectos adversos observados. Estos hechos permiten concluir que el medio líquido micorrizógeno para Glomus clarum, especie mas pequeña y mas débil en estructura de pared celular, puede mezclarse a altas concentraciones con el complejo 20-6-6 sin pérdida significativa de la viabilidad de las esporas. Las mezclas con los complejos 10-40-10 y 18-18-18 sin bien pueden inducir mayores pérdidas de viabilidad de las esporas, ésta permanece a niveles aceptables y en mezclas más diluidas no cabría esperar la ocurrencia de estos comportamientos.

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Inmunodetección de esporas de HMA. Detección de autofluorescencia en esporas de Glomus clarum . Las esporas de G. clarum mostraron resultados totalmente diferentes cuando eran expuestas a diferentes longitudes de onda, respecto a las técnicas de fluorescencia convencionales utilizadas en este trabajo como controles negativos, debido a la presencia de la propia autofluorescencia de la pared de la esporas de G. clarum. En este estudio se observó de forma muy característica el fenómeno de la autofluorescencia (Figura 1 b, c y d), y se encontró no sólo excitación y emisión de luz a 480 nm (luz verde), sino que por vez primera se informa una marcada excitación tanto en el rango del ultravioleta (240-280 nm) como en el naranja-rojo (690 nm). Esporas expuestas a la luz blanca. Esporas expuestas a luz roja.

Esporas expuestas a la luz verde. Esporas expuestas a la luz azul. Figura 1. Esporas de Glomus clarum excitadas a diferentes longitudes de onda. La autofluorescencia de las esporas se debe en gran medida a que en las plantas se produce acumulación de compuestos fenólicos como respuesta de defensa ante la presencia de microorganismos, y los mismos producen fluorescencia (Gange et al., 1999). También se tiene evidencia que estos compuestos pueden acumularse dentro de la pared de las esporas y conferirles autofluorescencia (Bennett et al., 1996)). Este fenómeno puede presentarse en mayor o menor grado en dependencia del grado de acumulación de fenoles que tenga la pared de la espora y en el sitio donde las mismas se hayan desarrollado. Las esporas de Glomus clarum pueden desarrollarse a partir del micelio extramátrico o de la formación de vesículas, las cuales son estructuras que pueden funcionar como reservorio de nutrientes para la espora o desarrollarse y devenir en esporas , por consiguiente, se encuentran diferencias en el grado de autofluorescencia, ya que las esporas que se desarrollan dentro de la raíz tendrán un mayor

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reforzamiento en la fluorescencia por el aumento de compuestos fenólicos oxidados en su pared, que rompen con la integridad de la pared de las esporas, debido a la cercanía de éstas con las células de la raíz de la planta. Esta autofluorescencia puede explicarse también atendiendo a las características que presenta la formación de las esporas en las especies que pertenecen al género Glomus. El proceso de formación de esta estructura está estrechamente relacionado con la génesis de las diferentes capas de la pared de la espora, siendo la primera y la segunda capa parte de la hifa que sostiene a la espora (Morton, 1999). El grosor de las paredes de estos hongos varía considerablemente de una especie a otra, e incluso de un ecotipo a otro dentro de una misma especie, además en las láminas pleomórficas (1ra lámina) de muchos de los miembros de Glomus, como es el caso de Glomus clarum la respuesta que se observa pudiera estar dirigida a alguna glicoproteína que se genere en el citoplasma de la espora en formación y que después viaje a través del poro para situarse en la primera lámina de la pared . En este trabajo se logró ver excitación de las esporas de G. clarum a 480 nm (luz verde) y una marcada excitación tanto en el rango de ultravioleta (240-280 nm ), como en el de la luz naranja-roja (690 nm), diferentes al color verde-amarillo del control negativo utilizado en el ensayo con el uso del IFI cuando éstas fueron excitadas a través del microscopio epifluorescente mostrando un color verde brillante que es fuertemente dirigido hacia la zona del esporóforo (Figura 2). Figura 2: Control negativo de esporas de G. clarum utilizado para establecer las diferencias entre la

autofluorescencia y la fluorescencia lograda por la técnica de inmunofluorescencia indirecta.

Detección de esporas de Glomus clarum por ELISA.

En la Tabla 1 se pueden apreciar los resultados alcanzados del enfrentamiento del Anticuerpo Policlonal a las especies de HFMA en estudio. En este caso se obtuvo una respuesta cruzada del antisuero frente a todas las especies a la dilución 1/500, no obstante, en el caso de la especie Glomus clarum, su reacción resultó mucho más intensa con valores indeterminados de absorbancia. A partir de 1/1000 y hasta la

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dilución 1/3000 el antisuero policlonal reconoció las esporas de Glomus clarum sin que se evidenciaran reacciones cruzadas con las otras especies de Glomus estudiadas. Es bueno destacar la baja respuesta del antisuero frente a la especie Acaulospora scrobiculata y para el resto de las especies de Glomus. Si bien aparecieron reacciones cruzadas en la dilución más baja, éstas fueron significativamente inferiores a las logradas frente a Glomus clarum y con valores muy cercanos a los del suero preinmune. Tabla 1. Resultados del ELISA. Reactividad del antisuero anti-Glomus clarum frente

a las especies de Glomales estudiadas. Título Cepas

1:500 1:1000 1:3000 1:5000 SPI B

G. clarum ID 0.85 a 0.41 b 0.13 d A. scrobiculata 0.12 de 0.09 def 0.07 def n.d G. fasciculatum 0.21 c 0.11 de 0.07 def n.d G. claroideum 0.26 c 0.12 de 0.07 def n.d Glomus sp1 0.24 c 0.12 de 0.06 def n.d

0.10 de 0.04 f

ES x 0.02 *** Leyenda: SPI: suero preinmune, B: Blanco, ID: indeterminados Medias con letras comunes no difieren significativamente para p<0.01

La Figura 3 muestra claramente las diferencias en los valores de absorbancia para las especies en estudio a la dilución 1/3000, siendo significativamente mayor el obtenido para la especie Glomus clarum con valor de 0.41. Las demás especies estudiadas no presentaron reacción a esa dilución y sus valores no sobrepasaron el valor 0.07, los cuales no diferían significativamente de los valores alcanzados por el suero preinmune.

00.050.1

0.150.2

0.250.3

0.350.4

0.45

G.c

A.S

crob

G. f

asc

G. c

lar

G.s

p1 Especies

Abs

(405

nm)

Figura 3. Valores de absorbancia a la dilución 1/3000 en el ELISA para Glomus clarum. Leyenda: Gc: Glomus clarum A.scrob: Aculospora scrobiculata G. fasc: Glomus fasciculatum G. clar: Glomus claroideum G. sp1: Glomus sp1 (Güira)

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La actividad del suero frente a las diferentes especies en estudio también se analizó por ELISA, el cual constituye por su naturaleza una eficiente herramienta de detección inmunológica, considerada una de las metodologías más sensibles a la hora de determinar uniones antígeno-anticuerpo a muy bajas concentraciones del analito (antígeno-anticuerpo). Se pudo determinar que a medida que se diluyó el antisuero las reacciones cruzadas disminuyeron y, por lo tanto, aumentó la especificidad del antisuero para la especie contra la cual fue levantado, en este caso Glomus clarum. Los valores de absorbancia indican que hubo un fuerte reconocimiento del antisuero policlonal hacia Glomus clarum, máxime si tomamos en consideración la similitud de grupos antigénicos que comparten estas especies de Glomaceas. Por otra parte, el análisis de varianza evidenció que los mayores valores siempre se presentaron en el caso de Glomus clarum, difiriendo significativamente con el resto de las especies estudiadas. En el caso del resto de las Glomaceas estudiadas, si bien aparecieron reacciones cruzadas, éstas fueron significativamente inferiores a las logradas con Glomus clarum y con valores muy cercanos a los del suero preinmune (Tabla 1). Resultados similares han sido obtenidos por otros investigadores quienes iniciaron sus experimentos con un número similar de esporas, al usado en este estudio. Con estos resultados se pudo constatar la utilidad de usar la autofluorescencia de la pared como herramienta en la detección de G. clarum además de corroborarse una vez más la factibilidad del uso de técnicas inmunoquímicas para el desarrollo del trabajo de identificación taxonómica, si se tiene en cuenta la especificidad del suero en reconocer determinantes antigénicos específicos para Glomus clarum. El antisuero policlonal logrado contra las proteínas de pared de las esporas pudo detectar hongos micorrizógenos y a su vez corroboró que estos últimos son microorganismos que están distantes filogenéticamente de otros tipos de hongos y bacterias, pudiendo considerarse esta técnica como promisoria en la identificación de estas esporas u hongos en los medios de cultivos en donde se aplique la inoculación con la especie estudiada.

