Micro Algas

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REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS MAESTRÍA EN MICROBIOLOGÍA EVALUACIÓN DE MICROALGAS Y DE BACTERIAS ASOCIADAS PRODUCTORAS DE EXOENZIMAS PARA TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES DE UNA EXTRACTORA DE ACEITE DE PALMA Trabajo de Grado presentado ante la División de Estudios para Graduados para optar el grado de Magister Scientarium en Microbiología. Autor: Microbióloga Sandra Milena Rodríguez Puerta C.I. 26.946.094 Tutor: Dr. Ever D. Morales A. C.I. 3.638.303 Co-Tutor: Carmen Cárdenas C.I. 4.148.207 MARACAIBO-JULIO 2010

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REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA

FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS

MAESTRÍA EN MICROBIOLOGÍA

EVALUACIÓN DE MICROALGAS Y DE BACTERIAS ASOCIADAS PRODUCTORAS DE EXOENZIMAS PARA TRATAMIENTO DE AGUAS

RESIDUALES DE UNA EXTRACTORA DE ACEITE DE PALMA

Trabajo de Grado presentado ante la División de Estudios para Graduados para optar el grado de Magister Scientarium en Microbiología.

Autor: Microbióloga Sandra Milena Rodríguez Puerta C.I. 26.946.094

Tutor: Dr. Ever D. Morales A. C.I. 3.638.303

Co-Tutor: Carmen Cárdenas C.I. 4.148.207

MARACAIBO-JULIO 2010

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EVALUACIÓN DE MICROALGAS Y DE BACTERIAS ASOCIADAS PRODUCTORAS

DE EXOENZIMAS PARA TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES DE UNA EXTRACTORA DE ACEITE DE PALMA

Sandra Milena Rodríguez Puerta Microbiólogo

C.I. 26.946.094

Dirección: Calle 27 No 5ª-149 Barrio Santa Rosa (Colombia-Cesar) Teléfono: 005755840394-3126288161

e-mail. [email protected], [email protected]

Dr. Ever D. Morales A. M.Sc. Carmen H. Cárdenas L. C.I. 3.638.303 C.I. 4.148.207 Tutor Co-Tutor

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4  

A mi Dios por todo su amor

A mis padres Israel y María Teresa

A mis hermanas Ximena y Adriana

A ti Julio por tu apoyo incondicional

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5  

Agradecimientos

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6  

A Dios padre Celestial, por su amor incondicional y por darme fuerza en los momentos

difíciles y por concederme este triunfo en mi vida.

A mis padres Israel Rodríguez y María Teresa Puerta, por brindarme esta oportunidad,

para un futuro mejor en mi vida, Gracias los quiero mucho.

A mis hermanas Ximena Paola y Adriana Patricia, a ti xime que me acogiste en tu casa

y me apoyaste en todo y mis seres queridos Carlos, Mi abuelo Marcos (QEPD) y toda

mi familia los quiero.

A la Empresa Palmas Oleaginosas de Casacará Ltda. por brindarme todo el apoyo en la

realización de este proyecto.

Al Laboratorio de Microorganismo Fotosintéticos y Laboratorio del Centro

Investigaciones del Agua por el financiamiento para la realización de este proyecto.

A mi profe Ever Morales por todos sus conocimientos transmitidos y sabiduría en todos

estos años, por su confianza y comprensión para con mi proyecto, y por toda su

colaboración, Gracias mi profe, y que Dios lo bendiga siempre.

A la profe Roberta Mora, por sus conocimientos, buenos consejos transmitidos, apoyo

en aquellos momentos difíciles por ser como una madre y una buena amiga.

A mis queridos profesores Laugeny Díaz, Mayela Yépez, Beltran Briceño y Gisela

Fuenmayor, por todos esos buenos momentos, ayudas y aclaratorias para la realización

de este proyecto.

A la profesora Carmen Cardenas por el apoyo en la realización de este proyecto.

A la Lic. Yadira y la Señora Oda por su apoyo y asesoría en la realización de este

proyecto.

A ti Julio Cesar, que en todo momento siempre has estado ahí apoyándome y dándome

ánimos para la culminación de este logro en mi vida Gracias.

A mis buenos compañeros y amigos Alexandra gracias por toda tu ayuda y paciencia,

José Leonardo (Cheleo), Jorge, Lita, Charity, Hugo, Nestor, Fidel, Tali, Fabiola Jorfran y

todos aquellos que me apoyaron de una forma u otra gracias por todo y por todos

aquellos momentos compartidos con ustedes.

A todos Los quiero mucho y mil Gracias que Dios los bendiga, no los olvidare!!!!!!!!!!.

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Índice de Contenido

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8  

Pág.

RESUMEN 14

ABSTRACT 15

INTRODUCCIÓN 16

OBJETIVOS 24

MATERIALES Y MÉTODOS 25

ETAPA 1. Caracterización de las lagunas de estabilización de la planta

extractora de aceite de palma

26

3.1. Descripción del área de estudio y toma de muestras de las Lagunas

de Estabilización de la Planta Extractora de aceite de palma

26

3.2. Microorganismos fotosintéticos presentes en las Lagunas de

Estabilización de una Extractora de Aceite

27

3.2.1. Aislamiento y diversidad de los microorganismos fotosintéticos en

Lagunas de Estabilización de una Extractora de Aceite

28

3.2.2. Medios de Cultivo 28

3.2.2.1. Inorgánico 28

a. Medio comercial: ALGAL 28

b. Fertilizante comercial: NITROFOSKA 29

c. Medio comercial: BG11 30

3.2.3. Técnicas de Aislamiento 30

3.2.3.1. Rayado en Placas 30

3.2.3.2. Diluciones seriadas 31

3.2.3.3. Uso de Agentes antiparasitarios 31

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9  

3.3. Cultivo de microalgas aisladas de las lagunas de estabilización 31

3.3.1. Cultivos de los microorganismos fotosintéticos aislados en

condiciones autotróficas

31

3.3.1.1. Recuento celular 31

3.3.1.2. Contenido de pigmentos: clorofila y carotenoides 32

3.4. Aislamiento e identificación de cepas bacterianas asociadas a las

microalgas

32

3.4.1. Medio de Cultivo 33

3.4.2. Identificación bioquímica de las cepas bacterianas 34

3.4.2.1. Método de biomerieux vitek 34

ETAPA 2. Determinación de Exoenzimas de las microalgas identificadas y sus

bacterias asociadas

35

3.5. Determinación de Exoenzimas 35

3.5.1. Determinación de Amilasa 35

3.5.1.1. Método del almidón (0,2%) en medio sólido 35

3.5.1.2. Método del almidón (0,2%) en medio líquido 35

3.5.2. Determinación de Lipasa 36

3.5.2.1. Método con la yema de Huevo 36

3.5.2.2. Método con el detergente Tween 80 36

3.5.2.3. Método con Lecitina al 0,1% 37

3.5.2.4. Método cuantitativo con el p-nitrofenilpalmitato (p-NPP) 37

3.5.3. Determinación de Proteasa 37

3.5.3.1. Método de hidrólisis de la gelatina 38

3.5.3.2. Método de hidrólisis de la caseína 38

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10  

3.5.4. Determinación de Fosfatasa 38

3.5.4.1.Equipo Olympus AU480 38

3.5.5. Determinación de Celulasa 39

3.5.5.1.Método de la carboximetil celulosa 39

3.5.6. Determinación de Ureasa 39

3.5.6.1.Urea de Rustigian y Stuart 39

ETAPA 3. Ensayos realizados con agua residual de una extractora de aceite

de palma

40

3.6. Ensayos 40

3.6.1. Ensayos en condiciones autotróficas 40

3.6.2.Ensayos en condiciones mixotróficas 40

3.6.2.1. Primer Ensayo 41

3.6.2.2. Segundo Ensayo 42

3.6.2.3. Parámetros de Cultivo 43

3.6.2.4. Exoenzimas a ensayos 1 y 2 43

3.7. Recuento de bacterias asociadas a los cultivos 43

3.8. Determinación de los parámetros fisicoquímicos de las muestras de

aguas residuales

44

3.8.1. Nitrógeno Total Kjeldahl (Standard Methods, 2005) 45

3.8.2. Fósforo Total (Standard Methods, 2005) 46

3.8.3. Demanda Química de Oxígeno (Standard Methods, 2005) 46

3.8.4. Aceites y Grasas (Standard Methods, 2005) 47

3.8.5. Sólidos Suspendidos Totales SST (Standard Methods, 2005) 48

3.8.6.Sólidos Suspendidos Volátiles SSV (Standard Methods, 2005) 49

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11  

3.8.7.Determinación del pH (Standard Methods, 2005) 49

3.9. Análisis Estadístico 49

RESULTADOS Y DISCUSIÓN 51

ETAPA 1. Caracterización de las lagunas de estabilización de la planta

extractora de aceite de palma

52

4.1. Microalgas y bacterias asociadas a las microalgas, aisladas de

Lagunas de Estabilización de una Planta extractora de aceite de

palma

53

4.1.1. Identificación de microorganismos fotosintéticos de lagunas de

estabilización de una planta extractora de aceite de palma

54

4.1.1.1. Cultivos unialgales de las microalgas aisladas de las lagunas de

estabilización

61

4.1.1.2. Aislamiento e identificación de bacterias asociadas a los cultivos

de microalgas y cianobacterias

63

a. Bacterias Asociadas a Chlorella sp. 1 y 2 63

b. Bacterias asociadas a Oocystis sp. 64

c. Bacterias asociadas a Scenedesmus sp. 64

d. Bacterias asociadas a la cianobacteria Geitlerinema sp. 65

e. Bacterias Asociadas a Chlorococcum sp. 66

4.1.2. Microalgas y su relación con los parámetros fisicoquímicos de las

lagunas de estabilización de una extractora de aceite de palma

67

4.1.2.1. Demanda Química de Oxigeno (DQO) 73

4.1.2.2. Sólidos Suspendidos Totales (SST) 73

4.1.2.3. Nitrógeno 75

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12  

4.1.2.4. Fosforo 76

4.1.2.5. Aceites y grasas 77

4.1.3. Variación del pH en las lagunas de estabilización de una planta

extractora de aceite

78

4.2. Exoenzimas en microalgas y en sus bacterias asociadas, aisladas

de Lagunas de Estabilización de una Planta extractora de aceite de

palma

80

4.2.1. Exoenzimas en microalgas y sus bacterias asociadas 81

4.2.1.1. Amilasa 81

4.2.1.2. Lipasa 84

4.2.1.3. Proteasa 89

4.2.1.4. Fosfatasa 91

4.2.1.5. Actividad de celulasa 93

4.2.1.6.Actividad de ureasa 95

4.3. Remoción de DQO, Nitrógeno, Fósforo y grasas en agua residual

de una Planta extractora de aceite de palma en presencia de

microalgas y sus bacterias asociadas

97

4.3.1. Cultivos mixtos de microalgas productoras de exoenzimas con

agua residual de la planta extractora de aceite de palma

98

4.3.1.1. Crecimiento y contenido de pigmentos en el primer ensayo 98

4.3.1.2. Crecimiento y contenido de pigmentos en el segundo ensayo 102

4.3.2. Efecto del pH en los cultivos mixtos de las Microalgas 105

4.3.3. Análisis de Remoción de materia orgánica y nutrientes 107

4.3.3.1. Demanda Química de Oxigeno (DQO) 107

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13  

4.3.3.2. Sólidos Suspendidos Totales (SST) y Sólidos Suspendidos

Volátiles (SSV)

109

4.3.3.3. Nitrógeno (Nitrógeno Total Kjeldahl) 113

4.3.3.4. Fósforo Total 116

4.3.3.5. Aceites y Grasas 119

4.3.4. Presencia de Exoenzimas 121

4.3.5. Población de bacterias asociadas a los cultivos 123

CONCLUSIONES 126

RECOMENDACIONES 129

Índice de Referencias 131

Índice de Figuras 147

Índice de Tablas 152

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Rodríguez Puerta, Sandra Milena. Evaluación de Microalgas y Bacterias Asociadas productoras de Exoenzimas para Tratamiento de aguas Residuales de una Extractora de Aceite de Palma. Trabajo de grado para optar el grado de Magister Scientarium. Universidad del Zulia, Facultad Experimental de Ciencias, División de Estudios para Graduados, Maracaibo, Venezuela. 2010. 154 p.

RESUMEN La capacidad de los microorganismos fotosintéticos y su potencial como productores de exoenzimas puede ser aprovechado para el tratamiento de aguas residuales. Se evaluó la diversidad y abundancia de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintéticas en lagunas de estabilización de una Planta extractora de aceite de palma (Elaeis guineensis) en relación a los parámetros fisicoquímicos. La presencia de lipasa, proteasa, fosfatasa, celulasa, amilasa y ureasa, también fue determinada en estos microorganismos y en su flora bacteriana asociada. Asimismo, se analizó la capacidad de remoción de DQO, nitrógeno, fósforo, sólidos totales, grasas y aceites en el agua residual en cultivos unialgales de microalgas y cianobacterias. El estudio se realizó con agua residual (AR) y enriquecida con fertilizante (ARN), en un primer bioensayo. Mientras que, se utilizó además, agua residual + fertilizante + mezcla orgánica (ARNO) y agua residual + mezcla orgánica (ARO), mezcla orgánica + fertilizante (NO) y en relación a los controles (control-AR) y agua destilada+ fertilizante (Control) en un segundo bioensayo. Se identificaron 18 microalgas, 8 cianobacterias y 1 bacteria fotosintética; de las cuales se cultivaron Chlorella sp. 1, Chlorella sp. 2 y Chlorella sp. 3, Scenedesmus sp. 1 y S. ecornis, Chlamydomonas sp., Chlorococcum sp., Oocystis sp. y Euglena sp. y 2 de cianobacterias Geitlerinema sp. y Synechocystis sp.; a partir de las cuales, también fueron aisladas 13 cepas de sus bacterias asociadas. La presencia de amilasa, lipasa, proteasa, fosfatasa, celulasa y ureasa fue detectada en Chlorella sp. 1, Chlorella sp. 2, Chlorella sp. 3, Synechocystis sp., Oocystis sp., Chlorococcum sp. y Geitlerinema sp. Los ensayos diseñados con agua residual permitieron deducir que, la remoción de DQO, parece no depender, al menos de las microalgas. En cambio, la de fósforo y de grasas fue más efectiva cuando dicho residual era más enriquecido con nutrientes inorgánicos y orgánicos (ARNO). De igual manera, con el agua residual enriquecida (ARN, ARO y ARNO) se produjo una remoción del 99,58% para el nitrógeno. Los resultados sugieren que las cepas de Chlorella sp., Oocystis sp., Scenedesmus sp., Chlorococcum sp. y Geitlerinema sp. productoras de exoenzimas pueden ser utilizadas para el tratamiento de residuales enriquecidas con almidones, proteínas y grasas. Palabras Claves: agua residual, exoenzimas, microalgas, bacterias, remoción. e-mail: [email protected].

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Rodríguez Puerta, Sandra Milena. Evaluation of microalgae and associated bacteria exoenzyme producing for wastewater treatment of an oil palm extractor plant. Grade work´s for to choose the grade master in microbiology. University of the Zulia, Experimental Ability of Sciences, Division of Studies for Graduate. Maracaibo, Venezuela. 2010. 154 p.

ABSTRACT The ability of photosynthetic microorganisms and potential as exoenzymes producers can be even useful for wastewater treatment. Diversity and abundance of microalgae, cyanobacteria and photosynthetic bacteria from a stabilization pond of palm oil (Elaeis guineensis) extracting plant were evaluated in relation to physicochemical parameters. Presence of lipase, protease, phosphatase, cellulose, amylase and urease were determinate in these microorganisms, as well as its associated bacterial flora. Furthermore, COD, nitrogen, phosphorous, total solids removal and fats and oils in unialgal cultures of microalga and cyanobacteria using wastewaters as a culture medium. The study is achieve with wastewater (WW) and enriched with nutrients (WWN), in an first experiment. While, were used also, wasterwater + fertilizant + organic mixture (WWNO) and wastewater + organic mixture (WWO) and in relation to culture controls (Control WW) and water distillate + fertilizant (Control) in an second experiment. Its identify eighteen microalgae, eight cianobacteria and one photosynthetic bacterial; the which was cultivate Chlorella sp. one, Chlorella sp. two y Chlorella sp. three., Scenedesmus sp. one y S. ecornis, Chlamydomonas sp., Chlorococcum sp., Oocystis sp. y Euglena sp. y two cyanobacterial Geitlerinema sp. y Synechcteocystis sp.; to split the which, also were aislates thirteen cepa associated bacterial. Presence of amylase, lipase, protease, phosphatase, cellulose and urease were determinate Chlorella sp. one, Chlorella sp. two, Chlorella sp. three, Synechocystis sp., Oocystis sp., Chlorococcum sp. and Geitlerinema sp. in experiment design with wastewater will let deduce, removal COD, appear did not depend to less the microalgae. In exchange, the phosphorous and fats were effective where wastewater was enriched with nutrients inorganic and organics (WWNO). While, wastewater enriched (WWN, WWO and WWNO) produced an removal 99,58% for nitrogen. Result to suggest the cepas Chlorella sp., Oocystis sp., Scenedesmus sp., Chlorococcum sp. and Geitlerinema sp. exoenzymes producers can were used for wastewater treatment enriched with almidon, protein and fats. Keywords: wastewater, exoenzymes, microalgae, bacterial, removal. e-mail: [email protected].

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16  

 

Introducción

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17  

Actualmente, se ha reducido la utilización del agua a causa del vertido de residuales

industriales, agropecuarios y domésticos, a fuentes hídricas produciendo, alteración y

limitando su capacidad de autodepuración con el incremento de la descarga de estos

residuales a los cuerpos de aguas (Seoánez, 1999). Sin embargo, constituyen un

recurso muy apreciado de gran valor económico para el riego y la acuicultura, en virtud

de la elevada concentración de nutrientes presentes en las aguas residuales.

La implementación de lagunas de estabilización para el tratamiento secundario de

aguas residuales, ha constituido un proceso de alta eficiencia en la remoción de

agentes contaminantes, exceso de nitrógeno, fósforo, DQO y metales, con la finalidad

de mejorar la calidad del agua, que pueda ser utilizada para otros fines. En este

sentido, los tratamientos biológicos en estos sistemas y los humedales construidos, han

representado una alternativa en el pulimento de aguas residuales, debido a que los

costos de operación y mantenimiento son bajos. Además, facilitan el reciclaje y

reutilización del agua (Lau y col. 1995; Romero, 1999). Estos sistemas de Lagunas de

estabilización se caracterizan también, por desarrollar una población microbiana,

integrada por bacterias heterótrofas, bacterias autotróficas, microalgas, cianobacterias y

protozoarios; que participan en el proceso de remoción de materia orgánica e

inorgánica (Romero, 2005).

Las microalgas y cianobacterias, presentes en estos residuales desempeñan un papel

importante en la purificación de aguas residuales; ya que tienen la capacidad de

remover cantidades elevadas de nitrógeno y fosforo, absorber metales y acelerar la

inactivación de bacterias patógenas (Abalde y col. 1995). La importancia y aplicación

de las microalgas en el tratamiento de aguas residuales, tiene sus antecedentes en la

época de Caldwell (1937), quien reporta la capacidad de remoción de nutrientes

contenidos en estos efluentes, para favorecer su crecimiento. Posteriormente Oswald

(1957), introduce un nuevo concepto al utilizar aguas residuales, para la producción

masiva de microalgas, con un alto contenido proteico, lo que finalmente se consideró

como un tratamiento terciario de las aguas residuales mediante el cultivo de microalgas

(Talbot y col. 1991; Valderrama y col. 2002; De-Bashan y Bashan, 2004).

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18  

Las microalgas utilizadas en el tratamiento de efluentes pueden ser consideradas como

una alternativa de tratamiento terciario, debido a los procesos acoplados entre las

bacterias aeróbicas, degradadoras de la materia orgánica y las microalgas, que

asimilan los productos de la degradación y compuestos inorgánicos, para realizar una

eficiente bioconversión de la energía solar. Generándose, así una producción de

biomasa microalgal, mejorando la calidad del efluente y aumentado la concentración de

oxigeno (Figura 1).

Las microalgas que se utilizan en el tratamiento de aguas residuales se caracterizan por

soportar elevadas concentraciones de nutrientes, presentar una actividad metabólica

elevada, contribuir con la oxidación bacteriana, capacidad de resistir variaciones

ambientales y estrategias fisiológicas para exhibir un crecimiento mixotrófico e

interacción favorable microalga-bacterias (Salazar, 2005).

Figura 1. Ciclo de oxigenación fotosintética de aguas residuales. Salazar, (2005).

Entre los microorganismos fotosintéticos comunes en lagunas de estabilización de

aguas residuales urbanas se encuentra una diversidad de microalgas (diatomeas,

euglenofitas, clorofitas), cianobacterias (coloniales, filamentosas y unicelulares) (Arauzo

y col. 2000) y bacterias fotosintéticas (Tabla 1).

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19  

Tabla 1. Microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintéticas más comunes en Lagunas de Estabilización.

GRUPO GÉNEROS REPRESENTATIVOS

Diatomeas Cyclotella, Gomphonema, Nitzschia, Navicula.

Euglenofitas Euglena, Phacus,

Clorofitas

Ankistrodesmus, Chlorella sorokiniana, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus, Scenedesmus rubescens, Scenedesmus obliquus Chlamydomonas, Oocystis, Stichococcus.

Cianobacterias Microcystis, Anabaena, Oscillatoria, Phormidium, Anabaenopsis, Arthrospira, Spirulina, Synechocystis.

Bacterias Thiopedia

Fuente: Safonova (2004); Salazar (2005); Escorihuela (2007).

De igual manera, se incluyen un registro de microalgas y cianobacterias cultivadas en

diferentes efluentes y en diversos países para la producción de biomasa con fines

agroalimentario (Tabla 2). En estas experiencias se refleja el amplio cultivo de Chlorella

sp., Scenedesmus sp. y de Spirulina sp. en Asia y América; con la particular

característica análoga de que son cosmopolitas, crecidas en los diversos cuerpos de

agua y de elevada capacidad de crecimiento en nutrientes orgánicos.

Tabla 2. Uso de microalgas para el tratamiento de aguas residuales en lagunas de alta tasa de oxidación en diversos países.

PAÍS INFLUENTE MICROALGA PRODUCTIVIDAD

(g.m2.d-1) Israel Municipal doméstico Scenedesmus sp. Euglena sp. Chlorella sp. 44.2

Taiwán Digerido porcino Spirulina sp. Chlorella sp. 15-25

India Orina humana Spirulina sp. 10-12

India Melaza (caña) Scenedesmus sp. 15-20

Tailandia Tapioca Spirulina sp. 7-10

Singapur Desecho porcino Cultivo mixto 5.4-5.0

E.U. Estiércol de ganado Chlorella sp. 30

Malasia Aceite de coco Chlorella sp. 2.7-12.8

Brasil doméstico Scenedesmus sp. Chlorella sp. 27-10

Fuente: Kojima y col. (2001).

La biomasa microalgal obtenida en estos sistemas de tratamiento, puede ser

cosechada o recuperada con un adecuado manejo de parámetros fisicoquímicos,

variación en cuanto a los volúmenes de cultivo, con altas densidades microalgales de

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cepas de microalgas “activadas” (adaptadas al efluente) y con residuales con bajos

tiempos de retención (Tabla 3). Además, las microalgas se utilizan en diferentes

aplicaciones comerciales como alimento de valor nutricional, alimentos en animales,

industria cosmética y productos de alto valor nutricional como los ácidos grasos,

pigmentos e isotopos bioquímicos estables (Correa, 1994; Apt y Behrens, 2002;

Salazar, 2005; Yamaguchi, 2005; Spolaore, 2006).

Tabla 3. Uso de biomasa de microalgas cultivadas en aguas residuales.

MICROALGAS EMPLEO Chaetoceros, Chlamydomonas, Chlorella, Chlorococcum, Cyclotella, Dunaliella, Haematococcus, Haslea ostrearia, Nannochloropsis oculata.

Acuacultura Moluscos, bivalvos, crustáceos, rotíferos, Rhodomonas, Cladóceros, Copépodos y peces.

Arthrospira, Chlorella, Dunaliella salina, Aphanizomenon flos-aquae.

Alimentación en Humanos

Chlorella, Scenedesmus, Arthrospira. Alimentación animal Avicultura, ganado porcino, ganado vacuno, perros, gatos y caballos.

Anabaena, Nostoc

Fertilizantes diversos

Arrozales y cultivos diversos.

Chlorella vulgaris, Dunaliella salina, Arthrospira, Nannochloropsis oculata, Porphyridium pupureum, Phaeodactylum tricornutum, Isochrysis galbana, Nitzschia laevis.

Producción de hidrógeno, metanización y ácidos orgánicos e industria cosmética.

Fuente: Salazar, (2005); Spolaore, (2006)

Los cultivos microalgales, al igual que algunas especies de cianobacterias (Álvarez y

Gallardo, 1989; Sallal, 1986; Talbot y De la Noüe, 1993; De la Noüe y Picard, 1985;

Oswald, 1988a,b; Tam y Wong, 1990), se han empleado con éxito en la remoción de

nutrientes de aguas residuales con un alto contenido de nitrógeno y fósforo (Przytocka-

Jusiak y col. 1984; Rodrígues y Oliveira, 1987; Gantar y col. 1984; Voltonia y col. 2005;

Larsdotter y col. 2007) y en la absorción de metales (Devars y col. 2000; Tam y col.

2001).

Entre otras estrategias fisiológicas de estos microorganismos, se encuentran la

capacidad de producir exoenzimas degradadoras de compuestos orgánicos en las

aguas residuales, a fin de generar sustratos más asimilables para su crecimiento y

metabolismo. Esto significa, que la carga orgánica en estos efluentes puede ser

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degradada por esta maquinaria enzimática; con lo cual la DBO5 es removida en función

del tiempo y actividad metabólica de bacterias, microalgas y cianobacterias presentes

(Hosetti y Patil, 1992). Las aplicaciones de los grupos de enzimas dependen de la

necesidad de hidrolizar polímeros complejos para incrementar su posterior degradación

microbiológica.

La producción de enzimas extracelulares, tales como; amilasa, proteasa, lipasa,

celulasa y fosfatasa constituye una propiedad bien conocida en microalgas y

cianobacterias; por ser utilizadas con carácter taxonómico, para identificación a nivel de

especies. Tal es el caso de las microalgas Chlorococcum y Spongiococcum quienes

producen enzimas proteolíticas extracelulares y enzimas amilolíticas (Archibald y Bold,

1970; Deason, 1976). Por ejemplo, la habilidad de hidrolizar gelatina es una

característica de las especies de Chlorella, Ankistrodesmus y Scenedesmus (Kessler,

1978; 1980). En las diatomeas, Navicula y Nitzschia se ha detectado actividad

agarolítica, proteolítica y fosfatasa (Tanaka y Ohwada, 1987). También se ha descrito,

en un estudio enzimático la fosfatasa alcalina en Phaeodactylum tricornutum,

Nannochloris y Nannochloropsis, que estas diatomeas usan fuentes de fosforo

inorgánico, mediante el uso de p-nitrofenil fosfato y 4-metil-umbeliferil fosfato (Ruiz y

col. 1997; Lubian y col. 1992).

Otra enzima degradante de polímeros utilizados de forma similar son las celulasas,

proteinasas y amilasas. Una aplicación particular que puede describirse como

tratamiento de residuos, es el empleo de proteinasas en las preparaciones comerciales

de detergentes, utilizadas como polvo de lavado biológico. Además de, estas hidrólisis

de materiales poliméricos, existen también aplicaciones de enzimas capaces de

degradar compuestos altamente tóxicos que podrían inhibir procesos de tratamiento

basado en el empleo microbiológico (Raymond, 2001).

