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Microarrays y Biochips de ADNInforme de VigilanciaTecnológica

Microarraysy Biochips de ADNInforme de VigilanciaTecnológica

4

MICROARRAYS Y BIOCHIPS DE ADN

El presente informe de Vigilancia Tecnológica ha sido

realizado en el marco del convenio de colaboración

conjunta entre Genoma España y la Fundación General

de la Universidad Autónoma de Madrid (FGUAM), entidad

que gestiona el Círculo de Innovación en Biotecnología

(CIBT), perteneciente al Sistema de Promoción Regional

de la Innovación MADRI+D.

Los autores de este informe agradecen la colaboración

ofrecida por toda la comunidad científica y empresarial

para la realización de este informe. Un especial

agradecimiento al Dr. Fernando Martín Sánchez (ISCIII),

Dra. Ana Dopazo (CNIO), Dr. Laureano Simón (Medplant

Genetics, S.L.), Dr. Juan Bernal (IIB), Dr. Juan Carlos

Tercero (Pharmagen, S.A.), Dr. Carlos Briones y

Dr. Victor Parro (Centro de Astrobiología),

a D. Pedro M. Franco de Sarabia (Biotools B&M Labs, S.A.),

Dr. José Manuel Guisan (CSIC), Dr. Joaquín Dopazo

(CNIO), Dr. José María Carazo (CNB-CSIC)

y Dr. Manuel Navarro (CIEMAT).

La reproducción parcial de este informe esta autorizada

bajo la premisa de incluir referencia al mismo, indicando:

Microarrays y Biochips de ADN, Informe de Vigilancia

Tecnológica. GENOMA ESPAÑA / CIBT-FGUAM.

Genoma España no se hace responsable del uso

que se realice de la información contenida

en esta publicación. Las opiniones que aparecen

en este informe corresponden a los expertos consultados

y a los autores del mismo.

© Copyright:Fundación Española para el Desarrollo

de la Investigación en Genómica y

Proteómica/Fundación General de la Universidad

Autónoma de Madrid.

Autores: Marta López (CIBT-FGUAM)

Paloma Mallorquín (CIBT-FGUAM)

Miguel Vega (Genoma España)

Referencia: GEN-ES02001

Fecha: Octubre 2002

Depósito Legal: M-52478-2002

ISBN: 84-607-6228-9

Diseño y realización: Spainfo, S.A.

Índice de contenido

• RESUMEN EJECUTIVO 7

1. INTRODUCCIÓN 8

2. TECNOLOGÍAS DE MICROARRAYS 10

2.1. Tipo de Sonda 10

2.2. Marcaje de Sondas 11

2.3. Material de Soporte 14

2.4. Inmovilización de ADN 16

2.5. Fabricación 17

2.6. Escaneado y Software 21

2.7. Breves cuestiones técnicas 23

2.8. Últimas tendencias en desarrollos tecnológicos 24

3. APLICACIONES DE LOS MICROARRAYS Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 26

3.1. Monitorización de la Expresión Génica 27

3.2. Cribado de compuestos activos y validación de dianas terapéuticas 28

3.3. Farmacogenómica 30

3.4. Diagnóstico molecular 31

• Chips para identificación de SNPs 31

• Chips de caracterización genética 31

• Chips de detección de enfermedades infecciosas 32

4. ASPECTOS DE MERCADO: APLICACIÓN DE MICROARRAYS DE ADN

Y BIOCHIPS EN SALUD HUMANA 34

4.1. Arrays de alta densidad 34

4.2. Arrays de media y baja densidad 35

4.3. Mercados: Affymetrix 36

4.4. Mercados: empresas que compiten con Affymetrix 38

4.5. Estrategias de desarrollo e implantación 40

4.6. Modelos de negocio 41

4.7. Tendencias: lab-on-a-chip 42

5


5. CASOS PRACTICOS 43

Caso Práctico 1: Biotools B & M Labs, S.A 43Caso Práctico 2: Centro de Astrobiología, CSIC-INTA 44Caso Práctico 3: PharmaGen S.A. 45Caso Práctico 4: Instituto de Investigaciones Biomédicas, CSIC-UAM 46Caso Práctico 5: Medplant Genetics, SL 47Caso Práctico 6: Instituto de Salud Carlos III 48Caso Práctico 7: Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO, ISCIII) 49