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Tarea 02:

Estudios sobre desinfección y germinación de esporas Para garantizar la eficaz germinación in vitro de las esporas de Glomus clarum empleadas en los experimentos se realizaron estudios previos de desinfección de las paredes de las mismas. En las tablas 1 y 2 se muestra el efecto de los diferentes tratamientos de desinfección empleados en dos medios de cultivo (Agar Agua y White Modificado) sobre las variables Germinación (%) y Contaminación (%), así como de sus porcentajes de incremento y decremento, respectivamente. De forma general, en las variables analizadas se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos, denotándose un comportamiento diferenciado entre los medios de cultivo empleados, siendo en el medio Agar Agua donde se observaron los mayores valores de las mismas. El análisis de los porcentajes de germinación, en los tratamientos en los que se utilizó Cloramina T y antibiótico (Cefalexina) como agentes desinfectantes, independientemente de los tiempos empleados y de los medios en los que se incubaron las esporas, siempre indicó el mejor comportamiento de esta variable con relación a los controles sin desinfectar. Como se había hecho alusión, dentro de estos tratamientos, los mayores valores se reportaron en el medio Agar Agua, con un rango entre 44,0 y 44,6 % de germinación, siendo las mejores variantes en las que se empleó Cloramina T(2%) combinada con la Cefalexina. Tabla 1. Efecto de los diferentes tratamientos de desinfección sobre el porcentaje de

Germinación (G) y su incremento a los 25 días de incubadas las esporas.

Tratamientos

Desinfección Medios de incubación

G (%) Incremento (%)

Cl T (2%) + Cefalexina (2min.) 44.0 a 1275 Cl T (2%) + Cefalexina (6min.) 46.4 a 1350 Cefalexina (6min.) 33.6 b 950 Sin desinfectar

Agar Agua

3.2 e - Cl T (2%) + Cefalexina (2min.) 31.1 b 185 Cl T (2%) + Cefalexina (6min.) 25.8 c 136 Cefalexina (6min.) 31.1 b 185 Sin desinfectar

White Modificado

10.9 d - Es x - 0.94*** - C.V (%) - 10.61 - Leyenda: Cl T: Cloramina T. Medias con letras desiguales difieren entre sí significativamente

para p≤ 0.05, según Test de Rangos Múltiples de Duncan.

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En cuanto a los tratamientos que solo contaron con la aplicación del antibiótico, aunque su comportamiento fue superior a los controles, nunca superaron el mejor tratamiento de desinfección en cualquiera de los dos medios estudiados. Este comportamiento se evidenció aún más, al analizar los diferentes porcentajes de incremento con relación a los controles sin desinfectar (Tabla 1). En este análisis se puso de manifiesto, nuevamente, la gran diferencia de respuestas a la germinación encontradas entre los medios de cultivo empleados, reportándose porcentajes de incrementos superiores a 1000 % en el medio Agar Agua. Otro de los aspectos estudiados fue el efecto producido por el uso de las soluciones desinfectantes sobre el porcentaje de contaminación de las esporas (Tabla 2). El comportamiento de esta variable denotó que de forma similar al porcentaje de germinación, existió una respuesta diferenciada de cada grupo de tratamientos en presencia de un determinado medio. En este caso, las variantes que estuvieron bajo la influencia de los agentes desinfectantes, mostraron los menores valores de contaminación. En el caso del medio Agar Agua no solo se observaron los menores valores de contaminación en los tratamientos desinfectados, sino también en el tratamiento control donde los valores disminuyeron a la mitad (42.8 %) con relación a su homólogo en medio White (93.0 %). Además, no se encontraron diferencias significativas en la exposición de las esporas a los distintos tiempos de desinfección (3.2 y 3.3 %). Tabla 3. Efecto de los diferentes tratamientos de desinfección sobre el porcentaje de

Contaminación (C) y su decremento a los 25 días de incubadas las esporas.

Tratamientos

Desinfección Medios de incubación

C (%) Decremento (%)

Cl T (2%) + Cefalexina (2min.) 3.3 f 92.28 Cl T (2%) + Cefalexina (6min.) 3.2 f 92.52 Cefalexina (6min.) 48.2 b -12.61 Sin desinfectar

Agar Agua

42.8 c - Cl T (2%) + Cefalexina (2min.) 22.0 e 76.34 Cl T (2%) + Cefalexina (6min.) 4.8 f 94.83 Cefalexina (6min.) 33.2 d 64.3 Sin desinfectar

White Modificado

93.0 a - Es x - 0.97*** - C.V (%) - 9.82 - Leyenda: Cl T: Cloramina T. Medias con letras desiguales difieren entre si significativamente

para p≤ 0.05 según Test de Rangos Múltiples de Duncan.

Sin embargo, en el medio White Modificado solo se lograron alcanzar niveles de contaminación significativamente similares a los anteriores en

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el tratamiento bajo desinfección, con ambas soluciones, durante 6 minutos. Este efecto se puede evidenciar claramente al observar los porcentajes de decremento en la contaminación (Tabla 2). Como se puede apreciar, solamente se observó incremento de los valores de contaminación (%) con relación a los controles en el caso del tratamiento en el cual se aplicó la solución antibiótica, en el resto de las variantes los porcentajes de contaminación fueron inferiores a los de los testigos de desinfección. Al analizar las variables Germinación y Contaminación se observó que existía cierta relación entre ambas, evidenciándose, por lo general, que un decremento en la contaminación correspondía a importantes incrementos en el porcentaje de germinación y viceversa. Tomando en consideración lo anterior, se estudió la relación existente entre ambas variables, a partir del cálculo de las curvas de tendencia y las ecuaciones de regresión, utilizando el modelo polinomial de 2do grado (Fig. 1). Como se puede apreciar, se encontró una alta y significativa relación negativa entre las variables en estudio, reportándose coeficientes de determinación superiores a 0.90. Tanto en medio Agar Agua como en White Modificado, los comportamientos indicaron una relación inversa en el funcionamiento de estas variables, demostrándose de forma fehaciente la estrecha vinculación de los mecanismos de germinación y las poblaciones contaminantes adheridas a la pared.

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Medio Agar Agua

Contaminación (%)

Ger

min

ació

n (

%)

0.3 8.0 15.8 23.5 31.3 39.1 46.8

0.29

11.74

23.20

34.65

46.10

57.56

69.01

Medio White Modificado

Ger

min

ació

n (

%)

0.4

3.54

9.26

14.98

20.70

26.42

32.14

37.86

Figura 1. Curvas de tendencia Contaminación (x) y G

y = 59.02-2.97x+0.039x2

R2=0.96***

Partiendo de estos resultmetodología de desinfecrespuestas, con el prhomogeneidad en la germla ocurrencia del proceso.Como se describió anterpara incrementar la efiaumento en el tiempo antibiótica, incremento membranas miliporo paraEstos nuevos procedimieen las esporas, pudiéndola desinfección, sobre un En las placas Petri inocualguno durante los 5 díasEn adición, el empleo deincubaron las esporas pano solo la homogenizació

y = 23.4+0.44x-0.006x2

R2=0.97***

Contaminación (%)

17.7 35.0 52.4 69.7 87.0 104.3

y ecuaciones de regresión realizadas entre las variables erminación (y) en los tratamientos

ados se realizaron algunas modificaciones a la ción con la cual se obtuvieron las mejores incipal interés de garantizar no solo la inación de las esporas, sino también acelerar

iormente entre las modificaciones realizadas ciencia de la desinfección se encontraban: de exposición de las esporas a la solución del número de antibióticos (2) y uso de filtrar los mismos. ntos garantizaron ausencia de contaminación se comprobar, al inocularlas posteriormente a medio rico (Agar Nutriente). ladas no se encontró crecimiento microbiano

de incubación. la cámara de CO2 o Gas Pack® en la cual se ra su germinación en medio líquido, garantizó n del proceso germinativo (Fig. 6), pudiéndose

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disponer del 100% de las esporas germinadas para ser empleadas en los experimentos posteriores de inoculación de plántulas en condiciones in vitro, sino que también posibilitó la obtención de dichas esporas a solo tres días de su desinfección.

Figura 6. Esporas de Glomus clarum germinadas en solución Ringer en cámara de CO2 (30x).

La desinfección de esporas de hongos micorrízicos empleadas como inóculo es crucial para la formación y el desarrollo exitoso de la micorrización en condiciones in vitro, por ser la presencia de contaminantes uno de los mayores problemas que atenta contra el estudio de estos microorganismos bajo condiciones controladas; además, las metodologías de desinfección deben ser establecidas para cada especie de hongo en particular pues el efecto de los desinfectantes o las combinaciones de estos varían en función de la especie utilizada (Walley y Germida, 1996). Los resultados reflejan el efecto de diferentes combinaciones de antibiótico (Cefalexina), desinfectante (Cloramina T) y medios de cultivo para la incubación de las esporas (Agar Agua y White Modificado) sobre las variables Germinación y Contaminación, destacándose positivamente los tratamientos en los que se utilizó Cloramina T (2%) y Cefalexina (2 y 6 min.) como agentes desinfectantes, sobre el medio de incubación Agar Agua, alcanzándose valores medios de germinación de 44.0 y 46.4 % respectivamente. En el experimento se empleó, primeramente, una dosis de Cefalexina de 200 mg.ml-1, la cual constituye, según Payró y col. (1998), una concentración suficiente para ejercer un adecuado control microbiano. Por otra parte, la Cefalexina está considerada como un antibiótico de

