Micro-evolución genómica de Helicobacter pylori

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

Micro-evolución genómica de Helicobacter pylori

TESIS

Que para obtener el grado de:

MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA

Presenta EDGAR EDUARDO LARA RAMÍREZ

Reynosa, Tamaulipas, México, Febrero de 2010

Micro-evolución Genómica de Helicobacter pylori


AGRADECIMIENTOS

Al Instituto Politécnico Nacional, líder en educación tecnológica vanguardista en México

por brindarme las herramientas necesarias en mí desarrollo académico.

Al Centro de Biotecnológica Genómica por facilitarme sus instalaciones durante la

Maestría.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por otorgarme la beca para realizar mis

estudios de Maestría.

Al Programa Institucional de Formación de Investigadores del Instituto Politécnico

Nacional por la otorgarme la beca.

Al Espacio Común de Educación Superior por otorgarme la beca de movilidad Santander.


i

ÍNDICE

CONTENIDO PÁGINA

ABREVIATURAS .............................................................................................................................. iii

RELACIÓN DE CUADROS Y FIGURAS ................................................................................................. v

RESUMEN ...................................................................................................................................... vi

ABSTRACT .................................................................................................................................... viii

1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 1

2. ANTECEDENTES .......................................................................................................................... 3

2.1. Helicobacter pylori, bacteria patógena del humano ............................................................. 3

2.2. Dinámica de la infección, transmisión y prevalencia de H. pylori .......................................... 3

2.3. Fisiopatología de H. pylori y enfermedades asociadas .......................................................... 4

2.4. Genes de virulencia asociados a la patogénesis de H. pylori ................................................. 5

2.5. Genomas secuenciados de H. pylori ..................................................................................... 7

2.6. Comparación genómica de H. pylori .................................................................................... 8

2.7. Diversidad y evolución genómica en H. pylori .................................................................... 10

2.8. Los mecanismos de recombinación dirigen la micro-evolución de los genomas ................. 11

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................................................ 14

4. JUSTIFICACIÓN ......................................................................................................................... 15

5. HIPÓTESIS ................................................................................................................................ 16

6. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 17

6.1. Objetivo general ................................................................................................................ 17

6.2. Objetivos específicos ......................................................................................................... 17

7. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................................... 18

7.1. Características generales de las secuencias genómicas analizadas ..................................... 18

7.2. Comparación de la estructura genómica de H. pylori ......................................................... 18

7.3. Genoma núcleo (“Core genome”) ...................................................................................... 19

7.4. Análisis de las secuencias repetidas ................................................................................... 19

7.5. Análisis evolutivos basados en los genomas completos ..................................................... 20

7.6. Análisis de la recombinación intra-especies ....................................................................... 20

7.7. Análisis filogenético de los genes cagA y vacA ................................................................... 21

8. RESULTADOS ............................................................................................................................ 23


ii

8.1. Características generales de las secuencias genómicas analizadas ..................................... 23

8.2. Comparación de la organización génica de H. pylori ........................................................... 24

8.3. Zonas de plasticidad .......................................................................................................... 27

8.4. Estructura de las islas de Patogenicidad............................................................................. 28


8.6. Prevalencia de las secuencias repetidas ............................................................................. 32

8.7. Análisis de las repeticiones en tándem .............................................................................. 33

8.8. Reconstrucción del genoma ancestral de H. pylori ............................................................. 37

8.9. Análisis de la recombinación intra-especies de H. pylori .................................................... 40

8.10. Análisis de la recombinación intra-especies de los genes vacA y cagA.............................. 41

8. 11. Análisis filogenético de los genes vacA y cagA ................................................................ 44

9. DISCUSIÓN ............................................................................................................................... 48


9.2. Orden génico ..................................................................................................................... 50

9.3. Isla de patogénesis y Zonas de plasticidad ......................................................................... 53

9.4. Secuencias repetidas ......................................................................................................... 55

9.5. Naturaleza de las repeticiones en tándem ......................................................................... 56

9.6. Genoma Ancestral ............................................................................................................. 59

9.7. Recombinación intra-especies ........................................................................................... 60

9.8. Filogenia del gen cagA y vacA ............................................................................................ 61

10. CONCLUSIONES ...................................................................................................................... 64

11. RECOMENDACIONES .............................................................................................................. 66

12. REFERENCIAS ......................................................................................................................... 67

13. GLOSARIO .............................................................................................................................. 79

14. APÉNDICE ............................................................................................................................... 82

Apéndice 1. Lista de las cepas de H. pylori utilizadas para la comparación de la estructura

genómica. ................................................................................................................................ 82

Apéndice 2. Genes obtenidos a partir del genoma nucleó del género Helicobacter, exclusivos los

siete genomas de H. pylori. ...................................................................................................... 83

Apéndice 3. Genes limitantes de cada uno de los 35 bloques generados por MAUVE. .............. 85

Apéndice 4. Lista de cepas y los orígenes de cada una ellas que se utilizaron para el análisis de

recombinación y filogenético de los genes vacA y cagA. ........................................................... 91


iii

ABREVIATURAS

ADN: Ácido desoxirribonucleico.

ARN: Ácido ribonucleico.

EMBOSS: Conjunto de Programas Libres Europeos para análisis de Biología Molecular,

por sus siglas en inglés.

G+C: Guaninas más Citocinas.

IS. Secuencias de Inserción, por sus siglas en inglés.

kb: Kilobases.

LCB : Bloques Colineales Locales, por sus siglas en inglés.

MALT : Linfoma del Tejido linfoide Asociado a Mucosas, por sus siglas en inglés.

MGR: Rearreglos genómicos múltiples, por sus siglas en inglés.

MLST : Tipificación de múltiples locus, por sus siglas en inglés.

MAUVE: Alineamiento múltiple de genomas, por sus siglas en inglés.

Multi-MUMs : Uniones múltiples máximas, por sus siglas en inglés.

MUSCLE : Alineamiento múltiple de secuencias, por sus siglas en inglés.

NCBI : Centro Nacional para la Información Biotecnológica de EEUU, por sus siglas en

inglés.


iv

NH3. Amonio.

nt. Nucleótidos

ORF: Marco de lectura abierto, por sus siglas en inglés.

RAPD: ADN polimórfico amplificado al azar, por sus siglas en inglés.

RAT: Herramienta para analizar patrones de recombinación, por sus siglas en inglés.

RDP: Programa para detectar patrones de recombinación, por sus siglas en inglés.

PAI. Isla de patogenicidad, por sus siglas en ingles.

PFGE: Gel de electroforesis de campos pulsados, por sus siglas en inglés.

pb. Pares de bases.


v

RELACIÓN DE CUADROS Y FIGURAS

CONTENIDO PÁGINA

Cuadro 1. Genomas de H. pylori completamente secuenciados, utilizados para el análisis de los

arreglos genómicos. ....................................................................................................................... 8

Cuadro 2. Características generales de los genomas completamente secuenciados de la especie H.

pylori ........................................................................................................................................... 24

Cuadro 3. Distribución de las repeticiones exactas intra-genómicas en H. pylori ......................... 32

Cuadro 4. Distribución de las repeticiones en tándem (> 100 pb con 80 % de identidad en cada

copia). ......................................................................................................................................... 34

Cuadro 5. Matriz de permutación que indica el orden génico de los genomas de H. pylori y el orden

génico ancestral sugerido por MGR.............................................................................................. 38

Cuadro 6. Eventos y señales de recombinación identificados en los genes de virulencia y genes de

mantenimiento provenientes de diversas cepas de H. pylori. ......................................................... 40

Figura 1. Alineamiento de siete genomas de aislados de H. pylori………………………26

Figura 2. Alineamiento de las islas de patogenicidad de H. pylori………………………29

Figura 3. Diagrama de Venn representando el genoma núcleo del genero Helicobacter..31

Figura 4. Árbol filogenómico de Helicobacter pylori basado en la historia de las

inversiones…………………………………………………………………………………39

Figura 5. Resultado de la salida originada por el programa RAT para el gen cagA……...42

Figura 6. Resultado de la salida originada por el programa RAT para el gen vacA……...43

Figura 7. Árbol filogenético construido a partir de secuencias completas del gen cagA…46

Figura 8. Árbol filogenético construido a partir de secuencias completas del gen vacA ...47


vi

RESUMEN

La bacteria Helicobacter pylori (H. pylori), que coloniza de forma persistente el

estómago humano, exhibe altos niveles de diversidad genética, por lo que es un modelo

para estudiar el papel de la plasticidad genómica en un organismo procariote. H. pylori

tiene un genoma dinámico que le permite adaptarse al ambiente de su hospedero.

La comparación genómica permite determinar los reordenamientos y las relaciones

evolutivas entre los diferentes genomas de H. pylori. En este estudio, las secuencias

concatenadas del cromosoma principal de siete cepas de H. pylori (26695, J99, HPAG1,

G27, P12, shi470, B38) y secuencias de la isla de patogenicidad se alinearon con el

programa MAUVE con el objetivo de examinar el orden génico, la extensión de las

regiones de ADN en común, el genoma de núcleo y el grado de relación entre ellos.

Igualmente, se realizó un análisis del genoma ancestral, basado en la historia de las

inversiones con el programa MGR, un análisis de los patrones de recombinación entre

especies y un análisis filogénetico de los genes cagA y vacA.

Los resultados obtenidos indican que H. pylori evoluciona a consecuencia de la

presión de selección positiva y negativa, lo que le permite adaptarse al huésped humano en

la fase de infección inicial y durante el proceso de establecimiento que produce los

síntomas clínicos de la enfermedad. Además, los mecanismos de recombinación intra-

genómicos e inter-genómicos son utilizados por H. pylori de manera selectiva e inteligente.

El análisis filogenético refuerza que H. pylori puede ser utilizado como un modelo genético

útil y esto pudiera ser extrapolado en el estudio de co-evolución con el humano. La alta


vii

flexibilidad micro-evolutiva de H. pylori juega un papel central en la adaptación de éste a

su hospedero.


viii

Genomic micro-evolution of Helicobacter pylori

ABSTRACT

The highly diverse bacterium Helicobacter pylori (H. pylori), which persistently

colonizes the human stomach, provides a model to study the genome evolution. H. pylori

has a very plastic genome which presumably enhances its adaptation to host niches. The

genome comparison approach can determine the genomic rearrangements and evolutionary

relationships among different genomes of H. pylori strains. In this study, the concatenated

chromosomal sequences from seven strains of H. pylori (26695, J99, HPAG1, G27, P12,

shi470, B38) and sequences from Cag Pathogenicity Island were aligned using MAUVE to

examine the gen order, extent of shared DNA regions, core genome, and the degree of

relatedness among them.

In parallel, the ancestral genome, based on history inversions using the program

MGR, was reconstructed. In addition, we analyzed the patterns of interspecific

recombination and examined the phylogeny of the cagA and vacA genes. The results

obtained suggest that H. pylori evolves from positive and negative selection forces allowing

its adaptation to the human host during the initial phase of infection, and throughout the

natural course of the disease. The mechanism of intragenomic and intergenomic

recombination is utilized for H. pylori from a selective and an intelligent mode.

Moreover, the phylogenomic and phylogenetic analysis indicated that H. pylori

maybe utilized like a useful genetic marker to study the human evolution. In summary, the


ix

high micro-evolutionary flexibility of H. pylori plays a central role in the adaptation to the

human host.


1

1. INTRODUCCIÓN

La bacteria H. pylori es un organismo micro-aerofílico que tiene la extraordinaria

capacidad de infectar el estómago humano y persistir en él incluso hasta pasadas varias

décadas evadiendo la respuesta inmune e inflamatoria de su hospedero.

A nivel mundial, más del 50% de la población humana es portadora de este

microorganismo. El reconocimiento de la infección por H. pylori como causa de morbilidad

gastroduodenal ha tenido probablemente un mayor impacto en el sector salud en

comparación con otras enfermedades emergentes como el VIH. Se ha investigado a la

especie H. pylori debido a su asociación como agente causal de la enfermedad ulcerosa

péptica y como factor de riesgo para el desarrollo de cáncer gástrico siendo considerado

como ente carcinógeno por la Organización Mundial de la Salud y por la Agencia para la

Investigación Contra el Cáncer (Kersulyte et al., 2000).

Helicobacter pylori es un organismo panmítico que exhibe altos niveles de

diversidad genética en los aislados de pacientes con distinto estado clínico. Esta diversidad

genética es debida a la alta frecuencia de mutación y a la recombinación genética que

experimenta dicha bacteria (Suerbaum et al., 1998). La alta diversidad genética en las

diferentes cepas de H. pylori sugiere que dicha bacteria adapta su genoma a nivel micro-

evolutivo de acuerdo a su nuevo ambiente (Suerbaum y Josenhans, 2007).

En el presente trabajo, mediante el uso de métodos computacionales y conceptos de

genómica comparativa, se obtuvo información que permite la comparación de los genomas

de H. pylori, las islas de patogenicidad y de secuencias de genes en particular. El análisis


2

integral de esta información permitió entender los mecanismos evolutivos mediante los

cuales la especie H. pylori se adapta a un medio tan hostil como el estómago humano. Así

mismo, se realizó un análisis del genoma ancestral a partir del orden génico del presunto

ancestro más antiguo. Finalmente, se realizó una discusión acerca del papel que tiene la

flexibilidad evolutiva del genoma sobre la patogénesis y adaptación de la bacteria a su

hospedero natural, el ser humano.


3

2. ANTECEDENTES

2.1. Helicobacter pylori, bacteria patógena del humano

En el año de 1893, en la ciudad de Turín, Italia, el Dr. Bizzorezo observó

espiroquetas Gram-negativas, no identificadas, en muestras histológicas de las células

parietales y de glándulas gástricas de caninos. Actualmente, se le adjudica el

descubrimiento de H. pylori al Dr. Bizzorezo (Marshall, 2001). Sin embargo, hasta inicios

de los años 80 se descubrió la asociación entre las enfermedades gastroduodenales y H.

pylori, resultado del experimento realizado por el Dr. Marshall quien ingirió cultivo líquido

de la bacteria lo cual le produjo una gastritis aguda (Marshall et al., 1985). La descripción

original de la bacteria fue como Campilobacter pyloridis, posteriormente se realizó una re-

descripción a Campilobacter pylori y, finalmente se propuso como H. pylori (Goodwing et

al., 1989).

Actualmente existen dieciocho especies validadas que forman parte del género

Helicobacter (H. hepaticus, H. acinonychis, H. cinaedi H. pametensis, H. muridarum, H.

bizzozeronii, H. felis, H. heilmanni tipo 1, H. heilmanni tipo 2, H. mustelae, H.

nemestrinae, H. salomonis, H. pullorum, H. bilis, H. trogontum, H. canis, H. suncus y H.

pylori) y dos cepas candidato (H. bovis y H. suis) (Solnick y Vandamme, 2001).

2.2. Dinámica de la infección, transmisión y prevalencia de H. pylori

El organismo H. pylori habita en el tracto gastrointestinal del humano, es una

bacteria Gram-negativa, micro-aerofílica, en forma de S, poseé un flagelo polar recubierto


4

que le permite su movilidad y es esencial para la colonización bacteriana. Por lo general, es

considerada una bacteria extra-celular.

La infección se adquiere de manera normal a temprana edad, persistiendo durante

toda la vida del paciente a pesar del tratamiento farmacológico. El mecanismo de

transmisión es vía fecal-oral ú oral-oral (Kivi et al., 2003; Björkholm et al., 2004). Con el

uso de modelos matemáticos se ha predicho que el mejoramiento sanitario que se estableció

en los asentamientos humanos hacia la segunda mitad del siglo pasado fue un factor

importante en la disminución de la transmisión de H. pylori de humano-humano.

La prevalencia de H. pylori en las poblaciones humanas difiere en las regiones del

mundo, dependiendo en gran media del estándar de calidad vida de la población en una

determinada región. Por ejemplo, en países en vías de desarrollo, el 80% de la población

puede estar infectada con la bacteria; por otro lado, en países industrializados, la

prevalencia varía en un rango de entre 20 y 50 %.

2.3. Fisiopatología de H. pylori y enfermedades asociadas

La infección por H. pylori se asocia, por lo general, a una gastritis crónica activa,

pero sólo del 10% al 15 % de los individuos infectados manifiesta una úlcera péptica

evidente (Bamford et al., 1998). El resultado final, concreto, de la infección por H. pylori

está determinado por una compleja interrelación entre el hospedador y la bacteria.

Factores de la bacteria: H. pylori es capaz de establecerse en el sistema gástrico ya

que poseé la enzima ureasa, permitiéndole sobrevivir en un ambiente de pH ácido. La

enzima ureasa genera amonio (NH3) e induce lesiones en las células gástricas. La bacteria


5

también genera los factores quimiotácticos para los neutrófilos y monocitos que

contribuyen a la lesión celular. H. pylori produce proteasas y fosfolipasas que rompen el

complejo lípido-glucoproteico del gel mucoso, que es la primera línea de defensa del

estómago (Atherton y Blaser, 2004).

Factores del hospedador: la respuesta inflamatoria que ocasiona H. pylori incluye

reclutamiento de neutrófilos, linfocitos (T y B), macrófagos y plasmocitos. El patógeno

origina daño local al unirse a las moléculas del complejo mayor de histo-compatibilidad

clase II, expresadas en las células del epitelio gástrico ocasionando su apoptosis. Además,

las bacterias que expresan el gen virulento cagA introducen la proteína al interior de las

células ocasionando lesiones más graves al activar las vías celulares que producen citocinas

(IL6) (Atherton y Blaser, 2004).

El tipo y distribución de las gastritis se relaciona con el cuadro patológico gástrico.

La presencia de gastritis predominantemente antral se vincula con la formación de úlcera

duodenal; y la gastritis que afecta predominantemente al cuerpo del estómago y predispone

a úlcera gástrica, atrofia a las células gástricas y, finalmente, lleva a la producción de un

carcinoma gástrico (Chen et al., 1994; Atherton y Blaser, 2004).

2.4. Genes de virulencia asociados a la patogénesis de H. pylori

Los genes asociados a virulencia se refieren a los productos génicos que le permite a

un microorganismo establecerse dentro del huésped de una especie determinada

aumentando su potencial patogénico. Los factores de virulencia son: las toxinas

bacterianas, las proteínas y los hidratos de carbono de la superficie celular bacteriana que


6

protegen a la bacteria y las enzimas hidrolíticas que pueden contribuir a la patogénesis de la

bacteria. H. pylori, contiene 127 genes asociados a patogénesis (http://mvirdb.llnl.gov/),

pero dos genes son los más relevantes (cagA y vacA) por su importancia en los procesos

patológicos relacionados a H. pylori (Yamazaki et al., 2005).