6. CONCLUSIONES 50

ANEXO I: Breve glosario de términos en genómica 53

ANEXO II: Índice de Tablas, Cuadros y Figuras 54

ANEXO III: Referencias 55

6

Los microarrays de ADN y biochips se definencomo una matriz bidimensional de materialgenético, que permite la automatizaciónsimultánea de miles de ensayos encaminados aconocer en profundidad la estructura yfuncionamiento de nuestra dotación genética,tanto en los distintos estados de desarrollo comopatológicos del paciente.

Hasta la fecha no puede establecerse un auténticoestándar en microarrays de ADN, sino lacoexistencia de distintas tecnologías con el mismofin: el análisis de la expresión y la variabilidadgénica. La decisión final sobre la tecnología aaplicar (ej. cDNA vs. Oligos; depósito vs. Síntesisin situ de sondas) dependerá de la aplicación uobjetivo final del ensayo.

Algunas tendencias de desarrollo prometedoraspretenden eliminar el paso de amplificación de lamuestra e incluso la integración de todas lasoperaciones en un solo dispositivo (Lab-on-a chipo LOAC). En este sentido, los principales motoresde la nueva generación de microarrays y biochipsserán la integración, la fiabilidad y la sensibilidaddel ensayo.

A continuación se enumeran las principalesaplicaciones de microarrays y biochips en saludhumana:

– Monitorización de la expresión génica.– Cribado de compuestos activos y validación de

dianas terapéuticas.– Farmacogenómica. Medicina personalizada.– Diagnóstico molecular y prognosis de

enfermedades.– Detección de agentes infecciosos.

Respecto a los aspectos de mercado, no hay dudaque Affymetrix es el actual líder del mercado,sobre todo en la venta de arrays de alta densidadpara expresión génica. Sin embargo, y para lapráctica clínica, donde se necesitan arrays demenor densidad y coste, existen otras compañíasque hacen de la fiabilidad, rapidez ysimultaneidad del ensayo, sus principales valores.

Las alianzas en este sector, con objeto decompartir bases de datos, licencias de secuenciasy tecnologías desarrolladas, son la constante delsector en EE.UU. Además, actualmente existe unaauténtica carrera tecnológica entre las distintasempresas que fabrican microarrays o suscomponentes, para posicionarse como líderes deeste importante mercado de futuro.

No obstante existen todavía importantesdificultades para transferir los resultadosobtenidos con microarrays o biochips a la prácticaclínica, es decir, para que los pacientes sebeneficien de este desarrollo tecnológico. En estecontexto, quizás la dificultad más importanteresida en la variabilidad de los resultadosobtenidos en los ensayos, si bien se estárealizando un importante esfuerzo para laestandarización de los protocolos de ensayo,como paso previo y necesario para obtenerprocedimientos y dispositivos clínicos fiables.

7


Resumen ejecutivo

A finales de los años 80 cuatro científicos,Stephen Fodor, Michael Pirrung, Leighton Read yLubert Stryer desarrollaron una revolucionariatecnología para la determinación y cuantificaciónde ADN en una muestra. Esta tecnologíadesembocaría posteriormente en la primeraplataforma de microarrays de ADN, denominadaentonces GeneChip de Affymetrix.

La principal ventaja de esta novedosa tecnologíafrente a los métodos tradicionales (Northern,Southern, etc.), residía en la alta densidad deintegración (cantidad) de material biológico quese consigue inmovilizar, es decir, la posibilidad deanalizar simultáneamente miles de genes.Actualmente esta tecnología se está aplicandoentre otros al análisis de la expresión génica,detección de mutaciones y polimorfismos,secuenciación, seguimiento de terapia, medicinapreventiva, screening y toxicología de fármacos, ydiagnóstico molecular.

8

1. Introducción

9


Clasificación de microarrays según:

Características Nombre

Material inmovilizado

• Oligonucleótidos.

• cDNAs.

• Proteínas.

• Tejidos.

• Gene Chips.

• cDNA Array.

• Protein Chip.

• Tissue Chip.