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amplio espectro, reportándose su mayor efecto sobre grupos bacterianos Gram - y algunas enterobacterias Gram +, además de actuar sobre algunos hongos de la clase Deuteromycete (Loyola-Vargas y Miranda, 1995). La efectiva acción de la Cloramina T como fuerte agente oxidante se puso de manifiesto en los tratamientos en los que se utilizó y estuvo dada por su mayor estabilidad con respecto a otros desinfectantes como el Hipoclorito de sodio, el cual libera el cloro instantáneamente. En el caso particular de la Cloramina T se liberan lenta y gradualmente las moléculas contenidas del halógeno, evitando que actúen negativamente sobre el proceso germinativo (Collins, 1969 y Colozzi - Filho y col., 1994). No obstante, según Walley y Germida (1996), la exposición prolongada de las esporas a esta sustancia puede inhibir la ocurrencia de la germinación, lo cual encontraron al tratar esporas de Glomus clarum con Cloramina T (5%) durante 120 min. Similares resultados fueron descritos por Collozi - Fhillo y col. (1994), quienes reportaron, en esporas de Gigaspora margarita (Becker & Hall) y Scutellospora heterogama (Nicolson & Gerdemann) Walker & Sander inoculadas en medio Agar Agua, valores cercanos a 60 % de germinación en presencia de Cloramina T (2%) y tiempos de exposición a la solución desinfectante + antibiótico entre 3 y 6 minutos. En cuanto a los medios de cultivo empleados en el estudio para la incubación de las esporas y su germinación se reporta el Agar Agua como el de mayores porcentajes de germinación con respecto al White Modificado en el que los valores oscilaban entre 25.8 y 31.1 %, lo cual no debe sorprender si se tiene cuenta la composición química de ambos medios. El medio White es sumamente rico desde el punto de vista nutricional lo cual origina que proliferen contaminantes indeseables presentes en las paredes de las esporas, que no se expresan en un medio tan pobre como el Agar Agua (Walley y Germida, 1996). En este sentido, es bueno destacar el determinado control que pueden ejercer los medios pobres como el Agar Agua, en el cual no solo se lograron los niveles de contaminación más bajos en general, sino que inclusive, en el tratamiento control estos niveles disminuyeron a la mitad (42.8 %) con relación a su homólogo en medio White. A partir del análisis de las regresiones realizadas a las variables porcentajes de Germinación y de Contaminación en ambos medios de cultivo, se encontró una alta y significativa relación negativa entre ellas, poniendo de manifiesto la vinculación existente entre los microorganismos que habitan las paredes de las esporas y los mecanismos de germinación de éstas. En estudios de desinfección realizados por Walley y Germida (1996) a

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esporas de Glomus clarum se encontró que los contaminantes que crecieron alrededor de las esporas obstaculizaron la emergencia y el crecimiento del tubo germinativo, por lo que la germinación de las mismas se vió limitada. Siqueira y col. (1984) y Paulitz y Linderman (1989) plantearon el papel destructor de los microorganismos cuando ocurre una exacerbación de sus poblaciones en la superficie de los propágulos de los hongos micorrizógenos arbusculares; inclusive algunas especies fúngicas y bacterianas, identificadas como hiperparásitos, pueden enquistarse, germinar y penetrar las paredes de las esporas hospederas, desarrollarse dentro de éstas, evitar que las mismas germinen y provocar su destrucción, así como obstruir la emergencia y el crecimiento del tubo germinativo (Walley y Germida, 1996). No obstante, es interesante resaltar que existen determinados grupos de microorganismos no considerados contaminantes que habitan las paredes de las esporas y que pudieran ejercer un papel sumamente benéfico sobre la germinación y el crecimiento del tubo germinativo. Autores como Will y Sylvia (1990) y Giovannetti (2000), han discutido acerca del papel beneficioso que juegan ciertos microorganismos adosados a las paredes de las esporas como Pseudomonas y Corynebacterium, los cuales incrementaron la germinación de esporas de Glomus versiforme, planteando incluso que estos pudieran incidir directamente en los mecanismos de destrucción de la pared externa, intercambiar material molecular y combinar algunos productos finales de la síntesis de cada uno de los microorganismos involucrados. Sin embargo, aunque con el empleo de los mejores tratamientos de desinfección se logra realizar un buen control de la contaminación, es necesario aclarar que la metodología utilizada solo garantiza la obtención de valores medios de germinación en las esporas tratadas, aún a los 25 días de incubación. En la segunda fase del experimento se utilizaron los antibióticos Kanamicina y Sulfato de Estreptomicina, los cuales tienen una gran similitud con la Cefalexina en cuanto a su acción sobre bacterias Gram + y Gram - (Willett, 1983), conjuntamente con la Cloramina T como agente oxidante y Tween 20 como surfactante y son reportados por numerosos autores al desinfectar esporas para su inoculación en cultivos tripartitas (Bécard y Piché, 1992; Elmeskaoui y col., 1995 y Fortin y col., 2002). Al incubar las esporas en la cámara de Gas Pack en presencia de CO2 se logró una aceleración considerable de la germinación, debido a su acción directa como estimulador del proceso germinativo y del crecimiento del tubo germinal, llegando a ser total a las 72 horas. Aunque generalmente los hongos micorrizógenos no necesitan condiciones específicas o la presencia de raíces hospederas para

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germinar, desde hace algunos años diversos autores comenzaron a hacer referencia al importante papel que puede jugar el CO2 en la ocurrencia de estos procesos (Bécard y Piché, 1989; Chabot y col., 1992; Poulin y col., 1993; Elmeskaoui y col., 1995; Louche - Tessandier y col., 1999 y Buée y col., 2000), resaltando principalmente como el CO2 conjuntamente con los exudados radicales pueden estimular la germinación y/o el crecimiento del tubo germinativo y como algunas especies en particular pueden fijar CO2 como fuente mineral de carbono. Recientemente, el empleo de 13CO2 marcado en experimentos realizados in vitro utilizando análisis espectroscópico de resonancia magnética nuclear (NMR), han confirmado que existe fijación de CO2 en la oscuridad durante la germinación de esporas de Glomus intraradices (Bago y col., 1999). Desde el punto de vista metabólico, el CO2 tiene una gran importancia para la germinación de estos hongos, debido a que en este estadio su metabolismo es predominantemente dependiente del catabolismo lipídico (Fortin y col., 2002) para realizar la biosíntesis de otros compuestos. Por lo tanto y como es conocido, el catabolismo de los lípidos conduce a la formación de acetilCoA, dos moléculas de carbono, las cuales son posteriormente oxidadas en el Ciclo de los Acidos Tricarboxílicos (CAT), por lo que el balance neto de carbono es teóricamente cero. No obstante, en los hongos micorrizógenos ocurre el Ciclo del Glioxalato (CG) (Bago y col., 1999), y este ciclo, a diferencia del CAT evita la pérdida de las dos moléculas de CO2, de lo que puede deducirse que para el CG, el CO2 puede representar una entrada adicional de carbono y activar significativamente el crecimiento del hongo (Fortin y col., 2002). Teniendo en cuenta lo anteriormente explicado, el CO2 puede ser considerado como el primer compuesto estimulador no específico emitido por las raíces hospederas; y muy recientemente Fortin y col. (2002) recomiendan, de forma similar a nuestros resultados, el uso de ambientes enriquecidos con CO2 (2-5%) en estudios sobre compuestos radicales estimuladores más específicos, en los cuales la respuesta del hongo se incrementa y las variaciones se minimizan notablemente. El desarrollo de este estudio permitió no solo poder contar con una metodología que garantizara la germinación exitosa de las esporas de Glomus clarum en ausencia de contaminación, sino también que estas estuvieran listas y en un medio fácilmente manipulable para ser inoculadas en plantas in vitro, al cabo de solo tres días de incubación.

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Tarea 03y 04. Inoculación con el HMA (Glomus clarum) de plántulas de papa en

condiciones in vitro. Luego de obtenidas las esporas germinadas y disponer de material vegetal suficiente para este experimento se procedió a la inoculación de las plántulas sobre el medio de cultivo N diseñado para estos fines. En la tabla 1 se puede observar el efecto de la inoculación con G. clarum sobre el comportamiento de las variables altura de las plantas y masas frescas foliar y radical en la primera fase del experimento. Como puede apreciarse existe un marcado efecto negativo del medio N o nuevo sobre el desarrollo de las plántulas de papa. Al analizar cada una de las variables puede observarse como se diferencian significativamente los valores, haciéndose menores en el caso del tratamiento micorrizado con respecto a su homólogo y al control sin inocular sobre medio MS. Sobre este medio las plantas se desarrollaron adecuadamente (figuras 1 a, b y c) y mostraron incrementos que oscilaban entre un 47 y hasta un 54 % en el caso de la variable altura de las plantas, comportamiento que se hace similar y evidente en el resto de las variables. Tabla 1. Fase I. Efecto de la inoculación con G. clarum sobre las

variables estudiadas al cabo de 30 días. Tratamientos

Altura (cm)

Masa fresca foliar (g)

Masa fresca radical (g)

N + HMA 2.10 b 0.06 b 0.09 b N 2.41 b 0.09 b 0.11 b MS Control 4.53 a 0.37 a 0.17 a Es x 0.14*** 0.02*** 0.02*** C.V. (%) 14.37 8.45 11.74

Leyenda: N: Medio Nuevo; M: Medio Mínimo y MS: Medio Murashige y Skoog. Medias con letras desiguales difieren entre si significativamente para p≤ 0.05 según Test de Rangos Múltiples de Duncan.