Isla de patogenicidad: La isla de patogenicidad cag PAI es una región altamente

plástica del genoma de H. pylori y juega un papel importante en la patogénesis de la

bacteria (Censini et al., 1996). Esta región tiene una longitud de 35 a 40 kb la cual contiene

de 27 a 33 genes (Azuma et al., 2004). La mayoría de los genes que contiene esta isla están

involucrados en el ensamblaje del sistema de secreción tipo IV que transportan a la proteína

CagA dentro de las células gástricas epiteliales e induce la producción de interleucina 8,

producida también por las células gástricas epiteliales. Sin embargo, los cambios inducidos

por estas proteínas durante la colonización y la manera en que éstos afectan el desarrollo de

las enfermedades gástricas aún no están bien determinados (Suerbaum y Josenhans, 2007).

Gen cagA. El gen cagA es uno de los genes más estudiados a detalle en cuanto a su

variación alélica y sus implicaciones funcionales, este se encuentra formando parte de la

isla de patogenicidad. Estudios epidemiológicos han mostrado que la colonización del

estómago con cepas positivas al gen cagA se asocian con el incremento del riesgo para el

desarrollo de úlcera péptica y cáncer gástrico (Hatakeyama, 2003).

El gen cagA es el encargado de codificar la proteína CagA, responsable principal de

las patologías asociadas a H. pylori. La proteína CagA contiene los motivos de

fosforilación de tirosina (EPIYA), que son fosforilados por tirosinas cinasas dentro de la


7

célula gástrica, iniciando los eventos que llevan al daño del tejido gástrico (Mimuro et al.,

2002)

Gen vacA: La mayoría de las cepas de H. pylori producen la citotoxina vacuolizante

VacA, la cual exhibe múltiples efectos en las células epiteliales e inhibe la proliferación de

las células T. El gen vacA muestra una alta variación alélica. Las cepas de H. pylori llevan

múltiples alelos recombinantes con diferente actividad tóxica y, por lo tanto, tienen afinidad

variable por los receptores celulares gástricos (Pagliaccia et al., 1998).

Las variaciones alélicas del gen vacA son conocidas como región señal 1(s1), región

señal 2 (s2), región media 1(m1) y región media (m2). Estas regiones se dividen en

subtipos solo en el caso de las regiones s1 y m1. Para la región s1 existen los subtipos s1a,

s1b, y s1c; para la región m1 los subtipos m1a y m1b (Ito et al., 1997). La presencia de

estas regiones se relaciona con la producción de la citotoxina vacA. En general los tipos

s1/m1 y s1/m2 se relacionan con alta y moderada producción de citotoxina, mientras que el

tipo s2/m2 se relaciona con baja producción de citotoxina (Atherton et al., 1995).

2.5. Genomas secuenciados de H. pylori

Actualmente existen siete genomas secuenciados de H. pylori pertenecientes a

diferentes cepas (Entrez Genome, Enero 2010) (cuadro 1). La primera secuenciación del

genoma completo de H. pylori fue llevada a cabo por el Instituto para la Investigación

Genómica (The Institute for Genomic Research TIGR) en el año de 1997, utilizando la cepa

26695, la cual fue originalmente aislada de pacientes que padecían gastritis (Tomb et al.,

1997). Posteriormente, la cepa J99 aislada de un paciente con úlcera duodenal fue


8

secuenciada en 1999 por la compañía farmacéutica AstraZeneca (Alm et al., 1999). La cepa

HPAG1 fue aislada de un paciente con gastritis atrófica crónica (Oh et al., 2006). La cepa

Shi470, proviene de un aislado del antro gástrico de un paciente de raza amerindia del Perú

(Kesulyte et al., 2009). La cepa P12, proviene de un paciente con úlcera duodenal. La cepa

G27, fue aislada de un paciente en Tocascana, Italia (Baltrus et al., 2009). Finalmente, la

cepa B38 originaria de Francia aislada de un paciente con MALT (linfoma del tejido

linfoide asociado a mucosas) (aun no publicado). El cromosoma principal de las diferentes

cepas es variable en tamaño y todos los genomas tienen un promedio de 39 % en el

contenido de GC.

Cuadro 1. Genomas de H. pylori completamente secuenciados, utilizados para el análisis

de los arreglos genómicos.

Organismo Síntoma clínico de la

enfermedad Origen No. de acceso

H. p. 26695 Gastritis Reino Unido NC_000915 H. p. J99 Ulcera duodenal E.U.A NC_000921 H. p. HPAG1 Gastritis Atrófica Suiza NC_008086 H. p. P12 Aislado clínico Alemania NC_011498 H. p. G27 Investigación Italia NC_011333 H. p. Shi470 Aislado clínico Perú NC_010698 H. p. B38 MALT Francia NC_012973

2.6. Comparación genómica de H. pylori

Los cambios en un consorcio de genes de una población a través del tiempo, lo cual

resulta en pequeñas variaciones genómicas del organismo de una misma especie, se ha

denominado micro-evolución. Se ha propuesto que la micro-evolución de la bacteria H.


9

pylori dentro de cada hospedero individual contribuye al mantenimiento de la interacción

patógeno-hospedero promoviendo su persistencia (Suerbaum y Josenhans, 2007).

La co-evolución de H. pylori y su hospedero humano ha progresado durante

aproximadamente 10,000 años. Estudios poblacionales revelaron una relación entre cepas

amerindias y este-asiáticas. Estas poblaciones humanas tiene una separación evolutiva

estimada en 11,000 años (Ghose et al., 2002, Yamaoka et al., 2002, Falush et al., 2003).

La comparación de los primeros genomas secuenciados (26695 y J99) permitió

observar la diversidad genómica existente en cepas de la misma especie y, por ende, la

evolución de las mismas. La comparación de los dos genomas completamente secuenciados

indica una diferencia en tamaño del genoma y en cantidad de marcos de lectura abiertos

(ORFs). Para la cepa 26695, la talla es de 1.67 Mb con 1,590 ORFs, mientras que para la

cepa J99 la talla es de 1.64 Mb y 1,496 ORFs (Alm et al., 1999; Kang y Blaser 2006). Un

total de 10 inversiones y transposiciones, que van de 1 a 83 kb de longitud, son necesarias

para el alineamiento de los genomas de estas cepas. Los genes ortólogos que comparten

estas dos cepas únicamente, son 92.6 % idénticos a nivel de nucleótido, y sólo dos de 1,406

genes compartidos tiene secuencias idénticas. Aproximadamente, el 7 % de las regiones

codificantes de la cepa 26695 están ausentes en la cepa J99. La mayoría de las regiones

codificantes en los genomas estudiados son H. pylori específicas, sin homólogos

identificables (Alm et al., 1999; Kang y Blaser 2006).

El genoma de H. pylori 26695 contiene numerosas secuencias repetitivas de ADN,

que van desde simples repeticiones homo-poliméricas o regiones de di-nucleótidos

repetidos, a largas regiones de nucleótidos idénticos apartados por cientos de bases. Estas


10

secuencias repetitivas de diferentes longitudes permiten las “deleciones” o rearreglos intra-

genómicos. Dichos elementos tienen una distribución no aleatoria dentro del genoma, lo

que implica una fuerte presión de selección por parte de H. pylori (Aras et al., 2003; Kang

y Blaser 2006; Suerbaum y Josenhans, 2007).

Las secuencias de inserción (IS) son elementos genéticos móviles cortos de ADN

que promueven rearreglos genéticos dentro de un genoma. Múltiples copias de secuencias

de inserción aparentemente específicas de H. pylori se encuentran distribuidas dentro de un

genoma en particular (Azuma et al., 2004; Kang y Blaser 2006). La cepas de H. pylori

también difieren en el contenido de plásmidos (Hofreuter et al., 2002; Hofler et al., 2004;

Kang y Blaser, 2006).

2.7. Diversidad y evolución genómica en H. pylori

Los procesos de adaptación que toman lugar en el contexto del ambiente del

hospedero son responsables de la diversificación bacteriana. La bacteria H. pylori tiene la

capacidad de adaptarse y persistir en el estómago humano, donde es el organismo

predominante. Este hecho llevó a la hipótesis de que H. pylori tiene una alta diversidad

genómica, la cual fue evidenciada por técnicas moleculares, tales como RAPD, MLST y

PFGE (Suerbaum y Josenhans, 2007).

Existen varias formas mediante las cuales se produce la diversidad genómica, pero

la recombinación homóloga es el paso esencial para la evolución microbiana, siendo la

plasticidad genómica lo que permite definir la presión de selección. Las presiones de


11

selección operan en un microorganismo que ostenta capacidades específicas para la

diversificación por procesos de mutación y recombinación (Suerbaum y Josenhans, 2007).

La especie H. pylori tiene una alta tasa de recombinación genética, lo que le permite

un elevado nivel de intercambio genético (Suerbaum et al., 1998). El intercambio genético

es posible debido a sistemas especializados (Secreción reversa tipo IV) que existen para la

toma de ADN extracelular, la cual facilita la competencia de la bacteria, siendo ésta última

dependiente de la fase de crecimiento (Baltrus y Guillemin, 2006).

Además de la recombinación genética, H. pylori también tiene una elevada tasa de

mutaciones. Los análisis del genoma revelan que H. pylori carece de genes homólogos que

contribuyen en la reparación del ADN (mutS1/mutL/mutH) y varias enzimas involucradas

en la escisión y reparación de bases (Kang y Blaser, 2006; Suerbaum y Josenhans, 2007).

Los sistemas de restricción-modificación típicamente se componen de dos enzimas:

una endonucleasa de restricción, que rompe secuencias de ADN específicas y una

metiltransferasa, la cual protege al ADN hospedero de roturas en el mismo. Las diferentes

cepas de H. pylori tienen múltiples sistemas de restricción-modificación que protegen al

genoma hospedero de invasión de ADN extraño, más comúnmente bacteriófagos; estos

sistemas contribuyen a la diversidad de la bacteria.

2.8. Los mecanismos de recombinación dirigen la micro-evolución de los genomas

El análisis de los genomas de diferentes organismos ha permitido investigar si

algunas regiones del genoma bacteriano han sido importadas de diferentes fuentes durante


12

su evolución a través de mecanismos de transferencia horizontal, es decir un factor de

recombinación. La mayoría de los genes bacterianos involucrados en la simbiosis están

localizados en compartimentos genómicos específicos, tales como replicones

independientes (plásmidos) o islas en el cromosoma (Flores et al., 2005). La identificación

de eventos de recombinación natural de cepas bacterianas es importante para el

entendimiento de su evolución.

La recombinación es el proceso donde dos moléculas separadas de ADN o ARN

intercambian regiones de sus secuencias. El intercambio, ocurre a menudo en regiones

homólogas de los genomas y ocurren en cadenas únicas o dobles de las moléculas de ADN

o ARN. Así, la recombinación es el mecanismo principal que dirige los cambios evolutivos

(Etherington et al., 2004). A través de la comparación de secuencias de ADN, de especies

estrechamente emparentadas, se pueden detectar eventos de recombinación. La

comparación de secuencias de ADN de especies muy emparentadas se ha referido como

genómica micro-evolutiva (Jordan et al., 2002). Existen cinco métodos reconocidos para

detectar la recombinación en las secuencias de ADN: 1) los métodos de similitud que se

basan en la tendencia que tienen los nucleótidos a ser más compartidos que otros sitios, 2)

los métodos que estiman las distancias genéticas entre secuencias, 3) los métodos

filogenéticos que identifican incongruencias en las topologías de los árboles creados a partir

de diferentes partes de las secuencia o del genoma, 4) los métodos de compatibilidad que

prueban la incongruencia filogenética y que no requiere de filogenia de secuencias

conocidas y 5) el método de distribución de sustituciones que examina las secuencias

buscando un agrupamiento significante de sustituciones (Posada et al., 2002).


13

Sin embargo, la detección de la recombinación dentro de las secuencias tiene varios

pre-requisitos. En particular: 1) la región recombinante debe ser lo suficientemente larga

para permitir análisis filogenéticos relevantes; 2) la región debe ser lo bastante divergente

con el pariente más y menos cercano para permitir identificación inequívoca y, 3) el patrón

de recombinación debe mantenerse durante recombinaciones evolutivas posteriores (Tolou

et al., 2001).

Un estudio reciente en donde se comparan fragmentos largos de las secuencias

genómicas en diferentes replicones de la bacteria Sinorhizobium spp. demostró que la

recombinación de ADN entre cepas muy relacionadas es el mayor evento en la micro-

evolución de su genoma (Guo et al., 2007).


14

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La comparación de genomas intra-especie permite identificar las características

micro-evolutivas. Para genomas simbióticos, la recombinación de ADN intra-especies es el

mayor evento en micro-evolución. La bacteria H. pylori es un patógeno particular del

humano con un genoma reducido. Los estudios realizados en esta bacteria han mostrado

que tienen una tasa de recombinación y de mutaciones puntuales muy elevadas. Sin

embargo, aún subyacen las siguientes interrogantes: ¿los genes de virulencia y genes de

mantenimiento tienen las mismas características evolutivas? ¿Qué contribuye en mayor

medida a la evolución de H. pylori, la recombinación o las mutaciones puntuales? para

responder a estas cuestiones es necesario indagar a profundidad.


15

4. JUSTIFICACIÓN

La bacteria H. pylori es un habitante natural del estómago humano. La capacidad de

sobrevivir en el ambiente hostil del estómago y persistir en él, puede ser explicada

mediante el estudio de los mecanismos de micro-evolución del genoma de la bacteria.

Existen estudios anteriores que comparan tres genomas de H. pylori. Sin embargo,

actualmente, están disponibles nuevas secuencias de genes de la bacteria y genomas de

variantes en la base de datos pública del Centro Nacional para la Información

Biotecnológica (NCBI). Este proyecto de tesis esta basado en conceptos de genómica

comparativa y tiene como objetivo realizar análisis de los genomas para entender el papel

de los mecanismos micro-evolutivos en la adaptación y patogénesis de la bacteria H. pylori.


16

5. HIPÓTESIS

La adaptación de H. pylori a un hábitat en particular está asociado a la micro-evolución de

su genoma.


17

6. OBJETIVOS

6.1. Objetivo general

Analizar los genomas de diferentes cepas de H. pylori e inferir sus mecanismos de micro-

evolución adaptativa

6.2. Objetivos específicos

1.- Comparar la organización génica de los genomas de H. pylori.

2.- Comparar la estructura genómica de las islas de patogenicidad de cepas de H. pylori.

3.- Analizar los patrones de recombinación intra-especie en genes asociados a patogénesis y

genes de mantenimiento de H. pylori.


18

7. MATERIALES Y MÉTODOS

7.1. Características generales de las secuencias genómicas analizadas

La información acerca de las características generales de los siete genomas

analizados (cuadro 1) fue obtenida de la pagina electrónica http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI), excepto por el número de

pseudogenes que fue corroborado manualmente.

7.2. Comparación de la estructura genómica de H. pylori

Los genomas Hp26695, HpJ99, HpHPAG1, HpG27, HpP12, HpShi470, HpB38

(Cuadro 1) fueron obtenidos de la página electrónica http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ del

NCBI. Para analizar estas secuencias, se utilizó el algoritmo progresivo del software

MAUVE 2.3.1 (Darling et al., 2004). Este método utiliza alineamientos por pares o

múltiples de secuencias genómicas conservadas de genomas completos con requerimientos

computacionales mínimos sin afectar la calidad del alineamiento. Los alineamientos locales

se llevaron a cabo con el objeto de identificar uniones múltiples máximas (multi-MUMs),

los cuales se utilizaron a continuación para construir un árbol filogenético guía.

Posteriormente, una parte de los multi-MUMs se usaron como anclas, los cuales a su vez se

dividieron en bloques colineales locales (LCB). Entonces, cada LCB formó una región

homologa de ADN de multi-MUMs que carece de rearreglos en la secuencia y la cual es

compartida por dos o más genomas. El alineamiento de los siete genomas fue construido

usando los parámetros estándar en MAUVE. El mismo método se utilizó para analizar la


19

estructura genómica de las islas de patogénesis de H. pylori. Los orígenes de replicación se

identificaron con la herramienta en línea Ori-Finder (buscador de orígenes de replicación)

(http://tubic.tju.edu.cn/Ori-Finder/).

7.3. Genoma núcleo (“Core genome”)

El algoritmo MAUVE tiene la habilidad de identificar los ortólogos posicionales

mediante alineamientos múltiples de las secuencias codificantes contenidas en los genomas

y exportar una lista con las características anotadas. Los parámetros utilizados fueron los

sugeridos en MAUVE consistentes en: porcentaje de identidad 60-100 % y una cobertura

de 70-100 %. El número de secuencias codificantes ortólogas compartidas por los

diferentes genomas de H. pylori incluyendo los genomas de H. hepaticus y H. acinonychis

fue extraído manualmente de la lista generada por MAUVE.

7.4. Análisis de las secuencias repetidas

El programa MUMer 3.0 (Delcher et al., 1999) se utilizó para identificar las

secuencias repetidas exactas de ADN dentro de los genomas de H. pylori. Este método

también incluye regiones paralogas duplicadas. Se empleó el corte mínimo permitido por

MUMer de 20 nucleótidos de longitud que perfectamente se unen dentro de la secuencia de

ADN del genoma en estudio. La salida originada por MUMmer indica las coordenadas de

cada par de secuencias idénticas y su longitud exacta. Del conjunto de programas EMBOSS

se utilizó el programa Etándem (Rice et al., 2000). Dicho programa fue aplicado para

analizar la distribución de las repeticiones en tándem, que al igual que MUMer indica las


20

coordenadas de cada repetición pero difiere de él al tomar porcentajes de identidad más

bajos que los exactos. Sólo se tomaron en cuenta repeticiones en tándem con 80 % de

identidad.

7.5. Análisis evolutivos basados en los genomas completos

Se utilizó el software MAUVE para crear una matriz de permutación que indica el

orden y orientación de los bloques de cada genoma por medio de integrales. A

continuación, esta matriz fue analizada en un computador local con el programa MGR

(Multiple Genome Rearregment) (Bourque y Pevzner, 2002). El algoritmo MGR crea un

árbol filogenómico que describe el escenario de rearreglos más plausible para múltiples

especies e infiere el posible orden de los potenciales ancestros más antiguos.

7.6. Análisis de la recombinación intra-especies

Para caracterizar la naturaleza de las secuencias codificantes de H. pylori se

utilizaron las secuencias completas de diez genes de mantenimiento (dnaA, dnaJ, dnaK,

ftsA, ftsH, ftsZ, glnA, groEL, recN, rpoD), de diez genes de virulencia de la isla de

patogenicidad (cag3, cag5, cag7, cag8, cag9, cag14, cag19, cag23, cag25, cagA,) y el gen

vacA, para analizar los eventos de recombinación intra-especie.

Las secuencias nucleotídicas de dichos genes, fueron alineadas con el programa

MUSCLE 3.0 (Edgar, 2004) utilizando parámetros estándar. En seguida, utilizando los

alineamientos generados con MUSCLE 3.0, se procedió a realizar un análisis sistemático

buscando la presencia de patrones de recombinación usando los programas RDP


21

(Recombination Detection Program) (Martin y Rybicki, 2000) y RAT (Recombination

Analysis Tool) (Etherington et al., 2004).