Diseño del arrayo surtido

Personalizado Arrayers

Industrial Cassettes

Alta: microarraysDensidad de integración

Generación de la sonda

Fabricación

Impresión

Baja: macroarrays

“in situ”

“depositadas”

Soporte rígido(Cristal y Plástico)

Membranas

No poroso / Covalente

Poroso / No covalente

Soporte / Tipo de unión

Aplicación

• Secuenciación por hibridación.

• Detección de cambios en laexpresión génica.

• Cuantificación de la expresióngénica.

• Chips de secuenciación.

• Chips de hibridacióncomparativa.

• Chips de expresión.

Una colección (array) de ADN consiste en un gran número de moléculas de ADN ordenadas sobre unsustrato sólido de manera que formen una matriz de secuencias en dos dimensiones. Estosfragmentos de material genético pueden ser secuencias cortas llamadas oligonucleótidos, o de mayortamaño, cDNA (ADN complementario, sintetizado a partir de mRNA), o bien productos de PCR(replicación in vitro de secuencias de ADN mediante la reacción en cadena de la Polimerasa). A estosfragmentos de ADN de una sola hebra inmovilizados en el soporte, se les denomina a menudo“sondas”. Los ácidos nucleicos de las muestras a analizar se marcan por diversos métodos(enzimáticos, fluorescentes, etc.) y se incuban sobre el panel de sondas, permitiendo la hibridación(reconocimiento y unión entre moléculas complementarias) de secuencias homólogas. Durante lahibridación, las muestras de material genético marcadas, se unirán a sus complementariasinmovilizadas en el soporte del chip, permitiendo la identificación y cuantificación del ADN presenteen la muestra (mutaciones, patógenos, etc.). Con posterioridad, el escáner y las herramientasinformáticas nos permiten interpretar y analizar los datos obtenidos.

Cuadro 1. Definición de microarray o biochip.

Tabla 1. Criterios de clasificación en Biochips (adaptado de http://infobiochip.isciii.es).

DEFINICIÓN DE MICROARRAY O BIOCHIP

http://infobiochip.isciii.es

2.1. Tipo de Sonda

El diseño de las sondas y su producción sonelementos clave a la hora de hacer posible lahibridación en el biochip. Sin la riqueza deconocimiento y datos de secuencias disponiblesen diversas bases de datos y proyectosgenómicos, la generación de estas sondas seríaimposible. Físicamente, las sondas tienen tresformas diferentes: clones de cDNA, productos dePCR, y oligonucleótidos.

Las sondas basadas en clones se depositan en lasuperficie del array en forma de fragmentos ogenes completos generalmente procedentes delibrerías génicas1. El tamaño de estas sondaspuede ser de varios cientos de pares de baseshasta varias kilobases. Los productos de PCRconsisten en fracciones de genes generados porPCR procedentes de clones de cDNA, libreríasgenómicas, o RNA. La longitud de estosfragmentos suele ser de 200 a 500 pares de

bases. Las sondas consistentes enoligonucleótidos difieren de las anteriores en queel número de pares de bases es más limitado, 20-25 para análisis de expresión diferencial yhasta 100 para análisis de expresión génica.

10

2. Tecnologías de microarrays

Fig.1. Operaciones y tecnologías necesarias para la elaboración de microarrays y biochips de ADN (elaboración propia).

Ácido nucleico DIANA:Ácido nucleico procedente de la muestraproblema, cuya secuencia genómica sepretende detectar.

SONDAS de hibridación:Fragmentos de ácidos nucleicos marcadoscuya secuencia es complementaria a la delADN diana.

1 “International Nucleotide Sequence Database Collaboration” [engloba DNA Data Bank of Japan (DDBJ), EuropeanMolecular Biology Laboratory (EMBL/EBI) Nucleotide Sequence Database, (GenBank, USA)].http://www.ncbi.nlm.nih.gov/collab