Las plantas que crecieron sobre medio N mostraron un crecimiento atrofiado y poco armónico, sobre todo en el caso de los tratamientos inoculados, observándose en estos un marcado cambio de coloración, de verde a purpúreo, en la zona aérea de todas las plantas (Fig. 1c), probablemente producido por algún tipo de deficiencia nutricional. Este efecto o variación en la coloración comenzó a observarse a los 10 días de inoculadas las plantas aproximadamente y aparecía primeramente sobre el envés de la hoja, extendiéndose lentamente sobre la superficie de la misma, hasta abarcar toda la zona aérea de las

55

plantas incluyendo, en algunos casos, los tallos. A los 20 días de inoculadas las plantas ya mostraban en todas sus hojas esta afección.

cba

Medio MS

Figura 1. Desarrollo diferenc

cultivo, inoculadcrecimiento de desarrolladas soplantas crecidas

Las plantas que crecievariación alguna de encontraba deprimido Al analizar el comportrepetición del experimtratamientos relacionestablecimiento del cuel caso anterior, un inoculados o no, sobreNuevamente el meddesarrollo de las plántlas variables estudiadtinción empleados no si se observó un efecrecidas en medio Msimilares a los obtenidfresca radical, en la control.

a

Medio N

iado de plántulas de papa sas o no con HMA, al cabolas plantas observado en bre medio MS (a). Cambien medio N en presencia del

ron sobre este medio la coloración, aún

y su desarrollo bastanamiento de estas vaento (tabla 2), en

ados con el medio ltivo dual, se observóefecto diferenciado

el crecimiento de lasio MS ofreció condulas, reflejado en losas. Sin embargo, ase logró observar la cto positivo de la in, las cuales alcanzaros sobre MS, con exque los mismos su

b

Medio N + HMA

embradas sobre diferentes m de 30 días (a, b y c). Depreel medio N (b y c) respecto de coloración reportado so HMA (c).

(N) sin inocular, no sufcuando su crecimiente retardado (Fig. 1b).

riables en la segunda la cual se introdujeroM como sustrato pa

, de la misma manera qde los medios de c

plántulas de papa. iciones favorables pa altos valores alcanzadunque con los métodcolonización en este enoculación sobre las pon valores estadísticacepción de la variableperaron estadísticame

c

edios de sión del o a las bre las

rieron to se fase o n los ra el ue en ultivo,

ra el os por os de sayo, lantas mente masa nte al

56

Tabla 2. Fase II. Efecto de la inoculación con G. clarum sobre las

variables estudiadas al cabo d e 30 días. Tratamientos

Altura (cm)

Masa fresca foliar (g)

Masa fresca radical (g)

N + HMA 2.12 c 0.08 c 0.11 b N 2.51 b 0.13 b 0.08 c M + HMA 3.38 a 0.18 a 0.18 a M 2.67 b 0.11 bc 0.11 b MS Control 3.36 a 0.17 a 0.14 b Es x 0.07*** 0.01*** 0.01*** C.V. (%) 8.36 13.57 10.52 Leyenda: N: Medio Nuevo; M: Medio Mínimo y MS: Medio Murashige y Skoog. Medias con letras

desiguales difieren entre si significativamente para p≤ 0.05 según Test de Rangos Múltiples de Duncan.

De igual forma, las plantas que crecieron sobre medio N presentaron un comportamiento similar al antes descrito, manifestando el efecto depresor sobre el crecimiento y el desarrollo de las mismas y mostrando valores de altura y masas frescas foliar y radical inferiores a las inoculadas sobre medio M y a los controles sobre medio MS. Así mismo, se pudo observar el cambio de coloración sobre las hojas en los tratamientos micorrizados sobre medio N, el cual presentó una dinámica de aparición y de extensión al resto de la planta similar a la anterior. Paralelamente se determinaron las concentraciones de clorofilas a, b y total de las plantas inoculadas sobre medio N (Fig. 2) para comprobar si los cambios de coloración se debían a deficiencias de este pigmento en las plantas micorrizadas. Al comparar los valores obtenidos en ambos tratamientos (plantas micorrizadas y no micorrizadas), no se encontró efecto alguno de estos sobre el comportamiento de la variable analizada, pues no existió diferencias significativas entre las concentraciones de clorofila determinadas. Tanto las clorofila a y b (datos no mostrados) como la total reflejaron valores estadísticamente no significativos en ambas repeticiones del experimento.

57

N + HMA

Fi

La graSebasactuamicorplantapreviaEl priplantaesporestos autotrLa deexitosprocecaso. Bioen(datosde panecescultivo1995;garanpues fósforestablEsto f

100

400

700

1000

1300

1600C

loro

fila

(u

g/g)

Fase 1 Fase 2

N

gura 2. Efecto de la inoculación con HMA sobre la concentración de clorofila total de las plántulas desarrolladas sobre medio N.

n mayoría de los autores (Elmeskaoui y col., 1995; Hernández - tia y col., 1999 y Louche - Tessandier y col., 1999) emplean lmente el sistema de cultivo tripartita para establecer la rización durante el estadio in vitro de la micropropagación de las s, utilizando como inóculo cultivo de raíces transformadas o no, mente inoculadas con hongos micorrizógenos. ncipal reto de este estudio fue poder lograr micorrización de s completas en condiciones in vitro utilizando como propágulos as germinadas, teniendo en cuenta las dificultades que presentan hongos para desarrollarse en medios de cultivo y la falta de ofia de las plantas bajo estas condiciones; finición de los medios de cultivo adecuados para el desarrollo o de ambos organismos es una de las etapas más críticas del so y depende en gran medida de las especies utilizadas en cada

sayos realizados previamente a la ejecución de este experimento no incluidos en el documento) en el cual se inocularon plántulas pa sobre el medio de propagación MS sugirieron claramente la idad de realizar un cambio de medio antes del establecimiento del dual, aspecto ya reportado por otros autores (Elmeskaoui y col., Hernández - Sebastia y col., 1999 y Fortin y col., 2002) al no tizarse el crecimiento adecuado del hongo bajo estas condiciones, este medio contiene altas concentraciones de sulfato de sodio, o y sacarosa, las cuales influyen negativamente sobre el ecimiento micorrízico in vitro. ue corroborado por Bressan (2002) quien al inocular embriones de

58

boniato con esporas de Glomus etunicatum sobre diferentes medios de cultivo (MS y White), encontró respuestas diferenciadas de la colonización en función de las concentraciones de nutrientes en los medios y comprobó que cuando se adicionaba al medio sacarosa (3%) se producía un efecto depresor sobre el crecimiento hifal y la colonización radical. En este trabajo pueden observarse los resultados derivados de la inoculación de plántulas de papa con esporas germinadas de G. clarum sobre un nuevo medio de cultivo semisólido (N), elaborado a partir de los medios MS y M y combinado a su vez con vermiculita, esto último con el propósito fundamental de aumentar las condiciones de aireación en el medio de cultivo y de crear un sistema relativamente similar al ambiente natural en el que se desarrollan ambos organismos. Como fue descrito en el capítulo anterior se observó un efecto negativo sobre las plántulas de los tratamientos (tanto micorrizados o no) que crecieron sobre este medio expresado en las variables de crecimiento estudiadas, comportamiento que pudo haber sido provocado por la interacción entre los componentes del nuevo medio y la vermiculita presente. Como es conocido las vermiculitas son arcillas con una capacidad de intercambio catiónico extremadamente alta (100 - 260 meq/100g) y se expanden y contraen con gran facilidad secuestrando gran número de iones entre sus capas (Grim, 1968), lo cual pudo haber ocurrido en este caso al reaccionar con el agar presente en el medio y provocar que los iones quedaran atrapados, ocasionando la indisponibilidad de los nutrientes. Por otra parte, en presencia de pH ácido, como es el caso (5.5), algunas cantidades de Al3+ y Fe3+ de las arcillas pasan a solución y pueden reaccionar con el escaso fósforo presente en el medio N, el cual contenía una baja concentración de macronutrientes y en especial de este elemento, formando fosfatos insolubles de hierro y aluminio y que indudablemente, disminuyeron aún más la concentración de fósforo a disposición de las plántulas en crecimiento. La disponibilidad de fósforo para las plántulas pudo haber sido aún menor si tenemos en cuenta que la micorrización en condiciones de muy baja disponibilidad de nutrientes deja de ser una relación mutuamente beneficiosa para convertirse en parasítica. Al respecto se refirieron Daniels y Menge (1980) y Fernández y col. (1990) al plantear que los hongos micorrizógenos arbusculares en condiciones muy bajas de disponibilidad de nutrientes expresan una relación hiperparasítica con la planta hospedera provocando serias afectaciones al normal desarrollo de las mismas. El empleo de este sustrato para tales fines fue reportado por vez primera por Bressan y col. (2000) quienes estudiaron la respuesta de