En el caso de los genes cagA y vacA, donde existe una gran cantidad secuencias

codificantes (96 y 93, respectivamente) (Apéndice 4), disponibles en las bases de datos

públicas, se realizó un multi-alinemiento del número total de secuencias y se extrajeron

previa inspección, las secuencias más divergentes para analizar los patrones de

recombinación. Así mismo, en el presente trabajo, el número total de secuencias de los

genes vacA y cagA fueron analizadas con el programa RAT que permite un análisis masivo

y rápido de secuencias mostrando de manera gráfica las zonas recombinantes. El programa

RAT calcula las distancias genéticas basándose en el índice de fijación. El índice de

fijación varía entre 0 y 1. El valor 0 indica que las secuencias son genéticamente idénticas,

mientras que los valores 1 indican diferencias genéticas en la secuencia. Una vez que el

programa realiza estos cálculos, proporciona una salida gráfica que indica las distancias

genéticas y las regiones recombinantes mediante entrecruzamientos de líneas, indicando la

posición del evento en el alineamiento de secuencias.

7.7. Análisis filogenético de los genes cagA y vacA

Las secuencias completas de los genes cagA y vacA fueron obtenidas en formato

FASTA del sitio electrónico NCBI. Posteriormente, se realizó el alineamiento múltiple con

el programa MUSCLE 3.0. A partir del alineamiento, se construyó el árbol filogenético

utilizando la interfaz gráfica de SEAVIEW&PHYLO_WIN (Galtier et al., 1996) con el


22

análisis Neighbor-Joining, bajo los parámetros de distancia de Jukes-Cantor y Bootstrap

con 10,000 repeticiones.


23

8. RESULTADOS

8.1. Características generales de las secuencias genómicas analizadas

La talla genómica de los diferentes genomas de H. pylori es relativamente variable.

Esta varía desde 1,576,578 nt a 1,673,813 nt (Cuadro 2) con una diferencia de 97.2 kb entre

el genoma de mayor tamaño que corresponde a H. pylori P12 y el genoma de menor

tamaño de H. pylori B38. El contenido génico por genoma es igualmente variable

(encontrándose en un rango de 1,535-1,648 genes) con una diferencia de 113 genes entre el

genoma de mayor contenido génico H. pylori Shi470 y el de menor contenido H. pylori

J99. Sin embargo, el número de proteínas que codifican los genes por genoma dentro de las

diferentes cepas de H. pylori es más variable que el contenido génico, encontrándose un

rango de 1382-1576, una diferencia de 194 proteínas codificantes entre el genoma que más

codifica (H. pylori 26695) y el que menos codifica (H. pylori B38). El contenido de G+C es

de un promedio de 38.4 % para los siete genomas; el porcentaje de codificación oscila en

un promedio de 88.4 % para todos los genomas. El contenido de RNAs es similar en todos

los genomas. La cepa H. pylori B38 presenta un mayor número de genes inactivos con 144

pseudogenes, lo que refleja la diferencia más grande entre proteínas codificantes y no

codificantes. Después de H. pylori B38 continúa la cepa H. pylori Shi470 con 37

pseudogenes, seguido por H. pylori G27 con 34 pseudogenes, luego H. pylori P12 con 14

pseudogenes, y finalmente, H. pylori 26695 y H. pylori J99 con 10 y 4 pseudogenes,

respectivamente. La cepa de H. pylori HPAG1 es la única que mantiene intactas la totalidad

de sus secuencias.


24

Cuadro 2. Características generales de los genomas completamente secuenciados de la

especie H. pylori

Genomas de

H. pylori Talla

genómica % de GC

% de codificacion

No. de genes

No. de proteínas

codificantes

RNAs. No. de Pseudogenes

26695 1,667,867

nt 38 90 1627 1573 43 10

J99 1,643,831 nt

39 90 1535 1489 42 4

HPAG1 1,596,366 nt

39 91 1578 1536 42

P12 1,673,813 nt

38 89 1624 1568 42 14

G27 1,652,982 nt

38 86 1570 1493 43 34

Shi470 1,608,548 nt

38 88 1648 1569 42 37

B38 1,576,758 nt

39 85 1571 1382 45 144

8.2. Comparación de la organización génica de H. pylori

Para analizar los rearreglos que sufre el genoma de H. pylori se realizó un

alineamiento global de secuencias de ADN concatenadas de los siete genomas de H. pylori,

utilizando el software MAUVE versión 2.3.1.

La comparación de los diferentes genomas con el software MAUVE permitió

identificar y alinear 35 bloques colineales locales (LCB) que comparten los siete genomas

de H. pylori, donde aproximadamente, el 90 % del genoma está contenido en los bloques y

el resto pertenece a regiones de linaje especificas, localizadas entre los huecos que separan

los bloques colineales. Utilizando la secuencia de H. pylori 26695 como referencia en el


25

alineamiento múltiple, MAUVE computó el orden y orientación de los segmentos

homólogos en cada genoma.

Cada uno de los siete genomas secuenciados poseé su propia estructura genómica

(Figura 1). En comparación con H. pylori 26695, cada uno de los taxones en estudio

presenta un orden génico variable. No obstante, los genomas con sintenia relativamente

similar se presentan en las cepas HpJ99, HpHPAG1, HpG27, Hp P12, excepto por la

inversión de 87 kb en Hp HPAG1 que se ubica en las coordenadas 1432271-1519807. Esta

porción se extiende desde la secuencia codificante HPAG1_1383 (timidilato sintetaza,

thyX) a la proteína hipotética HPAG1_1461.

Otro rearreglo destacable, observado únicamente en H. pylori 26695 en

comparación con el resto de los genomas, es la inversión y translocación de dos segmentos

de 81 kb en las coordenadas 367133, 448585 y de 84 kb que se extiende desde la posición

1072258 a la posición 1156222. Este arreglo parece ser exclusivo de este genoma. Los

segmentos mencionados se extienden desde el gen HP0357 (alcohol deshidrogenasa) al gen

HPrrnA5S (5s ribosomal RNA) en el caso del segmento inicial y del gen tRNA-Pro-1

(HPt26) a una proteína hipotética (HP1093). Un dato a mencionar de estos rearreglos es su

relación con la llamada zona de plasticidad de H. pylori.

En contraste, los genomas de los taxones Shi470 y B38 presentan la estructura

genómica más diferente en comparación con el resto de los genomas y es más parecida

entre ellos. La característica distintiva de estos dos genomas es la inversión y translocación

de un gran segmento de sus secuencias abarcando un total de 407 kb (466552, 873914) en

Hp Shi470 y 390 kb (470089, 851109) en Hp B38. Estos segmentos comprenden desde la


26

proteína hipotética de los canales de potasio (HP0490) hasta la proteína hipotética

(HP0879).

A parte de estos rearreglos, también se observaron inversiones alrededor del origen

de replicación, por lo que los diferentes genomas de H. pylori analizados preservan esta

característica evolutiva común en la mayoría de las bacterias procariotas (Eisen et al.,

2000).

Figura 1. Alineamiento de siete genomas de cepas de H. pylori. El alineamiento de genomas completos

usando MAUVE indica 35 bloques colineales conservados en los siete taxones. Cada cromosoma ha sido

colocado horizontalmente y los bloques homólogos en cada genoma se muestran como regiones con colores

idénticos. Las regiones que están invertidas con respecto a Hp J99 están colocadas debajo de la línea central,

y los principales rearreglos están unidos por líneas negras, indicando el orden invertido con respecto al otro,

que advierten tres principales estructuras. El origen de replicación y los genes limitantes en los rearreglos

están marcados por líneas verticales negras.


27

8.3. Zonas de plasticidad

En el análisis de comparación de genomas, MAUVE identificó las zonas de

plasticidad como linaje-específicas y estas zonas están localizadas entre los huecos que

separan los bloques y en áreas de poca similitud (zonas blancas dentro de los bloques)

(figura 1). Estas áreas, por lo tanto, representan secuencias particulares del genoma.

La zona de plasticidad en H. pylori 26695 está identificada en el alineamiento como

secuencia linaje-específico encontrándose dividida en dos partes. Dicha zona está asociada

a dos inversiones que presenta la secuencia, tal como se reportó en el primero de los

estudios sobre comparación de genomas (Kersulyte et al., 2009). La zona está ubicada entre

el gen ftsZ (HP0979) y los genes ribosomales 5 s y 20 s.

El genoma de la cepa P12 es el único que presenta una duplicación de dos zonas de

plasticidad, dispersas en el genoma. Esta zona está limitada por un pseudo-gen implicado

en los sistemas de restricción-modificación (HPP12_0436), abarcando las siguientes

coordenadas 450800, 451990 y por una proteína hipotética (HPP12_0474) ubicada en las

posiciones 494743, 496638. La siguiente ubicación de 1391788, 1394775 se encuentra

limitada por un pseudo-gen (HPP12_1319), involucrado en los sistemas de restricción-

modificación y por el gen nadC (HPP12_1354) en las coordenadas 1425436,1426257. La

inserción de las zonas de plasticidad en este genoma condujo a la inactivación de las

secuencias codificantes al caer en un marco abierto de lectura. Un dato interesante, es la

ausencia de la zona plástica en los genomas de HPAG1 y B38, ambos relacionados con

procesos neoplásicos y alteraciones fisiopatológicas similares.

La isla de patogenicidad es considerada también como una zona plástica. En el

multi-alinemiento de los genomas, las islas presentan coordenadas similares en los genomas


28

de 26695, J99, HPAG1, P12, G27, excepto en Hp Shi470, que cambia a una posición río

abajo debido a la gran inversión que sufre el genoma. Al igual que la carencia de la zona de

plasticidad la isla esta ausente en B38.

8.4. Estructura de las islas de Patogenicidad

Siguiendo el método de comparación de genomas, se analizó la estructura de las

islas de patogenicidad incorporando secuencias de islas completas pertenecientes a cepas

originarias de varias partes del mundo (Apéndice 1). La comparación de dichas estructuras

indica un orden génico altamente conservado (Figura 2).

Entre los hallazgos de este análisis, destaca la inversión única del gen cagQ14

(HP0535) en OK112, F32, F80, 2017,2018, 3K, 26695, J99, HPAG1, G27 y P12. La cepa

italiana G27 presenta tres copias de las características IS605 lo que divide la isla en dos

secciones, por lo que presenta una estructura que es similar a las cepas suizas Du23, Du52,

Ca52 y Ca73 y la cepa australiana NCTC 11638. Estos elementos están localizados entre

los genes HPG27_492 (cagS) y HPG27_493 (cag Q). Las secuencias de inserción (IS) no

afectan la funcionalidad de los genes relacionados. Hp Shi470 es la única cepa que presenta

una duplicación del gen cagA y la adquisición de cinco nuevos genes hipotéticos

(HPSH_04250, HPSH_04245, HPSH_04235, HPSH _4230 y HPSH_04220).

El gen cag7 es el menos conservado de todos los genes pertenecientes a la isla

debido a inserciones y “deleciones” originadas por la presencia de numerosas secuencias

repetidas. Esta conformación ha llevado a la inactivación de este gen como en el caso de las

cepas G27, 908, 2017 y 2018. En la inspección realizada con el visor de MAUVE se

Micro

observó que mayoría de las cepas estudiadas carece del gen Cag2 o si está presente se

encuentra inactivo.

Figura 2. Alineamiento de las islas de patogenicidad de

usando MAUVE indica 3 bloques colinea

horizontalmente y los bloques homólogos en cada secuencia genómica se muestran como regiones con

colores idénticos. Las regiones coloreadas que están invertidas con respecto a la secuencia de refe

aparecen debajo de la línea central. Los recuadros debajo de los bloques son los genes que conforman la isla y

se interpretan de igual manera que los bloques. Los principales rearreglos están unidos por líneas negras

indicando el orden invertido con


mayoría de las cepas estudiadas carece del gen Cag2 o si está presente se

. Alineamiento de las islas de patogenicidad de H. pylori. El alineamiento

indica 3 bloques colineales conservados en los taxones. Cada secuencia ha sido colocada


colores idénticos. Las regiones coloreadas que están invertidas con respecto a la secuencia de refe

debajo de la línea central. Los recuadros debajo de los bloques son los genes que conforman la isla y


indicando el orden invertido con respecto al otro.

29

mayoría de las cepas estudiadas carece del gen Cag2 o si está presente se

. El alineamiento de islas completas

conservados en los taxones. Cada secuencia ha sido colocada


colores idénticos. Las regiones coloreadas que están invertidas con respecto a la secuencia de referencia

debajo de la línea central. Los recuadros debajo de los bloques son los genes que conforman la isla y



30


El genoma núcleo se refiere a las secuencias codificantes ortólogas totales

compartidas por dos o más genomas. Los siete genomas analizados comparten secuencias

codificantes. El genoma núcleo de la especie H. pylori, basado en los siete genomas, fue

estimado en 1166 secuencias codificantes indicando una alta variabilidad génica. En

contraste, el genoma núcleo del género Helicobacter fue mucho menor y se estimó en 382

secuencias codificantes indicando una mayor variabilidad génica para el genoma núcleo del

género. El genoma de H. acinonychis comparte un mayor número de secuencias homólogas

con H. pylori. Por otro lado, los genomas mencionados comparten menor número con H.

hepaticus. En el caso de H. acinonychis, sólo comparte los genes correspondientes al

genoma núcleo y H. pylori comparte cuatro más con la especie H. hepaticus. Por lo tanto,

solo quedaron 74 secuencias codificantes exclusivas del genoma núcleo de H. pylori que

posiblemente son esenciales para la adaptación al hospedero. Sin embargo, también se tomó

en cuenta una secuencia codificante que comparte con H. hepaticus relacionadas con la

producción de molibdeno.

De las 75 secuencias codificantes (Apéndice 2), 31 secuencias están clasificadas

como proteínas hipotéticas; de las proteínas con función conocida destacan las proteínas de

membrana externa, miembros de la familias Hop que son porinas y adhesinas, genes

involucrados en la formación del co-factor molibdeno de las metalo-enzimas, que

participan en el metabolismo del nitrógeno, sulfuro y sustratos que contienen carbono. Otro

grupo de genes se relaciona con la utilización de hierro y otros metales. Diecinueve de las

secuencias codificantes encontradas mediante la búsqueda de genes exclusivos del genoma


31

núcleo de la especie H. pylori se han comprobado que son esenciales para la adaptación al

hospedero.

La mayor parte de las diecinueve secuencias codificantes corresponden a genes

involucrados en la formación del co-factor molibdeno de las metalo-enzimas, este grupo

esta formado por los genes HP0798, HP1341, HP0172, HP0768, HP0798, HP0799,

HP0800, HP0474, y HP0475, grupo al que le siguen cuatro proteínas de membrana externa

HP025, HP0477, HP0252, HP1453, dos proteínas asociadas con la replicación,

recombinación y defensa del organismo HP1371 y HP0050, dos proteínas con funciones

generales HP0211 y HP0357, una proteína de unión a metales rica en Histidina HP1427, y

finalmente dos proteínas hipotéticas HP1028 y HP1502.

Figura 3. Diagrama de Venn representando el genoma núcleo del género Helicobacter.


32

8.6. Prevalencia de las secuencias repetidas

Las duplicaciones génicas juegan un papel central en la evolución de nuevas

funciones biológicas y generan biodiversidad. La comparación de las duplicaciones exactas

intra-genómicas se muestran en el cuadro 3. El número de repeticiones por genoma es

ampliamente variable con una diferencia de 765 repeticiones entre el genoma con el mayor

número de repeticiones H. pylori HPAG1 y el de menor número H. pylori B38. Sin

embargo, en cuanto al contenido en pares de bases, el genoma de H. pylori Shi470 revela

70 kb de secuencias repetidas exactas lo que representa un 4.3 % de su genoma siendo el

genoma con mayor número en pares de bases de secuencias repetidas, sólo seguido por el

genoma HpHPAG1. La mayoría de las secuencias de ADN en los siete genomas fueron

menores a 200 kb, como se muestra en el cuadro 3. El genoma de Shi470 presenta más

frecuencia de secuencias repetidas de mayor rango en longitud de tamaño (200- >1000 kb),

lo que refleja un contenido mayor en pb del genoma. HpB38 muestra mayor número de

repeticiones en el rango de 1,000 kb con un total de 12 repeticiones y, por lo tanto, un

número mayor de genes repetidos.

Cuadro 3. Distribución de las repeticiones exactas intra-genómicas en H. pylori

Cepas de H. pylori

No. de duplicaciones y longitud de nucleótidos No. total de

duplicaciones

Contenido

(pb)

20-25

26-50

51-100

101-200

201-500

501-1000

>1 Kb

26695 475 340 120 46 20 5 5 1011 54055 J99 390 276 120 37 10 5 2 840 44653 HPAG1 592 456 143 35 9 4 4 1243 58376 G27 467 344 106 35 10 7 7 976 56537 P12 383 206 63 17 10 5 5 689 37374 Shi470 299 227 105 105 65 7 3 811 70094 B38 270 140 36 10 9 1 12 478 43935


33

8.7. Análisis de las repeticiones en tándem

La distribución de las repeticiones en tándem se muestra en el cuadro 4. La mayoría

de las repeticiones en tándem se encuentran localizadas dentro de secuencias codificantes y

en menor frecuencia en regiones inter-génicas. Las repeticiones en tándem se encuentran

predominantemente en proteínas hipotéticas no homólogas en los otros genomas y en genes

de conocida importancia relacionados con la virulencia de la bacteria y en algunos genes de

mantenimiento. Las secuencias codificantes homólogas en los siete genomas que presentan

repeticiones en tándem son los genes de virulencia cag7 y cagA y los genes que codifican a

las proteinas fucT (fucosiltransferasa), hcpC (proteína rica en cisteína) y el gen topA (ADN

toposiomerasa I), indicando que las repeticiones en tándem no son del todo aleatorias,

demostrada por la predilección a manifestarse en estos genes. De ellos, el gen cag7 es el

que presenta un gran contenido de secuencias repetidas en comparación con el resto,

encontrándose no funcional en la cepa G27. Las proteínas ricas en cisteína presentaron

repeticiones en tándem con mayor frecuencia en la secuencia de la cepa B38.


34

Cuadro 4. Distribución de las repeticiones en tándem (> 100 pb con 80 % de identidad en

cada copia).