Las actividades enzimáticas asociadas a la pared celular de plantas vasculares, hongos

y bacterias, también se han encontrado en especies de Chlorella y Scenedesmus, dada

la existencia de glicosidasas, fosfatasas y esterasas (Burczyk y Loos, 1995). De igual

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manera, en Chaetoceros ceratosporus se ha demostrado la actividad de una

fosfodiesterasa utilizando sustratos lipofílicos (Yamaguchi y col. 2005).

Esta capacidad de producción de exoenzimas por parte de las microalgas, de su flora

bacteriana asociada, y de otros microorganismos heterotróficos, puede ser utilizada

como herramienta para inducir una mayor eficiencia en la degradación de materia

orgánica existente en aguas residuales. Las enzimas extracelulares o ectoenzimas que

están unidas a la superficie de la célula y las de forma libre como las Exoenzimas son

absorbidas dentro de las sustancias poliméricas extracelulares (EPS) de la matriz del

lodo del tratamiento de aguas residuales (Cadoret y col. 2002); las hidrolasas son

importantes especialmente para la velocidad de la hidrólisis de la digestión anaerobia

(Figura 2).

Figura 2. Mecanismo de acción de las enzimas hidrolíticas sobre la materia orgánica. (1) Limitación de la transferencia de masa, (2) EPS, (3) Intermediarios metabólicos, (4) Condiciones del aceptor de electrones, (5) pH y Temperatura. Todos tienen un efecto sobre la actividad de las enzimas involucradas en el tratamiento de aguas residuales. Burgess y Pletschke, (2008).

En el tratamiento aeróbico las hidrolasas están libres en el medio o contenidas en una

matriz de EPS; y en el proceso anaeróbico estas enzimas están libres en el ambiente

extracelular o en este caso en las enzimas degradadoras de carbohidratos

Page 23: Micro Algas

23  

(glicohidrolasas) contenidas o inmovilizadas en un complejo catalítico llamado

celulosoma (solo presente en algunas bacterias) (Burgess y Pletschke, 2008). Higuchi

y col. (2005) clasifico las enzimas extracelulares del lodo digestado anaeróbicamente

en aguas residuales en dos: “Enzimas de Células-libres” dispersada en el líquido y las

“Enzimas ligada-célula” asociadas a la superficie de la célula del microbio.

Al respecto, se ha descrito el uso de lipasas asociadas a cultivos de especies de

Nitrosomonas, Nitrobacter, Pseudomonas, Xanthomonas, Micrococcus, Planocococcus

y Criptococcus, para eliminar depósitos de grasa procedentes de las paredes de las

tuberías que transportan el efluente de aguas residuales (Arias y Lastra, 2002; Gaseosa

y Hube, 1990). Asimismo, Leal y col. (2002), han descrito la producción de una lipasa

extraída de Penicillium restrictum para la remoción de DQO en tratamientos

anaeróbicos de aguas residuales, con alto contenido de grasas.

En este sentido, se han desarrollado paquetes biotecnológicos integrados por fuentes

de microalgas y bacterias para formular productos comerciales (Enzymplus 16 y

Oxydol), capaces de remover y acelerar el proceso de depuración biológica de las

aguas residuales de procedencia doméstica, agropecuaria e industrial (Ecobiotec,

2006). Es por ello, que reviste sumo interés, en el área de la biotecnología de

microalgas en nuestros países, incursionar en nuevas líneas de investigación sobre

remoción de materia orgánica de aguas residuales en función del uso de exoenzimas.

Y considerando, la falta de experiencias y conocimiento sobre la aplicación de inóculos

enriquecidos con microalgas-bacterias productoras de exoenzimas como catalizadores

en el pulimento de aguas residuales, se ha realizado el presente estudio, referente a la

detección de exoenzimas por parte de microalgas y su flora bacteriana asociada,

aislada de aguas residuales y a su posterior evaluación como fuentes de remoción de

materia orgánica y de nutrientes de residuales.

En este sentido, se ha seleccionado un sistema de Lagunas de Estabilización de una

Planta extractora de aceite de palma africana (Elaeis guinenesis) de la República de

Colombia, para considerar la producción de exoenzimas por microorganismos

Page 24: Micro Algas

24  

fotosintéticos presentes en estas aguas residuales, y en virtud del incremento constante

de la producción de estos residuales, por el ascenso de esta actividad agroindustrial en

Colombia y Venezuela. Por lo cual, se planteó como objetivo principal:

Evaluar microalgas y bacterias asociadas productoras de exoenzimas para tratamiento

de aguas residuales de una Planta extractora de aceite de palma.

Los objetivos específicos fueron los siguientes:

Identificar las microalgas y bacterias asociadas aisladas de lagunas de estabilización de

una extractora de aceite de palma.

Determinar presencia de exoenzimas en las microalgas y bacterias asociadas.

Relacionar las poblaciones de microalgas con el contenido de grasas y aceites,

Nitrógeno total Kjeldahl, Fosfato y DQO existentes en lagunas de estabilización.

Demostrar la remoción de DQO, nitrógeno y fósforo de aguas residuales de la Planta

extractora de aceite de palma, enriquecida con grasas, almidones y urea en presencia

de microalgas y sus bacterias asociadas productoras de exoenzimas.

Page 25: Micro Algas

25  

Materiales y Métodos

Page 26: Micro Algas

26  

Para el alcance de los objetivos planteados se realizaron las siguientes etapas

experimentales: la 1 etapa consistió en la caracterización de las lagunas de

estabilización de la planta extractora de aceite de palma Elaeis guinensis (aislar,

identificar y cultivar los microorganismos fotosintéticos y sus bacterias asociadas); la 2

etapa fue la determinación de exoenzimas de las microalgas identificadas y sus

bacterias asociadas y la 3 etapa fue la realización de los ensayos con agua residual de

una extractora de aceite de palma.

ETAPA 1. Caracterización de las lagunas de estabilización de la planta extractora de aceite de palma

3.1. Descripción del área de estudio y caracterización de las lagunas de estabilización de la planta extractora de aceite de palma

Se realizaron cuatro muestreos en las lagunas de estabilización de la Planta Extractora

de Aceite Palmas Oleaginosas de Casacará Ltda, ubicada en los predios de la hacienda

Centenario a 9° 50N y 73° 20W (Instituto Geográfico Agustín Codazzi) jurisdicción del

corregimiento de Casacará, municipio de Codazzi Departamento del Cesar, Colombia.

El sistema de lagunas de estabilización de la Planta Extractora de aceite, comprende

cinco lagunas en serie, comunicadas por medio de compuertas; de las cuales 2 lagunas

son facultativas y 3 de maduración o pulimento (Figura 3). El sistema se mantiene de

las aguas residuales provenientes del proceso de extracción de aceite de la planta. Las

muestras se colectaron en frascos de plástico (Ambar-Análisis Biológicos) y de vidrio

(Aceites y grasas) con capacidad de 1 litro en los seis sitios seleccionados del sistema

de estabilización.

De acuerdo a los sitios de muestreos fijados en el sistema de lagunas y en función de

las visitas realizadas se colectaron un total de 24 muestras; las cuales fueron evaluadas

para la determinación de los parámetros físico-químicos y la diversidad de

microorganismos fotosintéticos presentes en las muestras por recuento celular.

Page 27: Micro Algas

27  

Figura 3. Sistema de Tratamiento de aguas residuales de las Lagunas de Estabilización de Palmas Oleaginosas de Casacará Ltda-Colombia.

3.2. Microorganismos fotosintéticos presentes en las lagunas de estabilización de una extractora de aceite

 

Recolección de Efluentes Tratados

(Agua para Riego de Cultivos)

L A G U N A S D E E S T A B I L I Z A C I Ó N

Colector y Bombeo Agua Residual

Fuente de Alimentación

(Agua Residual Cruda)

L-1

L-2

L-3

L-4

L-5

Punto de Muestreo

 

Page 28: Micro Algas

28  

3.2.1. Aislamiento y diversidad de los microorganismos fotosintéticos en lagunas de estabilización de una extractora de aceite

De las muestras colectadas de las lagunas de estabilización se realizaron

observaciones en fresco tomando una alícuota de cada muestra, y de las

observaciones al microscopio se procedió a la toma de microfotografías de todas las

especies encontradas en las muestras. Para cada muestra en fresco se determinó

diversidad y población de los microorganismos fotosintéticos. La identificación de cada

espécimen fue realizado siguiendo los catálogos y claves taxonómicas de bibliografía

especializada (Yacubson, 1969; 1972; 1974a;b; 1980a;b; 1984-1985; Prescott, 1970;

Whitford y Schumacher, 1973; Jiménez, 1976; Ortega, 1984; Marshall, 1986; Infante,

1988; Dillard, 1999; Bérard-Therriaault y col. 1999; Rodríguez, 2000; Ramírez, 2000;

Lobo y col. 2002; Garduño y col. 2008). La identificación de las especies de

cianobacterias se realizó siguiendo las claves dicotómicas revisadas por Anagnostidis y

Komárek (1985; 1988; 1990); Komárek y Anagnostidis (1979; 1986, 1989); las claves de

Hoffman (1988) y Anand (1990) y Sant’Anna y col. 2006; De M. Bicudo, y col. 2006.

Para el aislamiento de los microorganismos fotosintéticos, se procedió a inocular

muestras procedentes de las lagunas, en medios de cultivos líquidos (ALGAL y

fertilizante NITROFOSKA). Estos fueron mantenidos durante 15 días y luego

transferidos a medio sólido mediante rayado en placa y diluciones seriadas. Una vez

observadas las colonias se hicieron crecer en medio líquido con la finalidad de

determinar las características morfológicas de cada cepa aislada.

3.2.2. Medios de Cultivo

3.2.2.1. Inorgánico

a. Medio comercial: ALGAL: Para los cultivos líquidos, se utilizó agua destilada

esterilizada por autoclave a 121°C y 15 libras de presión durante 20 minutos.

Posteriormente el agua se enriqueció con el medio nutritivo (Tabla 4) a una

Page 29: Micro Algas

29  

concentración equivalente a 4,0 mM de NaNO3. (Fábregas y col. 1989). Los cultivos en

medio sólido se prepararon con agar-agar (1,5%), suplementados con nutrientes

“ALGAL”; y correspondieron a los medios autotróficos.

Tabla 4. Composición química del medio de cultivo ALGAL. COMPUESTO CANTIDAD (g/100g)

MICRONUTRIENTES

Oligoelementos

Citrato Férrico 1,000

Cloruro de Zinc 0,061

Cloruro de Manganeso 0,566

Molibdato Sódico 0,110

Cloruro de Cobalto 0,010

Sulfato de Cobre 0,010

EDTA 0,900

Vitaminas

Tiamina 0,200

Biotina (del 0.02%) 0,130

Cianocobalamina (del 0.09%) 0,180

MACRONUTRIENTES NO3Na 90,81

PO4H2Na.2H2O 6,41

*Ácido etilendiaminotetracético.

b. Fertilizante comercial: NITROFOSKA: Los cultivos líquidos se prepararon con

agua destilada o potable esterilizada por autoclave a 121°C y 15 libras de presión

durante 20 minutos, y posteriormente el agua enriquecida con el medio nutritivo (Tabla

5) a concentraciones de 1,0 y 5,0 mL/L.

Tabla 5. Composición química del fertilizante NITROFOSKA FOLIAR (Insecticidas Internacionales, CA).

MACROELEMENTOS

Nitrógeno 10,00% (N)

Fósforo 4,00% (P2O5)

Potasio 7,00% (K2O)

Magnesio 0,2% (MgO)

Azufre 0,8% (S)

MICROELEMENTOS (ppm)

Hierro (Fe) 70

Boro (B) 11

Page 30: Micro Algas

30  

Cobre (Cu) 12

Manganeso (Mn) 8

Zinc (Zn) 2 Cobalto (Co) 12

Molibdato (Mo) 1

c. Medio comercial: BG11: Las cianobacterias fueron cultivadas en medios sólidos

y líquidos con nutrientes BG11 (Rippka, 1988); el cual presenta nitrógeno combinado de

concentraciones entre los medios KRATZ, MYERS y CHU-10; además de su extensa

utilización en muchos laboratorios para estimular el crecimiento de las cianobacterias

debido a su alto contenido en nitrógeno (NaN03 17,6 mM) y de concentraciones

adecuadas de calcio, zinc, manganeso, cobre, magnesio, borato, molibdeno y EDTA

(Tabla 6).

Tabla 6. Composición del medio BG11 (Rippka, 1988). COMPUESTO CONCENTRACIÓN (gr) VOLUMEN FINAL (mL)

NaNO3 75,0

MgSO4.7H2O 3,75

Solución I

CaCl2.2H2O 1,8

500

K2HPO4.3H2O 2,0 Solución II

EDTA 0,05

500

Ammonium(III) Citrato 0,3 Solución III

Acido Cítrico (C6H8O7) 0,03

500

H3BO3 2,86

MnCl2.2H2O 1,84

ZnSO4.7H2O 0,22

Na2MoO4.2H2O

CuSO4.5H2O

Solución IV

Co(NO3)

1000

El medio consta de cuatro soluciones: Para preparar 1,0L de medio completo, se añaden 10mL de Solución I; 10 mL de Solución II; 10mL de Solución III y 1 mL de solución IV.

3.2.3. Técnicas de aislamiento

3.2.3.1. Rayado en placas: Para esta técnica se utilizaron placas de medio

ALGAL, en donde se colocaron unas gotas de la muestra en un extremo de la placa y

luego se realizo una extensión por agotamiento con asa de platino. Las placas

sembradas se mantuvieron en condiciones controladas de Luz y temperatura. Al

Page 31: Micro Algas

31  

visualizarse las primeras colonias aisladas se procedió a observar al microscopio

indicando el género, y se transfirió a una placa con medio sólido para su reaislamiento

para obtener cultivos unialgales. Las colonias aisladas se trasfirieron a medio líquido y

se revisaron periódicamente.

3.2.3.2. Diluciones seriadas: Se utilizo esta técnica debido a que permite reducir

la densidad celular y separar las especies presentes en las muestras de agua

colectadas. Se prepararon una serie de 5 tubos con 9,9mL de medio ALGAL y se les

añadió 0,1mL de agua de las muestras colectadas.

3.2.3.3. Uso de agentes antiparasitarios: Debido a la presencia de parásitos en

algunos cultivos unialgales o mixtos, se aplicó Zentel® a 500mg.L-1, entre 24 y 48

horas. Luego el cultivo fue lavado con medio de cultivo fresco, por decantación y al

lograr la eliminación de los protozoarios se transfirieron nuevamente a medio de cultivo

fresco.

3.3. Cultivos de microalgas aisladas de las lagunas de estabilización

3.3.1. Cultivos de los microorganismos fotosintéticos aislados en condiciones autotróficas 3.3.1.1. Recuento celular: La población de los organismos en las muestras

colectadas, se determino por recuento celular mediante cámara de Neubaüer. Estas

fueron fijadas previamente con 5-10 gotas de lugol y analizadas por triplicado. De igual

manera, a las muestras por triplicado de 10mL colectadas del cultivo líquido, se les

determinó el crecimiento de los microorganismos fotosintéticos cada tres (03) días hasta

alcanzar la fase estacionaria, de acuerdo a la siguiente fórmula:

DC = C x 104 x Fd No de cuadrantes

Page 32: Micro Algas

32  

Donde: DC: Densidad celular en Células mL-1.

C: Número de células observadas.

Fd: Factor de dilución = (Volumen final)/(Volumen inicial).

Los valores de densidad celular reportados corresponden al promedio de las

densidades de las réplicas de cada tratamiento.

3.3.1.2. Contenido de pigmentos: clorofila y carotenoides: El contenido de

clorofila y de carotenoides fue determinado durante el crecimiento de los cultivos

unialgales o mixtos cada tres días. A estos se les extraía, 5 o 10mL por triplicado para

cada réplica de cultivo y luego sedimentados en una centrifuga HETTICH ROTINA 35.

Al precipitado se le adicionaba 2mL de acetona:metanol (2:1), y luego se resuspendía

en vortex y se guardaba a 4ºC durante 24h. El sobrenadante luego era analizado en un

Spectronic 21 a 480, 664 y 647nm para carotenoides y clorofilas a y b, respectivamente.

Los valores de clorofila fueron luego obtenidos a partir de las fórmulas de Jeffrey y

Humprhrey, (1975) para clorofitas:

Clorofila a (µg/mL) = (11,93 A664 – 1,93 A647)

Clorofila b (µg/mL) = (20,36 A647 – 5,50 A664)

Para determinar el contenido de carotenoides se utilizó la ecuación de Strickland y

Parson (1972):

Carotenoides (µg/mL) = (4 x A480)

3.4. Aislamiento e identificación de cepas bacterianas asociadas a las microalgas

Page 33: Micro Algas

33  

Para el aislamiento de las bacterias asociadas a cada cultivo no axénico de microalgas

y cianobacterias, se utilizó de igual manera el medio de cultivo organotrófico con

extracto de levadura, peptona y glucosa (Tabla 7).

3.4.1. Medio de Cultivo: Se preparó medio sólido con agar-agar al 1,5%;

enriquecido con extracto de levadura, peptona y glucosa y con adición de medio

“ALGAL” a una concentración equivalente a 4,0mM de NaNO3, a fin de incrementar el

crecimiento de las bacterias asociadas y de las microalgas, el medio sólido se preparó

en agar 15g/L (Blanco, 1990).

Tabla 7. Composición del medio organotrófico complejo.

NUTRIENTES g/L

Extracto de levadura 5,0

Peptona 1,5

Glucosa 2,5

Medio Algal (4mM de NaNO3) 20ml/L

La población bacteriana asociada a la microalga se determinó mediante el recuento en

placa. La cuantificación bacteriana se realizó según el método de dilución en placas

(Madigan y col. 2004), mediante diluciones seriadas de las muestras hasta 10-7,

empleando solución salina fisiológica (SSF) al 0,85% como solvente. De cada tubo de

dilución y de la muestra madre, se tomó 0,1mL para ser sembrado en placas

preparadas del medio sólido organotrófico. La muestra se diseminó con asa de vidrio

estéril y las placas se incubaron a 37° C durante 48 y 72 horas (Incubadora P Selecta,

modelo 2000994).

Las cepas bacterianas seleccionadas se sembraron en placas de agar tripticasa de

soya (TSA), para proceder a la caracterización macroscópica de las colonias, tomando

en cuenta la elevación, borde, forma, tamaño, color, opacidad y superficie de la colonia.

Además, se realizó la tinción de Gram, en la cual se observo: forma, arreglo y tinción

(McFaddin, 2000; Mata y col. 2003; Murray y col. 1999; 2007). Las cepas ya

seleccionadas se reaislaron en placas de agar nutritivo, en caldo nutritivo y sembradas

en agar conservación para su preservación y congelamiento a –20°C, respectivamente.

Page 34: Micro Algas

34  

3.4.2. Identificación bioquímica de las cepas bacterianas

Las cepas bacterianas seleccionadas y caracterizadas, se sometieron a pruebas

bioquímicas para su identificación. Para ello, se emplearon protocolos convencionales

reportados en la literatura para cada grupo morfotintorial bacteriano (Mc Faddin, 2000;

Murray y col. 1999; 2007). Entre las pruebas bioquímicas se aplicaron las de

crecimiento en Agar McConkey, comportamiento en agar TSI, catalasa, oxidasa,

reducción de nitratos, prueba de oxidación-fermentación en medio O/F glucosa,

producción de indol, gas y ácido; descarboxilación de lisina, ornitina, prueba de

DNAasa, fermentación de azúcares simples y polialcoholes (arabinosa, fructosa,

lactosa, maltosa, melobiosa, ramnosa, trehalosa, adonitol, inositol, manitol y sorbitol) y

producción de ureasa, entre otras (Mc Faddin, 2000; Murray y col. 1999; 2007).

3.4.2.1. Método de biomerieux vitek. Para la confirmación de las bacterias

aisladas se utilizó el equipo de Biomerieux Vitek. Inicialmente se preparó el inóculo

equivalente al patrón de turbidez No. 3 de MacFarland. Luego, se tomó un tubo de

12x75mm estéril y transferido al soporte de llenado, al cual se le agregó 1,8mL de

solución salina al 0,45-0,5%. Posteriormente, se extrajo suficiente cultivo de la

superficie de los medios de agar apropiados para lograr una suspensión densa

“Lechosa” (mínimamente un patrón de turbidez No. 3 de MacFarland) y luego se

introdujo el tubo en el colorimeter Vitek para comprobar el patrón de turbidez el tubo

tiene que estar en la Zona amarilla, 27%T-37%T. La tarjeta se marcó con el número

apropiado para la bacteria en estudio y también la prueba de oxidasa (+) o (–) para el

caso; luego se colocó la tarjeta y el tubo de transferencia en el soporte de llenado Vitek,

con la parte larga del tubo de transferencia insertado en el tubo de ensayo; si el tubo de

transferencia se insertó correctamente en la tarjeta, por el tubo se extendió bien la

muestra en la tarjeta. La tarjeta se selló utilizando el sistema Vitek 60/120 (modulo de

sellador); luego se colocó la unidad de tarjeta/tubo de transferencia en el soporte de

llenado del sellador. El sellador corto el tubo de transferencia de la tarjeta y sello el

puerto de la tarjeta, luego se incubo las tarjetas con las muestras hacia arriba durante 4

horas a 35-37 °C en una incubadora sin CO2 (Vitek, 2003).

Page 35: Micro Algas

35  

ETAPA 2. Determinación de Exoenzimas de las microalgas identificadas y sus bacterias asociadas

3.5. Determinación de Exoenzimas

La presencia de las exoenzimas: amilasa, lipasa, proteasa, fosfatasa, celulasa y ureasa

en cada microalga, cianobacteria y bacteria asociada fue evaluada tanto en medio

líquido y sólido organotrófico.

3.5.1. Determinación de Amilasa

3.5.1.1. Método del almidón (0,2%) en medio sólido: Sobre las placas de agar-

almidón se realizaron pozos usando varilla de vidrio estéril de 1cm de diámetro y

removiendo el agar por succión y después se inocularon las cepas a examinar, hasta un

total de 4 o 6 pozos por placa máximo. Estas fueron incubadas a 30-35 °C durante 48

horas y hasta 5 días en los casos dudosos. Tras la incubación se inundan las placas

con una solución alcohólica de iodo al 2%. La hidrólisis del almidón se manifiesta por la

aparición de un halo claro alrededor del pozo de crecimiento, en tanto que el resto de la

placa se tiñe de color azul oscuro. Se considero que la actividad amilolítica es mayor

cuanto más amplia es la zona clara (Mc-Faddin, 2003; Aguilar y col. 2000; Moronta,

2001).

3.5.1.2. Método del almidón (0,2%) en medio líquido: Este ensayo se basó en la

reducción de la intensidad del color azul del lugol, resultado de la hidrólisis enzimática

del almidón y la formación del complejo iodina-almidón. Se utilizó 0,4mL del cultivo

unialgal de cada microalga, se centrifugó a 4.000r.p.m (el sobrenadante), 0,5mL de la

solución del almidón al 0,2% y 1mL del buffer fosfato (0,1M, pH 6,0). Luego la mezcla

fue incubada a 50 °C por 10min. De allí se le agregó 0,50mL de HCl a 0,1N y se le

adicionó 0,50mL de la solución I/KI (al 2% KI y al 0,2% I). Estas muestras fueron luego

analizadas mediante densidad óptica (DO) a 690nm en un espectrofotómetro Milton

Roy Spectronic 21D. Una unidad de la actividad enzimática se definió como la cantidad

de enzima que causa la reducción del 0,01% de la intensidad del color azul de la

Page 36: Micro Algas

36  

solución iodina-Almidón a 50 °C en 1min/mL. La actividad enzimática se determinó

como unidades por gramo de sustrato seco (U/g) (Swain y Ray, 2007).

3.5.2. Determinación de Lipasa

3.5.2.1. Método con la yema de Huevo: Para la preparación de la emulsión de

yema de huevo se limpiaron y sumergieron los huevos de gallina en etanol al 95%

durante una hora. De manera aséptica, se separó la yema de huevo y con una pipeta

estéril se agregó a 500mL de agar base, hasta luego obtener un homogeneizado de la

suspensión. El medio de cultivo seleccionado fue el Agar-Agar 15g/L y después de la

esterilización, se agregó la suspensión de yema de huevo estéril a 500mL al medio

sólido fundido estéril con agitación constante con un vortex y se enfrió a 55-60 ºC.

Luego de solidificarse el gel, se realizaron pozos usando varilla de vidrio estéril de 1cm

de diámetro y se removió el agar por succión. Luego se adicionaron alícuotas de las

muestras de microalgas a un volumen de 0,5mL dentro de los pozos, cada

microorganismo se sembró por separado y se incubó a 25 ºC + luz y a 37 °C en

oscuridad durante 5 días (Mc-Faddin, 2003). La reacción fue positiva (+); cuando se

observó la presencia de una zona opaca en el medio alrededor del crecimiento, como

producto de la precipitación de los ácidos grasos. Negativo (-) cuando no ocurrió

ningún cambio en el aspecto de las colonias o del medio de cultivo.

3.5.2.2. Método con el detergente Tween 80: Se utilizó medio sólido con

peptona (5,0g), NaCl (2,5g), CaCl.2H2O (0,05g), Agar-Agar (15g) y Tween 80 (5mL/L).

Una vez preparadas las placas se realizaron pozos usando varilla de vidrio estéril de

1cm de diámetro y se removió el agar por succión. Luego se adicionaron las muestras

de 0,5mL dentro de los pozos. La reacción fue positiva (+); cuando se observó la

presencia de una zona clara alrededor del crecimiento, como producto de la

precipitación de los ácidos grasos. Negativo (-) ningún cambio en el aspecto de las

colonias o del medio de cultivo (Pratt y col. 2000; Mc-Faddin, 2003).

Page 37: Micro Algas

37  

3.5.2.3. Método con Lecitina al 0,1%: Se utilizó medio sólido con lecitina de val

natural 1200mg (100% soya natural), con adición de 1,2mL/0.25L de tritón X-100, Agar-

Agar (15g/L) y se calentó el medio a 100º C con agitación constante hasta su disolución

completa. Una vez preparadas las placas, se realizaron pozos usando varilla de vidrio

estéril de 1cm de diámetro y se removió el agar por succión. Las muestras fueron

previamente centrifugadas tomando el pellet de 0,5mL y se adicionaron en los pozos.

La hidrólisis de la lecitina se manifestó por la aparición de un halo claro alrededor del

pozo de crecimiento; se considero que la actividad fue mayor cuanto más amplia fue la

zona clara.

3.5.2.4. Método cuantitativo con el p-nitrofenilpalmitato (p-NPP): Este ensayo se

realizó en función de la estimación colorimétrica del para-nitrofenol (p-NP) a 410nm, en

el cual se liberó como resultado de la hidrólisis de p-NPP. Una unidad de la actividad

enzimática fue definida como 1µmol de p-nitrofenol liberado por minuto (µmol/min).

Para ello, se utilizó el tritón X-100 como agente solubilizante. El cultivo de microalgas

fue centrifugado a 4000r.p.m por 10min y el sobrenadante se utilizó como fuente de la

enzima. A 30mg del sustrato p-NPP, se le adicionó 10mL de isopropanol y luego fue

mezclado con una disolución de 207mg de deoxicolato de sodio en 90mL de buffer

fosfato a pH 7,0. De esta disolución se utilizó 2,4mL por 0,1mL del sobrenadante libre

de células del cultivo unialgal. Luego fue incubada por 15min a 37° C y se midió la

densidad óptica (DO) a 410nm (Winkler y Stuckmann, 1978; Gupta y col. 2002). La

Actividad enzimática se calculó aplicando la siguiente expresión y las unidades

expresadas en U/mL.