59

embriones somáticos de boniato a la micorrización con esporas germinadas de Glomus etunicatum, colocando los embriones previamente inoculados en tubos que contenían, además de medio White, una mezcla de vermiculita + arena estéril. En contraste con los resultados presentados en este trabajo, dichos autores reportaron un efecto estimulador de la micorrización sobre el desarrollo de los embriones inoculados, debido probablemente a que los componentes presentes en el medio White, mucho más rico, no resultaron limitantes para las plantas al interactuar con la vermiculita. Además de este efecto sobre el crecimiento de las plantas se encontró un marcado cambio de coloración solo en los tratamientos inoculados con HMA. Por las características que presentó la afección no parece estar relacionada con ninguna deficiencia nutricional simple, pues las variaciones de color observadas y el estado de las plantas no coinciden con ninguno de los síntomas provocados por el déficit individual de los elementos esenciales en el cultivo de la papa (Wallace, 1970). No obstante, si bien esta modificación pudiera atribuirse a deficiencia de fósforo por la presencia de coloración purpúrea en las hojas y el hecho de ser encontrada como sintomatología típica en otros cultivos como la col y el colinabo, no se reporta para el caso específico de la papa (Wallace, 1970 y Fedepapa, 1997). Por otra parte, las determinaciones de clorofila a, b y total realizadas a las plantas micorrizadas y a sus homólogas sobre el mismo medio, tampoco arrojaron resultados que relacionaran la presencia de esta coloración con algún efecto producido sobre este pigmento en especial. De acuerdo a los resultados se considera como muy probable que estemos en presencia de una deficiencia múltiple de elementos, lo cual ocasiona una sintomatología más compleja. Cuando se analizan los resultados de la segunda fase del experimento, en el cual se introduce el medio M como sustrato para ambos organismos, se observa nuevamente el efecto diferenciado de los tratamientos sobre el desarrollo de las plántulas; pero curiosamente, se aprecia un efecto positivo de la inoculación sobre las plantas que crecieron sobre el medio M . Resulta extremadamente interesante destacar el efecto beneficioso de la micorrización puesto de manifiesto en esta fase, en la cual las plantas de papa micorrizadas alcanzaron valores en las variables estudiadas, similares a los controles sobre medio MS y mostraron una mayor relación raíz / tallo, a pesar de los bajos contenidos nutricionales que caracterizan el medio M (Fortin y col., 2002). Los efectos encontrados “in vitro” pueden asociarse a efectos nutricionales favorables vinculados con la asociación simbiótica reportados “in vivo”, aunque también puede verse reflejado un efecto hormonal y / o fisiológico de las especies micorrízicas sobre las plantas

60

que colonizan. Lo anterior tiene una estrecha relación con lo planteado por Niemira y col. (1996) quienes refieren que aunque los niveles de colonización micorrízica encontrados en plantas de papa (en condiciones de campo) son relativamente bajos, presentan una alta respuesta a la inoculación micorrízica desde el punto de vista morfológico y fisiológico. Los resultados coinciden con los reportados por Elmeskaoui y col. (1995) quienes encontraron efectos estimuladores de la micorrización sobre plántulas de fresa, expresados en mayor altura y largo radical de las plantas inoculadas, así como una reducción del potencial osmótico, lo cual, según los autores, podría representar una importante condición preadaptativa para enfrentar el estrés hídrico que encuentran al ser transferidas a la fase de aclimatización, al aumentar en cierto grado la hidratación de las hojas. Es importante destacar que a pesar de no contar con datos cuantitativos de colonización micorrízica o con evidencia visual de ocurrencia del proceso, producto del empleo de una metodología inadecuada de tinción, la cual no permitió apreciar las estructuras fúngicas, si se pudo obtener suficiente información que involucra directamente la presencia de micorrización con los efectos (positivos o no) encontrados en las plantas inoculadas; constituyendo resultados de gran importancia en los estudios de inoculación de plantas bajo estas condiciones, si tenemos en cuenta que se trabajó con plantas completas utilizando como propágulo fúngico clamidosporas germinadas, hecho que hasta el momento se consideraba prácticamente imposible.

61

Tarea 05. Inoculación con HMA de vitroplantas de papa en fase de adaptación. En la figura 1 se muestran las plantas de papa en fase adaptativa inoculadas con HMA sobre dos sustratos nutricionalmente diferentes.

Ta

Figura 1. Plantas de papa inoculadas con diferentes cepas y concentrados de especies de HMA sobre dos sustratos diferentes.

Para el procesamiento de la información se procedió primeramente a realizar Análisis Multivariados de Componentes Principales y de Conglomerado Jerárquico de Ligamento Completo (Cluster), con el objetivo de valorar integralmente las diferentes combinaciones de los factores en estudio (3 cepas de HMA, 2 concentrados de especies de HMA nativas y 2 sustratos) y agruparlos en función de sus efectos. La aplicación del método de Componentes Principales permitió definir cuales de las variables estudiadas estaban más relacionadas con el comportamiento diferenciado de los tratamientos. Al realizar el análisis de Componentes Principales se encontraron dos componentes que explicaron un 43.8 y un 20.2 % de la variabilidad total, respectivamente (Tabla 1), para una varianza acumulada de 64,09 % .

bla 1. Representación de los valores propios y la varianza explicada. Componen

tes Valor

propio Varianza explicada

(%) Varianza

acumulada (%) 1 5.27 43.85 43.85 2 2.43 20.23 64.09

62

Al observar la tabla 2 puede apreciarse las variables que mayores coeficientes de correlación mostraron con las componentes. La primera componente está caracterizada fundamentalmente por las siguientes variables: Colonización, Densidad Visual, Tasa fotosintética, Eficiencia en el uso del agua (EUA) y el contenido de Magnesio foliar; mientras que la segunda se encuentra relacionada con el comportamiento de las plantas de papa en las variables Masa seca total y contenido de Manganeso foliar. El hecho de que estas variables presenten coeficientes de correlación significativos indica que las mismas se encuentran estrechamente relacionadas entre sí. Resulta interesante destacar que, en este caso, se encuentran incluidas tanto variables directamente relacionadas con la inoculación y el funcionamiento micorrízico, como variables dependientes de la inoculación e indicativas del crecimiento y del estado nutricional y fisiológico de las plantas. En las representaciones gráficas (Figs. 2 y 3) obtenidas a partir de la aplicación de ambos métodos puede apreciarse la formación de siete grupos (A, B, C, D, E, F y G).

Tabla 2. Correlaciones entre las variables iniciales y las dos primeras

componentes.

Variables Componente 1 Componente 2 Masa seca total (g) 0.5765 0.6034 Colonización (%) 0.8001 -0.3481

Densidad Visual (%) 0.8875 -0.2354 asa Fotosintética (µmolCO2.m

-2.s-1) 0.8210 -0.3239 Transpiración (µmolH2O.m-2.s-1) 0.2103 0.2023

Eficiencia uso agua (%) 0.7544 -0.4693 Potasio (%) 0.6515 0.4992 Fósforo (%) 0.4818 -0.4801 Calcio (%) 0.5940 0.5643

Magnesio (%) 0.7832 0.1544 Manganeso (ppm) 0.5978 0.6764

Zinc (ppm) 0.4841 0.4920

Los grupos se irán comentando de acuerdo con los valores obtenidos por estos en cada componente, teniendo en cuenta la mayor importancia de la componente 1, partiendo de los mayores valores. Las letras dadas a cada grupo fueron el resultado del orden de aparición de estos, a partir del análisis del Cluster (Fig. 11). Primeramente se encuentra el grupo F seguido por el C, integrados por los tratamientos inoculados con las cepas G. intraradices y G. fasciculatum sobre el sustrato Sunshine # 3, respectivamente, situados en el extremo derecho del cuadrante positivo.

63

Cercano a estos se destaca el grupo A el cual incluye los tratamientos 4 y 5 inoculados con los concentrados de especies de Selva y Desierto, ambos sobre el sustrato 1, así como al tratamiento 8 producto de la inoculación de la cepa G. fasciculatum sobre el sustrato 2, compuesto este por una combinación de la mezcla Sunshine # 3 + vermiculita en proporción 2:1.

1 1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

-2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5

Factor 1

Fac

tor

2

6

12

3

24

5 8

17

11

9

10

1 1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

-2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5

Factor 1

Fac

tor

2

1 1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

-2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5

Factor 1

Fac

tor

2

6

12

3

24

5 8

17

11

9

10C 2

C 1

G

F

ED

C BA

Figura 2. Representación gráfica del efecto de la inoculación con diferentes cepas de HMA en dos sustratos sobre plántulas de papa según los métodos de Componentes Principales y Conglomerado Jerárquico. A (Selva - S1, Desierto - S1 y G. fasciculatum - S2); B (G. intraradices - S2, Selva - S2 y Desierto - S2); C (G. fasciculatum - S1); D (G. clarum - S1); E (G. clarum - S2); F (G. clarum -S1) y G (Control -S1 y Control - S2) S1: Sustrato 1 (Sunshine # 3) S2: Sustrato 2 (Sunshine # 3 + Vermiculita (2:1)

Luego se encuentra el grupo B compuesto por la cepa G. intraradices (9) y los concentrados de especies de Selva y Desierto (10 y 11), todos sobre el sustrato 2. Por otra parte se hallan los grupos D y E compuestos por la cepa G. clarum en los sustratos 1 y 2, respectivamente.

64

Finalmente, y bastante alejado del resto de los grupos se ubica el grupo G, compuesto por los tratamientos controles en ambos sustratos.

Cluster Análisis

Dis

tan

cias

en

tre

ind

ivid

uos

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

12 6 3 7 11 10 9 8 5 4 2 1

Figura 3. Representación diagramática del Conglomerado Jerárquico de Ligamento Completo (Cluster) empleado para agrupar los diferentes tratamientos.