Cepa Posición inicial

Posición final

Talla (>100 pb)

Copias Identidad (>80%)

Genes relacionados

26695 557039 557500 231 2 95.7 HP0527(cag7)

582034 582303 135 2 84.8 HP0527(cag7)

582743 582946 102 2 82.4 HP0547(cagA26)

126366 126629 132 2 82.2 HP0116 (ADN topoisomerasa I)

696789 696998 214 3 100 HP0651 (fucT)

J99 519828 520169 114 3 91.8 jhp0476(cag7)

520267 520500 117 2 95.3 jhp0476(cag7)

520706 521389 114 6 88.5 jhp0476(cag7)

545715 545984 135 2 84.8 jhp0495 (cagA26)

122334 122597 132 2 83 jhp0108 (ADN topoisomerasa I

659300 659509 105 2 81 jhp0596 (fucT)

HPAG1 521862 522095 117 2 88 HPAG1_0502 (cag7)

522622 523083 231 2 90 HPAG1_0502 (cag7)

523183 523410 114 2 95.6 HPAG1_0502 (cag7)


35

523612 524073 231 2 89.8 HPAG1_0502 (cag7)

522305 522532 114 2 93.9 HPAG1_0502 (cag7)

548147 548416 135 2 84.4 HPAG1_0524 (cagA26)

548914 549117 102 2 82.4 HPAG1_0524 (cagA26)

123713 123976 132 2 83 HPAG1_0116 (ADN topoisomerasa I)

348452 348883 108 4 81.2 HPAG1_0339 (hcpC, Proteína rica en cisteína)

G27 522416 522649 117 2 88 HPG27_486 (cag7) no funcional

523070 523303 117 2 88.5 HPG27_486 (cag7) no funcional

523530 523871 114 3 81.6 HPG27_486 (cag7) no funcional

550361 550630 135 2 84.8 HPG27_507 (cagA26)

125581 125844 132 2 83 HPG27_108 (ADN topoisomerasa I)

666089 666298 105 2 87.1 HPG27_613 (FucT)

346128 346343 108 2 80.1 HPG27_317 (HcpC, Proteína rica en cisteína)

1166908 1167339 108 4 85.5 HPG27_1061(HcpC, Proteína rica en cisteína)

P12 561599 561832 117 2 88 HPP12_0534 (cag7)

562692 563033 114 3 95.9 HPP12_0534 (cag7)


36

563118 563579 231 2 94.4 HPP12_0534 (cag7)

587679 587948 135 2 85.9 HPP12_0555 (cagA26)

588404 588709 102 3 87.6 HPP12_0555 (cagA26)

705632 705841 105 2 88.6 HPP12_0664 (fucT)

125211 125474 132 2 82.6 ADN topoisomerasa I

Shi470 835142 835603 231 2 93.1 HPSH_04285 (cagY7)

835698 836153 114 4 93.2 HPSH_04285 (cagY7)

836360 836593 117 2 88.5 HPSH_04285 (cagY7)

805220 805489 135 2 84.1 HPSH_04145 (cagA26)

113185 113448 132 2 82.2 HPSH_00585 (DNA topoisomerasa I)

331954 332277 108 3 88 HPSH_01745 (HcpC, Proteína rica en cisteína)

B38 1521343 1521882 108 5 80.4 HELPY_1534 (HcpC, Proteína rica en cisteína)

335529 335852 108 3 81.8 HELPY_0339 (HcpC, Proteína rica en cisteína)

705085 705294 105 2 94.3 HELPY_0720 (fucT)

120053 120316 132 2 82.2 HELPY_0116 (ADN, topoisomerasa I)


37

8.8. Reconstrucción del genoma ancestral de H. pylori

En el contexto de los rearreglos genómicos, los genomas son vistos como matrices

de permutación, donde cada integral es tomada como un marcador único o gen individual y

el signo corresponde a la orientación en la cual se transcribe el genoma. Utilizando el

algoritmo MAUVE, se construyó una matriz de permutación a partir de los taxones de

estudio (cuadro 5), que posteriormente se analizaron con el programa MGR (Multiple

Genomes Rearragments), para generar un árbol filogenómico (figura 4).

El análisis con el programa MGR, identificó los ancestros putativos de los genomas

de H. pylori y el número de eventos (rearreglos) en la ruta evolutiva, desde el ancestro más

antiguo hasta los siete genomas actuales secuenciados. Esta reconstrucción recuperó cinco

ancestros (A8, A9, A10, A11, A12) y se presenta el posible orden histórico de cada uno de

ellos (cuadro 5). Los potenciales ancestros están localizados en los nodos del árbol. El

programa MGR calculó un total de 34 eventos a lo largo de la ruta evolutiva.


38

Cuadro 5. Matriz de permutación que indica el orden génico de los genomas de H. pylori y

el orden génico ancestral sugerido por MGR.

Cepa Sintenia de los bloques

26695 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

34 35 J99 1 6 2 -18 4 5 7 8 9 10 -11 12 13 -14 15 16 -17 -3 19 20 21 22 23 24 28 -29 30 31 -25 -27 -

26 -32 33 35 34 HPAG1 34 1 2 -18 4 5 6 7 8 9 -22 10 11 12 13 -14 15 16 -17 -3 19 -23 -21 -20 24 28 29 30 -31 -25 -

27 -26 32 33 35 G27 1 2 -18 4 5 6 7 8 9 -22 10 11 12 13 -14 15 16 17 -3 19 20 -21 23 24 28 29 30 31 -25 -27 -26

32 33 34 35 P12 1 2 -18 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 -17 -3 19 20 21 22 23 24 28 29 30 31 -25 -27 26 -

32 33 35 34 Shi470 1 2 -18 4 -15 -14 -13 8 -12 -11 -10 22 -9 -7 -6 -5 16 -17 -3 19 20 -21 23 24 28 29 -25 30 31

-27 -26 -32 33 35 34 B38 1 2 -18 4 -15 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 16 17 -3 19 20 21 22 23 24 28 29 30 31 -25 -

27 -26 32 33 34 35

A8 1 2 -18 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 -3 19 20 21 22 23 24 28 29 30 31 -25 -27 -26 32 33 34 35

A9 1 2 -18 4 5 6 7 8 9 -22 10 11 12 13 -14 15 16 17 -3 19 20 21 23 24 28 29 30 31 -25 -27 -26 32 33 34 35

A10 34 -35 -33 -32 26 27 25 -31 -30 -29 -28 -24 -23 -21 -20 -19 3 17 -16 -15 14 -13 -12 -11 -10 22 -9 -8 -7 -6 -5 -4 18 -2 -1

A11 1 2 -18 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 -14 15 16 -17 -3 19 20 21 22 23 24 28 29 30 31 -25 -27 -26 -32 33 35 34

A12 1, 2, -18, 4, 5, 6, 7, 8, 9, -22, 10, 11, 12, 13, -14, 15, 16, -17, -3, 19, 20, 21, 23, 24, 28, 29, 30, 31, -25, -27, -26, -32, 33, 35, 34

El análisis del árbol filo-genómico, generado a partir de los genomas provenientes

de diversas partes del mundo, indica tres grupos monofiléticos: hp Amerindio (Shi470 P12)

hp África (J99) y hp Europa (26695, B38, G27, HPAG1). Este árbol apunta que el taxón

amerindio Shi470 es más cercano al grupo Hp África. En el grupo anteriormente

mencionado, Hp P12 está muy relacionado a Hp J99, sugiriendo una relación con el grupo


39

hp África, aunque provine de una región europea. Además, el árbol sugiere que shi470 es el

descendiente más cercano al ancestro del cual se originan las diferentes especies de

Helicobacter.

Por otra parte, los taxones que conforman al grupo hp Europa está formado por los

taxones HPAG1, G27, B38 y 26695. En este grupo se advierte que del ancestro donde

deriva HPAG1 (colocándolo en una rama aislada) descienden los ancestros de los taxones

G27, B38 y 26695. En este grupo, se demuestra que las cepas 26695 y B38 están muy

relacionados al constituir el único clado del grupo europeo. Por otro lado, el árbol indica

que H. pylori ha evolucionado a través de mecanismos de especiación periprátida.

Figura 4. Árbol filogenómico de H. pylori basado en la historia de las inversiones. Utilizando el programa

MGR se construyó el árbol filo-genómico que indica la posición de los potenciales ancestros colocándolos

como nodos en el árbol y el número de pasos desde el potencial ancestro hasta los taxones terminales.


40

8.9. Análisis de la recombinación intra-especies de H. pylori

Los patrones de recombinación estuvieron más marcados en los genes de virulencia,

dentro de ellos destacan los genes cag7, cagA, y vacA, con el mayor número de eventos

confirmados (Cuadro 6). El gen cag7 presentó una gran cantidad de señales de

recombinación y eventos confirmados, seguido por el gen cagA. En el caso del gen cag14

no se encontraron evidencias de recombinación.

Los genes de mantenimiento también exhibieron eventos y señales de

recombinación. De manera interesante, los genes que mostraron estos patrones fueron

genes involucrados en la división celular (ftsA y ftsH).

Cuadro 6. Eventos y señales de recombinación identificados en los genes de virulencia y

genes de mantenimiento provenientes de diversas cepas de H. pylori.

Genes de

virulencia

Eventos de

recombinación

Señales de

recombinación

Genes de

Mantenimiento

Eventos de

recombinación

Señales de

recombinación

cag3 4 19 dnaA 1 5

cag5 11 52 dnaJ 3 9

cag7 43 265 dnaK 1 3

cag8 3 11 ftsA 5 27

cag9 2 3 ftsH 3 10

cag14 0 0 ftsZ 1 5

cag19 3 8 glnA 2 3

cag23 5 24 groEL 0 0

cag25 1 3 recN 1 4

cagA 27 226 rpoD 2 2

VacA 30 253


41

8.10. Análisis de la recombinación intra-especies de los genes vacA y cagA

Los genes vacA y cagA son de gran importancia debido al gran potencial virulento

que los ha asociado como principales desencadenantes de las patologías asociadas a H.

pylori. En las bases de datos públicas existen una gran cantidad de secuencias disponibles

que provienen de diferentes partes del mundo.

El análisis de las regiones recombinantes de las 95 secuencias completas de los

genes cagA muestran con claridad el alto potencial de recombinación intra-especies de

dichos genes. El gráfico proporcionado por RAT (figura 5) indica distancias genéticas en el

rango de 0.75 a 0.9 y sugiere altas diferencias a nivel genético. Por otro lado, en el gráfico

se aprecia claramente la existencia de dos grupos distintos, que posteriormente se

recombinan en la posición del alineamiento 2079 a la posición 2772 y nuevamente en las

posiciones 4389 y 4620 evidenciando las zonas de mayor recombinación. Los grupos se

relacionan con las áreas geográficas de donde fueron aisladas, la línea mas gruesa (parte

superior en el gráfico) corresponde a las cepas del continente asiático, y la línea más

delgada (parte inferior en el gráfico) corresponde a cepas del continente europeo

incluyendo algunas cepas del continente asiático.


42

Figura 5. Resultado de la salida originada por el programa RAT para el gen cagA. La líneas en el grafico

representan las distancias genéticas (eje Y) y las coordenadas del alineamiento (eje X). Las líneas coloreadas

representan cada una de las secuencias comparadas analizadas y que se muestran en el panel izquierdo. El

entrecruzamiento de las líneas se interpreta como un evento de recombinación.

El gen vacA presenta más variaciones en las distancias genéticas que se ubican en el

rango de 0.6 y 0.95. Indicando un parecido más cercano en las secuencias con más

identidad ubicadas en el rango de 0.6, y tiene a la vez un mayor número de diferencias

genéticas cuando divergen ubicándose en el rango de 0.95. En el gráfico claramente se

advierte un potencial de recombinación mayor que el gen cagA (figura 6). La primera zona

recombinante se ubica en las coordenadas 1057 a la 1735. Posteriormente, al igual que el

gen cagA, se manifiesta una separación apreciándose dos poblaciones de secuencias y

vuelven a recombinarse en la coordenadas 3769, extendiéndose a la posición 4447. Al igual

que en el gen cagA, la división de grupos en el gen vacA se relacionan con las áreas

geográficas de donde fueron aisladas las cepas utilizadas en este análisis, la línea más


43

gruesa (parte inferior en el gráfico) corresponde a las cepas del continente asiático, y la

línea más delgada (parte superior en el gráfico) corresponde a cepas del continente europeo

incluyendo también algunas cepas del continente asiático.

Figura 6. Resultado de la salida originada por el programa RAT para el gen vacA. La líneas en el gráfico

representan las distancias genéticas (eje Y) y las coordenadas del alineamiento (eje X). Las líneas coloreadas

representan cada una de las secuencias analizadas y que se muestran en el panel izquierdo. El

entrecruzamiento de las líneas se interpreta como un evento de recombinación.

De forma interesante, las regiones que presentan mayor recombinación están

asociadas a las zonas de las secuencias relacionadas con la patogénesis de la bacteria. En el

caso del cagA los motivos de fosforilación de tirosina (EPIYA) que están relacionados con

el daño a la célula gástrica y en el caso del gen vacA están relacionados con la región

mosaico S1 y la con capacidad citotóxica de dicho elemento.


44

8. 11. Análisis filogenético de los genes vacA y cagA

Los genes de H. pylori tienden a mostrar un patrón geográfico, motivo por el cual se

realizó un análisis filogenético de los genes vacA y cagA. En la revisión de estos patrones,

se utilizó el total de las secuencias obtenidas del NCBI. La mayoría de las secuencias

recolectadas son de origen asiático (Apéndice 4).

El árbol filogenético construido con secuencias del gen cagA revela tendencias filo-

geográficas. En el árbol se distinguen tres grupos A, B y C. los grupos A y C son

claramente los más grandes. El grupo B sólo lo conforma la cepa OK 197. El grupo A, se

puede subdividir en 5 subgrupos. En este grupo donde predominan cepas del continente

europeo, se encuentran cepas del continente asiático, todas originarias de la población de

Okinawa Japón. Estas forman parte de los primeros 3 subgrupos. En el grupo A, se

encuentra la cepa J99 clasificada como parte del grupo hp África. Dicha cepa es más

cercana a las cepas del continente asiático junto con las cepas de Holanda 147A y 147C,

indicando una relación entre ellas. El subgrupo 5 está formado en gran parte por cepas del

continente europeo, excepto por las cepas 2018, 2017, 908 de la India y las cepas de origen

asiático ss1 y F79. Las cepas de la india están muy relacionada con la cepa 26695,

originaria de Inglaterra, lo que es coherente tomando en cuenta que la India fue una colonia

de dicho país. El grupo C es el que manifiesta claramente una delimitación geográfica. Este

grupo está formado por cepas del continente Asiático, principalmente por cepas originarias

de las poblaciones de Okinawa y Fukui Japón, excepto la cepa amerindia Shi470,

originaria del Perú lo que indica una fuerte relación con las poblaciones asiáticas.

El análisis del árbol filogenético del gen vacA también se divide en tres grupos D, E

y F, que presentan, al igual que el gen cagA, patrones de división geográfica. Los grupos D


45

y F son los más grandes “clados” y el grupo E solo está formado por la cepa asiática Ch2

originaria de China. El grupo D es notoriamente el más grande por lo que se dividió en dos

subgrupos (D1 y D2) para su mejor entendimiento. El subgrupo D1 está conformado por

cepas provenientes del continente asiático en donde sobresale la división geográfica al

separarlo del resto de los otros taxones de estudio. El subgrupo D2 se subdivide en cinco

sub-subgrupos, en donde se encuentran las cepas provenientes del continente europeo. En

este subgrupo, la cepa amerindia shi470 también se encuentra muy relacionada a cepas del

continente asiático. En los sub-subgrupos 4 y 5 se encuentran las cepas provenientes del

continente europeo. En el sub-subgrupo 4, se localizan las cepas del continente africano,

confirmando la relación de la cepa estadounidense J99 con el grupo africano, al ser la cepa

más relacionada a las cepas originarias de la población de Kenia AFN4124, AFNG144,

AFN4769, AFN4847. La única cepa mexicana (4647C) es la más cercana a este grupo

indicando que las cepas de H. pylori de origen mexicano podrían descender de ancestros

africanos. Los sub-subgrupos 4 y 5 son muy heterogéneos ya que, además de que el grupo

africano se encuentra relacionado a cepas europeas, también se encuentra tres cepas del

continente asiático (F80, F92, F37) existiendo una alta diversidad en las secuencias de estas

cepas.

El grupo F está formado casi por completo por cepas del continente asiático, similar

al grupo A del gen cagA y formado principalmente por cepas provenientes de la ciudad de

Okinawa y algunas de China. En este grupo destacan dos cepas de orígenes distintos y que

forma un “clado”, por lo que están muy relacionadas. Las cepas que forman dicho “clado”

son las cepas Tx30a de origen estadounidense y la cepa africana AFN1156.


46

Figura 7. Árbol filogenético construido a partir de secuencias completas del gen cagA. Las letras en rojo

indican los principales grupos del árbol. Los números indican las sub-poblaciones dentro del grupo principal.

Los puntos azules señalan las cepas comentadas en el texto.


47

Figura 8. Árbol filogenético construido a partir de secuencias completas del gen vacA. Las letras en rojo

indican los principales grupos del árbol. Los números indican las sub-poblaciones dentro del grupo principal.

Los puntos azules señalan las cepas comentadas en el texto.


48

9. DISCUSIÓN


En el estudio de la evolución de patógenos, una lógica a menudo aceptada es que la

adaptación bacteriana a su hospedero es en gran parte debida a genes específicos. Este

punto de vista muy común ha relegado la idea plausible de que la adaptación de las

bacterias al hospedero se debe principalmente al genoma núcleo. El genoma núcleo de H.

pylori es de interés, en razón de que muchos de sus genes son probablemente esenciales

para la colonización del estómago humano. Estudios previos, realizados en 56 cepas de la

especie H. pylori, analizaron el genoma núcleo mediante metodología basada en

microarreglos, reportando un total de 1150 genes en común para las 56 cepas (Gressman, et

al., 2005).

En el presente trabajo, se analizaron las secuencias genómicas de siete cepas

provenientes de diferentes regiones geográficas y de diferentes aislamientos. Se

identificaron 1166 secuencias codificantes que estaban presentes en los siete genomas

secuenciados. El resultado obtenido es el más cercano al genoma núcleo predicho para la

comparación de genomas entre varias cepas, estimado en 1111 secuencias codificantes

(Gressmann et al., 2005).

Además de analizar el genoma núcleo de la especie H. pylori, también se analizó el

genoma núcleo de género Helicobacter al comparar los siete genomas con otros dos

genomas pertenecientes este género (H. pylori y H. acinonychis) obteniendo un número

reducido de secuencias codificantes de 382. El número de secuencias codificantes que

comparten H. pylori y H. acinonychis es acorde con los resultados obtenidos por Eppinger


49

et al., (2006), al informar de un gran número de secuencias codificantes que comparten H.

acinonychis y H. pylori. Por otra parte, H. hepaticus es el genoma que comparte un menor

número de secuencias con H. pylori y H. hepaticus sólo presenta una diferencia de cuatro

genes en comparación con H. acinonychis.

La marcada diferencia entre el genoma núcleo de la especie H. pylori con el resto de

los genomas es un reflejo de los distintos nichos que habitan. La especie H. pylori habita en

el estómago humano, la cepa H. acinonychis habita en el estómago de felinos (Eppinger et

al., 2006) y la cepa H. hepaticus habita en el hígado de ratones (Suerbaum et al., 2003).

Consideramos que estos distintos nichos producen la gran variabilidad genética y quizás

debido a fenómenos de transferencia horizontal se podría explicar el número reducido de

genes que comparten estas tres especies.