Concentración de p-NPP = A410 x 2,71 x 103 M-1 cm-1

3.5.3. Determinación de Proteasa

Para la proteasa se aplicaron dos métodos con el objeto de identificar las enzimas de

tipo proteolítico (gelatinasas) que licuan/hidrolizan la gelatina (Método cualitativo) y la

caseína (Método cuantitativo).

Page 38: Micro Algas

38  

3.5.3.1. Método de hidrólisis de la gelatina: Se utilizaron tubos conteniendo

gelatina (caldo nutritivo a 4,0mM de medio algal + gelatina 10-20%) en forma de taco y

sembrados por punción con el inóculo de cada microalga. Tanto los tubos inoculados

como los controles fueron incubados a 37 °C durante 6 días. La prueba fue positiva

para aquellas microalgas y bacterias capaces de hidrolizar la gelatina con la

subsecuente pérdida de la habilidad de gelificarse de nuevo, una vez colocados los

tubos a 4 °C durante 30 minutos (Mc-Faddin, 2003; Kassana y col. 2007).

3.5.3.2. Método de hidrólisis de la caseína: Para esta prueba, se preparó antes

una disolución de caseína al 2% en buffer Tris fosfato pH 7,8 de la cual se tomaron

5mL, para ser añadidos a un volumen igual del sobrenadante del cultivo de bacterias o

de microalgas. Esta mezcla luego fue incubada a 37 °C durante 5 minutos. La reacción

se detuvo con la adicción de 5mL de ácido tricloroácetico al 5% (TCA). Para la caseína

se definió la unidad de la enzima por la cantidad liberada en TCA equivalente a 0,001

A280 por minuto a 37 °C a un pH de 7,8. La actividad se calculó con la siguiente formula

(Sharma y col. 1996).

Unid/mL = A280 (ensayo) – A280 (blanco) tiempo x mL de enzima

3.5.4. Determinación de Fosfatasa

3.5.4.1. Equipo olympus AU480: Para esta enzima utilizamos los siguientes

reactivos: Amortiguador de ALP-SL; R2, y Sustrato de ALP-SL. Las concentraciones

para la prueba fueron: 0,84mol/L de 2-amino-2-metil-1-propanol (pH 10,4 a 25 °C),

2,0mmol/L de acetato de magnesio, 1,0mmol/L de sulfato de zinc, 2,0mmol/L de EDTA,

50mmol/L de p-nitrofenilfosfato, 50mmol/L de fenol y un conservador. Las condiciones

establecidas fueron: longitud de onda (Primaria) 415nm, (Secundaria) 660nm,

temperatura de 37 °C, paso de luz 1cm, tipo de reacción cinética, tiempo de reacción 5

minutos, volumen de muestra 5μL, volumen de reactivo, R1 280μL; R2 70μL, volumen

total 355μL y una relación de muestra/reactivo 1/70.

Page 39: Micro Algas

39  

El equipo olympus Au480 tiene dos sondas permanentes: una sonda de muestreo (2 a

50μL) y una sonda de reactivo (20 a 300μL); las cuales tomaron los volúmenes precisos

para cada reactivo indicado para la determinación de fosfatasa. En la Fosfatasa

Alcalina en olympus AU480: El Sustrato es p-nitrofenilfosfato en 2-amino-2-metil-1-

propanol; el tipo de la reacción en la presencia de magnesio es medido

dicromáticamente a 410/520nm (Hodgin y col. 1988). El valor normal es 31 a 110U/L

(unidades por litro) en plasma. Las fosfatasas alcalinas son enzimas que se encuentran

presentes en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente alta en

huesos, hígado, placenta, intestinos y riñón. Tanto el aumento, así como su

disminución en plasma tienen significado clínico. Su elevación puede indicar una

enfermedad hepática, pero también pueden elevarse en otras enfermedades o incluso

ser parte de fenómenos fisiológicos como crecimiento y embarazo. Los rangos de los

valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios.

3.5.5. Determinación de Celulasa

3.5.5.1. Método de la carboximetil celulosa: El medio sólido se preparó con

carboximetilcelulosa de sodio (0.1%), y agar (1%) en 0,1M buffer de fosfato de sodio pH

6,3 y luego se autoclavó a 120 °C por 2 minutos. Después de solidificarse el gel se

horadaron unos pozos usando varilla de vidrio estéril de 1cm de diámetro y se removió

el agar por succión. Las muestras de 0,5mL fueron inoculadas dentro de los pozos e

incubadas a 37 ºC por 16 horas. El rojo congo fue utilizado como indicador para

mostrar las zonas claras de la actividad celulolítica (Bremer y col. 1995).

3.5.6. Determinación de Ureasa

3.5.6.1. Urea de Rustigian y Stuart: Se utilizó el caldo con urea de Rustigian y

Stuart, pH 6,8. El medio utilizado contenía: fosfato monopotásico KH2PO4 9,1g, fosfato

disódico Na2HPO4 (buffer de Sorensen) 9,5g, extracto de levadura 0,1g, urea 1-2% 1-

2g, rojo de fenol 0,01g y agua estéril 1000mL. Como indicador se utilizó el rojo de fenol

(Morou y col. 2000). Se consideró positiva (+) la prueba cuando el medio cambió

Page 40: Micro Algas

40  

completamente a un color lila tenue. A diferencia del resultado negativo (-), el medio no

cambio quedando del mismo color inicialmente (Mc-Faddin, 2003).

ETAPA 3. Ensayos realizados con agua residual de una extractora de aceite de palma

La evaluación de la microalgas como tratamiento terciario de aguas residuales de una

extractora de aceite de palma africana, se realizó mediante cultivos discontinuos en dos

ensayos:

3.6. Ensayos

3.6.1. Ensayos en condiciones autotróficas: Para las microalgas se utilizaron los

nutrientes inorgánicos ALGAL y NITROFOSKA; para las cianobacterias se aplicó el

medio BG11. El inóculo para cada cultivo líquido procedía de un cultivo en medio sólido

con estos nutrientes hasta que eran escalados a volúmenes suficientes para desarrollar

cultivos hasta de 500mL (Figura 4). Para ello, se utilizaron envases cilíndricos de vidrio

de 250 y 1000mL de capacidad.

Figura 4. Cultivos en condiciones de laboratorio.

3.6.2. Ensayos en condiciones mixotróficas: En este caso se utilizó como medio

de cultivo, el agua residual vertida antes de su entrada al sistema de Lagunas de

estabilización de la Planta extractora de Aceite (Figura 5). Muestras de estos efluentes,

de 50 litros, con un pH inicial de 3,75 fueron neutralizados previamente hasta pH 7 con

Page 41: Micro Algas

41  

NaOH, para luego ser incubadas con agitación constante mediante vortex y durante 10

días. Una vez finalizada la agitación, se obtuvo un sobrenadante y un sedimento

correspondiente al lodo del residual. Solo, se seleccionó la fracción soluble al 25% y

sin esterilizar, como fuente de nutrientes para los cultivos y para la determinación de la

remoción de los compuestos presentes en el residual soluble.

Figura 5. Agua residual antes de ser vertidas a las Lagunas de Estabilización.

3.6.2.1. Primer Ensayo. Los cultivos se realizaron con agua residual no estéril,

respecto al volumen de cultivo de 150mL y fueron iniciados con un inóculo mixto de 2,0

x106 cel.mL-1 de las microalgas Chlorella sp. y Scenedesmus sp. (Figura 6). Además,

también se contempló una serie de cultivos con agua residual enriquecida con

NITROFOSKA. Entre los controles se seleccionaron dos: uno con agua residual sin

microalgas, y otro control, correspondiente a un cultivo autotrófico (agua potable estéril

enriquecida con NITROFOSKA 5mL/L). Es decir, los tratamientos en dicho

experimento, fueron los siguientes:

a) Agua residual con microalgas (AR).

b) Agua residual con microalgas + NITROFOSKA (ARN).

c) Agua Residual (Control)-(AR).

d) Agua estéril con microalgas + NITROFOSKA (Control).

Page 42: Micro Algas

42  

Figura 6. Primer Ensayo (Tratamientos).

3.6.2.2. Segundo Ensayo. En este caso, el medio de cultivo fue el agua residual,

previamente incubada mediante agitación y a una concentración del 25%. Los cultivos

se iniciaron con una densidad celular de 2,0 x106 cel.mL-1 de cada especie de microalga

(Chlorella, Chlamydomonas, Oocystis, Scenedesmus, Chlorococcum y Geitlerinema); y

luego mezcladas para iniciar el cultivo mixto. Además, el medio de cultivo fue

enriquecido con almidón* (0,1%), urea* (0,1%) y Lecitina* (0,1%) (Figura 7), a fin de

simular un medio residual con alta carga orgánica. El cultivo de control se desarrolló en

condiciones autotróficas, cuyo medio de cultivo fue agua potable estéril enriquecida con

NITROFOSKA a 5mL/L.

Los tratamientos evaluados fueron los siguientes:

a) Agua residual + inóculo mixto de microalgas (AR).

b) Agua residual + inóculo mixto de microalgas + NITROFOSKA (ARN).

c) Agua residual + inóculo mixto de microalgas + mezcla orgánica* (ARO).

d) Agua residual +inóculo mixto de microalgas + NITROFOSKA + mezcla orgánica

(ARNO).

e) Agua residual (Control)-(AR).

f) Agua potable estéril + inóculo mixto de microalgas+ NITROFOSKA (Control).

g) Agua potable estéril+ inóculo de microalgas + NITROFOSKA + mezcla orgánica

(NO).

Page 43: Micro Algas

43  

Figura 7. Segundo Ensayo* (Tratamientos).

3.6.2.3. Parámetros de Cultivo: Los cultivos autotróficos y mixotróficos (agua

residual) fueron iniciados con una densidad celular entre 1,0 y 2,0x106 cel.mL-1 y

mantenidos con aireación constante, iluminación lateral suministradas por lámparas

fluorescentes, fotoperiodo de 12:12 horas, utilizando lámparas fluorescentes Philips

Daylight de dos tubos de 40W, a una intensidad luminosa de 156 µmol quanta.m-2.s-1, y

a 28±2ºC.

3.6.2.4. Exoenzimas en Ensayos 1 y 2: En este caso se tomó 10mL de cada uno

de los tratamientos realizados para cada tipo de ensayo se centrifugó a 4.000r.p.m. en

una centrifuga tipo HETTICH ROTINA 35, tomando el pellet para realizarle las

exoenzimas en medio sólido a las cuales se les realizó pozos usando varilla de vidrio

estéril de 1cm de diámetro y removiendo el agar por succión y después se inocularon

0,5mL de cada tratamiento, las exoenzimas determinadas fueron lipasa, amilasa 02%,

celulasa y urea al 0,1% para el ensayo 1, y en el ensayo 2 a parte de estas se le realizó

además la lecitina al 0,1%.

3.7. Recuento de bacterias asociadas a los cultivos

Se realizó por el método de Contaje de Placa Heterotrófico (9215.B), al inicio y final de

cada experimento. Para ello, se tomaron 10mL de la muestra y se diluyeron en 90mL

de solución salina al 0,85% estéril, lo cual representó la dilución 10-1, y luego hasta

Page 44: Micro Algas

44  

obtener una dilución de 10-7. La finalidad de realizar estas diluciones es que el número

de colonias en las placas se encuentre entre 30 y 300. Se tomó 0,1mL de cada dilución

utilizando una micropipeta y se agregaron en placas de petri estériles de Agar nutritivo,

dispersando el inoculo con una asa de Hockey y se incubaron las placas invertidas a

35ºC durante 24-48 horas, luego de las cuales se realizó la observación y contaje de las

colonias formadas (Standard Methods, 2005).

Para realizar el cálculo de las Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/mL)

se utilizó la siguiente ecuación:

UFC/mL = (Nº de colonias x Fd)/Vm

Donde: Fd: Factor de dilución (Volumen final/Volumen de muestra)

Vm: volumen de muestra (mL).

3.8. Determinación de los parámetros fisicoquímicos de las muestras de aguas residuales

Para el análisis físico-químico de las diferentes muestras agua se siguieron los

procedimientos descritos en el Standard Methods for Examination the Water and

Wastewater (21th Edition 2005).

Las muestras de agua residual colectadas, eran preservadas en volúmenes de 1 litro

por cada una de las muestras por duplicado, con 1mL de Ácido Sulfúrico concentrado

(H2SO4) para la realización de DQO y para los demás análisis, el resto de las demás

muestras fueron mantenidas en refrigeración. Todos los análisis fueron realizados en el

Centro de Investigaciones del Agua (CIA) de la Universidad del Zulia. Así mismo,

fueron analizadas muestras de los cultivos realizados con agua residual, tanto al inicio y

como al final de cada ensayo. Todas las muestras fueron pasadas a través de un filtro

de borosilicato GF7547MM con la finalidad de eliminar la interferencia causada por las

Page 45: Micro Algas

45  

microalgas. Los análisis se hicieron por duplicado, a excepción de la DQO que se

realizó por triplicado.

3.8.1. Nitrógeno total kjeldahl (Standard Methods, 2005): El nitrógeno total

Kjeldahl se hizo un proceso de digestión previo a la destilación en el que el nitrógeno

orgánico se convierte en amoníaco. Por lo tanto el nitrógeno total Kjeldahl incluye el

nitrógeno orgánico y el amoniacal. El método a emplear es el Semi-Micro Kjeldahl

(4500-Norg-C). Para la digestión se agregaron 6mL de solución digestora de Ácido

Sulfúrico/Peróxido de Hidrógeno (H2SO4/H2O2) en una relación 1/3. Luego se coloco la

muestra en el digestor Tecator 2020 a 250ºC hasta que el volumen se reduje

aproximadamente a 25mL. Luego se realizo el método de Destilación Preliminar-

Titulación (4500-NH3.B). Este ensayo se basa en la conversión de equilibrio entre el ión

amonio y el amoníaco libre, y la liberación del amoníaco gaseoso junto con el vapor que

es producido con la ebullición del agua. Para este análisis se emplearon muestras de

50mL, a las cuales se le agregaron 15mL de solución de Hidróxido de Sodio (NaOH)-

Tiosulfato de Sodio (Na2S2O3) para incrementar el pH.

La muestra se destiló en una unidad de destilación Büchi 315 y se colectó en un

Erlenmeyer de 125mL de capacidad que contenía 25mL de solución mixta de ácido

bórico (H3BO3), hasta obtener un volumen entre 75 y 100mL. La cantidad de amonio en

la muestra se determina por la cantidad de ácido bórico consumido en el Erlenmeyer.

Esto se midió titulando la muestra con una solución de ácido sulfúrico (H2SO4) 0,02N.

Para determinar la concentración de nitrógeno total Kjeldahl se empleó la siguiente

fórmula:

Nitrógeno (mg/L) = [(T – B) x N x 14 x 1000)] Vm

Donde: T: Volumen de ácido gastado en la titulación (mL).

B: Volumen de ácido gastado en la titulación del blanco (mL).

N: Normalidad del ácido (0.02N).

Page 46: Micro Algas

46  

Vm: Volumen de muestra (mL).

3.8.2. Fósforo total (Standard Methods, 2005): Se determinó el contenido de

fosfato mediante el método Colorimétrico con Ácido Vanadomolibdofosfórico (4500-

P.C), para esto se emplearon 25mL de muestra y se le agregó 1mL de reactivo

vadanato–molibdato, constituido por una solución de molibdato de amonio

((NH4)6Mo7O24.4H2O) y metavanadato de amonio (NH4VO3) produciéndose un complejo

de color amarillo con el fosfato. El desarrollo del color se midió cuantitativamente luego

de 20 minutos usando un espectrofotómetro HACH DR/2000 midiendo la absorbancia a

430nm. Con el valor de la absorbancia, y la curva de calibración obtenida en el

laboratorio se calculó el contenido de fosfato (mg/L) mediante la siguiente expresión:

PO4-3 (mg/L) = Abs430 – 0,0039479

0,1164871

Donde: Abs430: Absorbancia de la muestra medida a longitud de onda de 430nm.

3.8.3. Demanda Química de Oxígeno (Standard Methods, 2005): El contenido de

materia orgánica se oxida empleando un agente químico fuerte (K2Cr2O7) en medio

ácido (H2SO4) utilizando un catalizador (AgSO4) para facilitar la oxidación de

determinados tipos de compuestos orgánicos. Para la determinación de la DQO se

empleó el método Colorimétrico de Reflujo Cerrado (5220 D). Se tomaron 2mL de

muestra en tubos de ensayo con tapa refractaria de 16 x 100mm previamente

preparados con 3mL de solución de Ácido Sulfúrico concentrado (H2SO4) + Sulfato de

Plata (AgSO4) y 1mL de solución de Dicromato de Potasio (K2Cr2O7) preparado con

Sulfato de Mercurio (HgSO4). Los tubos se agitaron hasta lograr una mezcla

homogénea y se colocaron en un digestor HACH modelo 2100A a 140 C durante dos

horas. Luego de la digestión se midió la absorbancia de los tubos en el

espectrofotómetro HACH DR/2800 a 600nm. Con el valor de la absorbancia, y la curva

de calibración obtenida en el laboratorio se calculó la DQO (mg/L) mediante la siguiente

expresión:

Page 47: Micro Algas

47  

DQO (mg/L) = (Abs600 x 3204,5135) – 5,884

Donde: Abs600: Absorbancia de la muestra medida a 600nm.

3.8.4. Aceites y Grasas (Standard Methods, 2005): Para la determinación de

Aceites y grasas se empleó el método gravimétrico (5520-B, F.). Para esto se tomó

50mL de la muestra en un erlenmeyer de 100mL previamente secado y pesado hasta

un peso constante (P1) (diferencia entre pesadas consecutivas no mayor a 0.0005 g).

Luego se transfirió el volumen de la muestra a un embudo de separación verificando

que la llave de salida este cerrada. Posteriormente, se lavó la botella que contenía la

muestra y el cilindro donde se midió el volumen con 30mL del solvente de extracción

(mezcla de n-Hexano/metil-terbutil-éter). Después, se transfirió el líquido de lavado a

uno que contenía la muestra; se agitó el embudo de separación por dos minutos.

Seguidamente, se separó la capa acuosa y la orgánica en el embudo de separación,

drenándose el solvente a través de un embudo, al cual previamente se le había

colocado un disco de papel de filtro Whatman No. 1 y con aproximadamente 10g de

sulfato de sodio (Na2SO4) anhidro en un erlenmeyer de 100mL, llevado a peso

constante.

El paso siguiente, consistió en adicionar 30mL de solvente, al embudo de separación

con la muestra, y se repitieron las fases de agitación y extracción, por lo menos dos

veces. Finalmente, se combinaron las capas orgánicas en el mismo erlenmeyer de

100mL, se lavó el papel filtro y el Na2SO4 con 10 ó 20mL del solvente de extracción, la

evaporación del solvente fue en un rotavapor a una temperatura de 85 ºC hasta que

estuviera totalmente seco, se enfrió en un desecador durante 30min y se peso el balón

(sea este valor P2). El resto de la muestra contenida en el embudo de separación se

descartó. Con el peso del erlenmeyer sin la muestra y el del erlenmeyer con la muestra

se calculó, el contenido de grasas y aceites, mediante la siguiente expresión:

Grasas y Aceites (mg/L) = (P2 – P1) x 106 Vm

Page 48: Micro Algas

48  

Donde: P2: Peso del balón + residuo (g).

P1: Peso del balón vacío (g).

Vm: Volumen de muestra (mL).

3.8.5. Sólidos Suspendidos Totales SST (Standard Methods, 2005): Para la

determinación de la concentración de sólidos suspendidos totales (2540-D) en la

muestra se procedió de la siguiente manera: se realizó una preparación previa al papel

de filtro de fibra de vidrio GC50 de 47mm de diámetro, el mismo se lavó con agua

destilada y se colocó en una capsula de aluminio, la cual se calentó durante 5 minutos

en una mufla marca Thermolyne tipo 48000 furnace a una temperatura de 600ºC,

transcurrido ese tiempo se sacó y se dejó enfriar en un desecador durante

aproximadamente 15 minutos para luego pesarlo, correspondiendo este al peso uno (1).

Una vez pesado se colocó el papel de filtro en el equipo de filtración al vacío, se

midieron 50mL de muestra con un cilindro graduado y se filtró dicho volumen de

muestra, quedando en el papel de filtro los sólidos suspendidos contenidos en ese

volumen de muestra, el papel de filtro se colocó de nuevo en la capsula de aluminio y

se llevó a una estufa donde se secó a una temperatura de 103–105ºC durante una

hora. Transcurrido ese tiempo, se sacó de la estufa y se dejó enfriar en un desecador

durante aproximadamente 15 minutos para luego pesarlo, correspondiendo este al peso

dos (2). La concentración de sólidos suspendidos totales se determinó mediante la

siguiente expresión:

SST (mg/L) = (P2 – P1) x 106

Vm

Donde: P1: Peso del papel de filtro + Cápsula de aluminio (g).

P2: Peso del papel de filtro + Cápsula de aluminio + sólidos de la muestra

(g).

Vm: Volumen de la muestra (mL).

Page 49: Micro Algas

49  

3.8.6. Sólidos Suspendidos Volátiles SSV (Standard Methods, 2005): Para la

determinación de la concentración de sólidos suspendidos volátiles (2540-E) en la

muestra se procedió de la siguiente manera: Luego de la determinación de los sólidos

suspendidos totales se coloca la capsula con el papel de filtro en una mufla a 600ºC

durante 5 minutos, transcurrido ese tiempo se sacó y se dejó enfriar en un desecador

durante aproximadamente 15 minutos para luego pesarlo, correspondiendo este al peso

tres (3). La concentración de sólidos suspendidos volátiles se determinó mediante la

siguiente expresión:

SSV (mg/L) = (P2 – P3) x 106

Vm

Donde: P2: Peso del papel de filtro + Cápsula de aluminio + SST (g).

P3: Peso del papel de filtro + Cápsula de aluminio + sólidos no volátiles (g).

Vm:Volumen de la muestra (mL).

3.8.7. Determinación del pH (Standard Methods, 2005): Se realizo in situ a las

muestras de agua colectadas de las Lagunas de estabilización la medición de

temperatura con un termómetro de mercurio de apreciación 0,1°C (marca Bannan), pH

(pH-metro de campo marca Orion) y salinidad (salinómetro-refractrómetro C-1, modelo

SZJ-S), con el fin de determinar las condiciones ambientales donde se encontraron las

microalgas y cianobacterias; y las bacterias asociadas a estas. A los cultivos de

microalgas, luego de su aislamiento y purificación, se midió el pH (Método 4500-H+.B),

realizándose cada dos (02) días hasta alcanzar la fase estacionaria, utilizando un pH-

metro CORNING, que lee directamente en unidades de pH. Para evitar la

contaminación, el electrodo se lavó con alcohol isopropílico al 70% y luego con agua

destilada estéril antes de introducirlo a los cultivos.

3.9. Análisis estadístico

Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de un factor para la comparación de

Page 50: Micro Algas

50  

medias, aplicando la prueba Tukey a un nivel de significancia de 0,05 y un análisis de

correlación lineal utilizando el coeficiente de correlación de Pearson para realizar la

comparación entre grupos y estudiar la relación entre los mismos (Pardo y Ruíz, 2002).

Estos análisis se realizaron utilizando programa SPSS 10.0 para Windows.

Page 51: Micro Algas

51  

Resultados y Discusión

Page 52: Micro Algas

52  

ETAPA 1. Caracterización de las Lagunas de Estabilización

de una Planta extractora de aceite de palma

Page 53: Micro Algas

53  

Microalgas y bacterias asociadas a las microalgas, aisladas de Lagunas de Estabilización de una Planta extractora de

aceite de palma

Page 54: Micro Algas

54  

4.1.1. Identificación de microorganismos fotosintéticos de lagunas de estabilización de una planta extractora de aceite de palma

En las lagunas de Estabilización de la planta extractora de aceite de palma (Elaeis

guineensis) de la empresa “Palmas Oleaginosas de Casacará Ltda”, Colombia, se

observo la presencia de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintéticas en todas

las lagunas, indicando su adaptación en estas aguas residuales. Todas, crecieron bien

en medios sólidos y líquidos, con el medio comercial ALGAL, BG11 y NITROFOSKA.

Así como también, las bacterias asociadas a los cultivos de microalgas crecieron

satisfactoriamente en agar nutriente.

La diversidad de los organismos en las lagunas de oxidación se evidencio en todos los

muestreos, encontrando mayor diversidad en las lagunas 2, 3 y 4. En la laguna 2 se

encontró al grupo de microalgas y bacterias fotosintéticas. Mientras que, en la laguna 3

y 4, el grupo con mayor diversidad fue el de microalgas y cianobacterias. En todas las

lagunas se observo una predominancia de las Chlorophyta con un alto índice de

dominancia del género Chlorella. En cambio, Cyanophyta y Euglenophyta presentaron

índices de dominancia intermediarios, seguido por las Crysophyta.

Las microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintéticas observadas en las lagunas de

estabilización, fueron 27 cepas (Tabla 8), con predominio de 5 cepas, correspondiente a

las especies de Chlorella, Scenedesmus, Euglena, Phacus y Thiopedia en todas las

lagunas y para todos los muestreos; mientras que las otras 22 cepas se encontraron en

menor proporción.

Tabla 8. Microorganismos observados en los muestreos de las lagunas de Estabilización. LAGUNAS DE ESTABILIZACIÓN

NÚMERO NOMBRE DEL ORGANISMO 1 2 3 4 5

1 Oocystis sp. ++ 2 Kirchineriella lunaris ++ + 3 Chlorella sp. +++++ +++ +++++ +++ ++ 4 Clorofita N.I. + + 5 Hyaloraphidium sp. + + + 6 Coelastrum sp. ++ 7 Scenedesmus sp. . +++++ +++++

Page 55: Micro Algas

55  

8 Chlorococcum sp. ++ ++ + 9 Ankistrodesmus sp. ++ 10 Monoraphidium sp. + 11 Chlamydomonas sp. ++ 12 Closteriopsis sp. +++ 13 Pandorina sp. ++ 14 Haematococcus sp. ++ +++ 15 Euglena sp. +++++ +++++ +++ +++++ 16 Phacus sp. ++ +++++ ++ ++++ 17 Navicula sp. + +++ ++ 18 Nitzschia sp. + ++++ +

Cianobacterias 19 Lyngbya sp. + ++ 20 Oscillatoria sp. ++ 21 Synechococcus sp. ++ + 22 Merismopedia sp. +++ + 23 Synechocystis sp. ++ ++ 24 Geitlerinema sp. + ++ 25 Pseudanabaena sp. +++ + + 26 Chroococcus sp. +++

Bact. Fotosintética 27 Thiopedia sp. +++++ +++++ ++ ++

+: Presente, ++: Escasa cantidad, +++: Regular Cantidad, ++++: Abundante, +++++: Dominante. N.I.: no identificada.

Las microalgas observadas en fresco de las Lagunas de Estabilización fueron 27

géneros; de las cuales solo se lograron aislar en medios de cultivos sólidos, las

Chlorophyta: Chlorella, Scenedesmus, Oocystis, Chlamydomonas, Chlorophyta N.I.