En el análisis multivariado se pudo apreciar, un marcado efecto positivo de la inoculación micorrízica sobre las plántulas de papa, donde se destacan los tratamientos en los que se emplearon las cepas G. intraradices y G. fasciculatum en el sustrato 1 (Grupos F y C, respectivamente), como los de mejores comportamientos, siendo importante señalar que la inoculación con hongos micorrízicos presentó los mayores efectos cuando las plantas crecieron en este sustrato. Un comportamiento interesante fue el mostrado por la cepa G. fasciculatum, la cual además de ejercer sus mayores efectos sobre las plantas que se desarrollaron en el sustrato 1, presentó también un buen comportamiento en el sustrato 2 (Grupo A - 8 -). En la tabla 3 se recogen los valores medios de cada una de las variables estudiadas en los grupos formados a partir de la aplicación del Cluster. En la misma se observan que los mayores valores de las variables más correlacionadas con la primera componente se encuentran en los grupos F, C y A.

65

Al analizar esta información se observa, primeramente, el comportamiento de los porcentajes de Colonización y de Densidad Visual, variables que evalúan el funcionamiento fúngico de la asociación, así como de las variables fisiológicas Tasa fotosintética y EUA, del porcentaje de Magnesio y de la Masa seca total, donde todas evidencian el efecto positivo de la inoculación micorrízica al presentar siempre los tratamientos micorrizados (grupos A, B, C, D, E y F) valores más altos que los controles (G). Además de los Análisis Multivariados se realizaron Análisis de Varianza a las variables que mostraron mayores coeficientes de correlación con las componentes y consecuentemente estaban más relacionadas entre si, los cuales corroboraron, en sentido general, los análisis previos realizados y dejaron claro el efecto diferenciado de las cepas y los sustratos, así como de la interacción entre ambos factores. En la figura 4 se puede observar como el porcentaje de Densidad Visual no solo logró diferenciar mejor el efecto de los sustratos que el porcentaje de Colonización, sino que también el ordenamiento de los mejores tratamientos en base a la docimación (G. intraradices - S1, G. fasciculatum - S1 y S2 y concentrado de Selva - S1) mostró mayor similitud con el realizado por el Análisis Multivariado, que el obtenido en base al porcentaje de Colonización (G. fasciculatum - S2, concentrado de Selva - S1 y G. intraradices - S1). Tabla 3. Valores medios de las variables estudiadas en los grupos formados a partir de la aplicación del método de Conglomerado Jerárquico de Ligamento Completo

(Cluster).

G M.S. T (g)

Col. (%)

D.V (%)

T. F T E.U.A (%)

K (%)

P (%)

Ca (%)

Mg (%)

Mn (ppm

)

Zn (ppm)

A 1.156 38.43 5.69 8.36 0.0040 0.0019 2.16 0.092 0.40 0.31 64.6 102.9

B 1.46 35.05 4.77 7.01 0.0040 0.0017 1.88 0.052 0.28 0.27 65.0 164.5

C 1.35 36.27 5.80 10.19 0.0052 0.0019 2.12 0.131 0.47 0.30 75.1 103.7

D 1.012 33.83 4.79 9.10 0.0039 0.0023 1.75 0.127 0.29 0.25 57.5 72.5

E 0.53 36.86 5.73 7.41 0.0040 0.0018 1.56 0.089 0.22 0.25 42.5 96.25

F 1.63 38.64 6.29 8.14 0.0043 0.0018 2.12 0.058 0.57 0.31 97.5 145.0

G 0.885 19.12 2.06 5.825 0.0041 0.0013 1.84 0.057 0.35 0.22 60.0 247.5

Leyenda: M.S.T: Masa Seca Total; Col: Colonización; D.V.: Densidad Visual; T. F.: Tasa Fotosintética (µmolCO2.m

-2.s-1); T.: Transpiración (µmolH2O.m-2.s-1); E.U.A.: Eficiencia en el uso del agua.

66

Seguidamente se encuentran las variables fisiológicas Tasa fotosintética y Eficiencia en el uso del agua, en las cuales el efecto de los tratamientos también se ve reflejado (Fig. 5). De igual forma que en las variables antes explicadas, los mayores valores de Tasa fotosintética se encuentran en los tratamientos inoculados, los cuales muestran respuestas diferenciadas en función de las cepas empleadas y los sustratos y demuestra, a su vez, el efecto positivo de la micorrización sobre el estado fisiológico de las plantas de papa. Se destacan nuevamente los tratamientos antes presentados como los que mayores valores alcanzan en esta variable y es en este caso el tratamiento 2 (G. fasciculatum - S1) el que presenta el mayor valor. En el caso de la variable EUA no se observan grandes diferencias entre los diferentes tratamientos, sin embargo los valores de los mismos si son superiores a los de los controles en ambos sustratos. Esto puede verse con mayor claridad representado en la figura 5, en la cual también puede observarse que en ambas variables se graficaron los factores por separado al no encontrarse diferencias significativas en el análisis de la interacción. Asimismo, se encontró un marcado efecto del factor sustrato, obteniéndose, en el caso del sustrato 1, un comportamiento significativamente superior al observado en el sustrato 2. De igual forma, el contenido de Magnesio foliar (%) también reflejó el comportamiento diferenciado de los tratamientos (Fig. 6) y manifestó efectos significativos en la interacción de los factores cepas x sustratos. Los mayores contenidos estuvieron asociados nuevamente con los tratamientos en los que se emplearon las cepas G. intraradices y G. fasciculatum en el sustrato 1y G. fasciculatum conjuntamente con el concentrado de especies de Selva en el sustrato 2. Por otra parte se hace referencia a la Masa seca total (Fig. 2), no solo por ser una de las variables que mayores coeficientes de correlación alcanzó en la segunda componente, aunque presentó un comportamiento relativamente homogéneo en ambas (Tabla 2), sino por ser la variable que mejor representa el alcance positivo que tiene el empleo de los inoculantes micorrízicos sobre el desarrollo morfológico de las mismas.

De forma general, se observó un efecto positivo y diferenciado de la inoculación micorrízica sobre esta variable, presentando los tratamientos inoculados un comportamiento superior a los testigos. Los mejores tratamientos estuvieron coincidentemente asociados a la inoculación del concentrado de Selva en el sustrato 2 y de G. intraradices y G. fasciculatum en el sustrato 1. A pesar que esta variable no presentó coeficientes de correlación del nivel del resto de las anteriormente analizadas, si manifestó un

67

comportamiento similar en cuanto a las cepas o concentrados de especies que originaron los mayores valores. Como consecuencia de la integración de los Métodos Multivariados y de los Análisis de Varianza (ANOVA) realizados a las variables que mayor influencia ejercieron sobre la conducta de los tratamientos, se obtuvo que las cepas y los concentrados de especies empleados se comportaron de la siguiente forma: G. intraradices - S1 > G fasciculatum - S1 > G. fasciculatum - S2 y concentrados de especies de Selva y de Desierto ambos en el sustrato 1.

68

Colonización

Densidad Visual

f

cdee

ac

g

cdabb

ce

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A(%)

Sustrato 1 Sustrato 2

ef

ba

b

c

g

cdb

fcde de

g

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

B(%)

Sustrato 1 Sustrato 2

Leyenda: 1 y 7: G. clarum; 2 y 8: G. fasciculatum; 3 y 9: G. intraradices; 4 y 10: Selva; 5 y 11: Desierto y 6 y 12: Controles. Sustrato 1: Sunshine # 3 Sustrato 2: Sunshine # 3 + Vermiculita (2:1) Barras con letras desiguales difieren entre si significativamente para p≤ 0.05 según Test de Rangos Múltiples de Duncan.

Figura 4. Efecto de la aplicación de diferentes inoculantes micorrízicos y sustratos sobre plántulas de papa expresado en las variables fúngicas Porcentaje de Colonización (A) y de Densidad Visual (B).

69

ab

0

2

4

6

8

10

Sustrato 1 Sustrato 2

aba

b ab b

c

0123456789

10G

. cla

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G. f

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G. i

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(umol CO2. m-2.s-1)

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0

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G. i

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t.

(%)

Leyenda: G. clar.=G. clarum; G. fasc.= G. fasciculatum; G. intr.= G. intraradices; Des.= Desierto y Cont.= Control. Sustrato 1: Sunshine # 3 Sustrato 2: Sunshine # 3 + Vermiculita (2:1) Barras con letras desiguales difieren entre si significativamente para p≤ 0.05 según Test de Rangos Múltiples de Duncan.

Eficiencia en el uso del agua

Tasa Fotosintética

a

b

0.0015

0.0016

0.0017

0.0018

0.0019

0.002

Sustrato 1 Sustrato 2

A

B

Figura 5. Efecto de la aplicación de diferentes inoculantes micorrízicos y sustratos sobre plántulas de papa expresado en las variables fisiológicas Tasa fotosintética (A) y Eficiencia en el uso del agua (B).

70

(%) Magnesio A

cd

12

Sustrato 2Sustrato 1

cd

a

c

a

dbcbcbc

ababcd

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

) (%

f

dc

d

g

eed

bc

e

a

0

0.5

1

1.5

2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

(g) B

Sustrato 2 Sustrato 1

Masa seca total

Figura 6. Efecto de la aplicación de diferentes inoculantes micorrízicos y sustratos sobre plántulas de papa expresado en el porcentaje de Magnesio (A) y la Masa seca foliar (B).