Por otra parte, el método empleado para identificar los posibles genes del genoma

esenciales para la adaptación de la bacteria mediante la obtención primeramente del

genoma núcleo de la especie H. pylori y posteriormente utilizar este para obtener el genoma

núcleo del genero Helicobacter, y a partir de él determinar los genes exclusivos para

especie H. pylori, el presente estudio sugiere que es un enfoque correcto para la obtención

de genes fundamentales para la adaptación a nichos específicos. Esta aseveración, se hace

en base a los resultados obtenidos.

De los 75 genes que se encontraron por este método se obtuvieron secuencias

codificantes con función conocida. Estos pertenecen a proteínas de membrana externa

miembros de la familias HopF que son porinas y adhesinas, genes involucrados en la

formación del co-factor molibdeno de las metalo-enzimas que participan en el metabolismo


50

del nitrógeno, sulfuro y sustratos que contienen carbono. Otro grupo de genes se relaciona

con la utilización de hierro y otros metales. De forma interesante, diecinueve de estos genes

se ha comprobado que son esenciales para la adaptación al hospedero. La función de dichos

genes fue establecida mediante un perfil transcripcional de genoma completo en la cepa

HPAG1, realizado a niveles variables de pH (Oh et al., 2006). En la determinación

funcional de dichos genes sobresalieron los genes relacionados con la formación del co-

factor molibdeno y los de unión a metales, al ser los que más expresaban al exponer el

organismo a cambios de pH comprobando su importancia para la adaptación al hospedero

(Oh et al., 2006). Por lo tanto se sugiere que los genes encontrados y que prevalecen de

manera exclusiva en la especie H. pylori son vitales para la adaptación al hospedero.

9.2. Orden génico

Los rearreglos en el genoma son procesos universales en los organismos procariotas

y son resultado de eventos de recombinación (Eisen et al., 2000; Tillier y Collins 2001).

Los organismos evolucionan a través de diferentes tipos de arreglos genómicos. Estos se

deben a varios procesos tales como mutaciones aleatorias, duplicaciones del ADN, pérdida

de material genético (genes), inversiones y translocaciones e integración de nuevos

elementos genéticos. Debido al fenómeno de transferencia horizontal y con el surgimiento

de la disciplina de genómica comparativa, estas aseveraciones han sido confirmadas.

Los rearreglos tienen impactos profundos en el fenotipo del organismo (Couturier y

Rocha, 2006). Los análisis basados en genómica comparativa y usando los genomas

completos de Mycoplasma genitalum vs Mycoplasma pnumoniae indicaron que estas


51

especies, a pesar de estar muy relacionadas, presentan un orden diferente debido a

translocaciones de seis segmentos de sus genomas (Himmelreich et al., 1997). Otras

comparaciones revelaron que las inversiones y translocaciones son de utilidad para

distinguir especies muy relacionadas como se demostró en la comparación de genomas de

las bacterias Neisseria meningitidis vs Neisseria gonorrhoeae (Dempsey et al., 1995),

Mycobacterium tuberculosis vs Mycobacterium bovis (Brosch et al., 2000).

La comparación genómica de las diferentes cepas de H. pylori con el programa

MAUVE produjo una descripción completa de los patrones mencionados de donde

sobresalen las inversiones y translocaciones. En la comparación de los genomas de la

especie H. pylori, se observa que la mayor diferencia entre los siete genomas es la

frecuencia de los rearreglos genómicos que llegan a alterar el orden génico.

Los rearreglos en el genoma claramente distinguen a tres especies de H. pylori

(Hp26695, HpShi470, HpB38) del resto de los genomas. Donde la inversión y

translocación de dos segmentos del genoma de hp 26695 parece ser un rasgo específico de

este genoma. En contraste, la organización genómica en HpShi470 y HpB38 es claramente

distinta de las estructuras del resto de los genomas al presentar ambos la inversión y

translocación del gran segmento de 470 kb en la unión de la proteína putativa de los canales

de potasio (HP0490) y de una proteína hipotética (HP0879). De esta manera, los siete

genomas secuenciados presentan tres tipos principales de estructuras genómica, sugiriendo

que la organización del genoma es muy diversa en la especie H. pylori.

En el estudio de la organización de los genomas también se observó un rearreglo

constante a través de la evolución de los organismos procariotas consistente en inversiones


52

alrededor del origen de replicación (Hugues, 2000). Esto ha quedado demostrado en la

comparación de genomas de diversos procariotas tales como Vibrio cholera-E. coli,

Streptococus pneumoniae-Streptococcus pyrogenes, y Mycobacterium tuberculosis-

Mycobacterium leprae. Dichas inversiones forman un patrón en forma de X, que invierte la

secuencia genómica simétricamente alrededor del eje de replicación (Eisen et al., 2000).

Otro estudio reciente realizado en genomas de Yersinia pestis encontró esta misma

característica a una distancia igual del origen de replicación y al final de la inversión en

todos los genomas, indicando que la replicación está en balance (Darling et al., 2008). Los

rearreglos encontrados en esta localización están sujetos a intensa tasas de reorganización y

recombinación como lo indican los estudios realizados en especies de Clamydia (Read et

al., 2000). En H. pylori se conserva este rasgo evolutivo alrededor de su origen de

replicación, por lo que al igual que los genomas comentados anteriormente, este sitio está

sujeto a recombinación y la replicación en la especies de H. pylori se encuentra en balance.

Por otro lado, los rearreglos en el genoma bacteriano pueden alterar la funcionalidad

del material genético que lo conforma. Dichos rearreglos pueden impactar la expresión

génica si éstos ocurren dentro de un marco de lectura abierto, causando la pérdida total de

la función del gen (Darling et al., 2008). Esto se ha demostrado en la bacteria Lactococcus

lactis, mediante la inducción de inversiones en el cromosoma que afectaron la habilidad de

la bacteria para subsistir a su medio habitual (Campo et al., 2004). En contraste, en H.

pylori los rearreglos no impactan la expresión génica ya que la mayoría de los rearreglos

están flanqueados por secuencias codificantes hipotéticas o de mantenimiento intactas

(cuadro 7).


53

En oposición a lo anterior, se ha observado en bacterias patógenas del ser humano

que el incremento substancial de inversiones y translocaciones aumentan el potencial de

adaptación al hospedero al reforzar su capacidad infecciosa. El incremento de estos

rearreglos refleja la respuesta bacteriana hacia el sistema inmune del huésped (Hugues,

2000). En el presente estudio, se encontró un marcado incremento en las inversiones y

translocaciones en algunas cepas de H. pylori (26695, Shi470, B38) apuntando su relación

hacia una respuesta bacteriana para evadir el sistema inmune humano. Entonces, H. pylori

necesita reorganizar el genoma en respuesta al ataque del sistema inmune del huésped, ya

sea para evadirlo o resistir la agresión y salvaguardar su existencia.

9.3. Isla de patogénesis y Zonas de plasticidad

La isla de patogenicidad es considerada como una zona plástica y se encuentra

asociada a la virulencia de la bacteria. Las bacterias que expresan este elemento inducen

alteraciones patológicas en la mucosa gástrica promoviendo el desarrollo de la enfermedad

(Bourzac y Guillemin, 2005). En la primera comparación de los genomas secuenciados

(26695 y J99), se observó una inusual zona discrepante en cuanto a contenido y

organización de genes específicos. Debido a la alta variabilidad genética de estas regiones

se le llamó zona de plasticidad (Tomb et al., 1997; Alm et al., 1999). Varias de las

secuencias codificantes pertenecientes a estas zonas han sido asociadas con mecanismos de

recombinación especializados (XerT) (Barre y Sherratt, 2002), en la regulación del súper-

enrollamiento del ADN y la expresión génica (topA, ADN polimerasa I) (Forterre et al.

2007) y en la separación del ADN en la división celular o en la preparación del ADN para

la transferencia por medio de conjugación (parA) (Surtees y Funell, 2003). También se ha


54

encontrado unido a estas secuencias otro tipo de agrupamiento de genes que codifica

proteínas del complejo de secreción tipo IV, llamado tfs3; también perteneciente a la zona

de plasticidad. Los datos anteriores han llevado a la teoría de que las zonas plásticas son

esenciales en la patología originada por la especie H. pylori. Contrario a lo anterior y lo

interesante de las zonas de plasticidad en el presente trabajo, no es la presencia de ellas,

sino más bien la carencia de las mismas.

En un estudio reciente, reportan que la infección por cepas de H. pylori que

contienen la citotoxina vacA y que portan el genotipo s1/m1, precede y probablemente

causa hipoclorhidria gástrica aumentando el riesgo para desarrollar cáncer (Argent et al.,

2008). En la presente comparación genómica, dos cepas de H. pylori (B38, HPAG1) fueron

aisladas de pacientes con una alteración en común, la hipoclorhidria, y ambas tienen

relación con un proceso neoplásico. La cepa HPAG1 fue aislada de un paciente con

gastritis atrófica, una condición clínica donde se encuentra disminuida la secreción de ácido

debido a la atrofia de las células parietales gástricas y además es un estado pre-maligno, por

lo tanto un factor para desarrollar cáncer gástrico (Fuchs y Mayer 1995). La cepa B38 fue

aislada de un paciente con MALT que es un proceso canceroso donde, al igual que la

gastritis atrófica, se encuentra la misma alteración fisiopatológica, la hipoclorhidria.

Aunado a las relaciones en común que tienen estas dos bacterias en la comparación de

genomas, se observó en ambas la ausencia de la zona de plasticidad, agregando una nueva

característica en común. Los hallazgos descritos indican una débil relación entre las zonas

de plasticidad y los estados neoplásicos. Por lo que al parecer, las islas y las zonas plásticas

que presentan en su interior genes linaje-específicos sólo tienen relación con los cuadros

clínicos iniciales asociados a H. pylori, evidenciado fuerzas de presión de selección positiva


55

en las primeras fases y conforme la enfermedad progresa hacia una atrofia de las células

gástricas, se sugiere que la especie H. pylori tiende a reducir su genoma para adaptarse al

nuevo ambiente carente de ácido, propio de la gastritis atrófica y las neoplasias del

estómago. Por ende, la pérdida de genes indica que H. pylori está sujeta a presión de

selección negativa en estadios neoplásicos o pre-malignos. El manejo ambiguo de las

fuerzas de presión selectivas positiva y negativa evidencian la alta flexibilidad evolutiva de

la especie H. pylori.

9.4. Secuencias repetidas

Los rearreglos en la mayoría de los casos son consecuencia de recombinación

homóloga entre secuencias repetidas de orientación directa en los genomas bacterianos. Las

secuencias repetidas de orientación directa por medios de recombinación permiten la

“deleción” o duplicación de las secuencias involucradas (Chédin et. al., 1994). Estos

hechos se han comprobado en H. pylori mediante análisis por computadora y experimental

(Aras et al., 2003).

El análisis del primer genoma secuenciado (H. pylori 26695) indicó la presencia de

numerosas secuencias de ADN repetidas (Tomb et al., 1997). En este trabajo se analizó el

número total de estas estructuras genéticas encontrando una gran prevalencia en todos los

genomas, lo que sugiere un gran potencial de recombinación en el genoma de la especie H.

pylori. Las secuencias repetidas existen en mayor número en el genoma de H. pylori

HPAG1, una cepa aislada de un paciente con gastritis atrófica. La cepa HPAG1, además de

la presencia de estas estructuras, carece de la zona de plasticidad (zona de la cual se sugiere


56

que los genes que la conforman están involucrados en la adaptación de la bacteria). En el

caso de la bacteria HPAG1, que tiene una mayor presencia de secuencias repetidas

comparadas con el resto, podría estar sujeta a intensa recombinación y éste sería el posible

mecanismo de adaptación de la bacteria a un medio donde la secreción de ácido se

encuentra disminuida a causa de la atrofia de las células parietales gástricas. Aunque la

cepa Hp B38 también fue aislada de un paciente con una patología (MALT, linfoma del

tejido linfoide asociado a mucosas), donde se encuentra disminuida la secreción de ácido e

igualmente presenta la ausencia de la zona de plasticidad (incluyendo la isla de

patogenicidad) exhibe una menor cantidad de secuencias repetidas. En contraste con

HPAG1, el taxón B38, contiene una mayor frecuencia de rearreglos. El aumento en la

frecuencia de los rearreglos se ha asociado con la capacidad de los organismos para evadir

el sistema inmune lo que indica también una alta tasa de recombinación molecular (Hugues,

2000). La cepa B38, como se comentó anteriormente, fue aislada de un paciente con MALT

que es una proliferación neoplásica monoclonal de linfocitos B que infiltran las glándulas

gástricas, por lo tanto, incrementa la respuesta inmunitaria del huésped, por lo que los

rearreglos tal vez sean una manifestación del genoma para eludir los mecanismos de

defensa del huésped.

9.5. Naturaleza de las repeticiones en tándem

En el presente trabajo, se observó una marcada predilección de las repeticiones en

tándem por ciertos elementos genéticos tales como las fucT, hcpC, topA, cag 7 y cagA;

todos ellos con características muy interesantes y relacionadas.


57

Las proteínas ricas en cisteína son específicas de la familia épsilon bacteria, que

incluye al género Helicobacter. Un análisis del secretoma de H. pylori encontró que las

proteínas inmunogénicas ricas en cisteína se encontraban en los sueros de pacientes con

cáncer (Haas et al., 2002). Por otra parte, las proteínas ricas en cisteína (HcpC) están

involucradas en la respuesta inmunitaria de células T (Th1) exacerbada por la infección de

H. pylori que inducen la producción de IL12 dependiente de la secreción de interferón

gamma (INF) (Aigner et al., 2002).

Los lipopolisacáridos son componentes principales de la membrana externa de las

bacterias Gram-negativas. Las moléculas de lipolisacáridos están compuestas de un lípido

tipo A anclado a la bicapa lipídica, un conservado centro de glicoproteínas y una cadena O

antigénica. Los genes que codifican a las fucosiltransferasas están presentes en aislados de

H. pylori que exhiben los antígenos de Lewis en la cadena O. La presencia de estos

antígenos en la superficie de la bacteria tiene diversas funciones biológicas.

La presencia de estos antígenos está involucrado en la promoción de la adhesión y

colonización bacteriana, escape del sistema inmune del hospedero a través de mimetismo

molecular, modulación de la respuesta inmune del hospedero través de la interacción con

células del sistema inmune y la inducción de autoinmunidad gástrica (Moran, 2008).

El gen de la topoisomerasa I tiene mayor actividad al remover el superenrollamiento

negativo del ADN. Dicho elemento parece ser esencial en H. pylori (Suerbaum et al.,

1996) ya que es uno de los genes regulados durante exposición prolongada al medio ácido

sugiriendo que es requerido para resistir a los retos que impone el estómago humano (Dong


58

et al., 2001). Se ha observado en E. coli que la pérdida del gen topA disminuye

significativamente la resistencia al medio ácido (Stewart et. al., 2005).

La topoisomerasa I junto con la topoisomera IV y la ADN girasa juega un papel

importante en el superenrollamiento local y global. Estudios realizados en H. pylori

basados en la regulación transcripcional indican que durante el proceso de

superenrollamiento a nivel global, este puede coordinar la regulación de la síntesis del

flagelo (Yea et al., 2007).

Los genes cag7 y cagA se encuentra inmersos en la isla de patogénesis, que a su vez

está correlacionada con la severidad de las enfermedades atribuidas a H. pylori. El gen cag7

interactúa con la membrana interna y externa de la bacteria (Busler et al., 2006) y está

asociado con la formación estructural del pili entre la bacteria y las células del hospedero

(Kersulyte et al., 2003) por lo que participa en la inyección de la proteína CagA dentro de

la célula. El gen cagA, produce la proteína CagA que una vez dentro de la células gástricas

aumentan la producción de IL 8, interrumpe las señales de transducción y estimula

actividad de las fosfatasas, causando daños que llevan a la atrofia de las células gástricas.

Los datos anteriores muestran que los genes que contienen un mayor número de

secuencias repetidas están muy relacionados con el sistema inmune del hospedero ya sea

imitándolo ó evadiéndolo. Se relacionan también con la capacidad de colonización de la

bacteria y, por lo tanto, con la adaptación al medio ácido. La presencia de las secuencias

repetidas en genes selectos indica un potencial de recombinación intra-genómico muy

selectivo. La presencia de dichas secuencias de manera no aleatoria, manifiesta a H. pylori

como un organismo inteligente diseñado para sobrevivir en el medio ácido del estómago


59

humano y que a su vez tiene la capacidad de transformarlo a un medio carente del mismo,

al dañar la células gástricas.

9.6. Genoma Ancestral

Los estudios de evolución molecular están basados generalmente en el análisis

individual de genes en lugar de genomas enteros. Sin embargo, los fenómenos de

transferencia horizontal, pérdida diferencial de genes y otros diversos mecanismos, a

menudo llevan a situaciones en la cuales los árboles evolutivos indican diferentes historias

a lo largo de la ruta evolutiva. Un enfoque alternativo es inferir la historia evolutiva de

genomas completos, en vez de genes individuales. Este enfoque está basado en análisis del

orden génico (Pevzner y Tesler 2003).

Utilizando el algoritmo MGR, que se basa en el orden y orientación de diferentes

segmentos del genoma, se construyo un árbol que representa la historia evolutiva de los

genomas secuenciados al presente. El árbol está acorde con estudios realizados en genes

individuales al presentar señales de división geográfica.

En el caso de Hp shi470, una cepa amerindia, el árbol sugiere que es el genoma más

cercano al potencial ancestro del cual descienden los demás taxones, por lo tanto es el

organismo que ha evolucionado menos con respecto al organismo original. Los datos

aportados por el análisis filo-genómico son congruentes con estudios previos que reportan a

esta cepa como descendiente de organismos pertenecientes al grupo Hp Este-Asiático a su

vez este es cercano al grupo Hp África donde pertenece la cepa J99 (Falush et al., 2003)

por lo que tal vez las bacterias de este grupo son más cercanas al ancestro antiguo en


60

relación a los demás grupos. Aunado a lo anterior, shi470 es un aislado de un habitante de

una región remota del Perú que ha tenido poco contacto con la civilización moderna

(Kersulyte et al., 2009), por lo tanto menos expuesta a cambios evolutivos, reforzando la

hipótesis de que es el organismo menos evolucionado.

Los genomas pertenecientes al continente europeo tienden a agruparse, aún en el

análisis de genomas completos, indicando una estrecha relación a nivel de estructura

genómica no sólo a nivel de genes individuales. Esto sugiere que los análisis filo-

genómicos pueden ser una herramienta útil para estudiar la historia evolutiva, como podría

ser el ser humano que es el hospedero natural de H. pylori.

9.7. Recombinación intra-especies

La importación de ADN en procariotas se lleva a cabo por tres mecanismos

principales: 1) conjugación (conexión física entre dos bacterias), 2) transducción (mediado

por bacteriófagos y plásmidos) y 3) transformación natural (sustracción activa de ADN

extracelular a través de la pared celular de la bacteria transformante). Se ha sugerido que la

importación de ADN es importante para la adaptación de H. pylori al hospedero

(Montecucco y Rappuoli, 2001). Un estudio demostró que en efecto, la recombinación es

un paso critico para mediar la persistencia de dicho microbio patógeno a través de la

inducción de repuestas inmune inefectivas (Robinson et al., 2005).