(Forma de banano) y Chlorococcum. En cuanto a representantes de la División

Cyanophyta, se encontró Oscillatoria, Pseudanabaena, Lyngbya, Synechocystis y

Geitlerinema. Phacus y Euglena de la División Euglenophyta, y de la División

Chrysophyta, Nitzschia y Navicula.

Al momento de realizar reaislamiento en medio de cultivo líquido se obtuvieron solo

cultivos unialgales de las especies de Chlorella, Scenedesmus, Chlamydomonas,

Oocystis y Chlorococcum, Geitlerinema y Euglena. No obstante, el cultivo de Euglena

se mantuvo activo hasta 12-15 días. En cuanto a los cultivos mixtos, se lograron

mantener tres combinaciones: (Chlorella + Scenedesmus), (Euglena + Chlorella),

(Navicula + Chlorella + Thiopedia) (Tabla 9).

Page 56: Micro Algas

56  

Tabla 9. Microalgas y cianobacterias observados durante el periodo de estudio en las Lagunas de Estabilización de una Planta extractora de aceite de palma.

MEDIO LIQUIDO (OBSERVACIÓN DIRECTA)

MEDIO SÓLIDO MEDIO LÍQUIDO

(CULTIVOS UNIALGALES-MIXTOS)

Oocystis sp. Oocystis sp. Oocystis sp.

Kirchineriella lunaris Chlorella sp. Chlorella sp.

Chlorella sp. Scenedesmus sp. Scenedesmus sp.

Clorofita N.I. Chlorococcum sp Chlorococcum sp.

Hyaloraphidium sp. Chlamydomonas sp. Chlamydomonas sp.

Coelastrum sp. Haematococcus sp. Geitlerinema sp.

Scenedesmus sp. Oscillatoria sp. Euglena sp.-Chlorella sp.

Chlorococcum sp. Geitlerinema sp. Euglena sp.-Navicula sp.

Ankistrodesmus sp. Pseudanabaena sp. Chlorella sp.-Navicula sp.-Thiopedia

Monoraphidium sp. Euglena sp. Chlorella sp.-Scenedesmus sp.

Chlamydomonas sp. Navicula sp.

Closteriopsis sp. Nitzschia sp.

Pandorina sp.

Haematococcus sp.

Lyngbya sp.

Oscillatoria sp.

Synechococcus sp.

Merismopedia sp.

Synechocystis sp.

Geitlerinema sp.

Pseudanabaena sp.

Chroococcus sp.

Euglena sp.

Phacus sp.

Navicula sp.

Nitzschia sp.

Thiopedia sp.

De las 27 cepas de microalgas, cianobacterias y bacteria fotosintética, observadas en

las lagunas de estabilización solo se aislaron 12 cepas en medio sólido, y 6 cepas en

medio líquido, y las microalgas que se mantuvieron en medio líquido pero en conjunto

con otras microalgas fueron 4 cepas. Esto indica que al final del proceso de aislamiento

se pudieron aislar y mantener bajo condiciones de laboratorio, solo 6 cepas.

Algunos de los géneros encontrados en estas aguas residuales coinciden con las

encontradas en aguas residuales municipales, industriales, agrícolas y de acuacultura.

Tal es el caso de las especies de: Chlorella, Scenedesmus, Ankistrodesmus, Oocystis,

Euglena, Chlamydomonas, y Nitzschia. Entre las especies de Cianobacterias, se han

Page 57: Micro Algas

57  

reportado Oscillatoria, Chroococcus, Synechocystis, Synechococcus, Geitlerinema,

Pseudanabaena, Lyngbya y Merismopedia.

Figura 8. Micrografias (400x). (1) Primer Muestreo. a. Scenedesmus sp. b. Oscillatoria sp. c. Oocystis sp. d. Pandorina sp. e. Lyngbya sp. f. Chroococcus sp. (2) Segundo muestreo. g. Thiopedia sp. h. Pseudoanabaena sp. i. Euglena sp. j. Monoraphidium sp. k. Synechococcus sp. l. Ankistrodesmus sp. (3) Tercer muestreo. m. Haematococcus sp. n. Geitlerinema sp. o. Kirchineriella lunaris.

a b c

d e f

g h i

j k l

m n o

Page 58: Micro Algas

58  

Mientras que, entre las bacterias fotosintéticas, Thiopedia (Sallal, 1986; Peinador, 1999;

Oudra y col. 2000)

En el primer, segundo, tercer y cuarto (1-2-3-4) muestreo respectivamente (Figura 8) se

encontraron diversidad de microorganismos fotosintéticos (Tabla 10); indicándonos que

las microalgas pueden encontrarse en las lagunas en cualquier época del año, sin

embargo, una sucesión de tipos de microalgas se produce durante las temporadas.

Algunos estudios han reportado microalgas, cianobacterias, diatomeas, ciliados y

bacterias fotosintéticas en varios lugares del mundo y por ende en varios tipos de clima.

Así; Peinador (1999); Colon, (2008) encontraron especies de Microcystis y Oscillatoria

en época seca y Calothrix, Merismopedia, Microcystis, Leptolyngbya, Oscillatoria,

Pseudanabaena, Phormidium y Planktothrix en época de lluvia, en dos ríos usados

como receptores de agua residuales y en el cabo rojo de Costa Rica.

Thajuddin y Subramanian (2005), reportaron en las costas de India a Trichodesmium

erythraeum, Ammeatoidea normanii, Dichothrix spiralis, Oscillatoria borneti,

Pseudoanchobrosa fluminenensis, Radaisia violácea, Siphononema polonicum,

Anabaena, Aulosira, Calothrix, Cylindrospermum, Gloeocapsa, Nostoc, Rivularia,

Scytonema y Tolypothrix. Y en lagos de la Florida: Anabaena, Aphanocapsa,

Dactylococopsis, Merismopedia, Oscillatoria, Dactylococcopsis, Microcystis y Lingbya

reportado. Y en Sao Paulo, Brasil en aguas tropicales y subtropicales del sur de

América 4 especies del genero Romeria, Geitlerinema unigranulatum, Arthrospira,

Planktothricoides y Hormoscilla por Komárek y Komárková (2007).

La Chlorophyta, como Chlorella, Scenedesmus, Micractinium, Ankistrodesmus y

Chlamydomonas y las Euglenophyta como Euglena suelen predominar en las lagunas

de tratamiento de aguas residuales y los géneros de microalgas flagelares como

Euglena, Leponicinclis, Chlamydomonas asociados con Micratinium; la biomasa es baja

en las lagunas 1, 2 y 3 probablemente al efecto del pH alto y concentraciones de NH3-N

altas y en las lagunas 4 y 5 es mayor (Wrigley y Toerien, 1990).

Page 59: Micro Algas

59  

Las especies predominantes de algas dependen de las condiciones de crecimiento, en

particular la temperatura, carga orgánica, oxígeno, disponibilidad de nutrientes, y la

depredación. Otras especies son encontradas en estas lagunas como las

cianobacterias como Aphanothece, Microcystis, Anabaena y Oscillatoria

Tabla 10. Diversidad de microorganismos fotosintéticos en Lagunas de estabilización de una Planta extractora de aceite.

MICROALGAS LAGUNAS

ANAEROBIAS (1-2)*

LAGUNAS FACULTATIVAS

(3-4-5)**

MUESTREOS (VECES)***

Oocystis sp. X 2 Kirchineriella lunaris X X 1-2-3-4 Chlorella sp. X X 1-2-3-4 Hyaloraphidium sp. X 1 Coelastrum sp. X 1 Scenedesmus sp. X 2-3 Chlorococcum sp. X X 1-2-3 Ankistrodesmus sp. X X 1-2-3 A.falcatus X 1 Monoraphidium sp. X 1-2 Chlamydomonas sp. X 1-2 Closteriopsis sp. X 1 Pandorina sp. X 1-2 Lyngbya sp. X 1 Oscillatoria sp. X X 1-2-3-4 Synechococcus sp. X X 1-2 Merismopedia sp. X X 1-2-3-4 Synechocystis sp. X X 1-2-3 Geitlerinema sp. X 2-3-4 Pseudanabaena sp. X 2 Chroococcus sp. X 1-2-3-4 Euglena sp. X X 1-2-3-4 Phacus sp. X 1-2-3-4 Navicula sp. X X 1-2-3-4 Nitzschia sp. X 1-4 Thiopedia sp. X X 1-2-4 Haematococcus sp. X 2-3

(1-2)* Número de lagunas anaerobias. (3-4-5)** Número de lagunas facultativas. Veces*** se realizaron hasta 4 muestreos.

Los géneros encontradas en las lagunas de estabilización de un planta extractora de

aceite de palma coinciden con los estudios realizado por Vinces y col. (1971) indicando

que en este estudio se estudiaron lagunas de estabilización de agua residuales

Page 60: Micro Algas

60  

municipales en San Juan Lima-Perú observando mayor diversidad de Chlorophyta (19

géneros) Actinastrum, Crucigenia, Chlorogonium, Elakatothrix, Gleocystis, Micractiniun,

Palmella, Pascheriella, Sphaerocystis, Stephanoptera, Tetraspora, Myrmecia y

Tetrastrum. Cyanophyta (12 géneros) Anacystis, Anabaena, Aphanocapsa, Calothrix,

Chroococcus, Gleocapsa, Nostoc, Scytonema, Spirulina, y Thalpophila. Euglenophyta

(2 géneros) Euglena y Phacus. Crysophyta (4 géneros) Chloromeson, Diceras,

Ceratoneis y Surirella y Pyrrophyta (1 género) Peridinium. Esta diversidad mayor es

debido a que la lagunas tienen longitudes de 7000m2; siendo más grandes que lagunas

de empresas industriales. Salazar, (2005); indico otro grupo como las Cryptophytas con

el género de Chryptomonas con una aplicación del 25% para lagunas de oxidación del

agua residual domestica de las instalaciones (laboratorios de docencia e investigación,

cafetería, actividades deportivas, aulas de clases) de la Universidad Autónoma

Metropolitana de Iztapalapa. Escorihuela y col. (2007), en un estudio de una laguna

con agua residual en la Universidad del Zulia Maracaibo (Centro de Investigaciones del

Agua CIA), reportó mayor incidencia del grupo Cyanophytas (Synechocystis),

Chlorophyta (Chlorella) y Euglenophytas (Euglena).

En sistema de tratamiento de agua residual municipal de Esmoruz-Portugal como

Planktothrix mougeotii, Microcystis aeruginosa, Pseudanabaena mucicola y en

industrias de papel encontramos dominancia de cianobacterias como Oscillatoria,

Phormidium, Geitlerinema y Pseudanabaena; además de Chroococcusa (Vanconcelos

y Pereira, 2001; Kirkwood y col. 2001).

a b c

Page 61: Micro Algas

61  

Figura 9. Micrografias (400x). (4) Cuarto Muestreo. a. Navicula sp. b. Synechocystis sp. c. Phacus sp. d. Nitzschia sp. e. Merismopedia sp.

Las bacterias fotosintéticas purpuras, tales como, Chromatium, Thiocystis, Thiocapsa y

Thiopedia también crecen en lagunas facultativas, y en nuestro caso, sólo se observó

Thiopedia, en el cuarto muestreo (Figura 9). Estas bacterias dependiente de sulfuros

para su crecimiento, aportan la coloración rosada-roja a las aguas residuales y son

indicadoras de sobrecarga orgánica. En lagunas de estabilización de aguas residuales

municipales de Rosario-Argentina, se han descrito, la presencia de Thiocapsa y

Thiopedia como bioindicadoras de condiciones anóxicas y frecuentes durante todo el

tiempo de estudio (Igallinella y col. 2000).

4.1.1.1. Cultivos unialgales de las microalgas aisladas de las lagunas de estabilización

Todas las microalgas (Chlorella sp., Scenedesmus sp., Chlorococcum sp., Oocystis sp.

y Chlamydomonas sp.) crecieron satisfactoriamente en cultivos autotróficos con el

fertilizante, inclusive de inmediato exhibieron fase exponencial, desde el inicio del

cultivo hasta los días 9 y 12 (Figura 10a). Scenedesmus sp. produjo la mayor densidad

celular, con 36,89 x106 cel.mL-1; seguido de Chlorella sp. Mientras que la menor

densidad lo fue para Oocystis con 16,85 x106 cel.mL-1. Sin embargo, esta microalga es

de poco crecimiento, comparada al resto de las clorofitas evaluadas.

Para el caso de, la cianobacteria Geitlerinema sp., cuyo crecimiento se siguió mediante

turbidez, también expresó su fase exponencial desde el inicio hasta los 21-22 días, para

d e

Page 62: Micro Algas

62  

luego alcanzar la fase estacionaria (Fig. 10b). De acuerdo a las curvas de crecimiento

obtenidas, se sugiere que todas estas microalgas se adaptaron fácilmente al medio y

condiciones de cultivo; lo cual significa, su posible utilización para estudios a nivel de

laboratorio.

 

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

DC

(x 1

06ce

l.mL

-1)

Edad del cultivo (días)

Chlorella sp.

Scenedesmus sp.

Chlamydomonas sp.

Oocystis sp.

Chlorococcum sp.

  

 

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

DC

(DO

75

0n

m)

Edad del Cultivo (días)

Geitlerinema sp.

 

Figura 10. a. Crecimiento comparativo de microalgas Chlorophyta. b. Crecimiento de la cianobacteria Geitlerinema sp., seguido mediante turbidez.

a

b

Page 63: Micro Algas

63  

4.1.1.2. Aislamiento e identificación de bacterias asociadas a los cultivos de microalgas y cianobacterias.

De acuerdo a las diferentes pruebas bioquímicas, se identificaron cepas de:

Corynebacterium durum, Bacillus sphaericus, Delftia acidovorans, Actinobacillus

actinomycetemcomitans, Pasteurella stomatis,  Pasteurella aerogenes,

Stenotrophomonas maltophilia, Brevundimononas diminuta y Staphylococcus hominis

(Tabla 11 y 12). Al menos en, agua residual de aceite de oliva se ha detectado Bacillus

sphaericus (Eusébio y col. 2007) y Stenotrophomonas maltophilia, asociada a la

biodegradación de polifenoles (Lee y col. 2002). 

a. Bacterias Asociadas a Chlorella sp. 1 y 2: Se identificó a Corynebacterium

durum, bacilo gram positivo con forma de bastón, en el frotis teñido aparecen en

empalizada o como células individuales que yacen en ángulos agudos unas con otras

en formaciones en V (Figura 11). Las colonias son pequeñas, de color blanco, con

bordes irregulares y un poco mucoide. También, se encontró Bacillus sphaericus;

cuyas características morfológicas son las siguientes: bacilos gram-positivo grandes

con esporas terminales esféricas en agar nutriente las colonias son de color blanco con

bordes irregulares y grandes; en agar sangre las colonias son de color amarillo opaco

con bordes irregulares algunas son pequeñas y otras grandes (Figura 12).

Figura 11. Corynebacterium durum.

Page 64: Micro Algas

64  

Figura 12. Bacillus sphaericus.

b. Bacterias asociadas a Oocystis sp.: En esta microalga se identificaron

Bacillus sphaericus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pasteurella stomatis y P.

aerogenes. Entre las características de A. actinomycetemcomitans se distinguen, las

de ser un bacilo gram-negativo pequeño, con colonias lisas o rugosas y opacas, con

apariencia del borde de un cigarrillo cuando es cortado. En cambio, las especies de

Pasteurella son bacilos gram-negativos, no motiles, cocoides pequeños individuales, en

pares o en cadenas. En agar sangre son grisáceas opacas y son mucoides, con bordes

irregulares y pequeñas. P. aerogenes las colonias en placas de Agar sangre en 1 día

están a 0,5 a 1mm de diámetro, convexas, lisas, translucientes y no hemolíticas; al igual

que otras especies P. aerogenes es ureasa + y produce gas en glucosa. P. stomatis su

diferenciación incluye acidificación de maltosa y manitol, producción de Indol y

descarboxilación de Ornitina.

c. Bacterias asociadas a Scenedesmus sp.: De esta microalga se aislaron e

identificaron: Corynebacterium durum, Bacillus sphaericus, Delftia acidovorans y

Staphylococcus hominis. Las características de D. acidovorans, la distinguen como

bacilo gram-negativo, aislado o en pares. Además, son catalasa y oxidasa positiva,

reducen el nitrato a nitrito, oxidan fructosa y manitol y producen una pigmentación

amarilla en los cultivos. D. acidovorans también, ha sido descrita como una bacteria

ambiental, localizada en suelo y agua, y al parecer no es patógeno en humanos (Rocco

y Knutson, 2005). Para el caso de, Staphylococcus hominis, este se presenta como un

Page 65: Micro Algas

65  

coco gram-positivo, que ocurre en grupos y menos a menudo en pares, tétradas o

cadenas (3 o 4 células), no es motil, ni formador de esporas. Las colonias en agar

sangre son pequeñas de color amarillas-naranjas o cremas y no pigmentadas, lisas y

con bordes irregulares.

d. Bacterias asociadas a la cianobacteria Geitlerinema sp.: .De las cincos

bacterias, solo se identificaron tres y a continuación se describen sus características:

Stenotrophomonas maltophilia, bacilo gram-negativo, cuyas colonias son lisas, brillantes

y de color blanco a amarillento (Figura 13). Brevundimononas diminuta bacilos gram-

negativo sus colonias son circulares, convexas y brillantes, con márgenes lisos y son de

color amarillas o rosadas en agar sangre (Figura 14). Staphylococcus hominis, ya

descrita y asociada también a Scenedesmus. La cepa C-12 Blanca, bacilos Gram (-),

de tamaño grande y con esporas subterminales y la cepa C-12 Naranja, de cocobacilos

Gram (+) y oxidasa y catalasa positivas.

Figura 13. B. diminuta bacilo gramnegativo.

Figura 14. Colonias de Stenotrophomonas maltophilia.

Page 66: Micro Algas

66  

e. Bacterias Asociadas a Chlorococcum sp.: En esta microalga se encontraron

tres bacterias asociadas: otra especie de Delftia diferente a la aislada de cultivo de

Scenedesmus, la cepa C-42, de bacilos Gram (–) pequeños y la cepa C-13, de bacilos

Gram (+) con esporas subterminales; y con oxidasa y catalasa positivas.

Los procesos biológicos del agua residual domestica pueden ser aerobios y anaerobios;

en donde se producen unos floculos los cuales pueden permanecer en la superficie o

se hunde y alcanzan un diámetro de 20-50cm. Entre las bacterias de los floculos

predominan las representantes de géneros con metabolismo aerobio-oxidativo como

Zooglea, Pseudomonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Corynebacterium, Acinetobacter,

Micrococcus y Flavobacterium. Pero también se presentan bacterias anaerobias

facultativas, que son fermentativas en ausencia de sustratos oxigenados, de los

géneros Aeromonas, Enterobacter, Escherichia, Streptococcus y distintas especies de

Bacillus. Todas las bacterias contribuyen con las cápsulas de mucílago y con las

microfibrillas al crecimiento colonial y a la formación de los floculos reportado por

Chacón, (2010); coincidiendo algunos de estos géneros con los cultivos de microalgas y

cianobacterias aisladas de las aguas residuales de una extractora de aceite de palma.

Otros microorganismos que también intervienen en el tratamiento aerobio de aguas

residuales son: Citrobacter, Serratia, mohos y levaduras que actúan mas de

componentes acompañantes que de degradantes y algunas algas como Anabaena sp.

que convierte los poliuretanos en H2; Chlorella sp. los alginatos los convierte en

glicolato y Dulaniella sp. los alginatos en glicerol reportado por Chacón, (2010).

Los resultados obtenidos indican que se aislaron 12 cepas en medio sólido, y 6 cepas

en medio líquido. Además, de lograrse cultivos mixtos con otras 4 microalgas. Esto

indica que al final del proceso de aislamiento se pudieron aislar y mantener bajo

condiciones de laboratorio, solo 6 cepas. De estos cultivos unialgales, se identificaron y

aislaron 13 cepas de bacterias, asociadas a los cultivos de Chlorella sp. 1 y sp. 2,

Scenedesmus sp., Oocystis sp., Geitlerinema sp. y Chlorococcum sp. en donde

predominaron 5 cepas como Chlorella sp., Scenedesmus sp., Euglena sp., Phacus sp. y

Page 67: Micro Algas

67  

Thiopedia sp. en todas las lagunas y para todos los muestreos, las otras 22 cepas se

encontraron en menor proporción.

En cuanto a las pruebas bioquímicas, se identificaron 13 cepas de bacterias, de las

cuales se identificaron: Corynebacterium durum, Bacillus sphaericus, Delftia

acidovorans, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Pasteurella stomatis,  Pasteurella

aerogenes, Stenotrophomonas maltophilia, Brevundimononas diminuta y

Staphylococcus hominis. Mientras que, se aislaron las C-12 Blanca, C-12 Naranja, C-

13 y la C-42, no identificadas.

4.1.2. Microalgas y su relación con los parámetros fisicoquímicos de las lagunas de estabilización de una extractora de aceite de palma

Los muestreos realizados a las lagunas de estabilización de una planta extractora de

aceite de palma permitieron determinar la abundancia y diversidad de los

microorganismos fotosintéticos por muestreo. De igual manera fueron caracterizadas

las muestras de aguas en función de los parámetros fisicoquímicos a fin de establecer

posibles relaciones con la población de microalgas, cianobacterias y bacterias

fotosintéticas presentes en este sistema de estabilización. Para ello, se realizaron

cuatro muestreos en las siguientes fechas: 30 de junio 2008, 14 de septiembre del

2008, 01 de diciembre 2008 y el 05 de mayo 2009.

En el muestreo 1, la población de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintéticas

fue de 17,65; 4,35 y 0,04 x106 cel.mL-1 respectivamente. Entre las microalgas, las

Chlorophyta fueron las más abundantes, con 16,50 x106 cel.mL-1; mientras que, las

Euglenophyta y las Crysophyta presentaron los valores más bajos a nivel de clorofita,

con 0,73 y 0,42 x106 cel.mL-1 (Figura 15).

Entre los géneros de mayor abundancia en Chlorophytas, se observó a Chlorella sp.

con 13,86 x106 cel.mL-1 y seguido en orden descendente por Scenedesmus sp.,

Chlamydomonas sp., Monorhaphidium sp., Ankistrodesmus sp., Oocystis sp. y

Page 68: Micro Algas

68  

Tabla 11. Características bioquímicas y diferenciales de Bacterias Gram-positivas asociadas a las Microalgas.

Chlorella

Scenedesmus

Chlorella

Oocystis

Cat

alas

a

Cal

do E

scul

ina

Ure

a

Esc

ulin

a

Características

- R +

Mel

obio

sa

Fen

ilala

nina

Imel

ina

Bacillus sphaericus NR - + +

Mal

tosa

Man

itol

Cel

obio

sa

Mel

ixito

sa

Xilo

sa

Sac

aros

a

Bilis

Esc

ulin

a 10

%

Bilis

Esc

ulin

a 40

%

Clo

ruro

de

Na

6%

Opt

oqui

nona

Glu

cosa

Lact

osa

Oxi

dasa

Gel

atin

a al

4%

+ -

Bacterias Asociadas a las Microalgas

Sal

icin

a

Tre

halo

sa

Arg

inin

a

+ -

Corynebacterium durum NR

+ - - -- - + - - -+ + +

Glic

erol

D.C

.

O.F

.

Rib

osa

Indo

l

VP

Sal

icin

a

Sor

bito

l

Tet

razo

lium

- + - + - -

Nov

obio

cina

Piru

vato

Bac

itrac

ina

Mot

ilidad

Alm

idón

Gel

atin

a

Nitr

ato

L-A

rabi

nosa

Raf

inos

a

R - S - + ++ - - + + R

+/- R + - + ++ + - - + + + + - NR- - - + - NR - R NR NR +NR NR + +/- R RNR NR + +/- - -NR NR

   

Tabla 12. Caracterización bioquímica y de proliferación de las Bacterias Gram-negativas asociadas a los cultivos de microalgas.

Scenedesmus

Chlorococcum

A. actinomycetemcomitans + + - - + - + + - - - - - - NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR - - - - - NR + - - - - - NR NR NR NR NR NR NR NR NR

Pasteurella stomatis + + - - + - - - - - + - - - NR NR + NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR - - - - - - + - - - + - NR NR NR NR NR NR + NR NR

Pasteurella aerogenes - + + - + - + - - + + - - - NR NR + NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR - + - - - - + + - - - - NR NR NR NR NR NR - NR NR

S. maltophilia - + - + - - + - - - - - + + NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR NR - - - - - + + - NR + - NR + NR NR NR NR NR NR NR NR

Brevundimononas diminuta + + - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + - - - - - - NR NR - NR NR - + NR NR NR NR NR NR

Scenedesmus

Geitlerinema+ + -

Características

+ - -NR NR NR NR+ - NR NR NR

D-T

reha

losa

α-La

ctos

a

Coa

gula

sa

- - - - - NR

Fos

fata

sa

Arg

inin

a-A

.a

Piro

linod

onil-

A.a

Mal

onat

o

Nitr

ato

L-A

rabi

nosa

ON

PG

Mot

ilidad

NR + - NR NR NR NR NR NR NR

Arg

inin

a

Orn

itina

Ado

nito

l

Sor

bito

l

Raf

inos

a

DN

Aas

a

RM

a

Cis

tina

Indo

l

VP

a

- - NR NR NR NR NR NRNR - NR NR NR NR

Geitlerinema

Staphylococcus hominis - + + -

L-S

erin

a

Ace

tato

Aco

nila

to

NR NR NR NR NR NR

+ - - - -- - + -

But

irato

Bacterias Asociadas a las Microalgas

Oocystis

L-A

spar

tato

L-G

luta

mat

o

L-H

istid

ina

L-Is

oleu

cina

L-Le

ucin

a

L-P

rolin

a

Citr

ato

Lisi

na

Cel

obio

sa

D-A

rabi

nosa

Man

osa

Mal

tosa

Man

itol

Ram

nosa

Xilo

sa

Sac

aros

a

Inos

itol

Oxi

dasa

Cat

alas

a

NR NR

Ure

a

Esc

ulin

a

Glu

cosa

Lact

osa

Delftia acidovorans + + - + + - + - - - - - - - NR NR NR NR NR NR NRNR - - - - - NR + NR

 a. (VP)Voges-Proskauer; (RM) Rojo de Metilo; (A-A) Arginina-Arilamidasa; (P-A) Pirolinodil-Arilamidasa.

Page 69: Micro Algas

69  

Chlorococcum sp., con un total de 2,64 x106 cel.mL-1. Las cianobacterias, estuvieron

representadas por Merismopedia sp. con 1,93 x106 cel.mL-1, Synechocystis sp. con 1,92

x106 cel.mL-1 y en menor proporción por Oscillatoria sp. con 0,51 x106 cel.mL-1. En

cambio, se cuantificaron 0,51 y 0,22 x106 cel.mL-1 para Euglena sp. y Phacus sp.,

respectivamente, como euglenofitas.

0

5

10

15

20

25

30

35

12

34

17,65

8,48

31,19

4,60

4,35

3,33

0,520,30

0,040,11

0,000,02

DC

(x10 6

cel.m

L -1

)

Muestreos

Microalgas Cianobacterias Bac. Foto. 

 Figura 15. Población de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintéticas en Lagunas de estabilización de una Planta extractora de aceite de palma, orden cronológico de los muestreos. Muestreo 1: junio-2008, muestreo 2: Septiembre 2008, muestreo 3: diciembre 2008, muestreo 4: mayo 2009.