Leyenda: 1 y 7: G. clarum; 2 y 8: G. fasciculatum; 3 y 9: G. intraradices; 4 y 10: Selva; 5 y 11: Desierto y 6 y 12: Controles. Sustrato 1: Sunshine # 3 Sustrato 2: Sunshine # 3 + Vermiculita (2:1) Barras con letras desiguales difieren entre si significativamente para p≤ 0.05 según Test de Rangos Múltiples de Duncan.

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La introducción de hongos micorrizógenos arbusculares como inoculante en la fase adaptativa de la micropropagación de plantas ha tomado auge en los últimos años, involucrando un gran número de cultivos de interés económico (Fortin y col., 2002). Sin embargo, no abundan los trabajos en los que se incluyan mediciones de tasa fotosintética y otras variables fisiológicas para evaluar la respuesta de las plantas a la micorrización en este estadio, así como tampoco se reportan estudios que empleen diferentes combinaciones de cepas, concentrados de especies y/o sustratos con este enfoque y que además se refieran a este cultivo en particular. En este estudio se presentan claramente dos aspectos fundamentales y de marcado interés: (1) la interacción cepas ó concentrados de especies - sustratos y (2) el efecto diferenciado de la cepas sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas Desde el punto de vista de un manejo eficiente de los HMA en esta y en cualquiera de sus otras aplicaciones, uno de los aspectos decisivos resulta la dependencia que existe entre la eficiencia de los hongos micorrizógenos y la riqueza nutricional del sustrato, definida por sus componentes. La mezcla de turba de musgo Sunshine # 3 es muy utilizada en numerosos países como México para realizar la adaptación de vitroplantas de gran variedad de cultivos como la papa, la fresa, el agave, el chile, etc. Esta mezcla posee un tamaño de fibra pequeño y contiene una carga media de fertilizantes, además de cal dolomítica la cual provee de calcio y magnesio y yeso como servidor de azufre y calcio. Indiscutiblemente, el empleo de este sustrato permitió no solo el exitoso desarrollo y establecimiento de la asociación micorrízica, expresado en cada una de las variables estudiadas, sino que también garantizó, conjuntamente con la micorrización, el adecuado crecimiento y adaptación de las plántulas. La efectividad de las cepas está indisolublemente ligada a la riqueza del sustrato, por lo que el hecho que las cepas presentaran un mayor efecto en los tratamientos sin vermiculita sugiere o indica que la disminución de los nutrientes provocada por la mezcla con este sustrato limitó en alguna medida el suministro de nutrientes para las plantas micorrizadas, originando un comportamiento diferenciado de las cepas en función del sustrato empleado: Glomus intraradices (sustrato 1) > G. fasciculatum (sustrato 1) > G. fasciculatum (sustrato 2) > Concentrado de especies de Selva y Desierto (sustrato 1). De forma general, la micorrización resulta eficiente cuando las plantas se desarrollan en condiciones de suministro subóptimo de nutrientes con respecto a plantas no micorrizadas (Harley y Smith, 1983, Fernández, 1999 y Sánchez, 2001), de manera que exista una ganancia neta para la

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planta con esta asociación y que la energía y productos del metabolismo de la planta que son utilizados para el desarrollo de la micorriza, sean largamente retribuidos a través de los incrementos en absorción y en la tasa de crecimiento neto (Marschner y Dell, 1994; Smith y col., 1994). Estudios previos realizados por Fernández (1999) y Sánchez (2001) en posturas de cafeto sobre la respuesta a la inoculación con variadas cepas de HMA en diferentes tipos de suelos, permitió establecer la existencia de una alta dependencia entre la efectividad y eficiencia de la micorrización y la riqueza del sustrato, definida en ese caso por el tipo de suelo y su fertilidad asociada, así como por la relación suelo / abono orgánico utilizada para conformar los sustratos. Aunque los trabajos realizados por estos autores estuvieron enfocados a posturas de cafeto, no cabe duda que la ocurrencia de este fenómeno es extensiva para cualquiera de los sistemas de cultivo empleados. Al respecto han sido publicados algunos trabajos en los cuales se estudió el efecto de diferentes sustratos sobre el desarrollo de la micorrización en plántulas micropropagadas en estadio adaptativo, como los de Noval y col. (1995 y 1997), quienes estudiaron el desarrollo de vitroplantas de piña y banano respectivamente, encontrando un comportamiento diferenciado de las cepas frente a los diferentes sustratos, así como variadas respuestas de las plantas en función de los contenidos nutricionales de estos. En cuanto al comportamiento de las cepas se destacan G. intraradices y G. fasciculatum por su mayor efecto sobre el desarrollo integral de las plantas de papa, no obstante, el empleo de concentrados de especies también originó efectos positivos, aunque inferiores a los encontrados con la inoculación de cepas individuales, lo cual puede estar relacionado, no solo con la concentración de propágulos, sino también con la capacidad de adaptación de las diferentes cepas a nuevos ambientes, así como con las relaciones de competencia que pueden establecerse entre ellas. Dentro de las especies pertenecientes al Orden Glomales existen marcadas diferencias en cuanto a su distribución en los ecosistemas y a la eficiencia de sus mecanismos de colonización (Sieverding, 1991). Precisamente, las especies pertenecientes al género Glomus poseen de manera general un amplio rango de distribución funcional, predominando en ecosistemas de alta y media fertilidad en los cuales resultan extremadamente eficientes y competitivas (Barros, 1987 y Sieverding, 1991). Según Duc y col. (1989) y Vierheilig (2001) en las paredes celulares de sus esporas e hifas se encuentra con relativa abundancia el compuesto 1, 3 β Glucano, similar a como ocurre en grupos de hongos más evolucionados, el cual, al ser reconocido, es hidrolizado por determinadas enzimas de las plantas, las que pueden activar y acelerar

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sus mecanismos de germinación y crecimiento, provocando una rápida colonización radical, todo lo cual le confiere una mayor ventaja y rapidez en los mecanismos de infección sobre los otros integrantes del orden al cual pertenecen. En las otras familias que lo componen no se presenta con tanta claridad este fenómeno debido a la falta o escasez de este compuesto en sus paredes celulares, por lo que los mecanismos de colonización son, por lo general, más lentos y dependen en mayor grado de los procesos químico - biológicos normales del suelo (Gianinazzi - Pearson y col., 1993). En estudios realizados en posturas de cafeto por Fernández (1999) y Sánchez (2001) sobre diferentes tipos de suelos y combinaciones de sustratos empleando gran número de cepas de HMA se encontró, igualmente, que en cualquiera de los suelos estudiados los mejores efectos sobre el crecimiento de las plantas estuvieron relacionados con cepas pertenecientes al género Glomus. Al respecto se pronunciaron Dodd y Thompson (1994) al plantear que la respuesta a la inoculación es dependiente no sólo de la infectividad y eficiencia de la cepa aplicada, sino que además es consecuencia de la existencia y cantidad de propágulos de la misma. Resultados similares fueron reportados por Fernández (1999) al inocular posturas de cafeto con concentrados de especies nativas y cepas independientes y comparar su efecto sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas, encontrando en todos los casos un mayor efecto de las cepas individuales respecto a los concentrados. Por otra parte, las variables fúngicas de porcentajes de Colonización y de Densidad Visual reflejaron ampliamente el comportamiento micorrízico, no obstante, la segunda logró realizar una mejor diferenciación del efecto de los sustratos, lo cual resulta lógico si tenemos en cuenta que la colonización cuantifica solamente la presencia del hongo en la raíz y no la intensidad de la misma. Sobre este aspecto se han referido pocos autores como Herrera y col. (1995); Fernández (1999); Sánchez (2001) y Hart y Reader (2002), pero todos coinciden en que la Densidad Visual expresa la intensidad infectiva del simbionte tomando en consideración niveles visuales de ocupación fúngica en el interior radical, a diferencia del porcentaje de Colonización que solo tiene en cuenta la presencia del simbionte. Resulta de gran importancia el papel que pueden jugar estos microorganismos sobre el estado fisiológico y nutricional de las plantas colonizadas (Varma y Schuepp, 1994; Cordier y col., 1996; Dolcet - San Juan y col., 1996; Davies y col., 2000 y Yao y col., 2002). Su impacto en este sistema de cultivo responde a su capacidad de colonizar ampliamente el sistema radical, participando activamente en la absorción de los diferentes nutrientes (macro y micronutrientes) y el agua.