En el presente trabajo se estudiaron los patrones de recombinación intra-especies en

diez genes de virulencia de la isla de patogenicidad, diez genes de mantenimiento y el gen

vacA. Los genes de virulencia mostraron mayores eventos de recombinación en


61

comparación con los genes de mantenimiento. De los genes de virulencia, los genes cag7,

cagA y vacA presentaron mayores eventos de recombinación homologa intra-especies.

Los genes cag7 y cagA, como se ha comentado anteriormente, están relacionados

con el sistema inmune del hospedero. En esta parte de la investigación también destacan

por su capacidad de recombinación pero, en este caso, entre diferentes cepas de H. pylori,

indicando tanto potenciales de recombinación intra-genómicos (a través de las secuencias

repetidas) como inter-genómicos (a través de la recombinación intra-especies).

El gen vacA, presenta mayor número de eventos de recombinación que el gen cagA,

éste presenta escasas secuencias repetidas en comparación con el gen cagA, sugiriendo que

el gen vacA obtiene su capacidad virulenta principalmente a través de la recombinación

homóloga entre especies.

En las situaciones de los genes cagA y vacA, resaltan las zonas recombinantes por

desplegar, manifiesta preferencia por las regiones de la secuencia donde se ha comprobado

que interviene en la habilidad infecciosa, en este caso los motivos EPIYA para el gen cagA

y la región señal (S) de vacA. Estos datos sugieren también importación selectiva de ADN

para determinadas regiones.

9.8. Filogenia del gen cagA y vacA

En el presente estudio se analizaron las secuencias completas del gen cagA de 96

cepas provenientes de diferentes partes del mundo, así mismo se analizaron 93 secuencias

del gen vacA también de diversas geografías, con el fin de evaluar su historia evolutiva.


62

Helicobacter pylori es una bacteria que se adquiere durante la infancia y persiste

durante toda la vida en el estómago humano, usualmente la transmisión es intrafamiliar, por

lo que se ha propuesto como un marcador genético ideal para estudiar la evolución humana

(Wirth et al., 2004).

Las cepas de H. pylori de diferentes áreas geográficas se han asociado con clara

diferenciación filo-geográfica (Wirth et al., 2004; Eppinger et al., 2006). A pesar de las

altas frecuencias de recombinación, las especies de H. pylori pueden subdividirse en varias

poblaciones (HpEuropa, HpAsia2, HpEste-Asiatica, HpAfrica1, HpAfrica2, HpNEAfrica,)

(Suerbaum y Josenhans, 2007).

Nuestros resultados no difieren de este hecho, al encontrar fuertes señales de

separación geográfica tanto en el análisis del gen cagA, como el gen vacA. En ambos

árboles las cepas del continente asiático claramente se agruparon distantes de las cepas

originarias de otras geografías como las del continente europeo o africano. Un pequeño

grupo de las cepas del continente asiático, en su mayoría pertenecientes a la población de

Okinawa se separó del resto, acercándolas a cepas del continente europeo y la separación

de dicho grupo tiene una explicación. Las poblaciones de Okinawa han estado en contacto

con el mundo occidental desde tiempos históricos y desde mediados de siglo XX han tenido

presencia las poblaciones americanas (Satomi et al., 2006). Esto explica el patrón de

agrupamiento del árbol y el por qué algunas cepas del continente asiático se encuentran

relacionadas con cepas del continente Europeo. Un patrón similar que puede ser entendido

de la misma manera, se localizó en el árbol construido a partir de secuencias completas del

gen cagA. El patrón al que se hace referencia es el grupo formado por cepas del continente

Europeo, donde se encontraron tres cepas indias muy relacionadas con la cepa de Reino


63

Unido (26695). Este agrupamiento es coherente ya que el país de la India fue una colonia

británica. En la construcción del árbol a partir de secuencias del gen vacA, se confirma que

la cepa estadounidense J99 tiene raíces africanas al agruparse con cepas de origen Keniano

y la única cepa mexicana se relaciona también con este grupo. Por lo que es posible que las

cepas de H. pylori de origen mexicano formen parte del grupo Hp África. La cepa

amerindia shi470 se asoció en las dos construcciones filogenéticas con cepas del continente

asiático fortaleciendo su pertenencia a este grupo.


64

10. CONCLUSIONES

La comparación de los siete genomas de H. pylori indicó una amplia colinealidad

entre los genomas pero diferente orden génico. A través del análisis del orden génico se

identificaron tres principales estructuras, la primera que distingue a las cepas J99, HPAG1,

G27 y P12 por poseer una sintenia similar, la segunda estructura conformada por las cepas

Shi470 y B38 que se diferencian del resto por la gran inversión de que sufren sus genomas

y finalmente la estructura de la cepa 26695 que es la única que tiene translocados e

invertidos dos segmentos de su genoma, estas estructuras podrían permitir diferenciar cepas

de H. pylori de diferentes regiones. Así mismo, se determinó un contenido génico variable

en los siete genomas secuenciados, que se refleja en el genoma núcleo de H. pylori y del

género Helicobacter. Además, la determinación del genoma núcleo del género

Helicobacter permitió obtener 75 secuencias codificantes exclusivas de H. pylori que

podrían ser vitales para la adaptación al hospedero.

De la comparación de la estructura genómica de las islas de patogenicidad de las

diferentes cepas de H. pylori se observaron tres bloques colineales, indicando una

estructura conservada para este elemento genético donde destacó el rearreglo que invierte al

gen cag14 y la poca conservación del gen cag7 a diferencia del resto.

La investigación sugiere que en el curso de la enfermedad desde la infección inicial

y el paso de los diferentes cuadros clínicos de gastritis, H. pylori está sujeto a fuerzas de

presión selectiva positiva y conforme la enfermedad avanza a estadios de cáncer, la especie

H. pylori tiende a reducir su genoma como mecanismo de micro-evolución adaptación.


65

Las recombinaciones intra-genómicas e inter-genómicas (intra-especies) juegan un

papel preponderante en la adaptación de la bacteria al hospedero. De estos mecanismos las

secuencias repetidas y la recombinación intra-especies caracterizan a H. pylori como una

bacteria inteligente con la capacidad de decidir cuáles genes y qué regiones se deben de

recombinar.

Los mecanismos de recombinación intra-genómicos e inter-genómicos

probablemente son una manifestación de la bacteria para hacer frente a la respuesta

inmunológica de su huésped. Por lo tanto, el análisis de las cepas estudiadas permitió inferir

que el mecanismo micro-evolutivo principal que utiliza H. pylori para adaptarse y

establecerse en su hospedero natural es la recombinación.


66

11. RECOMENDACIONES

Para tener una mayor certeza de los resultados que se desprenden de la presente

investigación, se recomienda ampliar el estudio, cuando se encuentran disponibles en las

bases de datos públicas los genomas secuenciados, de otras cepas de H. pylori diferentes a

los ya existentes y analizados en este trabajo (26695, J99, HPAG1, G27, P12, shi470, B38).

Es necesario estudiar la naturaleza de las secuencias repetidas en tándem en un

número mayor de genomas para comprobar la no aleatoriedad de las mismas y si siguen

siendo selectivas en cuanto a su presencia en determinados genes. Además, se tiene que

analizar la localización de repeticiones en tándem a nivel de estructura tridimensional de las

proteínas para evaluar si dichos cambios afectan la funcionalidad de la misma.


67

12. REFERENCIAS

• Alm, R.A.; Ling, L.S.; Moir D. T.; King, B.L.; Brown E.D.; Jiang, Q.; Doig, P. C.;

Smith, D.R.; Noonan, B.; Guild, B.C.; De Jonge, B. L.; Carmel, G.; Tummino, P. J.;

Caruso, A.; Uria-Nickelsen, M.; Mills, D. M.; Ives, C.; Merberg, D.; Mills, S.D.;

Taylor, D.E.; Vovis, G. F.; Trust, T. J. (1999) Genomic sequence comparison of

two unrelated isolates of the human gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature

397:176–180.

• Aigner, M.; Decker, J.; Deml, L.; Knoll, G.; Lehn, N.; Schneider-Brachert, W.

(2002). The biological function of Helicobacter cysteine-rich protein A (HcpA) is

IL-12 dependent and located at the carboxyterminus. Gut, 51, 21.

• Appelmelk, B.J.; Martin, S.L.; Monteiro, M.A.; Clayton C.A.; McColm, A.A.; et al.

(1999) Phase variation in Helicobacter pylori lipopolysaccharide due to changes in

the lengths of poly(C) tracts in a 3-fucosyltransferase genes. Infect Immun 67:5361–

5366.

• Aras, R. A.; Kang, J.; Tschumi, A. I.; Harasaki, Y.; Blaser, M. J. (2003) Extensive

repetitive DNA facilitates prokaryotic genome plasticity. Proc. Natl Acad. Sci.USA

100, 13579–13584.

• Argent, R.H.; Thomas, R.J.; Aviles-Jimenez, F.; Letley D.P.; Limb, M.C.; El-Omar,

E.; Atherton, J.C. (2008). Toxigenic Helicobacter pylori Infection Precedes Gastric

Hypochlorhydria in Cancer Relatives, and H. pylori Virulence Evolves in These

Families. Clin Cancer Res. 2008;14(7) 2227-2235.

• Atherton, J. C.; Cao, P.; Peek, R. M.; Tummuru, M. K.; Blaser, M. J.; Cover T. L.

(1995) Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori:


68

association of specific vacA types with cytotoxin production and peptic ulceration.

J. Biol. Chem. 270:17771–17777.

• Atherton y Blaser (2004) Ulcera péptica y trastornos relacionados. Harrison

principios de Medicina Interna 16 a. Edición Ed. Mc Graw Hill Cap 285:1930-

1931.

• Azuma, T.; Ito, Y.; Wong, B.C.Y.; Dailide, G.; Berg, D.E.; Mukhopadhyay, A. K.

(2004).Evolutionary dynamics of insertion sequences in Helicobacter pylori. J.

Bacteriol. 186:7508–7520.

• Baltrus, D. A.; Amieva, M. R.; Covacci, A.; Lowe, T.M.; Merrell, D. S.; Ottemann,

K M.; Stein, M.; Salama N. R.; Guillemin, K. (2009)The Complete Genome

Sequence of Helicobacter pylori Strain G27 J. Bacteriol 141(1):447–448.

• Baltrus, D. A.; and Guillemin, K. (2006). Multiple phases of competence occur

during the Helicobacter pylori growth cycle. FEMS Microbiol. Lett. 255:148–155.

• Bamford, K.B.; Fan, X.; Crowe, S.E.; Leary J.F.; Gourley, W. K.; Luthra, G.K.;

Brooks, E.G.; Graham, D. Y.; Reyes, V.E.; Ernest, P.B.; (1998) Lymphocytes in the

human gastric mucosa during Helicobacter pylori have a T Helper cell 1 phenotype.

Gastroenterology 114: 482-492.

• Barre, F-X.; Sherratt, D.J.S. (2002) Xer Site-Specific Recombination: Promoting

Chromosome Segregation. In: Craig NL, Craigie R, Gellert M, Lambowitz A, eds.

Mobile DNA II. Washington, D.C.: ASM Press, 149–161.

• Börjkholm, B.; Guruje, J.; Karlsson, M.; O´Donell, D.; Engstrand. L.; Falk, P.;

Gordon, J. (2004) Gnotobiotic transgenic mice reveal that transmission of


69

Helicobacter pylori is facilitated by loss of acid-producing parietal cells in donors

and recipients. Microbes infect 6:213-220.

• Bourque, G.; Pevzner, P.A. (2002). Genome-scale evolution: Reconstructing gene

orders in the ancestral species. Genome Res. 12:2636.

• Bourzac, K.M.; Guillemin, K. (2005) Helicobacter pylori-host cell interactions

mediated by type IV secretion. Cell Microbiol 7: 911–919.

• Brosch, R.; Gordon, S.V.; Buchrieser, C.; Pym, A.S.; Garnier, T.; Cole, S.T. (2000)

comparative genomics uncovers large tandem chromosomal duplications in

Mycobacterium bovis BCG Pasteur. 17:111-123.

• Busler, V.J.; Torres, V.J.; McClain M.S.; Tirado, O.; Friedman, D.B.; Cover, T.L.

(2006). Protein-protein interactions among Helicobacter pylori cag proteins. J

Bacteriol 188: 4787-4800.

• Campo, N.; Dias, M.J.; Daveran-Mingot, M.L.; Ritzenthaler, P.; Le Bourgeois,

P.(2004) Chromosomal constraints in Gram-positive bacteria revealed by artificial

inversions. Mol. Microbiol. 51:511–522.

• Censini, S.; Lange, C.; Xiang, Z.; Crabtree, J.E.; Ghiara, P.; Borodovsky, M.;

Rappuoli, R.; Covacci, A. (1996) cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori,

encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proc Natl Acad Sci

USA 93:14648–14653.

• Chédin, F.; Dervyn, E.; Ehrlich, S.D.; Noirot, P. (1994) Frequency of deletion

decreases exponentially with distance between short direct repeats. Mol. Microbiol.,

12:561-569.


70

• Chen, T. S.; Tsay, S.H.; Chang, F.Y.; Lee, S.D. (1994) Efect of eradication of

Helicobacter pylori on serum pepsinogen I, gastrin, insulin in duodenal ulcer

patients: a 12-month follow-up study. Am J Gastroenterology 89:1511-1514.

• Couturier, E.; Rocha, E.P (2006) Replication-associated gene dosage effects shape

the genome of fast-growing bacteria but only for transcription and translation genes.

Mol Microbiol 59: 1506-1518. Doi:10.1111/j.1365-2958.2006.05046.

• Darling, A.; C, E.; Mau, B. .; Blattner, F. R.; Perna, N. T. (2004). Mauve:multiple

alignment of conserved genomic sequences with rearrangements. Genome Res.

14:1394–1403

• Darling, A.; Miklós, I.; Ragan, M. A. (2008) Dynamics of Genome Rearrangement

in Bacterial Populations. PLoS Genet 4(7): e10000128.

Doi:10.1371/journal.pgen.1000128.

• Delcher, A. L.; Kasif, S.; Fleischmann, R.D.; Peterson, J.; White, O.; Salzberg, S. L.

(1999) Alignment of whole genomes. Nucleic Acids Research 27: 2369-2376.

• Dempsey, J.A.F.; Wallace, A.B.; Cannon, J.G. (1995) the physical map of the

chromosome of a serogroup A strain of Neisseria meningitidis shows complex

rearrangements relative to the chromosomes of the two mapped strains of the

closely related species N. gonorrheae. J Bacteriolol. 177:6390-6400.

• Dong, Q.; Hyde, D.; Herra, C.; Kean, C.; Murphy, P.; O’Morain, C.A; Buckley, M.

(2001) Identification of genes regulated by prolonged acid exposure in Helicobacter

pylori. M. FEMS Microbiol. Lett, 196, 245-249.


71

• Edgar, R. C. (2004) MUSCLE: a multiple sequence alignment method with reduced

time and space complexity BMC Bioinformatics 5:113 doi:10.1186/1471-2105-5-

113.

• Eisen, J.A.; Heidelberg, J.F.; White, O.; Salzberg, S.L. (2000) Evidence for

symmetric chromosomal inversions around the replication origin in bacteria.

Genome Biology 61:research0011.

• Eppinger, M.; Baar, C.; Linz, B.; Raddatz G.; Lanz, C.; Keller, H.; Morelli, G.;

Gressmann, H.; Achtman, M.; Schuster, S. (2006) Who Ate Whom? Adaptive

Helicobacter Genomic Changes That Accompanied a Host Jump from Early

Humans to Large Felines. PLoS Genet 2(7):1097-1110.

• Etherington, G. J.; Dicks, J.; Roberts, I. N.; (2004) Recombination Analysis Tool

(RAT): A program for the high-throughput detection of recombination.

Bioinformatics 27:1-9

• Falush, D.; Kraft, C.; Taylor, N. S.; Correa, P.; Fox, G. J.; Atchman, M.; Suerbaum,

J. (2001) Recombination and mutation during long-term Gastric colonization by

Helicobacter pylori: estimates of clock rates, recombination size and minimal age

Proc Natl Acad Sci USA 98: 15056-15061.

• Falush, D.; Wirth, T.; Linz, B.; Pritchard, J.K.; Stephens, M.; Kidd, M.; Blaser,

M.J.; Graham, D.Y.; Vacher, S.; Perez-Perez, G. I.; Yamaoka, Y.; Mégraud, F.;

Otto, K.; Reichard, U.; Katzowitsch, E.; Wang, X.; Achtman, Mark.; Suerbaum, S.

(2003) Traces of human migrations in Helicobacter pylori populations. Science 299:

1582–1585.


72

• Flores, M., Morales, L., Ávila, A., González, V., Bustos, P., García-Alonso, D.,

Mora, Y., Guo, X.W., Collado-Vides, J., Pinero, D., Dávila, G., Mora, J. and

Palacios, R. (2005). Diversification of DNA Sequences in the Symbiotic Genome of

Rhizobium etli. J Bacteriol. 187(21):7185-7192

• Forterre, P.; Gribaldo, S.; Gadelle, D.; Serre, M.C. (2007) Origin and evolution of

DNA topoisomerases. Biochimie 89: 427–446.

• Fuchs, C.S.; Mayer, R.J. (1995) Gastric carcinoma. N Engl J Med.333:32–41.

• Galtier, N.; Gouy, M.; Gautier, C. (1996) SEAVIEW and PHYLO_WIN: two

graphic tools for sequence alignment and molecular phylogeny. Comput Appl

Biosci., 12:543-548.

• Ghose, C.; Perez-Perez, G. I.; Van Doorn, L. J.; Dominguez-Bello, M. G.; Blaser,

M. J. (2002). East Asian genotypes of Helicobacter pylori strains in Amerindians

provide evidence for its ancient human carriage. Proc. Natl Acad. Sci. USA

99:15107–15111.

• Goodwing, C.S.; Armstrong, J. A.; Chilvers, T.; Peters, M.; Collins, L.; Sly, L.;

McConnell, W.; Harper, W.S. (1989) Transfer of Campylobacter pylori and

Campylobacter mustelae to Helicobacter genus. Int. J Syst Bacteriol 4: 397-405.

• Gressmann, H.; Linz, B.; Ghai, R.; Pleissner, K.P.; Schlapbach, R.; Yamaoka, Y.;

Kraft, C.; Suerbaum, S.; Meyer, T.F.; Achtman, M. (2005) Gain and loss of

multiple genes during the evolution of Helicobacter pylori. PLoS Genet, 1:e43.

• Guo, X.; Flores, M.; Morales, L.; García, D.; Bustos. P.; González, V.; Palacios, R.;

Dávila, G. (2007) DNA Diversification in Two Sinorhizobium Species J. of

Bacteriol, 189 (17): 6474–6476.