En el muestreo 2, la abundancia de microorganismos fotosintéticos, continuó en el

siguiente orden descendente: microalgas>cianobacterias>bacterias fotosintéticas, con

densidades de 8,48; 3,33 y 0,11 x106 cel.mL-1, respectivamente. De igual manera, las

Chlorophyta las más abundantes con 7,97 x106 cel.mL-1 y su representante Chlorella sp.

con 5,73 x106 cel.mL-1. Entre las clorofitas, continuaron presente en un 2,24 x106

cel.mL-1, los géneros Scenedesmus, Chlamydomonas, Chlorococcum, Monorhaphidium,

Oocystis y Ankistrodesmus (Chlorophyta). Entre las diatomeas y euglenofitas, se

encontró la más abundante, Navicula sp. y Euglena sp. con 0,10 y 0,36 x106 cel.mL-1

respectivamente. Mientras que, de las cianobacterias, Merismopedia sp. fue la más

observada, con 2,01 x106 cel.mL-1.

Page 70: Micro Algas

70  

En el muestreo 3, la mayor abundancia también correspondió a las microalgas con

31,19 x106 cel.mL-1; la cual fue las más elevada de todos los muestreos. Además, las

clorofitas mantuvieron su hegemonía en cuanto a las más abundantes en el sistema de

estabilización, con 30,08 x106 cel.mL-1. Es relevante, destacar que Chlorella sp.

contribuyó con el 96,3%, en relación a la población total de microorganismos

fotosintéticos y tan solo Chlorococcum sp. y Monorhaphidium sp., aportaron con 0,03

x106 cel.mL-1. En cambio, las cianobacterias estuvieron representadas en un 3,5%, de

la población total y mientras que, no fue observada presencia de bacterias fotosintéticas

en este muestreo (Figura 15).

Para el muestreo 4 observamos que la abundancia mayor fue en la microalgas con 4,45

x106 cel.mL-1, cianobacterias con 0,30 x106 cel.mL-1 y las bacterias fotosintéticas con

0,02 x106 cel.mL-1. De acuerdo a la distribución poblacional de los microorganismos

fotosintéticos en las diferentes lagunas y por muestreo se obtuvo, la mayor abundancia

de clorofitas en las lagunas 2, 3 y 4 en el primer muestreo, 2,64 x106 cel.mL-1, 2,79 x106

cel.mL-1 y 4,84 x106 cel.mL-1, respectivamente. Y para el caso de las cianobacterias con

3,09 x106 cel.mL-1 en la laguna 3. En el segundo muestreo en las lagunas 3, 4 y 5

también hubo la mayor dominancia en las clorofitas con 1,61 x106 cel.mL-1, 1,76 x106

cel.mL-1 y 1,87 x106 cel.mL-1 respectivamente; mientras que en la laguna 3, continuaban

predominando las cianobacterias con 2,95 x106 cel.mL-1. Para el tercer muestreo

observamos que las clorofitas mantuvieron su dominio en las lagunas 1, 2 y 3 con 1,42

x106 cel.mL-1, 14,22 x106 cel.mL-1 y 11,41 x106 cel.mL-1 respectivamente. De igual

manera, para el muestreo 4 se obtuvo la mayor densidad en clorofitas con 1,47 x106

cel.mL-1, 1,31 x106 cel.mL-1 y 1,33 x106 cel.mL-1 respectivamente en las lagunas 1, 2 y

3. Con respecto a las cianobacterias se determinó su predominio en la laguna 1 con

0,27 x106 cel.mL-1 y 0,22 x106 cel.mL-1 respectivamente para el tercer y cuarto muestreo

(Figura 16). Estos resultados también, indican que el mayor índice de abundancia se

encontró en las lagunas anaerobias del sistema, específicamente la laguna número 2.

Page 71: Micro Algas

71  

0

1

2

3

4

5

E1AS1A

E2AE3F

E4FE5F

S5F

DC

(x10

6cel.m

L-1

)

Lagunas de Estabilización

Microalgas Cianobacterias Bfot

0

1

2

3

E1AS1A

E2AE3F

E4FE5F

S5F

DC

(x10

6cel.m

L-1

)

Lagunas de Estabilización

Microalgas Cianobacterias Bfot

Page 72: Micro Algas

72  

0

2

4

6

8

10

12

14

16

E1AE2A

E3FE4F

E5F

DC

( x

10

6cel.m

L-1

)

Lagunas de Oxidación

Microalgas Cianobacterias Bfot 

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

E1AE2A

E3FE4F

E5F

DC

( x

10

6cel.m

L-1

)

Lagunas de Oxidación

Microalgas Cianobacterias Bfot 

 Figura 16. Abundancia de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintéticas según los sitios de muestreos en lagunas de estabilización de una Planta extractora de aceite de palma, de acuerdo al orden de los muestreos. a. Muestreo 1. b. Muestreo 2. c. Muestreo 3 y d. Muestreo 4.

Page 73: Micro Algas

73  

4.1.2.1. Demanda Química de Oxigeno (DQO): La demanda química de oxigeno

constituye un parámetro esencial para caracterizar la calidad del agua residual y su

análisis permanente indicará la efectividad de su remoción en el transcurso del tiempo,

del tipo de laguna y de las condiciones de operación de la misma. Los resultados

obtenidos a través de los muestreos en las diferentes lagunas, aportan una variabilidad

de los valores de remoción, los cuales aproximan hacia una reducción de la DQO con la

transferencia del efluente desde la laguna 1 hasta la 5 (Tabla 13).

Tabla 13. DQO (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a cada muestreo.

Muestreos

Laguna 1 2 3 4

1 787,66 14.804,49 1.243,25 1.830,43*

2 941,21 14.847,22 8.004,04* 1.381,23*

3 914,51 7.626,38* 4.771,58 569,83

4 687,52* 13.736,32 4.303,79 883,20

5 460,54 8.267,28 1.723,33 1.031,83 *: Lagunas con los valores más elevados de densidad celular de microalgas y cianobacterias.

De igual manera, estos resultados parecen no relacionarse con los obtenidos para el

nitrógeno, fósforo y grasas, en el sentido que se registra un claro descenso de los

niveles respectivos, según se va transfiriendo el agua residual de una laguna a otra,

hasta llegar a la número 5, en donde se considera teóricamente que debe contener los

valores más bajos, como producto del proceso de remoción obtenidos gradualmente.

4.1.2.2. Sólidos Suspendidos Totales (SST): Los sólidos indican que a

medida que el residual va pasando por las diferentes lagunas este va disminuyendo a

valores bajos de 78,00mg.L-1 removiendo casi la totalidad de los sólidos en estas

lagunas de estabilización. Asimismo se puede afirmar que este parámetro no tiene

ninguna relación con la densidad encontrada de microalgas, cianobacterias y bacterias

fotosintéticas en estas lagunas, a su vez estas no co-ayudan al aumento de la

concentración de los sólidos en las lagunas de estabilización.

Page 74: Micro Algas

74  

Tabla 14. SST (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a cada muestreo.

Muestreos

Laguna 1 2 3 4

Laguna 1 266,00 3.060,00 11.400,00 530,77*

Laguna 2 432,00 1.436,00 390,00* 330,00*

Laguna 3 80,00 600,00* 263,33 185,00

Laguna 4 60,00* 420,00 127,50 133,33

Laguna 5 80,00 166,00 78,00 440,00 *: Lagunas con los valores más elevados de densidad celular de microalgas y cianobacterias.

Tabla 15. SSV (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a cada muestreo.

Muestreos

Laguna 1 2 3 4

Laguna 1 160,00 20,00 14.800,00 392,31*

Laguna 2 316,00 5,00 650,00* 290,00*

Laguna 3 64,00 0,00* 1.663,33 155,00

Laguna 4 40,00* 2,50 1.032,50 110,00

Laguna 5 44,00 4,00 330,00 376,00 *: Lagunas con los valores más elevados de densidad celular de microalgas y cianobacterias.

Para los muestreos, M-1 (Muestreo 1); M-2 (Muestreo 2); M-3 (Muestreo 3) y M-4

(Muestreo 4); para la materia orgánica compuesta por (DQO, SST y SSV), en DQO

indica que para M-1, M-2 y M-3 (941,21-14.847,22-8.004,04mg.L-1 respectivamente), la

laguna 2 aporta la mayor DQO, mientras que en M-4 la laguna 1 (1.830,43mg.L-1)

aporta la mayor DQO (Tabla 13). En SST indica que, en M-1 la laguna 2 (432,00mg.L-1)

aporto la mayor cantidad de SST, y en el muestreo M-2, M-3 y M-4, la laguna 1

(3.060,00-11.400,00-530,77mg.L-1) aporto la mayor cantidad de este parámetro (Tabla

14). Para SSV, en M-1 la laguna 2 (316,00mg.L-1) aporto la mayor cantidad de SSV,

pero en M-2, M-3 y M-4, la laguna 1 (20,00-14.800,00-392,81mg.L-1) aporto la mayor

cantidad de SSV (Tabla 15).

El fitoplancton puede aprovechar estos compuestos, junto con el dióxido de carbono

atmosférico, el amoníaco y el ortofosfato del agua residual, como sustancias nutritivas

para su crecimiento; es de considerar, que una parte de los sólidos en suspensión

están formados por materia orgánica, algas o microorganismos; observamos que en los

Page 75: Micro Algas

75  

muestreos la variación de los sólidos es debida a la cantidad de materia orgánica que

poseen las aguas residuales de una extractora de aceite.

La actividad fotosintética del fitoplancton genera oxígeno que puede ser utilizado por las

bacterias aerobias heterótrofas para degradar la materia orgánica y disminuir la DBO5

del agua residual (García, 1998). Pero observamos también que cuando hay poca

cantidad de nutrientes las microalgas y bacterias fotosintéticas proporcionan una

población alta indicándonos que estos microorganismos al tener la cantidad suficiente

de materia orgánica la óptima crecen bien; y cuando hay unos valores intermedios en

DQO, SST y SSV las microalgas como bacterias bajan en su población. También la

cantidad de materia orgánica se ve influenciada por la calidad del fruto de la Palma de

Aceite (Elaeis guineensis), debido a que en los periodos de lluvia el fruto viene con un

alto índice de descomposición debido a que los recolectores (Camiones) se demoran

para transportarlos hasta el sitio donde este es procesado (Extractora de Aceite). A su

vez la carga orgánica en las lagunas de oxidación de una extractora de aceite es

influenciada por los periodos de mayor producción y toneladas de la palma africana

recibidos para el proceso de extracción del aceite, indicándonos que los meses de

mayor producción son de abril a noviembre donde es el periodo de Invierno y HAY

mayor producción para este tipo de plantaciones (Fedepalma, 2008)

4.1.2.3. Nitrógeno: En relación al orden de entrada de los efluentes desde la

laguna 1 hasta la laguna 5, se registró igualmente, la mayor concentración de nitrógeno

en este sentido y con los valores más elevados en el muestreo 2 y 4 (Tabla 16). Es por

ello que, a la salida del sistema se verifica una excelente remoción de nitrógeno; con lo

cual se sugiere que el sistema de estabilización es eficiente.

En términos de la cantidad de microalgas como referencia, se describe una amplia

distribución de dicha población en todos los rangos de concentración de nitrógeno, el

hecho de que los valores más elevados de población se fueron obteniendo para las

lagunas 4, 3, 2 y 1; conforme se realizaron los muestreos 1, 2, 3 y 4, se sugiere la

existencia de otros factores combinados que expliquen la variabilidad de la población

Page 76: Micro Algas

76  

por laguna. Incluso, el elevado contenido de nitrógeno en la laguna 1, de acuerdo al

cuarto muestreo deduce que, tampoco esta condición restringe el crecimiento

microalgal.

Tabla 16. Nitrógeno Total (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a cada muestreo.

Muestreos

Laguna 1 2 3 4

1 104,72 6.594,00 252,00 5.474,00*

2 111,72 1.358,00 60,48* 3.796,80*

3 6,72 770,00* 43,68 2.811,20

4 3,36* 175,00 23,52 896,00

5 3,92 161,00 4,48 201,60 *: Lagunas con los valores más elevados de densidad celular de microalgas y cianobacterias.

4.1.2.4. Fósforo: Los análisis de fósforo realizados por laguna y muestreo,

también son indicativos de una buena remoción a partir de la laguna 1, hasta terminar

en la laguna 4 y 5 (Tabla 17). Por otra parte, se observa que los residuales no portan

concentraciones elevadas de fósforo y por lo tanto, se registran valores bajos en la

laguna 5. Es conocido, que la remoción de fósforo no alcanza niveles óptimos, tanto en

procesos químicos como en los biológicos.

Tabla 17. Fósforo Total (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a cada muestreo.

Muestreos

Laguna 1 2 3 4

1 47,86 223,21 28,07 28,03*

2 46,49 94,01 14,72* 15,56*

3 4,53 91,22* 8,09 10,80

4 3,50* 56,88 4,55 9,57

5 5,84 28,98 3,59 7,64 *: Lagunas con los valores más elevados de densidad celular de microalgas y cianobacterias.

Igualmente, la población microalgal, de cianobacterias y bacterias fotosintéticas,

también se ubicaron en diferentes niveles de concentración de fósforo, desde los más

bajos, de 3,50 hasta de 91,22 mg.L-1 (Tabla 17); lo cual indica que la distribución de

estos microorganismos no dependió exclusivamente del fósforo para su crecimiento.

Page 77: Micro Algas

77  

4.1.2.5. Aceites y Grasas: Los valores más elevados de grasas y aceites en los

cuatro muestreos fueron obtenidos en la laguna 1; lo cual evidencia la alta carga de

materia orgánica que directamente recibe este reservorio como producto de la

extracción del aceite de palma. Además, se demuestra la eficiente remoción de grasas

desde la laguna 1 hasta la 5 (Tabla 18). Es decir, se observa la tendencia de una

remoción drástica en la laguna 2, para luego definirse otra remoción en la quinta

laguna.

En relación a la población de microalgas encontrada por laguna y por muestreo (Figura

16a, 16b, 16c y 16d) se infiere que los valores de población de microalgas se

determinaron a una concentración de grasas y aceites, entre 31,03 y 16.244,44mg.L-1;

lo que significa que su contenido no parece influir en el crecimiento de las microalgas.

Sin embargo, a los niveles más elevados entre 19.465,54 y 411.251,11mg.L-1 (Tabla

18), presentes en la laguna 1, hubo crecimiento significativo de microalgas, pero no

alcanzaron poblaciones que superara a las obtenidas en otras lagunas.

Por otra parte, es importante destacar que, la concentración más elevada de grasas y

aceites se detectó en el muestreo 1 (Figura 17); lo cual estaría relacionado

principalmente con el volumen de extracción de aceite de palma procesado para esa

fecha del muestreo.

Tabla 18. Grasas y aceites (mg.L-1) en las lagunas de estabilización de acuerdo a cada muestreo.

Muestreos

Laguna 1 2 3 4

1 411.251,11 125.042,57 119.465,54 31,03*

2 13.151,11 3.998,65 8.264,19* 8,33

3 12.022,22 3.655,41* 15.073,65 5,38

4 16.244,44* 4.939,19 27,03 3,89

5 8.962,22 2.725,00 13,51 3,33 *: Lagunas con los valores más elevados de densidad celular de microalgas y cianobacterias.

Page 78: Micro Algas

78  

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

Muestreos

92326,22

28072,16 28568,78

10,39

Gra

sas

y A

ceite

s (m

g.L-

1)

M-1 M-2 M-3 M-4

Figura 17. Grasas y aceites (mg.L-1) en las lagunas de estabilización de acuerdo a los muestreos.

4.1.3. Variación del pH en las lagunas de estabilización de una planta extractora de aceite

La determinación del pH constituye un parámetro esencial para detectar grado de

acidez o de alcalinidad de las aguas residuales según el tipo de laguna, sea anaeróbica

facultativa o de maduración. De tal forma, que los diferentes procesos biológicos,

químicos y fisicoquímicos sean considerados en función de los valores obtenidos de

pH. De acuerdo, a los muestreos realizados se observó poca variabilidad desde la

entrada de la primera laguna (L1) hasta la salida de la última laguna de maduración

(L5). En este orden se apreció un incremento del pH desde 7,51 hasta 8,95 en el

primer muestreo. De la misma manera, ocurrió en los otros muestreos, en donde se

registra el menor pH en la primera laguna y a medida que avanza el sistema de laguna

el pH incrementa, de pH 9,07 a 10,51 en el segundo muestreo y de pH 6,00 a 8,30 en el

cuarto muestreo (Tabla 19).

Page 79: Micro Algas

79  

Tabla 19. Monitoreo del pH en las Lagunas de Estabilización.

Muestreos Laguna 1 2 3 4

L1E 7,51 9,07 8,00 6,00

L1S 7,70 9,35 8,38 6,98

L2S 7,60 9,90 7,70 7,20

L3S 7,73 10,30 8,30 7,70

L4S 9,44 10,88 8,75 7,90

L5E 9,42 10,37 8,80 8,20

L5S 8,95 10,51 8,90 8,30

Diversos estudios reportan una oscilación del pH en torno a la neutralidad y alcalinos

dependiendo del tipo de residual que se esté procesando. A propósito, Hosetti y Patil,

(1992), indican que, el pH varía también en función de la concentración de CO2 que se

esté generando como producto metabólico y dado que las actividades de los consorcios

microbianos se adaptan a los cambios que puede afectar el pH.

Los elevados valores de los parámetros fisicoquímicos del sistema de estabilización

durante los cuatro muestreos, reflejan el exceso característico de materia orgánica, N, P

y de grasas típicos de estos residuales. Sin embargo, a pesar de estos niveles

elevados en todas las lagunas, estos ejercen un efecto sobre la adaptación, diversidad,

abundancia y competencia de los microorganismos fotosintéticos. Es decir, la

variabilidad en el tamaño de la población de las microalgas y cianobacterias, está

condicionada al acceso de estos; a la materia orgánica, fuentes de nitrógeno y fósforo,

entre otros. De tal manera que, las variaciones de la población estarían modulas por

las concentraciones de DQO, N y P, existentes en las lagunas. Así, se puede inferir,

que la mayor población observada en el primer y tercer muestreo, podría estar

influenciada por las concentraciones de Nitrógeno (46,09 y 76,83mg.L-1); ya que las

concentraciones más elevadas para el segundo y cuarto muestreo (1.811,60 y

2.635,92mg.L-1) se reduce la población total de 11,92 x106 cel.mL-1 a 4,91 x106 cel.mL-1.

En cambio, el fósforo y las grasas-aceites, parecen no ejercer influencia directa sobre

los cambios poblaciones de microalgas y cianobacterias.

Page 80: Micro Algas

80  

Exoenzimas en microalgas y en sus bacterias asociadas, aisladas de Lagunas de Estabilización de una Planta

extractora de aceite de palma

Page 81: Micro Algas

81  

4.2.1. Exoenzimas en microalgas y sus bacterias asociadas

La presencia de las exoenzimas amilasa, fosfatasa, ureasa, proteasa y celulasa, fue

estudiada en las microalgas Chlorella (cepas sp. 1, sp. 2 y sp. 3), Scenedesmus (sp. 1 y

S. ecornis), Chlorococcum, Oocystis, Chlamydomonas, Euglena y en las cianobacterias:

Synechocystis y Geitlerinema; así como en sus bacterias asociadas (Tabla 20, 22 y 24);

ya que en estos microorganismos demostraron excelente crecimiento y adaptación en

condiciones de laboratorio.

4.2.1.1. Amilasa: De acuerdo al método en medio sólido con almidón (0,2%), se

encontró, que los mayores diámetros de los halos estuvo en el siguiente orden

descendente: Chlorella sp. 2> Chlorococcum sp.> Scenedesmus ecornis> Chlorella sp.

1; siendo los valores promedios para Chlorella sp. 2, y Chlorococcum de 6,29±0,16cm y

3,18±1,42cm respectivamente. Mientras que, la menor producción del halo se obtuvo

en las especies de Chlamydomonas, Geitlerinema y Synechocystis con 0,45±0,18cm,

0,60±0,57cm y 0,63±0,07cm respectivamente (Figura 18).

En cuanto a la detección de amilasa en las bacterias asociadas, se observó una

formación de halos muy pequeños como para ser medidos sus diámetros. En cambio,

no se demostró presencia de amilasa en las bacterias A. actinomycetemcomitans y P.

aerogenes asociadas a la microalga Oocystis sp.; en Brevundimononas diminuta y cepa

blanca C-12 asociadas a la cianobacteria, Geitlerinema sp. y en las cepas C-42 y C-13

asociadas a la microalga Chlorococcum sp. (Tabla 20).

El hecho de encontrar una mayor producción de amilasa en bacterias, que en

microalgas, sugiere que estas presentan capacidad mixotrófica, de utilizar compuestos

orgánicos, como el almidón como sustrato para la asimilación de glucosa en el medio

de cultivo. No obstante, se esperaba una elevada actividad en las bacterias, en función

de su mayor versatilidad y velocidad para utilizar diversos sustratos en su medio

natural; ya que al menos en otras especies de bacterias, esta descrita una alta actividad

Page 82: Micro Algas

82  

de amilasa. Tal es el caso de cepas de Thermoactynomyces y Thermomonospora

productoras versátiles de α-amilasas. Además, del género Bacillus sp. caracterizado

por una gran variedad de amilasas, producida por B. licheniformes, B. subtilis y B.

coagulans. En bacterias acido lácticas también se ha descrito en Lactobacillus

amylophilus, L. amylovorans, L. plantarum y L. manihotivorans. Así como en

Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Streptococcus pneumoniae y en

Salmonella typhimurium (Simpson y Russell, 1998; Aguilar y col. 2000; Haq y col. 2003;

Swain y Ray, 2007).

Figura 18. Presencia de amilasa en medio sólido (almidón al 0,2%) en microalgas y bacterias asociadas. a. Oocystis, b. Chlorella, c. Scenedesmus, d. cepa bacteriana C-12 Naranja, e. A. actinomycetemcomitans, f. S. maltophilia.

Los resultados sobre la detección de amilasa en las microalgas, también indican que en

los cultivos sólidos con almidón, no hubo presencia de crecimiento bacteriano; con lo

cual se sugiere que la expresión de dicha enzima, obedece más a la actividad

intrínseca de cada microalga, y no a la de su flora bacteriana asociada.

Los análisis de amilasa determinados en cultivo líquido y mediante espectrofotometría,

también indicaron que la cepa de Chlorella sp. 2, fue la de mayor capacidad hidrolítica

sobre almidón, con 1,155U/g, seguido de Scenedesmus sp. y Chlorococcum sp. con

a b c

d e f

Page 83: Micro Algas

83  

0,960U/g y 0,956U/g respectivamente. Mientras que, para el cultivo mixto de Chlorella

sp. 1 y S. ecornis se determinó una actividad de 1,050U/g (Figura 19).

 

0

0,4

0,8

1,2

1,6

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

U/g

Edad del Cultivo (horas)

Chlorella sp. 2

Scenedesmus sp.

Chlorococcum sp.

Chlorella sp./S. ecornis

 

Figura 19. Variación de la actividad amilasa (U/g) en microalgas, en función del tiempo (h).

Tabla 20. Amilasa en microalgas y bacterias asociadas. Microalga Amilasa Halo(cm) Microalga Bacterias asociadas Amilasa

Chlorella sp 1 +++ 2,11 C. durum +

Scenedesmus sp. 1 ++ 1,70 Chlorella sp.

B. sphaericus +

C. durum + Oocystis sp. ++++ 1,77

B. sphaericus + Euglena sp. ++ 0,80 D. acidovorans +

Chlorococcum sp. ++++ 3,18

Scenedesmus sp.

S. hominis +

Synechocystis sp. ++ 0,63 B. sphaericus + Scenedesmus ecornis.

+++++ 2,73 A. actinomycetemcomitans -

Chlorella sp 2 +++++ 6,29 P. stomatis +

Chlorella sp 3 ++ 1,35

Oocystis sp.

P. aerogenes -

Geitlerinema sp. + 0,60 S. hominis +

Chlamydomonas sp + 0,45 S. maltophilia +

. B. diminuta -

C-12 Blanca -

Geitlerinema sp.

C-12 Naranja +

C-42 -

Delftia sp. +

Chlorococcum sp.

C-13 -

Page 84: Micro Algas

84  

Es importante resaltar que la actividad de amilasa expresó un incremento con el tiempo

de exposición del sustrato en el cultivo, hasta unas 6 y 8 horas, para las diferentes

microalgas, y luego parece describir una fase estacionaria, por el mantenimiento de la

actividad enzimática más o menos constante. Aun cuando a las 12 horas, se observó

un incremento ligero de la hidrólisis del almidón para todas las microalgas. Esto

significa que, la amilasa puede ser detectada a cualquier tiempo a partir de la

inoculación del sustrato (Figura 19).

En cultivos líquidos con diferentes concentraciones de almidón (0.5, 1.0, y 3.0%)

también se ha descrito presencia de actividad de amilasa en condiciones mixotróficas y

heterotróficas de Chlorella sorokiniana, aislada de un embalse de agua; lo cual

demostró la elevada capacidad de esta microalga en condiciones axénicas de expresar

una amilasa inducible a la presencia de almidón en el medio de cultivo (Moronta, 2001).

La presencia de amilasas en estas microalgas procedentes de aguas residuales de una

planta extractora de aceite de palma, confiere un aporte valioso para el diseño de

inóculos productores de estas enzimas hidróliticas que puedan acelerar el proceso de

remoción de materia orgánica. A propósito, se ha reportado que las amilasas alcalinas

son las principales responsables de la hidrólisis del lodo biodigerido en el tratamiento de

aguas residuales y constituyen una herramienta para prevenir contaminantes

ambientales; además de ser utilizadas en la industria de detergentes (Burgess y

Pletschke, 2008). De igual manera, Nybroe y col. (1992) demostraron que el almidón

hidrolizado en lagunas de estabilización municipal, es un reflejo del incremento en la

actividad de la α-glucosidasa presente en el lodo activado del sistema, aunado a la

intervención del sulfuro, como activador de la actividad de β-glucosidasas en la

degradación de celulosa (Watson y Pletschke, 2006).

4.2.1.2. Lipasa: La presencia de lipasa mediante el uso del medio de cultivo con

yema de huevo fue observada en especies de Chlorella, Scenedesmus,

Chlamydomonas y Euglena. De acuerdo, al diámetro del halo de hidrólisis se encontró

que el mayor halo se produjo en las cepas de Chlorella sp. 2 y 1, respectivamente con

Page 85: Micro Algas

85  

4,97±0,39cm y 4,73±0,01cm, seguido de Scenedesmus sp. con 3,14±0,70cm y S.

ecornis con 2,56±0,58cm con y sin peptona. La menor hidrólisis se presento en

Chlorella sp. 3, y Chlamydomonas sp. con halos de 0,15±0,00cm y 0,15±0,00cm

respectivamente, seguido por el género Euglena sp. con un halo de 0,24±0,08cm

(Figura 20).

Figura 20. Lipasa en microalgas. Medio Yema de Huevo: a. Chlorella sp.1, b. Chlorococcum, c. Oocystis. Medio Tween 80: d. Euglena, e. Oocystis, f. Chlorella sp. 3.

Cuando se analizó la presencia de lipasa con tween 80 (con o sin peptona), se observó

el mayor halo de actividad en Chlorella sp. 2 con 3,15±0,15cm y en Oocystis sp. con

1,50±0,35cm. En cambio, Geitlerinema sp. y Euglena sp. demostraron poca actividad

hidrolítica sobre este sustrato, con 0,33±0,04cm y 0,37±0,01cm respectivamente. Para

el caso del método espectrofotométrico con para-nitrofenil palmitato (p-NPP), se detectó

la mayor actividad en las tres cepas de Chlorella con 0,804±0,001; 0,608±0,03 y

0,504±0,002U/mL, en Chlorella sp. 2, Chlorella sp. 1 y Chlorella sp. 3 respectivamente.