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Según Barea y col. (1991) y Smith y Read (1997), por cada metro de raíz colonizada se producen entre 7 y 250 metros de hifas externas de hongos micorrizógenos arbusculares, dependiendo de la especie implicada y de las condiciones de crecimiento. El micelio extramatrical ha mostrado ser capaz de captar muy eficazmente agua y nutrientes (George y col., 1995), en especial fósforo (Jakobsen, 1995 y Carreón y col., 2000), nitrógeno (Tobar y col., 1994 y Ruiz, 2001), y actualmente se reconoce el efecto directo de las micorrizas sobre la absorción de prácticamente todos los elementos esenciales minerales (George 2000), a partir de estructuras captadoras de nutrimentos muy similares a los arbúsculos intraradicales (Bago y col., 2000). En este caso, en particular, la micorrización eficiente de las plantas de papa provocó incrementos en las variables fisiológicas estudiadas producto, no solo de una mayor absorción del fósforo y otros nutrientes, sino también por incrementar la fortaleza de la raíz y del sistema aéreo como sitios de consumo y garantizar una mayor absorción y retención del agua en los tejidos de las plántulas inoculadas. En consecuencia se han manifestado algunos autores, quienes aseguran que la micorrización de los sistemas radicales de las plantas tiene un efecto positivo sobre la asimilación del carbono (Schwob y col., 1998; Wright y col., 1998), especialmente bajo condiciones de estrés (Sánchez - Díaz y col., 1990 y Shrestha y col., 1995). Primeramente, existen evidencias de que la fotosíntesis puede ser regulada por la fortaleza de los sumideros o sitios de consumo como determinadas estructuras de almacén, frutos u otros órganos (Wright y col., 1998 y Douds y col., 2000). Un segundo mecanismo puede ser a través de incrementos en la nutrición de la planta, mediante lo cual el hongo puede incrementar la tasa fotosintética de su hospedero.En relación con el fósforo específicamente, se plantea que los niveles de Pi citoplasmático en la hojas regulan la exportación del carbono y por lo tanto la fotosíntesis, a través del translocador de triosa - P / Pi que se encuentra en la membrana cloroplástica. Los bajos niveles de Pi permiten reconstituir el almidón en los cloroplastos, lo cual puede disminuir la tasa fotosintética (Douds y col., 2000).

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Por otra parte, las relaciones con el agua también pueden verse afectadas a causa de la colonización micorrízica, al presentar, las plantas micorrizadas, mayores valores de conductancia estomática y de potencial de agua de las hojas bajo condiciones de estrés. Las hifas son capaces de absorber agua a potenciales más bajos que los pelos radicales lo que provoca una mayor absorción del agua y por tanto, que las plantas micorrizadas tengan mayores tasas fotosintéticas y contenidos de agua que las no micorrizadas. Los mecanismos involucrados aún no están totalmente dilucidados, no obstante las hipótesis elaboradas al respecto relacionan diferentes aspectos como: efectos indirectos a partir de incrementos en la absorción de P; aumentos en la toma de agua a través de los sistemas micorrizados, ya sea por incrementos en la conductividad hidráulica de la raíz o por variación de su arquitectura; modificaciones bioquímicas en la regulación del agua en la planta hospedera por cambios en las señales hormonales o una inducción de respuestas osmorreguladoras de las plantas inoculadas comparadas con los controles (Hernández - Sebastia y col., 1999). En un trabajo similar al aquí presentado empleando vitroplantas de guayaba micorrizadas, se concluyó que la tasa fotosintética de las plantas inoculadas incrementó como consecuencia de su estado nutricional, refiriendo además, que el incremento pudo haber ocurrido independientemente de los niveles de fósforo (Douds y col., 2000). De igual forma, obtuvieron que los mayores valores de masas secas foliares, radicales y de los tallos estaban relacionados con los tratamientos inoculados, que además mostraron las mayores tasas fotosintéticas, así como un mejor estado nutricional, expresado en un aumento de la absorción de P, Mg, Cu y Mo con relación a los controles. Por otra parte y coincidiendo con este trabajo se encuentra el realizado por Valencia y col. (2000), quienes evaluaron la influencia de Glomus fasciculatum sobre el intercambio de gases y la calidad de los tubérculos de plantas de papa (Variedad Alfa) en condiciones de campo. Estos autores reportaron marcados incrementos de las plantas micorrizadas con respecto a sus homólogas en cuanto a la masa seca total, el número de tallos, la tasa fotosintética, la eficiencia en el uso del agua y el rendimiento. Los primeros trabajos sobre el estudio de la simbiosis micorrízica y sus efectos nutricionales sobre las plantas, estaban enfocados principalmente al fósforo como elemento fundamental involucrado en el intercambio de nutrientes entre ambos simbiontes (George, 2000), sin embargo fue demostrado por trabajos subsecuentes que producto de la micorrización ocurren efectos directos sobre la nutrición de prácticamente el resto de los elementos minerales esenciales,

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beneficiándose otros elementos como el K, N, Ca, Mg, Mn, Zn, Cu, Cd, Fe y Mo (Marschner y Dell, 1994; George y col., 1995; Jakobsen, 1995 y Smith y Read, 1997). Diferentes estudios relacionados con la aplicación de hongos micorrizógenos arbusculares en la fase de adaptación de vitroplantas se han referido a este tema en particular, destacando el efecto positivo de la inoculación sobre la absorción de nutrientes.

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CONCLUSIONES.

Tarea 01.

Se obtiene por primera vez en el mundo un inoculante micorrizógeno de Glomus fasciculatum y Glomus clarum en soporte líquido con una viabilidad demostrada de 8 meses de almacenamiento.

Los propágulos fúngicos presentes en los inoculantes líquidos estudiados mantuvieron su capacidad germinativa y su capacidad colonizadoras de plantas, después de 8 meses de incubación.

El medio líquido micorrizógeno puede mezclarse a altas concentraciones con el complejo 20-6-6 (NPK) sin pérdida significativa de la viabilidad de las esporas. Las mezclas con los complejos 10-40-10 y 18-18-18 sin bien pueden inducir mayores pérdidas de viabilidad de las esporas, ésta permanece a niveles aceptables y en mezclas más diluidas no cabría esperar la ocurrencia de estos comportamientos.

Se encontró una marcada autofluorescencia en la especie Glomus clarum a partir de la excitación, no sólo a la longitud de onda de 480 nm, sino que por primera se informa excitación en la zona del ultravioleta (280 nm) y en la luz roja (690 nm).

Se cuenta con una antisuero específico para la detección de Glomus clarum mediante la metodología de ELISA

La reacción del antisuero desarrollado contra Glomus clarum resultó mucho más intensa con valores indeterminados de absorbancia. A partir de 1/1000 y hasta la dilución 1/3000 el antisuero policlonal solo reconoció las esporas de esta especie, sin que se evidenciaran reacciones cruzadas con las otras especies de Glomus estudiadas.

.

Tarea 02.

La desinfección de esporas de Glomus clarum con Cloramina T (2%) y Cefalexina (200 mg.ml-1) en medio Agar Agua y en tiempos de exposición de dos y seis minutos fue efectiva, no solo para el control de la contaminación microbiana, alcanzando

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valores de 3.3 y 3.2 % de contaminación respectivamente, sino también para garantizar la germinación de las esporas, aunque con porcentajes de solo 44.0 y 44.6 % a los 25 días de incubación.

La incubación de las esporas previamente desinfectadas en atmósfera de CO2 (5%) posibilitó la rápida y homogénea germinación de las mismas, garantizando el 100 % de las esporas germinadas y asépticas en solo tres días de incubación, listas para ser empleadas en los estudios de inoculación de plantas en condiciones in vitro.

Las variables Germinación (%) y Contaminación (%) mostraron una relación inversa en su comportamiento presentando coeficientes de determinación superiores a 0.95***, lo cual indicó una dependencia altamente significativa entre ambas.

Tarea 03 y 05.

El nuevo medio de cultivo (N) diseñado como soporte para el cultivo dual, no satisfizo las necesidades nutricionales de las plántulas de papa, las cuales mostraron serias afecciones relacionadas con su crecimiento, sin embargo posibilitó el establecimiento de la colonización micorrízica.

El efecto depresivo provocado por el medio N fue más intenso en los casos de las plantas inoculadas, lo cual indica un incipiente proceso de reconocimiento simbiótico afectado por la escasez de nutrientes, puesto de manifiesto a partir de un crecimiento atrofiado y poco armónico y cambios sustanciales en el coloración de las hojas que se tornaron purpúreas.

Las plántulas de papa inoculadas y desarrolladas sobre el medio de cultivo Mínimo (M) reflejaron el efecto positivo de la inoculación micorrízica, llegando a alcanzar valores, en las variables estudiadas, similares estadísticamente a los de las plantas controles cultivadas sobre medio Murashige & Skoog (MS).

Tarea 05.

En los estudios de inoculación post in vitro las plantas de papa mostraron una alta respuesta a la inoculación con las diferentes cepas y los concentrados de especies de HMA, dependiente de los

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sustratos empleados, siendo los mejores tratamientos los siguientes: G. intraradices y G fasciculatum, en el sustrato 1, seguidos por G. fasciculatum en el sustrato 2 y los concentrados de especies de Selva y de Desierto ambos en el sustrato 1.

Los Análisis Multivariados de Componentes Principales y de Cluster permitieron definir dos componentes que explicaban en un 64,09 % la variabilidad total del experimento, estando caracterizada la primera componente por las siguientes variables: Colonización, Densidad Visual, Tasa Fotosintética, EUA y contenido de Magnesio foliar y la segunda por: Masa seca foliar y contenido de Manganeso foliar.

El efecto positivo de la inoculación micorrízica se expresó, no solo a través de incrementos en las variables fúngicas Colonización y Densidad Visual, sino que también se reflejó en el resto de las variables estudiadas, demostrando la factibilidad del uso de la micorrización en esta etapa de la micropropagación del cultivo de la papa.

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