73

• Haas, G.; Karaali, G.; Ebermayer, K.; Metzger, W. G.; Lamer, S.; Zimny-Arndt, U.

Diescher, S.; Goebel, U.B.; Vogt, K.; Roznowski, A.B.; Wiedenmann, B.J.; Meyer,

T.F.; Aebischer, T.; Jungblut, P.R. (2002). Immunoproteomics of Helicobacter

pylori infection and relation to gastric disease. Proteomics, 2:313–324.

• Hatakeyama, M. (2003) Helicobacter pylori CagA – a potential bacterial

oncoprotein that functionally mimics the mammalian Gab family of adaptor

proteins. Microbes Infect 5:143–150.

• Himmelreich, R.; Plagens, H.; Hilbert, H.; Reiner, B.; Hernan, R. (1997)

comparative analysis of the genomes of the bacteria Mycoplasma pneumonia and

Micoplasma genitalium. Nucleic Acids Res, 25:701-712.

• Hughes, D. (2000) Evaluating genome dynamics: the constraints on rearrangements

within bacterial genomes Genome Biology. 1(6):reviews0006.1–0006.8.

• Hofler, C.; Fischer, W.; Hofreuter, D.; Haas, R. (2004) Cryptic plasmids in

Helicobacter pylori: putative functions in conjugative transfer and microcin

production. Int. J. Med. Microbiol. 294: 141–148.

• Hofreuter, D.; Haas, R. (2002).Characterization of two cryptic Helicobacter pylori

plasmids: a putative source for horizontal gene transfer and gene shuffling. J.

Bacteriol. 184:2755 -2766.

• Ito, Y.; Azuma, T.; Ito, S.; Miyaji, H.; Hirai, M.; Yamazaki, Y.; Sato, F.; Kato, T.;

Kohli, Y.; Kuriyama, M. (1997). Analysis and typing of the vacA gene from cagA-

positive strains of Helicobacter pylori isolated in Japan. J. Clin. Microbiol.

35:1710–1714.


74

• Jordan, K.; Rogozin, I. B.; Wolf, Y. I.; Koonin, E. V. (2002) Microevolutionary

genomics of bacteria. Theor. Popul. Biol. 61:435–447.

• Kang, J.; Blaser, M. J. (2006) Bacterial populations as perfect gases: genomic

integrity and diversification tensions in Helicobacter pylori. Nature 4:826-326.

• Kersulyte, D.; Lee, W.; Subramaniam, D.; Anant, S.; Herrera, P. Cabrera L.; Balqui,

J.; Barabas, O.; Kalia, A.; Gilman, R.H.; Berg, D. (2009) Helicobacter Pylori’s

Plasticity Zones Are Novel Transposable Elements. PLoS ONE 4(9): e6859.

doi:10.1371/journal.pone.0006859.

• Kersulyte, D.; Mukhopadhyay, A. K.; Velapatino, B.; Su, W.; Pan, Z.; Garcia, C.;

Hernandez, V.; Valdez, Y.; Mistry, R. S.; Gilman, R. H.; Yuan, Y.; Gao, H.;

Alarcon, T.; Lopez-Brea, M.; Balakrish, N.G.; Chowdhury, A.; Datta, S.; Shirai,

M.; Nakazawa, T.; Ally, R.; Segal, I.; Wong, B. C.; Lam, S. K.; Olfat, F. O.; Boren,

T.; Engstrand, L.; Torres, O.; Schneider, R.; Thomas, J. E.; Czinn, S.; Berg, D. E.

(2000). Differences in genotypes of Helicobacter pylori from different human

populations. J. Bacteriol. 182:3210–3218.

• Kersulyte, D.; Velapatino, B.; Mukhopadhyay, A.K.; Cahuayme, L.; Bussalleu, A.;

Combe, J.; Gilman, R.H.; Berg, D. (2003) Cluster of type IV secretion genes in

Helicobacter pylori’s plasticity zone. J Bacteriol 2003; 185: 3764-3772.

• Kivi, M.; Tindgerg, Y.; Sörberg.; Casswall, T.H.; Befrits, R.; Hellström, P. M.;

Bengtsson, C.; Engstrand. L.; Granström, M. (2003) Concordance of Helicobacter

pylori strains with families J Clin Microbiol 41: 5604-5608.

• Marshall, B.J. (2001) One hundred years of discovery an rediscovery of

Helicobacter pylori and it´s association with peptic ulcer disease. “Helicobacter


75

Pylori. Physiology and Genetics” (M. G. L., Mobley H.L.T.; Hazell S.L., Ed.),

ASM Press;Washington D.C.

• Marshall, B.J.; Armstrong, J. A.; McGechie, D.B.; Glancy, R. J. (1985) Attempt to

fulfill Koch´s postulate for pyloric Campylobacter Med J Aust 142:436-439.

• Martin, D.; Rybicki, E. (2000). RDP: detection of recombination amongst aligned

sequences. Bioinformatics 16:562-563.

• Mimuro, H.; Suzuki, T.; Tanaka, J.; Asahi, M.; Haas, R.; Sasakawa, C. (2002) Grb2

is a key mediator of Helicobacter pylori CagA protein activities. Mol Cell 10: 745–

755.

• Montecucco, C.; Rappuoli, R. (2001) Living dangerously: how Helicobacter pylori

survives in the human stomach Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 457–466.

• Moran, A.P. (2008) Relevance of fucosylation and Lewis antigen expression in the

bacterial gastroduodenal pathogen Helicobacter pylori. Carbohydr Res 343:1952–

1965.

• Oh, J.D.; Kling-Bäckhed, H., Giannakis, M.; Xu, J.; Fulton, R.S.; Fulton L. A.;

Cordum, H.S.; Wang, C.; Elliot, G.; Edwards, J.; Mardis, E. R.; Engstrand, L.G.;

Gordon, J I. (2006) The complete genome sequence of chronic atrophic gastritis

Helicobacter pylori strain: evolution during disease progression. Proc. Natl Acad.

Sci. USA 27, 103 (26): 9999-10004.

• Pagliaccia, C.; Bernard, M.; Lupetti, P.; Ji, X.; Burroni, D. (1998). The m2 form of

the Helicobacter pylori cytotoxin has cell type-specific vacuolating activity. Proc.

Natl Acad. Sci. USA 95:10212–1021.


76

• Pevzner, P.; Tesler, G.; (2003) Genome Rearrangements in Mammalian Evolution:

Lessons From Human and Mouse Genomes. Genome Res. 13: 37-45.

• Posada, D., Crandall, K.A.; Holmes, E. C. (2002) Recombination in Evolutionary

Genomics. Annu. Rev. Genet. 36:75-97

• Read, T.D.; Brunham, R.C.; Shen, C.; Gill, S.R.; Heildelberg, j.F.; White, O.;

Hickey, E.K.; Peterson, J.; Utterback, T.; Berry. (2000) Genome sequences of

Chlamydia trachomatis MoPn and Chlamydia pneumonia AR39. Nucleic Acid Res.

28:1397-1406.

• Rice, P.; Longden, I.; Bleasby, A. (2000) EMBOSS: The European Molecular

Biology Open Software Suite. Trends in Genetics 16(6):276-277.

• Satomi, S.; Yamakawa, A.; Matsunaga, S.; Masaki, R.; Inagaki, T.; Okuda, T.; Suto,

H.; Ito, Y.; Yamazaki, Y.; Kuriyama, M.; Keida, Y.; Kutsumi, H.; Azuma, T.

(2006) Relationship between the diversity of the cagA gene of Helicobacter pylori

and gastric cancer in Okinawa, Japan. J Gastroenterol 2006; 41:668–673.

• Solnick, J. V; Vandamme, P (2001) Taxonomy of the Helicobacter genus.

“Helicobacter Pylori: Physiology and Genetics” (M. G. L., Mobley H.L.T.; Hazell

S.L., Ed.), ASM Press;Washington D.C.

• Stewart, N.; Feng, J.; Liu, X.; Chaudhuri, D.; Foster, J. W.; Tse-Dinh, Y.-C. (2005)

Loss of topoisomerase I function affects the RpoS-dependent and GAD systems of

acid resistance in Escherichia coli. Microbiol., 151, 2783-2791

• Suerbaum, S.; Brauer-Steppkes, T.; Labigne, A.; Cameron, B.; Drlica, K. (1998)

Topoisomerase I of Helicobacter pylori: juxtaposition with a flagellin gene (flab).

Gene 219:151-161.


77

• Suerbaum, S.; Josenhans, C. (2007) Helicobacter pylori evolution and phenotypic

diversification in a changing host. Nature 5:441-552.

• Suerbaum, S.; Josenhans, C.; Sterzenbach, T.; Drescher, B.; Brandt, P.; Bell, M.;

Dröge, M.; Fartmann, B.; Fischer H.; Ge, Z.; Hörster, A.; Holland, R.; Kerstin, K.;

Köning, J.; Macko, L.; Mendz, G.; Nyakatanura, G.; Schauer, D.B.; Shen, Z.;

Weber J.; Frosch, M.; Fox, J. (2003) The complete genome sequence of the

carcinogenic bacterium Helicobacter hepaticus. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 100

(13): 7901-7906.

• Surtees, J.A.; Funnell, B.E. (2003) Plasmid and chromosome traffic control: how

ParA and ParB drive partition. Curr Top Dev Biol 56: 145–180.

• Robinson, K.; Loughlin, M. F.; Potter, R.; Jenks, P. J. (2005) Host Adaptation and

Immune Modulation Are Mediated by Homologous Recombination in Helicobacter

pylori. Journal of Infectious Diseases 191:579–87.

• Tillier, E.R.; Collins, R.A.; (2000) Genome rearrangement by replication-directed

translocation. Nat Genet 26:195-7.

• Tomb, J.F.; White, O.; Kerlavage, A.R.; Clayton, R.A.; Sutton, G.G, et al. (1997)

The complete genome sequence of the gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature

388:539–547.

• Tolou, H. J. G.; Couissinier-Paris, P.; Durand, J.-P.; Mercier, V.; de Pina, J.-J.; de

Micco, P.; Billoir, F.; Charrel, R. N.; de Lamballerie, X. 2001. Evidence for

recombination innatural populations of dengue virus type 1 based on the analysis of

complete genome sequences. J. Gen. Virol.82:1283–1290


78

• Wang, G.; Rasko, D.A.; Sherburne, R.; Taylor, D.E. (1999) Molecular genetic basis

for the variable expression of Lewis Y antigen in Helicobacter pylori: analysis of

the a (1,2) fucosyltransferase gene. Mol Microbiol 31: 1265–1274.

• Whirt, T.; Wang, X.; Linz, B.; Novick, R. P.; Lum, J. K.; Blaser M.; Morelli, G.;

Falush, D.; Achtman, M. (2004) Distinguishing human ethnic groups by means of

sequences from Helicobacter pylori: Lessons from Ladakh 101 (14): 4746-4751.

• Yamaoka, Y.; Orito, E.; Mizokami, M.; Gutierrez, O.; Saitou, N.; Kodama, T.;

Osato M. S.; Kim J. G.; Ramírez F. C.; Mahachai V.; Graham. D. Y. (2002)

Helicobacter pylori in South and north America Before Columbus. FEBS lett

517:180-184.

• Yamazaki, S.; Yamakawa, A.; Okuda, T.; Ohtani, M.; Suto, H.; Ito, Y.;

Yamazaki, Y.; Keida, Y.; Higashi H. Hatakeyama, M:, Azuma T. (2005) Distinct

Diversity of vacA, cagA, and cagE Genes of Helicobacter pylori Associated with

Peptic Ulcer in Japan International Journal of Medical microbiology 43(8) 3906–

3916.

• Yea, F.; Brauer, T.; Niehus, E.; Drlica, K.; Josenhans, C.; Suerbaum, S. (2007)

Flagellar and global gene regulation in Helicobacter pylori modulated by changes in

DNA supercoiling International Journal of Medical microbiology 297(2): 65-81.


79

13. GLOSARIO

Apoptosis. Es una forma de muerte celular, que está regulada genéticamente.

Bacteria Gram-negativa. Aquellas bacterias que no se tiñen de azul oscuro o violeta por la

tinción de Gram.

Bacteriófago. Virus que infecta a las bacterias y que pueden modificar al genoma

hospedero codificando nuevas funciones o modificando las ya existentes.

Deleción. Tipo especial de anomalía estructural cromosómica que consiste en la pérdida de

un fragmento de ADN de un cromosoma.

Especiación peripátrida. Es una variedad del modelo de especiación alopátrida; aquí la

nueva especie se origina en un hábitat marginal de la población ancestral.

Filogenética. Clasificación científica de las especies basada únicamente en las relaciones

de proximidad evolutiva entre las distintas especies, reconstruyendo la historia de su

diversificación (filogénesis) desde el origen de la vida en la Tierra hasta la actualidad.

Fisiopatología. Estudia los mecanismos de producción de las enfermedades en relación a

los niveles molecular, subcelular, celular, tisular, orgánico y sistémico o funcional.

Genoma: Material genético total contenido en las células de un organismo en particular.

Genómica. Conjunto de ciencias y técnicas dedicadas al estudio integral del

funcionamiento, evolución y origen de un genoma.

Fosfolipasa. Es una enzima que hidroliza los enlaces éster presentes en los fosfolípidos.


80

Hipoclorhidria . Alteración fisiopatológica del estómago donde se encuentra disminuida de

la secreción de ácido clorhídrico.

Interleucina-8 (IL-8). Es una citocina de la familia de las quimiocinas, de naturaleza

proinflamatoria. Su síntesis se realiza en fibroblastos, célula endotelial, monocito y

macrófagos.

Linfocito . Es un tipo de leucocito (glóbulo blanco) comprendido dentro de los

agranulocitos.

Microaerofilia: hace referencia a las condiciones de baja y estricta concentración de

oxígeno que requieren determinados organismos para su desarrollo, conocidos como

microaerófilos.

Monocito. Son un tipo de glóbulos blancos agranulocitos.

Monofilético. Grupo monofilético se refiere a si todos los organismos incluidos en él han

evolucionado a partir de un ancestro común.

Neoplasia. Proceso de proliferación anormal de células en un tejido u órgano que

desemboca en la formación de un tumor.

Neutrófilo. Son glóbulos blancos de tipo granulocito.

Ortólogo. Los genes ortólogos son aquellos que divergieron por un evento de especiación.

Panmítico: Perdida de la capacidad clonal en una población de bacterias.

Parálogo. Los genes parálogos son aquellos que surgen por eventos de duplicación.

Patogénesis. Describe el origen y evolución de una enfermedad con todos los factores que

están involucrados en ella.

Plásmido. Moléculas de ADN circulares o lineares que existen en las células como

elementos extra cromosómicos con la capacidad de replicarse por sí mismos.


81

Plasmocito. Célula plasmática que pertenece al sistema inmunitario y su papel consiste en

la secreción de grandes cantidades de anticuerpos.

Polimerasa. Enzima que cataliza la síntesis del ADN o ARN.

Proteasas. Son enzimas que rompen los enlaces peptídicos de las proteínas.

Pseudogene. Copia de un gen que carece normalmente de intrones y de otras secuencias de

ADN esenciales para la función.

Secuencia de ADN. Sucesión de letras (A, G, C, T) que representan la estructura primaria

de una molécula real o hipotética de ADN, con la capacidad de transportar información.

Secuencias de Inserción. Segmentos pequeños de ADN de aproximadamente 2.5 kb que

codifican enzimas involucradas en su transposición entre los genomas.

Secuencias en tándem. Secuencia de ADN corta, que se repite consecutivamente, cabeza

con cola en un locus cromosómico específico.

Transcripción: Primer proceso de la expresión génica mediante el cual se transfiere

información contenida en el ADN hacia las secuencia de proteínas utilizando diversos ARN

como intermediarios.

Transferencia Horizontal: Proceso en el que un organismo trasfiere material genético a

otra célula de la cual no desciende.

Transposón: Moléculas de ADN que frecuentemente cambian su localización dentro del

genoma.


82

14. APÉNDICE

Apéndice 1. Lista de las cepas de H. pylori utilizadas para la comparación de la estructura genómica.

Cepas Origen No. de Acceso

Hp 2017 India EF195722 Hp 2018 India EF195723 Hp 908 India EF195721 Hp Ca 52 Suiza AY330636 Hp Ca 73 Suiza AY330638 Hp Du 23:2 Suiza AY330644 Hp Du 52:2 Suiza AY330640 Hp F16 Fukui Japón AB120416 Hp F17 Fukui Japón AB120417 Hp F28 Fukui Japón AB120418 Hp F79 Fukui Japón AB120420 Hp F80 Fukui Japón AB120421 Hp Ok107 Okinawa Japón AB120423 Hp Ok109 Okinawa Japón AB120424 Hp Ok112 Okinawa Japón AB120425 Hp Ok129 Okinawa Japón AB120426 Hp 26695 Reino Unido NC_000915 Hp J99 Estados Unidos NC_000921 Hp NTCC11638 Australia AF282852 Hp P12 Alemania NC_011498 Hp HPAG1 Suiza NC_008086 Hp Shi470 Perú NC_010698 Hp G27 Italia NC_011333


83

Apéndice 2. Genes obtenidos a partir del genoma nucleó del género Helicobacter,

exclusivos los siete genomas de H. pylori.

(El identificador de locus esta basado en la cepa 26695 y los diecinueve genes identificados

mediante perfil transcripcional en HPAG1 se marcan en amarillo).

Identificador de

locus Secuencia codificante

1.HP0025 Proteína de membrana externa (HofF)

2. HP0027 Isocitrato deshidrogenasa (icd)

3. HP0050 Adenina especifica ADN metiltransferasa (dpnA)

4. HP0057 Proteína hipotética





9. HP0141 L-lactato permeasa (lctP)

10. HP0132 L-serina deaminasa (sdaA)


12. HP0172 Proteína involucrada en la síntesis de molibdopterina (moeA)



15. HP0211 Proteína rica en cisteína

16. HP0227 Proteína de membrana externa (Hop)


18. HP0216 1-deoxi-D-xilulosa 5-fosfato reductoisomerasa



21. HP0250 Oligopéptido transportador ABC


84

22. HP0313 Proteína involucrada en la extrusión de nitritos (narK)

23. HP0379 Fucosiltransferasa



26. HP0357 Alcohol deshidrogenasa de cadena corta

27.HP0407 Biotina-sulfoxido reductasa (bisC)


29. HP0475 Transportador ABC de molibdeno, proteína de unión al ATP

30. HP0473 Transportador ABC de molibdeno, proteína de unión al ATP

31. HP0474 Transportador ABC de molibdeno, proteína permeasa






37. HP0653 Proteína no-hemo ferritina contenedora de hierro (pfr)

38. HP0652 fosfoserina fosfatasa (serB)

39. HP0768 Cofactor de molibdeno en la bio-síntesis de proteína A

40. HP0769

Proteína involucrada en la síntesis di-nucleótido molibdopterina-

guanina



43. HP0814 Proteína involucrada en la síntesis de tiamina (thiF)

44. HP0798 Co-factor de molibdeno en la bio-síntesis de proteína C






50. HP0843 Pirofosforilasa de tiamina-fosfato



85

52.HP0924 4-oxalocrotonate tautomerasa (dmpI)



55. HP0975 Subunidad aspartil/glutamil-tRNA amidotransferasa




59. HP1275 Fosfomanomutasa

60. HP1166 glucose-6-fosfato isomerasa

61. HP1185 Transportador de flujo de azucares


63. HP1371 Enzima de restricción-modificación

64. HP1403 Enzima de restricción tipo I proteina M (hsdM)


66. HP1341 Sideroporo-mediado por proteínas de transporte de hierro (tonB)


68. HP1441 peptidil-prolil cis-trans isomerasa B


70. HP1427 Polipéptido de unión a metales rico en Histidina

71. HP1562

Transportador de hierro (III) ABC, proteína peri-plasmica de unión al

hierro (ceuE)


73. HP0125 Proteína 50S ribosomal L35

74. HP0800 Factor convertidor de molibdopterina

75. HP0799 Co-factor de molibdeno en la bio-síntesis de proteína A

Apéndice 3. Genes limitantes de cada uno de los 35 bloques generados por MAUVE.