Este método también permitió detectar en Chlamydomonas, la presencia de otra lipasa,

debido a que se obtuvo una actividad de 0.302±0,001U/mL, al menos moderada, en

relación a las otras microalgas y cianobacterias. Caso similar para Oocystis sp., que a

a b c

d e f

Page 86: Micro Algas

86  

pesar de haber exhibido una actividad moderada en los medios con yema de huevo y

tween 80, no acusó actividad significativa con el sustrato p-NPP (Tabla 21).

Estos resultados sugieren que, la detección de lipasa obedece también al tipo de

sustrato utilizado y en consecuencia, al tipo de esterasa que pueda actuar sobre los

mismos. Es decir, en presencia de yema de huevo se describe a una lecitinasa

(fosfolipasa); con p-nitrofenilpalmitato se demuestra una lipasa específica para hidrolizar

el ester entre un grupo aromático y el ácido graso; y en presencia de tween 80, la de

una lipasa actividad y solubilizada con este detergente.

Las lipasas o enzimas lipolíticas son usadas para la hidrólisis de grasas, síntesis de

glicéridos-esteres y modificación de lípidos, se caracterizan por intervenir la interface

agua/lípido y dada su alta especificidad respecto al tipo y posición especifica del residuo

del acido graso, tiene aplicaciones en el área de los biosurfactantes, industria

alimentaria, oleoquímica, procesamiento del café, en cosmética, perfumería y en el

tratamiento de aguas residuales (Khan y col. 2003; Singh y col. 2006; de Azeredo y col.

2007). De tal manera que, las lipasas encontradas en las microalgas evaluadas,

pudiesen ser base de estudios destinados a la producción de las mismas; con lo cual se

destaca que Chlorella, Scenedesmus y Oocystis, exhibieron la mayor actividad lipasa,

comparada a otras microalgas y cianobacterias evaluadas. Mientras que, de acuerdo a

los dos métodos utilizados se estableció el siguiente orden descendente de actividad:

Chlorella sp. 2>Chlorella sp.1>Scenedesmus sp.1>Scenedesmus ecornis>Oocystis sp.

En relación, a las bacterias asociadas a los cultivos de microalgas, se encontró una

baja actividad de lipasa. Al menos con yema de huevo, se obtuvo, un mayor diámetro

de los halos. En este caso, Pasteurella stomatis asociada a Oocystis sp., las cepas C-

12 Naranja y C-12 Blanca asociada a Geitlerinema sp. y la cepa C-42 asociada a

Chlorococcum sp., resultaron más evidentes para lipasa (Figura 21). Mientras que,

para el ensayo con p-NPP todas las cepas bacterianas exhibieron valores entre 0,01-

0,03 U/mL (Tabla 22).

Page 87: Micro Algas

87  

Estos resultados contribuyen a sugerir que, las bacterias en comparación con las

microalgas presentaron una menor hidrólisis enzimática de lipasa. No obstante, las

actividades lipolíticas de las cepas aisladas de microalgas y bacterias asociadas, de

residuales de una extractora de aceite de palma, pueden tener un papel importante en

la eliminación de grasas de las plantas de tratamiento de aguas residuales con una

elevada cantidad de grasa.

Es posible, que en condiciones ambientales y en presencia de los residuales de la

laguna estudiada, se pueda estimular la producción de lipasas en las bacterias y quizás

en mayor grado en las microalgas. Al respecto, se ha descrito la participación de

Acinetobacter, en la degradación de grasas en los procesos de tratamiento de lodos

activados de una planta extractora de aceite de oliva (Chappe y col. 1994).

Figura 21. Presencia de lipasa en bacterias asociadas. Medio Yema de Huevo: a. Stenotrophomonas maltophilia, b. Staphylococcus hominis, c. Actinobacillus actinomycetemcomitans, Medio Tween 80: d. cepa C-12 Naranja, e. cepa C-42 Bacillus sphaericus, e. Staphylococcus hominis.

Las lipasas son utilizadas para hidrolizar aceites y grasas en el tratamiento de aguas

residuales industriales y en el tratamiento diario de aguas residuales; la utilización de

una tecnología enzimática asociada con el tratamiento biológico anaeróbico de aguas

a b c

d e f

Page 88: Micro Algas

88  

Tabla 21. Lipasa en Microalgas. Microalga Tween 80* Halo Tween 80** Halo Yema Huevo* Halo Yema Huevo** Halo Lipasa p-NPP (U/mL)

Chlorella sp. 1 ++ 0,70 + 0,35 +++++ 4,72 +++++ 4,74 0,608 Scenedesmus sp. ++ 1,21 +++ 1,20 +++++ 3,64 ++++ 2,65 0,038 Oocystis sp. +++ 1,74 +++ 1,25 ++++ 2,62 +++ 1,79 0,009 Euglena sp. + 0,37 + 0,38 + 0,18 + 0,30 0,011 Chlorococcum sp. ++ 0,85 + 0,15 ++ 0,95 ++ 0,85 0,022 Synechocystis sp. + 0,55 ++ 0,65 + 0,35 ++ 0,60 0,008 Scenedesmus ecornis ++ 1,35 +++ 1,10 ++++ 2,15 ++++ 2,97 0,075 Chlorella sp. 2 +++++ 3,04 +++++ 3,25 +++++ 4,70 +++++ 5,25 0,804 Chlorella sp. 3 ++ 1,55 + 0,45 + 0,15 + 0,15 0,504 Geitlerinema sp. + 0,35 + 0,30 +++ 1,45 +++ 1,20 Chlamydomonas sp. ++ 0,75 + 0,20 + 0,15 + 0,15 0,302

*Con peptona; **Sin Peptona. Halo (cm).

Tabla 22. Lipasa en bacterias asociadas a microalgas, método en placa y espectrofotométrico (p-NPP).

Microalga Bacterias Asociadas Tween 80 Yema Huevo Lipasa p-NPP (U/mL)

C. durum + + 0,02 Chlorella sp.

B. sphaericus + + 0,03 C. durum + + 0,02 D. acidovorans + - 0,01 Scenedesmus sp. S. hominis + + 0,02 B. sphaericus + + 0,03 A. actinomycetemcomitans - - 0,02 P. stomatis - +++ 0,01

Oocystis sp.

P. aerogenes - - 0,02 S. hominis + + 0,02 S. maltophilia + + 0,01 B. diminuta - + 0,02 C-12 Blanca - +++ 0,02

Geitlerinema sp.

C-12 Naranja ++ +++ 0,03 C-42 + ++++ 0,02 Delftia sp. + + 0,01 Chlorococcum sp.

C-13 - - 0,02

Page 89: Micro Algas

89  

residuales disminuye la grasa que afecta el lodo en reactores anaeróbicos (Leal y col.

2002; 2006).

Mudryk y Skórczewski, (2006), estudiaron el lago estuarino Gardno encontrando una

comunidad fototrófica dominada por cianobacterias Anabaena flos-aquae,

Aphanizomen-non flos-aquae y microcystis aeuginosa y cepas bacterianas

heterotróficas que son activamente lipolíticas, las cuales transforman y modifican los

compuestos de lípidos en cuerpos de agua. También se ha reportado que las

actividades lipolíticas en digestores anaeróbicos de aguas residuales aumentan su

actividad por la presencia de sulfuros y sulfitos y son inhibidas por sulfatos (Whiteley y

col. 2003a;b).

4.2.1.3. Proteasa: Todas las microalgas dieron positivo para la licuefacción de la

gelatina e hidrólisis de la caseína (Figura 22), con lo cual se infiere que ambos sustratos

pueden ser utilizados por estos microorganismos fotosintéticos. Para el caso, de la

actividad sobre caseína se reportaron los valores más altos para Scenedesmus sp.,

Chlorococcum sp. y Chlorella sp. 3 con 0,701±0,009U/mL, 0,695±0,007U/mL y

0,656±0,005 U/mL respectivamente. Solo Euglena sp. y Chlamydomonas sp. mostraron

bajas actividades, con 0,295±0,006U/mL y 0,486±0,003U/mL (Tabla 23).

Tabla 23. Exoenzimas (proteasa, ureasa, celulasa y fosfatasa) en microalgas.

PROTEASA FOSFATASA (U/mL) CELULASA UREASAMicroalga

Gelatina (caseína)

(U/mL) Rango

(31-115) Celulosa Halo (cm)

Urea (0,1%)

Chlorella sp. 1 + 0,578 35 + 0,4 + Scenedesmus sp. + 0,701 0 + 0,3 + Oocystis sp. + 0,579 0 + 0,3 + Euglena sp. + 0,295 0 + 0,1 + Chlorococcum sp. + 0,695 0 + 0,1 + Synechocystis sp. + 0,627 1 + 0,2 + S. ecornis + 0,510 0 + 0,3 + Chlorella sp. 2 + 0,593 33 + 0,5 + Chlorella sp. 3 + 0,656 32 + 0,4 + Geitlerinema sp. + ND 39 + 0,1 + Chlamydomonas sp. + 0,486 0 - - +

ND: determinada

Page 90: Micro Algas

90  

La presencia de proteasa en estas microalgas y al menos en Synechocystis, favorece la

opción de incluir la factibilidad de ser utilizadas también, para la hidrólisis de derivados

de proteínas en residuales. De tal manera que, contribuirían en su desempeño como

agentes removedores de materia orgánica en aguas residuales enriquecidas.

Figura 22. Licuefación de la gelatina en microalgas.

En las bacterias asociadas a las microalgas como Corynebacterium durum, Bacillus

sphaericus, Staphylococcus hominis, Stenotrophomonas maltophilia, Brevundimononas

diminuta, C-13, C-42 y C-12 Naranja en la prueba de Gelatina fueron negativas para

esta prueba a diferencia de Delftia acidovorans, C-12 Blanca, Pasteurella stomatis,

Pasteurella aerogenes y Actinobacillus actinomycetemcomitans que fueron positivas

para la licuefacción de la gelatina.

Para la determinación de proteasa con el método de la caseína, las cepas C-12 Naranja

obtuvo una actividad enzimática de 0,836±0,003U/mL, la cepa C-12 Blanca con

0,758±0,013U/mL, Bacillus sphaericus con 0,699±0,015U/mL y Delftia acidovorans con

0,659±0,008U/mL; siendo los valores más altos (asociadas a las microalgas Chlorella

sp., Scenedesmus sp. y Geitlerinema sp.) a diferencia de las demás bacterias que

produjeron los valores más bajos entre 0,149-0,535U/mL.

Page 91: Micro Algas

91  

El género Bacillus constituye uno de las más importantes fuentes de proteasas. Al

respecto, se han indicado diversas cepas alcalofilas de este género, tales como: B.

licheniformes, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. megaterium, B. polymyxa,

B. thermoproteolyticus, B. thurigensis y B. pumilus; y en el género Exiguobacterium sp.

con actividad de proteasa en placas de agar leche, similar al método utilizado en este

estudio (Takami y col. 1990; Kumar y Bhalla, 2004; Kasana y Yadav, 2007). Asimismo,

se ha descrito en B. sphaericus, la purificación y caracterización de una proteasa

alcalina extracelular aislado de suelo alcalino en los Himalayas (Singh y col. 2001).

Actualmente, en el campo de la biotecnología ambiental, se ha tomado en cuenta, la

actividad proteolítica de biopelículas en lodos de aguas residuales (Cadoret y col.

2002). Tales enzimas están asociadas a la chlorophyta Mougeotia, diatomeas

pennadas, a la cianobacteria Oscillatoria y a la comunidad de bacterias en dichos

tapetes microbianos. Entre la metodología desarrollada, en estos consorcios, se ha

postulado la determinación de proteasa extracelular involucrando moléculas

fluorescentes unidas a celulosa con una lecitina (Francoeur y col. 2001).

En ambientes extremos de bajas temperaturas, como en la Antártida, se han evaluado

bacterias heterotróficas proteolíticas; de las cuales, casi la mitad, producen proteasas

extracelular dependientes de temperatura, pH o concentraciones de sal. De igual

manera, se les ha detectado también, presencia de amilasa, ureasa, fosfatasas, β-

glucosidasas y lipasas (Alam y Singh, 2002).

4.2.1.4. Fosfatasa: En las tres cepas de Chlorella sp. 1, 2 y 3 y en la

cianobacteria, Geitlerinema sp. sólo se detectó la presencia de fosfatasa con valores

entre 32 y 39U/mL (Tabla 23). Es posible, que la concentración de fosfato en el medio

de cultivo utilizado para las microalgas, sea aun inhibitorio, como para detectar

actividad significativa de fosfatasa. Los niveles de fosfatasas se disparan cuando se

aproxima una limitación o deficiencia de fosfato en el medio. Diversos autores han

demostrado que la expresión de la fosfatasa está involucrada con la estrategia

fisiológica de detectar el poco fosfato que pueda estar presente en el medio de cultivo o

Page 92: Micro Algas

92  

natural (Kumar y col. 2000). Es decir, a medida que se incrementa el consumo de

fosfato en el medio, se van expresando actividades de fosfatasas extracelulares.

Quizás, para Chlorella sp. y Geitlerinema sp., se mantenga la actividad bajo las

condiciones de cultivo que se estudiaron o realmente tengan mayor capacidad de

producción de estas enzimas.

Para las bacterias asociadas que exhibieron actividad fosfatasa, se produjeron valores

más bajos que las microalgas; los cuales estuvieron entre 1-8U/mL y siendo estas

actividades las correspondientes a las bacterias asociadas a Chlorococcum sp. y

Chlorella sp. (Tabla 24). Es posible que, estos resultados también se relacionen con las

concentraciones remanente de fosfatos en los medios de cultivos de las bacterias, y por

lo tanto, se requieren también, ajustes de pH, para valorar la presencia de fosfatasas

alcalinas y ácidas.

La presencia de fosfatasas alcalinas y ácidas han sido reveladas en especies de grupos

diferentes de microalgas marinas. Así, Kuenzler y Perras, (1965) reportaron la actividad

de fosfatasa en 27 cepas de 6 clases diferentes de algas, encontrando en 13 cepas,

ambos tipos de fosfatasa. Por otro lado, Burzyk y Loos, (1995) reportaron actividad de

fosfatasas en células y pared celular de Chlorella vulgaris, C. kessleri, C. pyrenoidosa,

C. fusca y Scenedesmus obliquus.

La actividad de la Fosfatasa alcalina ha sido detectada también en Anabaena oryzae,

Anabaena flos-aque, Synechococcus sp., Plectonema boryanum, Anabaena sp. y la

diatomea Phaeodactylum tricornutum Bohlin (Ruiz y col. 1997; Kumar y col. 2000).

Estos autores demostraron que los niveles altos de fosfatos en el medio de cultivo

disminuye la expresión de la actividad, y los cultivos deficientes en fosforo bajo

oscuridad, reflejaron un 77% menos actividad que los cultivos con iluminación. Lubián y

col. (1992), reportaron fosfatasa ácida para cepas de Nannochloris sp. y fosfatasa

alcalina en N. maculata, Nannochloropsis salina y N. gaditana. De igual manera,

demostraron que la actividad de la fosfatasa alcalina disminuye por el consumo de

fósforo intracelular.

Page 93: Micro Algas

93  

Tabla 24. Exoenzimas (Proteasa, Ureasa, Celulosa y Fosfatasa) en bacterias asociadas a las microalgas.

C. durum + 0,404 2 + -

B. sphaericus + 0,699 5 + -

C. durum + 0,404 2 + -

D. acidovorans - 0,659 0 + +

S. hominis + 0,535 1 + -

B. sphaericus + 0,699 5 + -

A. actinomycetemcomitans - 0,166 0 - -

P. stomatis - 0,203 0 - -

P. aerogenes - 0,329 0 - -

S. hominis - 0,535 0 + -

S. maltophilia + 0,389 1 - -

B. diminuta + 0,490 0 - -

C-12 Blanca - 0,758 1 - -

C-12 Naranja + 0,836 1 + -

C-42 + 0,149 8 - -

Delftia sp. - 0,659 5 - +

C-13 + 0,490 2 - -

Microalga Bacterias

PROTEASA

CELULOSAUREASA

Gelatinacaseína (U/mL)

FOSFATASA

Rango 31-115 U/mL

Urea 0,1%

Chlorella sp.

Scenedesmus sp.

Oocystis sp.

Geitlerinema sp.

Chlorococcum sp.

4.2.1.5. Actividad de celulasa: Todas las microalgas evidenciaron actividad

celulolítica (Figura 23). En cuanto a las diversas cepas, fueron las cepas de Chlorella

que presentaron una hidrólisis parcial obteniéndose halos entre 0,4-0,5 cm de diámetro.

En cambio, para el resto de las microalgas, los valores de los halos oscilaron de 0,1-0,4

cm (Tabla 23).

En las bacterias asociadas como Corynebacterium durum, Bacillus sphaericus,

asociado a Chlorella sp., Corynebacterium durum, Delftia acidovorans y Staphylococcus

hominis asociadas a las microalga Scenedesmus sp., y Staphylococcus hominis, C-12

Naranja, asociadas a la microalga Geitlerinema sp. fueron positivas para la actividad de

celulosa, a diferencia de los demás géneros que fueron negativos (Tabla 24). De tal

manera que, tanto Chlorella sp. y Scenedesmus sp., continúan acaparando las

capacidades de producción de exoenzimas, conjuntamente con su flora bacteriana

asociada, en algunos casos, como para sugerir, las cepas correspondientes a estos dos

géneros, como las de mayor factibilidad para la remoción de materia orgánica.

Page 94: Micro Algas

94  

Las cianobacterias Anabaena flos-aquae, Aphanizomen-non flos-aquae y microcystis

aeuginosa y ciertas cepas bacterianas heterotróficas han sido reportadas en un lago

estuarino, con capacidad celulolítica. Una de las razones por la baja población de

microorganismos celulolíticos es el hecho de que la celulosa es relativamente resistente

a los procesos de degradación de bacterias y su transformación en glucosa requiere

una cantidad considerable de energía. De tal manera que, para una despolimerización

microbiológica de la celulosa se requiere una actividad sinérgica de muchas enzimas

hidróliticas sintetizadas por bacterias, actinomicetales, hongos y protozoos (Mudryk y

Skórczewski, 2006).

La presencia de celulasa es de suma importancia para los sistemas de estabilización de

aguas residuales, procedentes de actividades de procesamiento de madera, extracción

de grasas, aceites, pectinas y otros compuestos de plantas de interés comercial. El

hecho de que las microalgas, aisladas de aguas residuales de una planta extractora de

aceite de palma, supone un valor agregado, a este consorcio de microalgas, puesto que

contribuirían a remover, los excedentes de celulosas presentes en los efluentes del

proceso de extracción del aceite.

Figura 23. Celulasa en las microalgas a. Chlorella sp.1, b. Scenedesmus sp. c. Euglena sp.

4.2.1.6. Actividad de ureasa: De acuerdo a las condiciones de cultivo, todas las

microalgas fueron positivas, la prueba para ureasa (Figura 24); indicando que las

microalgas Chlorella sp. 1, 2 y 3, Scenedesmus, Oocystis, Euglena, Geitlerinema y

a b c

Page 95: Micro Algas

95  

Chlorococcum fueron las microalgas que evidenciaron la reacción de ureasa a los 5

días, las otras especies (Synechocystis, S. ecornis, Chlamydomonas) evidenciaron al 7

y 8 día. Infiriendo, que las cepas de Chlorella sp., Scenedesmus sp., Oocystis sp.,

Euglena sp., Geitlerinema sp. y Chlorococcum sp. tuvieron una mayor velocidad de la

expresión de urea que las demás microalgas evaluadas para esta exoenzima.

Figura 24. Presencia de ureasa en las microalgas Synechocystis sp. S. ecornis, Chlamydomonas sp. Geitlerinema sp. Chlorella sp.2 Scenedesmus sp. Oocystis sp. Euglena sp. Chlorococcum sp. y el Control. 

En cuanto a las bacterias asociadas, solo Delftia acidovorans y Delftia sp. resultaron

con actividad de ureasa, estando las mismas, asociadas con Scenedesmus sp. y

Chlorococcum sp.

La actividad de las exoenzimas es principalmente confinada a las enzimas hidrolasas,

las más notables las Lipasas, Fosfatasas, Glucosidasas y Proteasas; indicando que el

contacto de estas enzimas con los sustratos son importantes en la digestión anaerobia

del proceso biológico del tratamiento de aguas residuales; y declinan su actividad

durante la digestión aeróbica y anaeróbica (Jain y col. 1992; Novak y col. 2003; Burgess

y Pletschke, 2008). Whiteley y col. (2002) muestran que las enzimas proteasas y

fosfatasas están predominantemente asociadas con la materia orgánica particulada del

lodo del agua residual municipal.

Page 96: Micro Algas

96  

En Lagunas de estabilización de una planta extractora de aceite de acuerdo a los

resultados podemos decir, Chlorella sp. 1, 2 y 3, Scenedesmus sp. y S. ecornis

muestran la mayor producción de exoenzimas como amilasa, proteasa, lipasa, ureasa,

celulasa y fosfatasa; y Oocystis sp. estando también como una de las especies con

mayor cantidad de producción como amilasa, lipasa, ureasa y celulasa; mientras que

con menor producción las especies de Chlorococcum sp. (amilasa y proteasa), Euglena

sp. (ureasa) y Geitlerinema sp. (fosfatasa).

Page 97: Micro Algas

97  

Remoción de DQO, Nitrógeno, Fósforo y grasas en agua residual de una Planta extractora de aceite de palma en presencia de microalgas y sus bacterias asociadas

Page 98: Micro Algas

98  

4.3.1. Cultivos mixtos de microalgas productoras de exoenzimas con agua residual de la planta extractora de aceite de palma

En este estudio se seleccionaron las microalgas Chlorella sp., Chlorococcum sp.,

Chlamydomonas sp., Oocystis sp., Scenedesmus sp. y Geitlerinema sp.; previamente

aisladas de aguas residuales de la Planta extractora de aceite de palma y las cuales

demostraron ser fuentes de las exoenzimas: amilasa, lipasa, proteasa, fosfatasa,

celulasa y ureasa. Es por ello, que en el presente estudio se reportan los resultados

sobre niveles de remoción de DQO, nitrógeno, fósforo y grasas de muestras de aguas

residuales de una Planta extractora de aceite de palma, a fin de relacionar el posible

efecto de estas microalgas como co-participantes en los procesos de remoción. Los

experimentos fueron iniciados con un inóculo mixto de estas microalgas y la

concentración de estos parámetros químicos y biológicos, al inicio y final del ensayo.

Estos resultados derivan de dos diseños experimentales, cuyo Primer Ensayo se

relacionó con la evaluación de un control sin agua residual (cultivo autotrófico de

microalgas), un control AR (con agua residual sin ningún aditivo químico o biológico), y

un cultivo con agua residual complementada con un fertilizante comercial (Nitrofoska) e

inoculado con el consorcio de microalgas (ARN). En cambio, para la ejecución del

Segundo Ensayo se incluyeron los siguientes tratamientos: agua residual suplementada

con una mezcla orgánica (O), compuesta por lecitina (0,1%), urea (0,1%) y almidón

(0,1%), como materia orgánica referencial añadida al agua residual (ARO); agua

residual enriquecida con fertilizante (ARN), agua residual con el fertilizante y la mezcla

orgánica (ARNO), otro tipo de control integrado por el fertilizante y la mezcla orgánica

(NO). Para ambos experimentos se analizó el crecimiento y contenido de pigmentos,

pH, remoción de DQO, nitrógeno, fósforo, sólidos totales, grasas y aceites. Además de,

monitorear la presencia de exoenzimas y de bacterias al inicio y final de cada

experimento.

4.3.1.1. Crecimiento y contenido de pigmentos en el primer ensayo: Este

experimento realizado con agua residual de la extractora de aceite de palma africana,

colectada antes de entrar al sistema de lagunas de estabilización (AR) (Figura 25), se

Page 99: Micro Algas

99  

obtuvo el máximo crecimiento (p<0,05) en agua residual con Nitrofoska (ARN) con

12,34±2,32 x106 cel.mL-1. Mientras que, en el control (agua destilada + fertilizante) y

AR fue de 11,14±2,17 y 5,53±1,31 x106 cel.mL-1 (Figura 26). También se observó que,

con la adición del fertilizante al agua residual (ARN), se incrementó el crecimiento en un

45%. Es posible, que el bajo crecimiento producido en AR, sea debido a que los

nutrientes contenidos en el agua residual no estén del todo disponibles para las

microalgas. De tal manera que, acusa deficiencia para el crecimiento, y que la misma

es superada con la adición del fertilizante, el cual elevó dicho crecimiento a 2,2 veces.

Figura 25. Sistema de tratamiento aguas residuales (Extractora de Aceite de Palma).

En cuanto al contenido de clorofila y carotenoides (Figura 27 y 28), se alcanzaron

valores significativamente mayores (p<0,05) con valores similares de 19,13±0,42 y

17.94±0,32µg.mL-1 clorofila en ARN y control, respectivamente.

Agua Residual antes de suingreso a las Lagunas de

Estabilización (AR)

Muestra Agua Residual

 

Recolección de Efluentes Tratados

(Agua para Riego de Cultivos)

L A G U N A S D E E S T A B I L I Z A C I Ó N

L-1

L-2

L-3

L-4

L-5

 

Page 100: Micro Algas

100  

0

2

4

6

8

10

12

14

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

DC

(x 1

0 6

cel.m

L -1

)

Edad del Cultivo (días)

Control AR ARN

Figura 26. Crecimiento de microalgas en función de la edad del cultivo con agua residual. Control: AR: agua residual, ARN: agua residual enriquecida con Nitrofoska.

En cambio la clorofila, con el agua residual sin adición de fertilizante (AR) se produjo un

valor de 10,22±1,29µg.mL-1 (Figura 27), lo que solo representa un 50,4% del obtenido

cuando era adicionado el fertilizante.

0

5

10

15

20

25

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Clo

rofil

a a

(µg.

mL

-1)

Edad de Cultivos (días)

AR ARN Control Control (AR)

 

Figura 27. Variación del contenido de clorofila (µg.ml-1) con la edad del cultivo.

Page 101: Micro Algas

101  

El seguimiento de la concentración de los carotenoides en función de la edad del

cultivo, también contribuyó a ratificar que en ARN, seguido del control y luego de AR, se

reflejó el crecimiento en este orden descendente, y que apenas el bajo contenido de

carotenoides detectado en el control (AR), sea debido al poco crecimiento de las

microalgas presentes en las muestras colectadas del agua residual.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Car

oret

onio

des

(µg.

mL

-1)

Edad del Cultivo (días)

AR ARN Control Control (AR)

Figura 28. Variación del contenido de carotenoides (µg.ml-1) con la edad del cultivo.

Estudios anteriores han demostrado la posibilidad de utilizar las aguas residuales

urbanas como medio de cultivo para el crecimiento de microalgas. Chacón y col. (2002)

realizaron cultivos a nivel de laboratorio utilizando las microalgas Chlorella sp. y

Scenedesmus sp. en aguas residuales urbanas de la serie A del sistema de lagunas de

estabilización del CIA-LUZ, obteniendo un crecimiento satisfactorio de las mismas en el

agua residual y superando significativamente el crecimiento presentado por el

tratamiento de control, con lo que se demuestra el potencial estimulador del crecimiento

y de la producción de pigmentos esta agua residual.

Page 102: Micro Algas

102  

11,14

5,53

12,34

17,94

9,64

19,13

1,29 1,15 1,68

0

5

10

15

20

25

Control AR ARN

DC

(x10

6ce

l.mL

-1);

Pig

men

tos

(µg.

mL

-1)

Crecimiento Clorof ila Carotenoides

Figura 29. Densidad celular (x106 cel.mL-1), clorofila y carotenoides (µg.mL-1) del cultivo mixto de microalgas en control, AR y ARN.

El seguimiento de la concentración de la clorofila y carotenoides con la edad del cultivo,

también es una medida del crecimiento de las microalgas, y permite complementar el

comportamiento de las mismas ante medios de cultivos experimentales, como lo fueron

las aguas residuales. Es por ello que, la producción de clorofila se selecciona como

parámetro de crecimiento; puesto que se correlaciona con la densidad celular o peso

seco de las microalgas, conforme van transcurriendo los días del cultivo (Jonte, 2003).

En este estudio se aprecia (Figura 29) que el máximo crecimiento (p<0,05) fue en agua

residual con nitrofoska (ARN) con 12,34±2,32 x106 cel.mL-1. Mientras que, en el control

(agua destilada + fertilizante) y AR fue de 11,14±2,17 y 5,53±3,00 x106 cel.mL-1.

4.3.1.2. Crecimiento y contenido de pigmentos en el segundo ensayo: La mayor

densidad celular se produjo en el control (solo fertilizante) con 28,99±3,23 x106 cel.mL-1

(p>0,05); a pesar de que presentó un comportamiento similar con el control NO

Page 103: Micro Algas

103  

(fertilizante con la mezcla orgánica), hasta el día 16. De acuerdo a la curva de

crecimiento, ambos cultivos, parecen formar un subconjunto, muy diferente al resto de

los tratamientos (Figura 30). Por otro lado, en los cultivos mixotróficos (AR

complementados o no con NO y/o Nitrofoska), se encontró el mejor crecimiento en NO,

con lo cual, refleja el siguiente orden descendente: NO> ARO> AR > ARN> ARNO.

Además, se evidenció que NO, superó a ARO, AR, ARN y ARNO en 1.5, 2.10, 2.32 y

4.3 veces respectivamente, con diferencia significativa (p≤0,05), en los subconjuntos

homogéneos a,b,c; y sin diferencia significativa (p>0,05) entre subconjuntos

homogéneos.

0

5

10

15

20

25

30

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

DC

(x 1

0 6

cel

. mL

-1)

Edad del Cutivo (días)

Control NO AR ARN ARO ARNO

  

Figura 30. Cultivo de microalgas en función de la edad del cultivo con diferentes tratamientos. NO: Nitrofoska + O, AR: Agua residual, ARN: Agua residual con Nitrofoska, ARO: Agua residual + O,

ARNO: Agua residual Nitrofoska + O.

Es de indicar, además que, los cultivos ARN y ARNO presentaron una inhibición del

crecimiento más acentuada, que los cultivos ARO y AR, quizás como resultado de la

excesiva carga orgánica y falta de disponibilidad de nutrientes del agua residual. Dicho

Page 104: Micro Algas

104  

efecto, fue observado hasta el día 16 de iniciado el experimento. A partir del cual, se

observó un crecimiento real de estos cultivos, probablemente debido, a alguna actividad

de biodegradación de los componentes del agua residual, que hizo luego disponibles

los nutrientes necesarios para el incremento de la densidad celular. No obstante, en el

cultivo control, tampoco hubo un crecimiento adecuado hasta el día 16, presentando un

bajo crecimiento, para luego elevar su densidad celular drásticamente en el día 18. En

tal sentido, se sugiere algún efecto ambiental a los cultivos, que durante el período del

experimento, produjo bajo crecimiento hasta el día 16 en todos los cultivos (Figura 30).

El control autotrófico también superó al resto de los tratamientos (p≤0,05), en cuanto al

contenido de clorofila y carotenoides y ligeramente en cuanto a los valores de densidad

celular (Figura 31). Esto sugiere que las condiciones mixotróficas de los cultivos: AR,

ARN, ARO, ARNO y NO, parecen no favorecer la síntesis de pigmentos. Tal efecto, se

refleja en mayor grado, para ARNO, al cual se le ha adicionado al agua residual, el

fertilizante y la mezcla orgánica. De tal manera, que pudo haberse producido

compuestos que inhibieron tanto su crecimiento, como la acumulación de clorofila y de

carotenoides.

Es decir, si se compara el contenido de clorofila entre los cultivos con agua residual y el

control, se detecta que hubo una inhibición del 70,3; 68,1; 56,2 y 54,64 en ARNO, AR,

ARO, ARN, respectivamente. Mientras que en el cultivo control con fertilizante y la

mezcla orgánica (NO) también lo hubo, pero en un y 45,4%. Lo que permite, deducir

que, las condiciones mixotróficas en presencia de alto contenido de compuestos

orgánicos, influyeron en la baja acumulación de clorofila. El valor más alto del control

fue de 28,99±3,23 x106 cel.ml-1 y el de ARNO apenas alcanzo los 6 millones, tal como

se ve en la figura 31.

Page 105: Micro Algas

105  

28,99

18,92

12,50

9,05

13,79

6,75

21,86

11,96

6,98

12,2911,07

6,49

5,043,32

1,623,19

2,18 1,74

0

5

10

15

20

25

30

35

Control NO AR ARN ARO ARNO

DC

(x 1

0 6

cel.m

L -1

); P

igm

ento

s (µ

g.m

L -1

)

Crecimiento Clorof ila Carotenoides

 

Figura 31. Densidad celular (x106 cel.mL-1), clorofila y carotenoides totales (µg.mL-1) del cultivo mixto de microalgas con los diferentes tratamientos.

4.3.2. Efecto del pH en los cultivos mixtos de las microalgas

El pH del agua residual colectada (antes de entrar al sistema de lagunas de

estabilización) varió entre 3,75 y 4,28 a 3,75, el cual era ajustado hasta la neutralidad,

al momento de ser utilizada como medio de cultivo. Al realizar el Primer ensayo, el

agua residual cruda tuvo un pH de 6,5 después de realizar los diferentes tratamientos,

el pH vario. Para el control (AR) fue de 8,07, con AR fue de 7,67 y con ARN de 7,69.

Para el segundo ensayo, el agua residual tuvo un pH de 3,35 y ajustado luego a 7,00.

Mientras que, los valores iniciales de pH para el control, control (AR), AR, NO, ARN y

ARNO fueron de 7,68; 7,10; 8,24; 7,11; 7,23 y 7,20 respectivamente.

El monitoreo del pH con la edad del cultivo (Fig. 32a) en el primer ensayo y en el

segundo ensayo (Fig. 32b) a lo largo del periodo experimental, indican un ascenso del

pH entre 9 y 10 en los tratamientos con agua residual, en comparación con los del

control y NO, que solo se mantenían entre 8,5 y 8,0 y entre 7,8 y 8,2, respectivamente.

Page 106: Micro Algas

106  

0

2

4

6

8

10

12

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

pH

Edad del Culltivo (días)

Control Control (AR) AR ARN

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

pH

Edad del Cultivo (días)

Control Control (AR) NO AR ARN ARO ARNO

Figura 32. Variación del pH durante el periodo experimental. a. Ensayo 1 b. Ensayo 2.

Es posible que, el elevado pH en los cultivos con agua residual, ejerzan influencia en la

precipitación de nutrientes, y en consecuencia disminuyan la disponibilidad de los

mismos para las microalgas, si se compara con el control, cuyo pH permaneció en el

rango optimo para el crecimiento de microalgas (Abalde y col. 1995). El incremento del

pH en cultivos con microalgas utilizadas en el tratamiento de aguas residuales también

se ha descrito un incremento del pH desde 7 a valores superiores a 9 (Lau y col. 1995).

a

b

Page 107: Micro Algas

107  

4.3.3. Análisis de Remoción de materia orgánica y nutrientes

4.3.3.1. Demanda Química de Oxigeno (DQO): La remoción de DQO fue

observada en el primer ensayo en los tratamientos y el control con diferencias

significativas (p<0,05). De acuerdo a los resultados obtenidos, se produjo una remoción

de 23,46±4,42mg.L-1, 9123,02±331,84mg.L-1, 5411,93±536,72mg.L-1 y de

11859,06±379,33mg.L-1 en el control, control (AR), AR y ARN respectivamente; lo cual

representó el 52,93; 97,66; 95,51 y 96,77% en el control, control (AR), AR y ARN

(Figura 33).

La demanda química de oxígeno presente al inicio del control autotrófico, de

23,46±4,42mg.L-1, obedece a la carga orgánica que aportan el inóculo mixto de

microalgas a inicio del experimento, y luego esta misma es removida en un 52,93% al

final del primer ensayo (Figura 33). Asimismo, el incremento de la DQO a

2.924,19±57,04 mg.L-1 para el control utilizado en el segundo ensayo, se debe a que el

inóculo procedía del mismo cultivo mixto utilizado en el primer ensayo, con lo cual era

más envejecido y en consecuencia, tendría un mayor aporte de materia orgánica,

producto del metabolismo de las microalgas y de las bacterias asociadas.

En el segundo ensayo, la remoción de DQO fue también elevada con un 90,60% en

NO, 95,09% en ARN, 96,13% en el Control, 97,50 en ARO, 97,80% en ARNO, 98,14 en

AR y 98,39% en el Control (AR), sin diferencia significativa entre los tratamientos y

Controles (p>0,05). En referencia a las concentraciones removidas se encontró el valor

más bajo de 2281,07±33,01mg.L-1 en NO y el más alto, de 14700,73±564,97mg.L-1 en

AR (Figura 34).

El elevado porcentaje de remoción obtenido en el control (AR), deduce una alta

eficiencia por parte del consorcio bacteriano asociado al agua residual, además del

efecto de volatilización, que también contribuiría a la reducción de la materia orgánica

existente. Para el primer ensayo se obtuvo un valor inicial de DQO de 9341,67±329,34

mg.L-1; mientras que para el segundo ensayo fue de 14.166±665,97 mg.L-1 (Tabla 25 y

Page 108: Micro Algas

108  

26). Esta diferencia se debe a que para cada ensayo se utilizaron muestras de

residuales de diferentes muestreos. Además, la muestra de residual para el segundo

ensayo fue sometida a agitación constante durante una semana y luego se seleccionó

el 25% y el resto completado con agua potable; lo cual significa, que aun así, el residual

del segundo ensayo, fue superior en DQO en 1,5 veces respecto a la utilizada en el

primer ensayo. Sin embargo, las remociones de un 97,66% y 98,39% en el primer y

segundo ensayo, ratifica la elevada eficiencia de los microorganismos heterótrofos en

reducir la DQO, y a la presencia adicional de microalgas propias del agua residual, que

se mantuvieron hasta el final del experimento; las cuales en conjunto contribuyeron a la

elevada remoción de la materia orgánica en el segundo ensayo.

 

Figura 33. Remoción de DQO [(mg.L-1) (%)] en el primer Ensayo. Control (AR): agua residual no inoculada con microalgas, AR: agua residual, ARN: agua residual +

Nitrofoska.

En relación a la reducción de DQO en los tratamientos con agua residual (AR, ARN,

ARNO) y en el control NO inoculados con las microalgas, también hubo altos

porcentajes de remoción, en orden descendente: control (AR)> AR> ARNO>

ARO>control >ARN >NO (Figura 34).

Page 109: Micro Algas

109  

Figura 34. Remoción de DQO [(mg.L-1) (%)] en el segundo ensayo. O: mezcla con lecitina, urea y almidón, NO: Nitrofoska + O, Control (AR), ARN: agua residual+

Nitrofoska, ARO: agua residual + O, ARNO: agua residual + Nitrofoska + O.

Por otra parte, se encontró también que, no hubo diferencia entre el control (AR) y AR;

ya que se removió 14.700,73 y 13.938,63mg.L-1, respectivamente. Lo que parece

deducirse que, aparentemente no es necesario adicionar el inóculo mixto de

microalgas, porque con tan solo la presencia del consorcio microbiano nativo (bacterias,

hongos, microalgas) en el agua residual, se logra la reducción de la DQO con

resultados similares (Figura 34 y Tabla 26). En cambio, cuando se le adicionó al agua

residual la mezcla orgánica (ARO), el fertilizante (ARN) y tanto la mezcla orgánica como

el fertilizante (ARNO), la remoción de la materia orgánica fue menor; aun cuando los

porcentajes de remoción fueron similares entre los tratamientos y el control (AR). Al

respecto, se ha encontrado al menos en este trabajo, una mayor remoción de DQO,

que en trabajos realizado con aguas residuales en Samara (Rusia), en el cual se

produjo una remoción del 51%, correspondiente a una reducción a 590±48,9mg.L-1 a

partir de 1200±66,5mg.L-1 (Safonova y col. 2004).

4.3.3.2. Sólidos Suspendidos Totales (SST) y Sólidos Suspendidos Volátiles

(SSV): Durante el desarrollo de los cultivos, en el primer y segundo ensayo,

Page 110: Micro Algas

110  

observamos una producción de microalgas en las paredes de las unidades de cultivos,

que se supone una cantidad adicionar de sólidos suspendidos. Es de considerar, que

una parte de los sólidos en suspensión están formados por detritus, restos de las

microalgas y bacterias; por lo que los procesos de colmatación en los diferentes

ensayos fue evidente. La remoción de SST en el primer ensayo (Figura 35), fue más

efectiva en AR (p<0,05), con una remoción de 148,00mg.L-1; equivalente al 87,06%;

seguido por el control con 42,00mg.L-1 y un 47,73%; luego ARN con 18,00mg.L-1 y

25,71% y por último, se produjo la menor remoción en el control (AR) con 30, 00mg.L-1

y con tan solo un 14,29%. Sin embargo, en sólidos volátiles, tanto AR como en el

control (AR), se obtuvo la misma remoción con un 70% (Figura 36). En relación a la

remoción de SST y SSV, en el segundo ensayo, aunque fue por lo general baja, se

encontró que en el control (AR), se redujo la mayor concentración, de 110 mg.L-1

(p<0,05), equivalente al 37,93%. En ARNO fue de un 12,00% y en NO, de un 50,00%

con 40,00 mg.L-1 (Figura 37 y 38). Roman y col. 2006. Reporto en lodo primario de la

digestión anaerobia de agua residuales disminución de SST en un 80% (20% en el

control) y de 25g/L a 5g/L, lo cual indica que solo las enzimas como celulasa y pronasa

tienen poco o no impacto sobre la solubilización de los sólidos.

 

Figura 35. Remoción de sólidos totales [SST-(mg.L-1) y SST-(%)] en el primer ensayo. 

Page 111: Micro Algas

111  

 

Figura 36. Remoción de sólidos volátiles [SSV-(mg.L-1) y SSV-(%)] en el primer ensayo. 

 

Figura 37. Remoción de sólidos totales [SST-(mg.L-1) y (SST-(%)] en el segundo ensayo.  

Page 112: Micro Algas

112  

Figura 38. Remoción de sólidos volátiles [SSV-(mg.L-1) y (SSV-(%)] en el Segundo ensayo.

En general cuando la remoción de sólidos totales de aguas residuales en condiciones

de laboratorio, tiende a no ser eficiente, en el sentido de que a pesar de una

participación importante de las bacterias del residual, también se acumulan productos

de su metabolismo y el de las microalgas, con lo cual, puede existir remoción, pero a la

vez también hay producción de materia orgánica, que pasa a caracterizarse como

sólidos totales. En cambio, a cielo abierto, el efecto de la irradiación solar, lluvias y

mayor población bacteriana, puede contribuir a una remoción más efectiva de los

sólidos totales. No obstante, la biota presente en las lagunas de estabilización

incrementa, la producción de sólidos totales. Así se ha relacionada a las microalgas,

como influyentes en el mantenimiento de elevada carga de SST y al respecto, se ha

descrito un estudio realizado con aguas residuales industriales de la ciudad de

Hamadan en Iran, en el cual se demostró una correlación entre la concentración de

sólidos totales y microalgas. Además, de lograr una remoción del 100% de microalgas

y del 99.5% de SST, después de aplicar el método de electro-coagulación a las aguas

residuales del sistema (Azarian y col. 2007).

Page 113: Micro Algas

113  

4.3.3.3. Nitrógeno (Nitrógeno Total Kjeldahl): La remoción de Nitrógeno en el

primer ensayo fue superior en los cultivos con agua residual inoculados con microalgas

(AR), respecto al control autotrófico y al control de agua residual no inoculado con

microalgas. Es decir, la remoción se presento en el siguiente orden descendente: AR

(99,98%) > ARN (98,36%) >Control-AR (65,56%) >Control (22,37%) (Figura 39), con

diferencia significativa (p<0,05), en relación a los dos controles. Entre los resultados

más sorprendentes, se reflejan los obtenidos en la remoción de nitrógeno en AR, ya

que a partir de 291.200,00±1.400,00mg.mL-1 hubo una reducción hasta

70,93±6,47mg.mL-1 (Tabla 25) de nitrógeno; lo cual representó un 99,98% de remoción.

En el segundo ensayo (figura 40), se produjo una remoción del 67,35% para el control y

del 89,60% en el control (AR), siendo estos los valores más bajos (p<0,05) respecto a

los demás tratamientos. El valor más alto fue en ARNO con 99,58%, pero sin diferencia

significativa (p<0,05) en cuanto a NO, AR, ARN, ARO y ARNO, siendo estos

subconjuntos homogéneos. 

En el tratamiento que hubo la menor remoción de nitrógeno fue en NO, con

872,1±11,83mg.L-1; mientras que, la más elevada de 9.328,85±562,24mg.L-1 se produjo

en ARNO (Tabla 26). Es posible que, la adición del fertilizante y de la mezcla orgánica

al agua residual, contribuyo al crecimiento de la población de bacterias inherentes al

residual, y al de las microalgas y sus bacterias asociadas, como para que de manera

sinergística asimilaran las diferentes formas de nitrógeno para su crecimiento; además

del que pudo haber sido volatilizado, como para haberse consumido casi el total del

nitrógeno (99,58%) presente al inicio del experimento.

A pesar de que la remoción de la DQO en el control con solo agua residual (AR) fue

más eficiente que cuando el agua residual fue inoculada con el cultivo mixto de

microalgas, para el caso de la remoción del nitrógeno fue lo contrario. Es decir, en el

control (AR) se inició con una concentración de nitrógeno de 4.200,00±280,00mg.L-1 se

finalizó con un contenido de 429,33±140,93mg.L-1; lo cual representó un 89,60%. Sin

embargo, en el cultivo ARNO, con la mayor concentración de nitrógeno de todos los

Page 114: Micro Algas

114  

tratamientos, la remoción de nitrógeno supero todas las expectativas, se revela como

uno de los resultados más interesantes de este estudio.

 

Figura 39. Remoción de Nitrógeno Kjeldahl [(mg.L-1), (%)] en el primer ensayo.

Figura 40. Remoción de Nitrógeno Kjeldahl [(mg.L-1), (%)] en el segundo ensayo.

Page 115: Micro Algas

115  

Tabla 25. Concentración inicial y final de DQO, nitrógeno, fósforo, grasas y aceites (mg.mL-1) en el Primer ensayo. Nutriente mg.mL-1

DQO Inicial DQO Final Nitrógeno inicial Nitrógeno Final Fósforo Inicial Fosforo final A. y G. Inicial

A. y G. Final

Control 44,13±3,74 20,66±2,22 1418,67±8,08 1101,33±21,39 277,59±20,13 158,65±25,13 0,00 0,00

Control (AR) 9341,67±329,34 218,65±5,67 168,00±56,00 58,40±2,58 56,00±11,20 17,57±0,60 580,00 180,00

AR 5661,67±486,93 249,73±54,43 291200,00±1400,00 70,93±6,47 258,13±4,08 14,86±1,55 63,89 20,86

ARN 12267,96±377,91 408,91±100,47 6626,67±168,00 108,27±6,47 995,43±43,57 51,60±0,20 85,00 10,86

Control: agua destilada con Nitrofoska, control (AR): agua residual sin microalgas, (AR): agua residual+microalgas, (ARN): agua residual con Nitrofoska.

Tabla 26. Concentración inicial y final de DQO, nitrógeno, fósforo, grasas y aceites (mg.mL-1) en el Segundo ensayo. Nutriente mg.mL-1

DQO Inicial DQO Final Nitrógeno inicial Nitrógeno Final Fósforo Inicial Fosforo final A. y G. Inicial

A. y G. Final

Control 2924,19±57,04 113,19±4,44 992,51±14,00 324,05±2,59 760,43±6,01 386,17±31,59 0,00 00,00

Control (AR) 14166±665,97 227,53±31,64 4200,00±280,00 429,33±140,93 52,96±2,36 24,59±1,37 212,00 180,00

NO 2517,59±30,21 236,52±2,83 893,01±21,39 20,91±2,59 309,31±4,29 133,90±13,22 530,00 28,00

AR 14978,83±570,32 278,10±26,20 5600,00±280,00 34,35±2,59 140,38±2,58 94,64±3,09 110,00 18,00

ARN 10690,53±285,97 525,20±1,77 5169,18±161,66 40,32±0,00 355,86±0,43 154,39±6,18 206,00 20,50

ARO 9591,17±394,06 239,60±31,16 5878,50±427,71 34,35±2,59 220,65±0,86 71,06±14,25 432,00 12,00

ARNO 11073,03±155,01 243,97±25,78 9367,68±560,00 38,83±2,59 551,31±1,08 138,94±3,78 460,00 4,00

Control: agua destilada con Nitrofoska, control (AR): agua residual no inoculada con microalgas , (AR): agua residual+microalgas, NO: Nitrofoska y O (mezcla orgánica), (ARN): agua residual +Nitrofoska, (ARO): agua residual y O (mezcla orgánica), ARNO: agua residual + Nitrofoska + mezcla orgánica, (G y A): grasas y aceites. Concentración inicial: al inicio del experimento. Concentración final: al finalizar el experimento.

Page 116: Micro Algas

116  

En diversos estudios ya se ha demostrado, altas eficiencias en la remoción de nitrógeno

de aguas residuales. Así, efluentes de granjas de cerdos con alta carga de nutrientes e

inoculadas con las microalgas Microspora willeana, Ulothrix ozonada, Rhizoclonium

hieroglyphicum y Oedogonium sp. han reportado una remoción del 90%, equivalente a

una cantidad mayor a 1000mg.l-1 de nitrógeno total (Kebede y col. 2006). Por otro lado,

Chacón y col. (2006); encontraron remociones de nitrógeno amoniacal (100%) en aguas

residuales urbanas cultivadas con Chlorella sp. y Scenedesmus sp.

Entre otros trabajos, Andrade, (2007) también reporto remociones de 95,49% y de

99,78% nitrógeno amoniacal y de nitratos de aguas residuales con Scenedesmus sp.

En cuanto a las diferentes fuentes de nitrógeno existentes en los medios de cultivo, se

ha descrito una asimilación preferencial en el siguiente orden (N-NH4+)>(N-NO2

-)>(N-

NO3-)>Nitrógeno orgánico simple (como urea y aminoácidos). Es decir, la microalga

consumirá en primer lugar el NH4+ en función del grado de reducción de las diferentes

fuentes de nitrógeno, debido al gasto energético requerido para asimilar las fuentes

más oxidadas (Lau y col. 1995; Morales, 1996).

Voltolina y col. (2005) obtuvieron una remoción de Nitrógeno 43,7% utilizando una

dilución del 30% de agua residual artificial y luego a una dilución del 40%, la remoción

disminuyo a 26,4% con cultivo semicontinuo de Scenedesmus obliquus. No obstante,

en el presente estudio se utilizó una dilución del 25% del residual, produciéndose una

remoción de nitrógeno de 99,17% (AR).

4.3.3.4. Fósforo Total: La remoción de fosfatos en el primer ensayo (Figura 41)

alcanzó un 98,50% y 94,24% en ARN y AR respectivamente y ambos con diferencia

significativa (p>0,05) respecto a los controles. La mayor cantidad fue removida en ARN

y presento una relación directa con el mayor crecimiento microalgal presentado en este

tratamiento. Sin embargo, no se encontró relación directa entre la remoción de fosfato

y los tratamientos restantes. El control presentó el valor más bajo con

118,94±5,10mg.L-1 y 43,09% de remoción tanto en concentración como en el

porcentaje.

Page 117: Micro Algas

117  

  

Figura 41. Remoción de Fosfatos [(mg.L-1), (%)] en el primer ensayo.

En el segundo ensayo (Figura 42) observamos que los valores mayores de remoción de

fósforo fueron alcanzados en ARNO, con 412,38±2,71mg.L-1 y 74,80%, ARO con

149,60±15,11mg.L-1 y 67,78%, y NO con 175,41±56,74mg.L-1 y 56,74% y ARN con

201,48±5,75mg.L-1 y 56,62% respectivamente, sin diferencia significativa (p>0,05) entre

los mismos. En cambio, los controles presentaron los valores más bajos con una

remoción de 374,26±49,20; 45,74±5,67 y 28,37±3,74mg.L-1, equivalentes a un 53,43,

49,20 y 32,54% y para el control (AR), control autotrófico y AR.

En estos dos ensayos observamos que la remoción de fosforo se evidencio mejor en

los tratamientos en donde el agua residual fue enriquecida con Nitrofoska y la mezcla

orgánica, indicándonos que las bacterias en estas agua residuales tienen un papel

importante en la remoción de este parámetro. No obstante; al observar el tratamiento

en donde están las microalgas y bacterias con un medio enriquecido hay mayores

remociones de este parámetro, como es el caso de ARN en el primer ensayo y ARNO

en el segundo ensayo.

Page 118: Micro Algas

118   

  

Figura 42. Remoción de Fosfatos [(mg.L-1), (%)] en el segundo ensayo.

Es conocido que, la eliminación de los fosfatos del agua residual tratada mediante

sistemas biológicos, como en el caso de las microalgas tiene lugar por asimilación de

las mismas. Así mismo, la actividad fotosintética diurna también contribuye a la

eliminación de este nutriente, ya que al elevar el pH del líquido de mezcla, produce la

precipitación del mismo (El Halouani y col. 1993). Estudios anteriores realizados con

aguas residuales urbanas colectadas del sistema A de lagunas de estabilización de la

Universidad del Zulia, Venezuela, las microalgas Chlorella sp. y Scenedesmus sp.

registraron remociones de fosfato en el orden de 2,40mg.L-1 (44,0%) y 2,65mg.L-1

(48,7%), respectivamente, en un periodo de 27 días (Chacón y col. 2004). De igual

forma en el tratamiento aplicado a aguas residuales del sistema B del mismo Sistema

de lagunas utilizando la microalga Chlorella sp. se logró una remoción máxima de

12,6mg.L-1 representado el 73,5% de la concentración inicial (Andrade y col. 2002).

Andrade, (2007) en los tratamientos a aguas residuales del sistema B de las lagunas

(CIA-LUZ) B3 y las Lagunas Piscícolas enriquecidas con medio de cultivo comercial

alcanzaron las mayores remociones de este parámetro con 1,83mg.L-1 (91,04%) y

1,65mg.L-1 (86,39%).

Page 119: Micro Algas

119  

El tratamiento de aguas residuales de cerdo con alta carga de nutrientes también ha

sido reportado, mediante la utilización de microalgas filamentosas (Microspora willeana,

Ulothrix ozonada, Rhizoclonium hieroglyphicum y Oedogonium sp.), y para lo cual se

obtuvieron eficiencias de remoción de fósforo entre 68 y 76%; lo que equivale a

cantidades entre los 231,2 y 258,4mg.L-1. Estos resultados, permitieron sugerir que el

tratamiento con microalgas es eficiente para la depuración de efluentes con alta carga

de nutrientes (Kebede y col. 2006).