86

Bloq

ue

Genes limitantes de cada uno de los bloques en los diferentes genomas

Hp26695 HpJ99 HpHPA

G1

HpG27 Hp12 HpShi47

0

HpB38

1 HP0001(nu

sB)-

HP0313(na

rK)

Jhp_000

1-

jhp_029

8

HPAG1

_0001-

HPAG_

0317(na

rk)

HpG27_1-

HPG27_29

4

HPP12_

0001-

HPP12_

312

HPSH_0

0005-

HPSH_0

1635

HELPY_

0001-

HELPY_

320

2 HP0318(P.

hemo)-

HP0356

(LepA)

Jhp_030

1-

Jhp_033

0

HPAG1

_0321-

HPAG1

_0351

HPG27_29

9-

HPG27_33

3

HPP12_

0315(he

me

iron)-

HPP12_

0350

HPSH_0

1645-

HPSH_0

1835

HELPY_

0321-

HELPY_

0359

3 HP0357(de

shidrogenas

a)-

HPrrnA5S

Jph_102

3-

jhp_095

HPAG1

_1035-

HPAG1

_r01

HPG27_10

38-

HPG27_rR

NA25s

HPP12_

1062-

HPP12_

r15S

HPSH_0

5635-

HPSH_r0

83545Sr

NA

HELPY_

1066-

HELPY_

5S_2

4 HP0462(hs

ds)-HP0487

(HofD)

Jhp_041

4-

jhp_043

9

HPAG1

_0437-

HPAG1

_0463

HPG27_41

9-

HPG27_44

6

HPP12_

0434-

HPP12_

0494

HPSH_0

2265-

HPSH_0

2405

HELPY_

0444-

HELPY_

0470

5 HP0490(po

tasio

canal)-

HP0610(to

xin outer)

Jhp_044

2jhp_05

56

HPAG1

_0466-

HPAG1

_0590

HPG27_45

0HPG27_5

70

HPP12_

0498-

HPP12_

0618

HPSH_0

4465-

HPSH_0

3815

HELPY_

0864-

HELPY_

0763

6 HP0611- Jhp_029 HPAG1 HPG27_57 HPP12_ HPSH_0


87

HP0613(A

BC

transportad

or)

9-

jhp_030

0

_0591-

HPAG1

_0594

1-

HPG27_57

3

0619-

HPP12_

0622

3810

HPSH_0

3805

7 HP0614-

HP0637

Jhp_055

7-

jhp_058

0

HPAG1

_0595-

HPAG1

_0630

HPG27_57

4-

HPG27_59

8

HPP12_

0623-

HPP12_

0649

HPSH_0

3800 –

HPSH_0

3680

HELPY_

0758-

HELPY_

0734

8 HP0638(o

mp13)

Jhp_058

1

HPAG1

_0621

HPG27_59

9

HPP12_

0650

HPSH_0

3300

HELPY_

0733

9 HP0639-

HP0680(rib

onucleotide

-

diphosphata

se)

Jhp_058

2-

jHp_062

1

HPAG1

_0622-

HPAG1

_0662

HPG27_60

0-

HPG27_62

8 -

HPP12_

0651-

HPP12_

0621

HPSH_0

3670-

HPSH_0

3465

HELPY_

0732-

HELPY_

0691

10 HP0683(gl

mU)-

HP0688

Jhp_062

4-

Jhp_062

8

HPAG1

_0667-

HPAG1

_0671

HPG27_64

1-

HPG27_64

45

HPP12_

0696-

HPP12_

0700

HPSH_0

3450-

HPSH_0

3425

HELPY_

0688-

HELPY_

0684

11 HP0690(fa

dA)-

HP0697

Jhp_063

8-

jhp_063

1

HPAG1

_0675-

HPAG1

_0682

HPG27_64

6-

HPG27_65

3

HPP12_

0701-

HPP12_

0708

HPSH_0

3405-

HPSH_0

3365

HELPY_

0683-

HELPY_

0673

12 HP0699-

HP0711

Jhp_063

9-

jhp_065

0

HPAG1

_0684-

HPAG1

_0696

HPG27_65

5-

HPG27_66

8

HPP12_

0709-

HPP12_

0722

HPSH_0

3360-

HPSH_0

3305

HELPY_

0670-

HELPY_

0655

13 HP0714(R

NA pol

sigma-54–

Jhp_06-

jhp_065

8

HPAG1

_0699-

HPAG1

HPG27_67

0-

HPG7_676

HPP12_

0723-

HPP12_

HPSH_0

3295-

HPSH_0

HELPY_

0652-

HELPY_


88

HP0721 _0705 0729 3265 0646

14 HP0723(L-

asparaginas

a)-

HP0724(dc

uA)

Jhp_066

1-

jhp_066

0

HPAG1

_0708-

HPAG1

_0707

(dcuA)

HPG27_67

9-

HPG27_67

8

HPP12_

0731-

HPP12_

0732

HPSH_0

3250 -

HPSH_0

3245

HELPY_

0644-

HELPY_

0643

15 HP0726(p

mo)-

HP0879

Jhp_066

3-

jhp_081

2

HPAG1

_0710-

HPAG1

_0861

HPG27_68

1-

HPG27_83

2

HPP12_

0734-

HPP12_

0878

HPSH_0

3230 –

HPSH_0

2420

HELPY_

0641 –

HELPY_

0474

16 HP0883(ru

vA)-

HP0979(fts

Z)

Jhp_081

5-

jhp_091

3

HPAG1

_0863-

HPAG1

_0960

HPG27_83

6-

HPG27_92

6

HPP12_

0880-

HPP12_

0975

HPSH_0

4655-

HPSH_0

5170

HELPY_

0868-

HELPY_

0967

17 HP0983 Jhp_091

5

HPAG1

_0963

HPG27_93

3

HPP12_

0979

HPSH_0

5200

HELPY_

0976

18 HPt26(tRN

A-Pro-

1,ppK)-

HP1093(hi

po,flgG

Jhp_041

3-

Jhp_033

2

HPAG1

_t012-

HPAG1

_0354

HPG27_tR

NA2-

HPG27_33

6

HPP12_t

12-

HPP12_

0352

HPSH_t0

8304-

HPSH_0

1850

HELPY_

tRNA27-

HELPY_

0361

19 HP1098(P.

rica en

citeina)-

HP1276

Jhp_102

4-

jhp_119

7

HPAG1

_1036-

HPAG1

_1220

HPG27_10

39-

HPG27_12

21

HPP12_

1063-

HPP12_

1242

HPSH_0

5640-

HPSH_0

6610

HELPY_

1067 -

HELPY_

1253

20 HP1277(trp

A)-HP1286

Jhp_119

8-

jhp_120

6

HPAG1

_1235-

HPAG1

_1227

HPG27_12

223-

HPG27_12

38

HPP12_

1243-

HPP12_

1252

HPSH_0

6615-

HPSH_0

6655

HELPY_

1254 -

HELPY_

1262

21 HP1287(ten

A)

Jhp_120

7

HPAG1

_1226

HPG27_12

39

HPP12_

1253

HPSH_0

6655

HELPY_

1263


89

22 HP1289 Jhp_120

9

HPAG1

_0663

HPG27_63

9

HPP12_

1255

HPSH_0

3460

HELPY_

1265

23 HP1290(pn

uC)-

HP1291

Jhp_121

0-

jhp_121

1

HPAG1

_1223 -

HPAG1

_1222

HPG27_12

40-

HPG27_12

41

HPP12_

1256-

HPP12_

1257

HPSH_0

6670 -

HPSH_0

6675

HELPY_

1266-

HELPY_

1267

24 HP1292

(rplQ,

50Sr)

HP1382

Jhp_121

2

(rplQ)-

Jhp_129

5

HPAG1

_1237

(riboso

mal)-

HPAG1

_1327

HPG27_12

42 (50S)-

HPG27_13

26

HPP12_

1258(50

S)-

HPP12_

1376

HPSH_0

6685(50S

)-

HPSH_0

7150

HELPY_

1269(50

S)-

HELPY_

1369

25 HP1383

(RMS)

Jhp_142

2

HPAG1

_1462

HPG27_14

55

HPP12_

1508

HPSH_0

7300

HELPY_

1506

26 HP1384-

HP1387

(ADN pol)

Jhp_144

1-

jhp_143

8

HPAG1

_1484-

HPAG1

_1481

HPG27_14

73-

HPG27_14

70

HPP12_

1524-

HPP12_

1527

HPSH_0

7985-

HPSH_0

7970

HELPY_

1538-

HELPY_

1535

27 HP1391-

HP1403

(hsdM)

Jhp_143

6-

jhp_142

3

HPAG1

_1479-

HPAG1

_1464

HPG27_14

68-

HPG27_14

56

HPP12_

1522-

HPP12_

1509

HPSH_0

7950 –

HPSH_0

7890

HELPY_

1519-

HELPY_

1507

28 HP1406(bi

oB)-

Hp1427 (P.

rica ne

Histidina)

Jhp_129

8 –

jhp_132

0

HPAG1

_1330-

HPAG1

-1352

HPG27_13

29 –

HPG27_13

48

HPP12_

1379 -

HPP12_

1399

HPSH_0

7170-

HPSH_0

7270

HELPY_

1372 –

HELPY_

1396

29 HP1428-

HP1431(ks

gA)

Jhp_132

5 – jhp-

1322

(ksgA)

HPAG1

_1353 -

HPAG1

_1356

HPG27_13

49 -

HPG27_13

52

HPP12_

1400 –

HPP12_

1403

HPSH_0

7275 –

HPSH_0

7290

HELPY_

1397-

HELPY_

1400


90

30 HP1434(pu

rU)-

HP1453

(homD)

Jhp_132

7-

jhp_134

6

HPAG1

_1360-

HPAG1

_1379

HPG27_13

55-

HPG27_13

74

HPP12_

1409 -

HPP12_

1430

HPSH_0

7305-

HPSH_0

7435

HELPY_

1403-

HELPY_

1423

31 HP1454-

HP1533(th

yX)

Jhp_134

7-

jhp_142

1

HPAG1

_1461-

HPAG1

_1383

HPG27_13

77 –

HPG27_

1454

HPP12_

1432 –

HPP12_

1507

HPSH_0

7445 –

HPSH_0

7875

HELPY_

1425 –

HELPY_

1504

32 HP1538

(fbcH)-

HP1555

(tsf)

Jhp_146

1 -

jhp_144

4

HPAG1

_1487 –

HPAG1

_1504

HPG27_14

76 –

HPG27_14

93

HPP12_

1546 –

HPP12_

1529

HPSH_0

81008

HPSH_0

8005

HELPY_

1541 –

HELPY_

1558

33 HP1556

(ftsI) -

HP1585

(flg)

Jhp_146

4 -

jhp_149

2

HPAG1

_1505-

HPAG1

_ 1533

HPG27_14

94 –

HPG27_15

23

HPP12_

1548 –

HPP12_

1576

HPSH_0

8110 –

HPSH_0

8250

HELPY_

1559 –

HELPY_

1589

34 HP1588 Jhp_149

4

HPAG1

_1536

HPG27_15

25

HPP12_

1580 –

HPP12_

1581

HPSH_0

8270 -

HPSH_0

8275

HELPY_

1591-

HELPY_

1592

35 HP1590 Jhp_149

3

HPAG1

_1535

HPG27_15

27

HPP12_

1579

HPSH_0

8265

HELPY_

1593


91

Apéndice 4. Lista de cepas y los orígenes de cada una ellas que se utilizaron para el

análisis de recombinación y filogenético de los genes vacA y cagA.

Las marcas amarilla indican las cepas que están presentes en ambos arboles.

vacA cagA

CEPA

ORIGEN CEPA ORIGEN

Hp F13 Fukui, Japón Hp F80 Fukui Japón Hp F15 Fukui, Japón Hp F79 Fukui Japón Hp F16 Fukui, Japón Hp F28 Fukui Japón Hp F17 Fukui, Japón Hp F37 Fukui Japón Hp F18 Fukui, Japón Hp F15 Fukui Japón Hp F20 Fukui, Japón Hp F36 Fukui Japón Hp F21 Fukui, Japón Hp F55 Fukui Japón Hp F28 Fukui, Japón Hp F23 Fukui Japón Hp F29 Fukui, Japón Hp F57 Fukui Japón Hp.F26 Fukui, Japón Hp F24 Fukui Japón Hp F31 Fukui, Japón Hp F17 Fukui Japón Hp F32 Fukui, Japón Hp F75 Fukui Japón Hp F33 Fukui, Japón Hp F92 Fukui Japón Hp F34 Fukui, Japón Hp F18 Fukui Japón Hp F36 Fukui, Japón Hp ATCC49503 Reino Unido Hp F37 Fukui, Japón Hp ATCC49503 Reino Unido Hp F38 Fukui, Japón Hp ATCC43526 Reino Unido Hp F42 Fukui, Japón Hp NCTC11637 Australia Hp F43 Fukui, Japón Hp OK112 Okinawa Japón Hp F44 Fukui, Japón Hp OK111 Okinawa Japón Hp F45 Fukui, Japón Hp OK314 Okinawa Japón Hp F47 Fukui, Japón Hp OK312 Okinawa Japón Hp F51 Fukui, Japón Hp OK206 Okinawa Japón Hp F52 Fukui, Japón Hp OK109 Okinawa Japón Hp F55 Fukui, Japón Hp OK311 Okinawa Japón Hp F56 Fukui, Japón Hp OK316 Okinawa Japón Hp F57 Fukui, Japón Hp OK212 Okinawa Japón Hp F61 Fukui, Japón Hp OK313 Okinawa Japón Hp F62 Fukui, Japón Hp OK305 Okinawa Japón


92

Hp F63 Fukui, Japón Hp OK317 Okinawa Japón Hp F64 Fukui, Japón Hp OK302 Okinawa Japón Hp F65 Fukui, Japón Hp OK101 Okinawa Japón Hp F68 Fukui, Japón Hp OK159 Okinawa Japón Hp F69 Fukui, Japón Hp OK129 Okinawa Japón Hp F70 Fukui, Japón Hp OK309 Okinawa Japón Hp F71 Fukui, Japón Hp OK158 Okinawa Japón Hp F72 Fukui, Japón Hp OK306 Okinawa Japón Hp F73 Fukui, Japón Hp OK194 Okinawa Japón Hp F78 Fukui, Japón Hp OK113 Okinawa Japón Hp F79 Fukui, Japón Hp OK204 Okinawa Japón Hp F80 Fukui, Japón Hp OK197 Okinawa Japón Hp F87 Fukui, Japón Hp OK310 Okinawa Japón Hp F92 Fukui, Japón Hp OK181 Okinawa Japón Hp F94 Okinawa, Japón Hp OK160 Okinawa Japón Hp OK101 Okinawa, Japón Hp OK155 Okinawa Japón Hp OK107 Okinawa, Japón Hp OK308 Okinawa Japón Hp OK109 Okinawa, Japón Hp OK144 Okinawa Japón Hp OK111 Okinawa, Japón Hp OK210 Okinawa Japón Hp OK118 Okinawa, Japón Hp OK187 Okinawa Japón Hp OK129 Okinawa, Japón Hp OK139 Okinawa Japón Hp OK130 Okinawa, Japón Hp OK130 Okinawa Japón Hp OK144 Okinawa, Japón Hp OK107 Okinawa Japón Hp OK155 Okinawa, Japón Hp OK168 Okinawa Japón Hp OK158 Okinawa, Japón Hp OK180 Okinawa Japón Hp OK159 Okinawa, Japón Hp OK185 Okinawa Japón Hp OK160 Okinawa, Japón Hp J241 Japón Hp OK179 Okinawa, Japón HP j248 Japón Hp OK180 Okinawa, Japón Hp J230 Japón Hp OK181 Okinawa, Japón Hp J207 Japón Hp OK185 Okinawa, Japón Hp J216 Japón Hp OK187 Okinawa, Japón Hp J16 Japón Hp OK194 Okinawa, Japón Hp J149 Japón Hp OK204 Okinawa, Japón Hp J187 Japón Hp OK205 Okinawa, Japón Hp J578 Japón Hp OK210 Okinawa, Japón Hp J566 Japón Hp AFN1156 Kenia Hp J198 Japón Hp AFN4124 Kenia Hp J194 Japón Hp AFN4847 Kenia Hp CAPMN111 China Hp AFN4769 Kenia Hp CAPMN93 China


93

Hp AFNG114

Kenia

Hp CAPMN62

China

Hp CHN5114a China Hp MEL-HP27 China Hp CHN1811a China Hp CPY3401 Japón Hp CHN3554a China Hp CPY2052 Japón Hp CHN4611a China Hp Ca73 Suiza Hp CHN3295b China Hp Ca52 Suiza Hp CHN5147c China Hp Du23:2 Suiza Hp CHN5038c China Hp OK118 Okinawa Hp CHN5060d China Hp 908 India Hp ch2 China Hp 2017 India Hp ATCC43526 Reino Unido Hp 2018 India Hp NCTC11637 Australia Hp 7Bqs Korea Hp NCTC11638 Australia Hp P310 Alemania Hp Shi470 Perú Hp SS1 China Hp J99 USA Hp 27G China Hp P12 Alemania Hp 42G China Hp G27 Italia Hp C401 F32 Fukui Japón Hp HPAG1 Suiza Hp 147a Holanda Hp 26695 Reino Unido Hp 147C Holanda Hp Tx30a USA Hp 132C China Hp 95-54J128 Japón Hp Shi470 Perú Hp 60190 USA Hp HPAG1 Suiza Hp 4647C México Hp 26695 Reino Unido Hp cpWS16 Clone Alemania Hp P12 Alemania Hp G27 Italia Hp J99 USA

Micro-evolución genómica de Helicobacter pylori

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