Por otra parte, Lau y col. (1995), demostraron que la capacidad de asimilación de

fosfato por Chlorella vulgaris no se redujo por la presencia de bacterias nativas; sino

que, por el contrario, ambas, bacterias y microalgas fueron capaces de captar y asimilar

fosfatos del agua residual y que además de este mecanismo, el fosfato pudo haber sido

eliminado del medio a través de la precipitación del mismo. De igual manera,

tratamientos con agua residual domestica (en tandem, con pre-muerte y microalga co-

inmovilizada (Chlorella sorokiniana y Chlorella vulgaris) contribuyeron a incrementar a

una remoción del 72% de fosforo en el agua residual (Hernández y col. 2006).

4.3.3.5. Aceites y Grasas: El análisis de aguas residuales derivadas de

actividades industriales de extracción o de procesamiento de materia prima rica en

grasas, es de suma importancia al momento de determinar, los niveles de remoción de

DQO y de grasas, en función del tiempo de residencia de los residuales, y de la

comunidad microbiana existente en las lagunas de estabilización respectiva. Es por ello

que, también se sometió a evaluación el grado de reducción de grasas y aceites en los

cultivos con los diferentes tratamientos. Así, observamos en el primer ensayo, que la

mayor remoción se produjo en el control (AR) con 400mg.L-1; lo que equivale a un

68,97%. Para el caso de AR y ARN hubo una remoción de 43,03mg.L-1 y 74,14mg.L-1,

equivalentes a 67,35% y 87,23% respectivamente con diferencia significativa (p<0,05) y

de igual forma en los diferentes tratamientos con diferencia significativa (p<0,05) con

respecto al control (Figura 43).

Page 120: Micro Algas

120  

En la figura 44, observamos que para el segundo ensayo, este parámetro obtuvo la

mayor remoción en los tratamientos de NO y ARNO con 502mg.L-1, 456,00mg.L-1 y

94,72% y 99,13% respectivamente, con respecto al control (AR) y AR en donde se

obtuvo los valores más bajos de remoción con 32,00mg.L-1 y 15,09% y 92,00mg.L-1 y

83,64%, observándose diferencia significativa (p<0,05) entre todos los tratamientos.

La remoción significativa de residuales de aceite de oliva se ha reportado en sistemas

de tratamiento de residuales industriales y realizado por filtros de arena, con una

concentración de 7,5±1,03mg.L-1 a la entrada y de 0.3±0,07mg.L-1, a la salida,

obteniéndose una reducción del 96%. En este estudio se demostró la participación de

Lyngbia, Microcoleus chthonoplastes, Phormidium corium, Phormidium sp., Oscillatoria

salina, Plectonema terebrans y Aphanocapsa sp., en asociación con bacterias

heterotróficas (Safonova y col. 2004).

  

Figura 43. Remoción de aceites y grasas [(mg.L-1), (%)] en el primer ensayo.

Page 121: Micro Algas

121  

Figura 44. Remoción de aceites y grasas [(mg.L-1), (%)] en el segundo ensayo.

Bhumibhamon y col. (2002), estudiaron dos grupos de bacterias (cultivos individuales–

cultivos mixtos) productores de lipasas, habiendo mayor remoción de DQO y Aceites y

grasas (81-99% y 73-88% respectivamente) con cultivos simples (cepas KUL8

Acinetobacter sp., KUL39 Bacillus sp. y KLB1 Pseudomonas sp.) durante 7 días de

tratamiento; las aguas residuales de palma de aceite y aguas residuales de panadería

utilizadas, demostraron que las cepas KUL8 y KUL39 remueven grasas y aceite en una

proporción de 87,7% y 80,6% en aguas residuales de palma de aceite, mientras que

solo el 70% y 64% en aguas residuales de panadería dentro de 48 horas de

tratamiento.

4.3.4. Presencia de exoenzimas

La presencia de exoenzimas en los diferentes cultivos con el agua residual inoculada

con microalgas y en el control, fue confirmada para amilasa, lipasa, celulasa y ureasa

(Tabla27). En cambio, en el control (AR), no inoculado con microalgas, solo se apreció

halos de actividad para amilasa y lipasa.

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122  

Tabla 27. Exoenzimas (halo-cm) presentes en los diferentes tratamientos del primer ensayo.

TRATAMIENTO AMILASA LIPASA* CELULASA UREASA

Control 0,8 0,5 0,4 +++

Control (AR) 0,4 0,3 - -

AR 0,5 0,6 0,4 ++

ARN 0,9 0,2 0,1 +

LIPASA*: yema de huevo, Ureasa: intensidad del color rojo-naranja.

En el segundo ensayo, se ratificó que el control (AR), solo registra una ligera actividad

de amilasa y celulasa; lo cual evidencia que la presencia de las microalgas inoculadas

al residual, favorece la producción significativa de las enzimas analizadas (Tabla 28).

Para el caso de la prueba de la ureasa, dicha actividad fue positiva después del tercer

día de incubación con muestras procedentes de los cultivos ARO y ARNO y AR;

mientras que en los otros tratamientos se detectó al quinto día.

Tabla 28. Exoenzimas (halo-cm) presentes en los diferentes tratamientos del segundo ensayo.

TRATAMIENTO AMILASA LIPASA* LIPASA** CELULASA UREASA

Control 1,6 1,2 0,7 - ++

Control (AR) 0,3 - - 0,3 -

NO 0,4 1,1 0,4 0,9 ++

AR 1,8 1,3 0,5 1,2 +++

ARN 1,8 1,2 0,3 0,1 ++

ARO 1,3 0,7 0,5 0,1 ++++

ARNO 1,5 1,6 0,5 0,1 ++++

Lipasa*: medio sólido con yema de huevo, Lipasa**: medio sólido con lecitina comercial (Val natural®), Ureasa: intensidad del color rojo-naranja.

Hosetti y Patil (1988, 1992), han determinado la presencia de catalasa, proteasa,

fosfatasa y amilasa en lagunas de estabilización de aguas residuales domésticas en

tres lagunas y comparadas durante los primeros 9 días y 60 días. Entre otros

resultados, reconocieron que las mayores actividades se encontraron en la laguna 3,

durante el periodo de pre-estabilización y de estabilización. Además, indicaron que las

actividades de catalasa, proteasa y amilasa fueron las más elevadas durante el período

de pre-estabilización, en relación a las actividades detectadas en el periodo de

estabilización.

Page 123: Micro Algas

123  

Es de destacar que, el tratamiento biológico de aguas residuales está relacionado con

los microorganismos existentes y sus enzimas asociadas, tanto en condiciones

aeróbicas como en anaeróbicas. Por ejemplo, las proteasas y glicosidasas

desempeñan un papel esencial en la degradación de lodos residuales; pero sus

actividades están condicionadas a los niveles de oxígeno, fuentes de azufre y de otros

sustratos. Por ejemplo, la adición de almidón hidrolizado estimuló la actividad de las ß–

glicosidasas en los lodos activados (Nybroe y col. 1992). En los exopolisacáridos

asociados a los flóculos producidos durante los procesos de biodegradación de aguas

residuales, se han detectado un 17% de aminopeptidasas, 5% de α-glucosidasas, 23%

de proteasas y un 44% de α-amilasas (Cadoret y col. 2002); lo que corrobora la

importancia de los microorganismos productores de estas exoenzimas para incrementar

la velocidad de remoción de proteínas, grasas, ácidos nucleicos, exopolisacáridos y

almidones presentes en aguas residuales. Actualmente, se continua investigando

sobre el efecto de los procesos de transferencia de masa, intermediarios metabólicos,

exopolisacáridos, aceptores de electrones, pH y temperatura en las diferentes enzimas

hidrolíticas que incrementan la remoción de los componentes en aguas residuales

(Burgess y Pletschke, 2008). De acuerdo a los resultados obtenidos en nuestra

experiencia, las exoenzimas asociadas a microorganismos fotosintéticos y heterótrofos

de aguas residuales, deben de ser más estudiadas y lograr, su mayor expresión para

incrementar la velocidad de remoción de residuales.

4.3.5. Población de bacterias asociadas a los cultivos

Con la finalidad de complementar los factores involucrados en los procesos de

remoción de N, P, DQO y de grasas, se determinó la población de bacterias

heterotróficas en cada uno de los tratamientos, tanto al inicio como al final del segundo

experimento. Los resultados indican que en ARN se alcanzó la mayor número de

colonias de bacterias, con 25x105 UFC/mL (Tabla 29); mientras que en el resto de los

cultivos la población bacteriana estuvo en el siguiente en orden descendente:

ARN>control=ARNO>ARO>NO>AR> Control (AR).

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124  

Se observa, igualmente que, en todos los tratamientos hubo un ascenso del número de

bacterias, desde el inicio hasta el final del ensayo. Posiblemente, debido al aumento de

la disponibilidad de nutrientes que se fueron liberando, como producto de la

biodegradación de los compuestos en dichos medios de cultivos. Efecto observado

también en el control autotrófico, que con tan solo el fertilizante añadido y el inóculo

mixto de microalgas, se estimuló el crecimiento bacteriano asociado a estas microalgas

(Tabla 29). En cambio, tanto en ARNO como en ARO, se esperaba una mayor

población bacteriana, debido a la carga bacteriana asociada al agua residual (25%); a la

adición del fertilizante y a la mezcla orgánica (ARNO), los cuales estimularían aun más

el crecimiento bacteriano, conforme se fuese desarrollando el cultivo. No obstante, el

exceso de sustrato o de carga orgánica existente, pudiese haber inhibido el incremento

de bacterias a niveles más elevados que en el control.

Tabla 29. Población de bacterias (UFC/mLx105) al inicio y final del segundo ensayo.

TRATAMIENTOS INICIO FINAL

Control 0,03 19,4

Control (AR) 0,05 2,70

NO 0,04 10,9

AR 2,99 6,40

ARN 2,84 25,0

ARO 3,00 17,3

ARNO 2,91 19,3

Tal es el caso del control (AR) y AR, con las más bajas densidades de bacterias, que

coinciden con las más elevadas concentraciones iniciales de DQO de 14.166±665,97 y

14.978,83±570,32mg.mL-1 respectivamente (Tabla 26). Esto parece deducir, que la alta

carga orgánica inhibió desde un inicio la proliferación de la población bacteriana;

mientras que al adicionársele al agua residual el fertilizante y la mezcla orgánica, se le

suministró nutrientes mas disponibles para el crecimiento bacteriano, o que ambos

ingredientes contribuyeron a incrementar la biodegradación de la materia orgánica,

como para hacer mas disponibles los nutrientes liberados, para las bacterias e incluso

para el crecimiento microalgal. Razón por la cual, se incrementaría la población de

bacterias, tanto de las asociadas, como las inherentes al agua residual. Y de esta

Page 125: Micro Algas

125  

manera, es como se puede explicar que, en NO, ARO, ARNO y ARN fue incrementando

la población bacteriana. Pero, con una mayor estimulación cuando se adicionaba el

fertilizante.

Los resultados obtenidos en el primer y segundo ensayo, reflejan que todos los factores

involucrados en el proceso de remoción de DQO, nitrógeno, fósforo, sólidos totales,

grasas y aceites contenidos en el agua residual derivada de la extracción del aceite de

palma, ejercen influencia sobre el crecimiento, producción de pigmentos y exoenzimas

en las microalgas; así como en el crecimiento bacteriano. Por otra parte, la remoción

de DQO pareció no depender de la adición de microalgas; ya que en su ausencia y

presencia hubo remociones de 14700,73±564,97 y 13.938,63mg.L-1 en el control (AR) y

A, lo cual representó un 98,14 y 98,39% respectivamente.

En cuanto al fósforo, se logró con el agua residual enriquecida con fertilizante y la

mezcla orgánica, la mayor remoción con el 74,80% (ARNO), un 67,78% en ARO y un

56,62% en ARN, cuando fue comparada a los controles (AR), autotrófico y AR. Las

grasas y aceites, también fueron removidas en mayor medida en ARNO con un 99,13%

(p<0,05), y con la eficiencias más baja en el control (AR). El tratamiento preliminar al

agua residual; así como su enriquecimiento con nutrientes orgánicos e inorgánicos,

también condicionan la eficiencia de remoción en cuanto a sólidos totales; ya que las

condiciones del segundo ensayo permitieron una mejor remoción que en el segundo

experimento. Por otra parte, la presencia de exoenzimas y de las bacterias asociadas

en los diferentes tratamientos, contribuyeron en menor o mayor grado a promover la

remoción de la DQO, Nitrógeno y fósforo; así como a interpretar el crecimiento y

desempeño de las microalgas en los diferentes tratamientos.

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126  

Conclusiones

Page 127: Micro Algas

127  

En el Sistema de Estabilización de la planta extractora de aceite de palma se

identificaron 27 especies de microorganismos fotosintéticos; de las cuales el género

Chlorella sp., fue la más abundante. Asimismo, fueron aisladas y cultivadas 9 cepas de

microalgas (Chlorella sp. 1, sp. 2 y sp. 3., Scenedesmus sp. 1 y S. ecornis,

Chlamydomonas sp., Chlorococcum sp., Oocystis sp. y Euglena sp.) y 2 de

cianobacterias (Geitlerinema sp. y Synechocystis sp.).

De estos cultivos unialgales, se identificaron y aislaron 13 cepas de bacterias,

asociadas a los cultivos de Chlorella sp. 1 y sp. 2 (Corynebacterium durum y Bacillus

sphaericus), Scenedesmus sp. (Corynebacterium durum, Delftia acidovorans y

Staphylococcus hominis) Oocystis sp. (Bacillus sphaericus, Actinobacillus

actinomycetemcomitans, Pasteurella stomatis y Pasteurella aerogenes), Chlorococcum

sp. (Delftia sp. C-13 y C-42) y Geitlerinema sp. (Staphylococcus hominis,

Stenotrophomonas maltophilia, Brevundimononas diminuta, cepa C-12 Blanca, C-12

Naranja).

Los elevados valores de nutrientes, materia orgánica, aceites y grasas del

sistema de estabilización, reflejan un efecto sobre la adaptación, diversidad y

abundancia de los microorganismos fotosintéticos. La influencia del pH, nitrógeno,

fósforo y DQO parecen determinar en mayor grado, el crecimiento de las microalgas y

cianobacterias.

Chlorella sp. 1, Chlorella sp. 2, Chlorella sp. 3, Synechocystis sp., Oocystis sp. y

Geitlerinema sp. demostraron actividad de amilasa, lipasa, proteasa, fosfatasa, celulasa

y ureasa; sugiriendo estos resultados que las cepas de Chlorella sp., Oocystis sp.,

Scenedesmus sp., Chlorococcum sp. y Geitlerinema sp. pueden ser utilizadas para el

tratamiento de residuales enriquecidos con almidones, proteínas y grasas.

Los diferentes tratamientos involucrados en los experimentos, para el caso de los

controles (autotrófico, AR y NO), y de los cultivos con aguas residuales (AR, ARN, ARO

y ARNO), permitieron deducir que, la remoción de DQO, parece no depender, al menos

Page 128: Micro Algas

128  

de las microalgas. En cambio, fue más efectiva la remoción del fósforo y de las grasas

cuando dicho residual era más enriquecido con nutrientes orgánicos e inorgánicos

(ARNO). De igual manera, con el agua residual enriquecida (AR, ARN, ARO y ARNO)

se remueve hasta un 99,58%, en relación a los controles.

El tratamiento preliminar al agua residual así como su enriquecimiento con

nutrientes orgánicos e inorgánicos, también condicionan la eficiencia de remoción en

cuanto a sólidos totales; ya que las condiciones del segundo ensayo permitieron una

mejor remoción que en el primer ensayo.

Los resultados obtenidos en condiciones de laboratorio reflejan que, todos los

parámetros fisicoquímicos analizados ejercen influencia sobre la población de bacterias

y sobre el crecimiento, producción de pigmentos y exoenzimas en las microalgas; las

cuales contribuyeron a promover la remoción de la DQO, Nitrógeno, fósforo, grasas y

aceites con alta eficiencia.

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129  

Recomendaciones

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130  

Monitorear el funcionamiento de las Lagunas de estabilización de la planta

extractora de aceite exhaustivamente, a fin de determinar la dinámica poblacional y

distribución de microorganismos fotosintéticos y heterotróficos para valorar su

contribución en los procesos de remoción de los residuales en función de los

parámetros fisicoquímicos.

Diseñar sistemas de cultivos de microalgas a diferentes proporciones de agua

residual de plantas extractoras de aceite a fin de establecer cual estimula un mayor

crecimiento que permita mejorar la calidad del agua a la salida del sistema.

Proponer a la empresa un estudio para utilizar la biomasa microalgal como

biofertilizante en los centros de propagación de la palma africana o de otros rubros

agrícolas.

Realizar estudios conducentes a la sobreproducción de exoenzimas de

microalgas y sus bacterias asociadas, a fin de aplicar inóculos altamente productores

para catalizar la velocidad de remoción en aguas residuales y para expandir su uso en

la industria.

Proponer a la empresa extractora de aceite de palma un estudio definitivo para

validar consorcios microbianos mixtos que aceleren la remoción de DQO, N, P y el

exceso de grasas y aceites en función del tiempo.

Page 131: Micro Algas

131  

Índice de Referencias

Page 132: Micro Algas

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Índice de Figuras

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Pág.

Figura 1. Ciclo de oxigenación fotosintética de aguas residuales. Salazar,

(2005).

18

Figura 2. Mecanismo de acción de las enzimas hidrolíticas sobre la materia

orgánica. (1) Limitación de la transferencia de masa, (2) EPS, (3)

Intermediarios metabólicos, (4) Condiciones del aceptor de electrones, (5) pH

y Temperatura. Todos tienen un efecto sobre la actividad de las enzimas

involucradas en el tratamiento de aguas residuales. Burgess y Pletschke,

(2008).

22

Figura 3. Sistema de Tratamiento de aguas residuales de las Lagunas de

Estabilización de Palmas Oleaginosas de Casacará Ltda-Colombia.

27

Figura 4. Cultivos en condiciones de laboratorio. 40

Figura 5. Agua residual antes de ser vertidas a las Lagunas de Estabilización. 41

Figura 6. Primer Ensayo (Tratamientos). 42

Figura 7. Segundo Ensayo (Tratamientos). 43

Figura 8. Micrografias (400x). (1) Primer Muestreo. a. Scenedesmus sp. b.

Oscillatoria sp. c. Oocystis sp. d. Pandorina sp. e. Lyngbya sp. f. Chroococcus

sp. (2) Segundo muestreo. g. Thiopedia sp. h. Pseudoanabaena sp. i.

Euglena sp. j. Monoraphidium sp. k. Synechococcus sp. l. Ankistrodesmus sp.

(3) Tercer muestreo. m. Haematococcus sp. n. Geitlerinema sp. o.

Kirchineriella lunaris.

54

Figura 9. Micrografias (400x). (4) Cuarto Muestreo. a. Navicula sp. b.

Synechocystis sp. c. Phacus sp. d. Nitzschia sp. e. Merismopedia sp.

56

Figura 10. a. Crecimiento comparativo de microalgas Chlorophyta. b.

Crecimiento de la cianobacteria Geitlerinema sp., seguido mediante turbidez.

59

Figura 11. Corynebacterium durum. 68

Figura 12. Bacillus sphaericus. 68

Figura 13. B. diminuta bacilo gramnegativo. 73

Figura 14. Colonias de Stenotrophomonas maltophilia. 74

Figura 15. Población de microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintéticas

en Lagunas de estabilización de una Planta extractora de aceite de palma,

75

Page 149: Micro Algas

149  

orden cronológico de los muestreos. Muestreo 1: junio-2008, muestreo 2:

Septiembre 2008, muestreo 3: diciembre 2008, muestreo 4: mayo 2009.

Figura 16. Abundancia de microalgas, cianobacterias y bacterias

fotosintéticas según los sitios de muestreos en lagunas de estabilización de

una Planta extractora de aceite de palma, de acuerdo al orden de los

muestreos. a. Muestreo 1. b. Muestreo 2. c. Muestreo 3 y d. Muestreo 4.

76

Figura 17. Grasas y aceites (mg.L-1) en las lagunas de estabilización de

acuerdo a los muestreos.

76

Figura 18. Presencia de amilasa en medio sólido (almidón al 0,2%) en

microalgas y bacterias asociadas. a. Oocystis, b. Chlorella, c. Scenedesmus,

d. cepa bacteriana C-12 Naranja, e. A. actinomycetemcomitans, f. S.

maltophilia.

77

Figura 19. Variación de la actividad amilasa (U/g) en microalgas 79

Figura 20. Lipasa en microalgas. Medio Yema de Huevo: a. Chlorella sp.1, b.

Chlorococcum, c. Oocystis. Medio Tween 80: d. Euglena, e. Oocystis, f.

Chlorella sp. 3.

83

Figura 21. Presencia de lipasa en bacterias asociadas. Medio Yema de

Huevo: a. Stenotrophomonas maltophilia, b. Staphylococcus hominis, c.

Actinobacillus actinomycetemcomitans, Medio Tween 80: d. cepa C-12

Naranja, e. cepa C-42 Bacillus sphaericus, e. Staphylococcus hominis.

88

Figura 22. Licuefación de la gelatina en microalgas. 88

Figura 23. Celulasa en las microalgas a. Chlorella sp.1, b. Scenedesmus sp.

c. Euglena sp.

89

Figura 24. Presencia de ureasa en las microalgas Synechocystis sp. S.

ecornis, Chlamydomonas sp. Geitlerinema sp. Chlorella sp.2 Scenedesmus

sp. Oocystis sp. Euglena sp. Chlorococcum sp. y el Control.

93

Figura 25. Sistema de tratamiento aguas residuales (Extractora de Aceite de

Palma).

99

Figura 26. Crecimiento de microalgas en función de la edad del cultivo con

agua residual. Control: AR: agua residual, ARN: agua residual enriquecida

con Nitrofoska.

100

Figura 27. Variación del contenido de clorofila (µg.ml-1) con la edad del 100

Page 150: Micro Algas

150  

cultivo.

Figura 28. Variación del contenido de carotenoides (µg.ml-1) con la edad del

cultivo.

101

Figura 29. Densidad celular (x106 cel.mL-1), clorofila y carotenoides (µg.mL-1)

del cultivo mixto de microalgas en control, AR y ARN.

102

Figura 30. Cultivo de microalgas en función de la edad del cultivo con

diferentes tratamientos. NO: Nitrofoska + O, AR: Agua residual, ARN: Agua

residual con Nitrofoska, ARO: Agua residual + O, ARNO: Agua residual

Nitrofoska + O.

103

Figura 31. Densidad celular (x106 cel.mL-1), clorofila y carotenoides totales

(µg.mL-1) del cultivo mixto de microalgas con los diferentes tratamientos.

105

Figura 32. Variación del pH durante el periodo experimental. a. Ensayo 1 b.

Ensayo 2

106

Figura 33. Remoción de DQO [(mg.L-1) (%)] en el primer Ensayo.

Control (AR): agua residual no inoculada con microalgas, AR: agua residual,

ARN: agua residual + Nitrofoska.

108

Figura 34. Remoción de DQO [(mg.L-1) (%)] en el segundo ensayo.

O: mezcla con lecitina, urea y almidón, NO: Nitrofoska + O, Control (AR),

ARN: agua residual+ Nitrofoska, ARO: agua residual + O, ARNO: agua

residual + Nitrofoska + O.

109

Figura 35. Remoción de sólidos totales [SST-(mg.L-1) y (SST-(%)] en el

primer ensayo.

110

Figura 36. Remoción de sólidos volátiles [SSV-(mg.L-1) y (SSV-(%)] en el

primer ensayo.

111

Figura 37. Remoción de sólidos totales [SST-(mg.L-1) y (SST-(%)] en el

segundo ensayo.

111

Figura 38. Remoción de sólidos volátiles [SSV-(mg.L-1) y (SSV-(%)] en el

Segundo ensayo.

112

Figura 39. Remoción de Nitrógeno Kjeldahl [(mg.L-1), (%)] en el primer

ensayo.

114

Figura 40. Remoción de Nitrógeno Kjeldahl [(mg.L-1), (%)] en el segundo

ensayo.

114

Page 151: Micro Algas

151  

Figura 41. Remoción de Fosfatos [(mg.L-1), (%)] en el primer ensayo. 117

Figura 42. Remoción de Fosfatos [(mg.L-1), (%)] en el segundo ensayo. 118

Figura 43. Remoción de aceites y grasas [(mg.L-1), (%)] en el primer ensayo. 120

Figura 44. Remoción de aceites y grasas [(mg.L-1), (%)] en el segundo

ensayo.

121

Page 152: Micro Algas

152  

Índice de Tablas

Page 153: Micro Algas

153  

Pág.

Tabla 1. Microalgas, cianobacterias y bacterias fotosintéticas más comunes

en Lagunas de Estabilización.

19

Tabla 2. Uso de microalgas para el tratamiento de aguas residuales en

lagunas de alta tasa de oxidación en diversos países.

19

Tabla 3. Uso de biomasa de microalgas cultivadas en aguas residuales. 20

Tabla 4. Composición química del medio de cultivo ALGAL. 29

Tabla 5. Composición química del fertilizante NITROFOSKA FOLIAR

(Insecticidas Internacionales, CA).

29

Tabla 6. Composición del medio BG11 (Rippka, 1988). 30

Tabla 7. Composición del medio organotrófico complejo. 33

Tabla 8. Microorganismos observados en los muestreos de las lagunas de

Estabilización.

57

Tabla 9. Microalgas y cianobacterias observados durante el periodo de

estudio en las Lagunas de Estabilización de una Planta extractora de aceite

de palma.

61

Tabla 10. Diversidad de microorganismos fotosintéticos en Lagunas de

estabilización.

62

Tabla 11. Características bioquímicas y diferenciales de Bacterias Gram-

positivas asociadas a las Microalgas.

63

Tabla 12. Caracterización bioquímica y de proliferación de las Bacterias

Gram-negativas asociadas a los cultivos de microalgas.

64

Tabla 13. DQO (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a cada

muestreo.

65

Tabla 14. SST (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a cada

muestreo.

65

Tabla 15. SSV (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a cada

muestreo.

69

Tabla 16. Nitrógeno Total (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a

cada muestreo.

72

Tabla 17. Fósforo Total (mg.L-1) en las lagunas estabilización de acuerdo a 78

Page 154: Micro Algas

154  

cada muestreo.

Tabla 18. Grasas y aceites (mg.L-1) en las lagunas de estabilización de

acuerdo a cada muestreo.

82

Tabla 19. Monitoreo del pH en las Lagunas de Estabilización. 83

Tabla 20. Amilasa en microalgas y bacterias asociadas. 85

Tabla 21. Lipasa en Microalgas. 87

Tabla 22. Lipasa en bacterias asociadas a microalgas, método en placa y

espectrofotométrico (p-NPP).

90

Tabla 23. Exoenzimas (proteasa, ureasa, celulasa y fosfatasa) en microalgas. 94

Tabla 24. Exoenzimas (Proteasa, Ureasa, Celulosa y Fosfatasa) en bacterias

asociadas a las microalgas.

95

Tabla 25. Concentración inicial y final de DQO, nitrógeno, fósforo, grasas y

aceites (mg.mL-1) en el Primer ensayo.

115

Tabla 26. Concentración inicial y final de DQO, nitrógeno, fósforo, grasas y

aceites (mg.mL-1) en el Segundo ensayo.

115

Tabla 27. Exoenzimas (halo-cm) presentes en los diferentes tratamientos del

primer ensayo.

122

Tabla 28. Exoenzimas (halo-cm) presentes en los diferentes tratamientos del

segundo ensayo.

122

Tabla 29. Población de bacterias (UFC/mLx105) al inicio y final del segundo

ensayo.

124