OPERACIONES A REALIZARTECNOLOGÍAS/

TÉCNICAS A EMPLEAR

Elección del tipo de ADN

Marcaje de sondas o muestras

Material de soporte

Inmovilización de sondas

Fabricación

Detección de la hibridación

Procesamiento de datos

Sondas, oligos, cDNA…

Enzimático, fluorescente…

Vidrio, plástico, membranas…

Activa, pasiva, covalente…

Impresión, síntesis in situ…

Escáneres, fluorimetrías…

Software

DISEÑO DE MICROARRAYS

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/collab

2.2. Marcaje de Sondas

La detección de la hibridación entre las sondas de ADN inmovilizadas en el soporte y los fragmentos dematerial genético de la muestra, requiere un marcaje previo para su posterior detección. Este marcajepuede ser directo o indirecto:

11


Marcaje Lectura Características Ventajas Desventajas

MARCAJE DE SONDAS Y MUESTRAS PARA DETECCIÓN DIRECTA

Enzi

ma

(Ej.

Fosf

atas

a al

calin

ay

per

oxid

asa)

Isóto

po R

adia

ctiv

o(E

j. 3

3P

o e

l 125I)

Fluoro

crom

o(E

j. F

luore

sceí

na)

Cro

mogén

ica

Auto

-rad

iogra

fía

Fluorim

etría

Se pone en contactoa la muestramarcada con laenzima con unsustrato cromogénicocapaz de absorberradiación.

Se incorporan a laestructura molecularde la sonda isótoposradiactivos.

Un marcadorfluorescente emiteluz al ser excitadomediante unadeterminada longitudde onda.

• No se necesitanreactivosauxiliares en elproceso dedetección.

• No se necesitanreactivosauxiliares en elproceso dedetección.

• Gransensibilidad,facilidad deuso,reproducibilidad,flexibilidad.

• Las enzimas puedenconfundirse conenzimas nativaspresentes en lamuestra, aumentandoel ruido de fondo.

• Necesidad del uso dereactivos auxiliares enel proceso dedetección.

• Radiactividad.

• Baja resolución.

• Los escáneresnecesarios para ladetección encarecen elcoste del ensayo.

• Algunos materialescomo el plásticoproducenfluorescencia.

• La señal se atenúa conel tiempo.

Tabla 2. Métodos de marcaje de ADN en microarray para detección directa (elaboración propia).

12

Marcaje Lectura Características Ventajas Desventajas

MARCAJE DE SONDAS Y MUESTRAS PARA DETECCIÓN INDIRECTAQ

uím

ico

Enzi

mát

ico

Fluorim

etría

Quim

io-l

um

inis

cenci

a o

Fluorim

etría

La sonda se une abiotina (indicador), yse añade a lamuestra avidina oestreptavidinaconjugada confluorocromos(marcador).

La sonda se une adigoxigenina(indicador) y seañade a la muestraun anticuerpo anti-DIG conjugadocon enzima(marcador). Elsustrato de la enzimase transforma en unproductoluminiscente.

• Altamentesensible.

• Disponibilidadcomercial deácidosnucleicosmarcados conbiotina.

• Altamentesensible.

• Disponibilidadcomercial deácidosnucleicosmarcados condigoxigenina.



Tabla 3. Métodos de marcaje de ADN en microarrays para detección indirecta.

Sin duda los métodos más utilizados para marcajede sondas o dianas en microarrays son losquímicos o enzimáticos, utilizándose comúnmentelos fluoróforos2 Cy3 y Cy5 (cianinas). El uso defluoróforos permite analizar varias muestras en elmismo “array”, eliminando la variabilidad que seproduce cuando se comparan los resultados de lahibridación de diferentes “array”, además dehacer posible el escaneado de múltiplesmarcadores simultáneamente, si bien presentandos inconvenientes:

• Tan solo son capaces de analizar dos patronesde expresión de genes, y además el patrón deincorporación de los mismos no es uniforme3.

• El gran tamaño de los fluoróforos contribuye adificultar la incorporación enzimática de losnucleótidos que compondrán la sonda.

Algunos de estos inconvenientes se estánsolucionando en la actualidad por medio de variasestrategias. Una de ellas consiste en la adiciónposterior a la síntesis de nuevos fluoróforos a lassecuencias, consiguiéndose el escaneado de más dedos longitudes de onda que permiten obtener mayorcantidad de datos4. Además otras compañías comoClontech han diseñado protocolos de modificacióncon grupos amino previa incorporación de lasmoléculas fluorescentes.

Otros marcadores que se están utilizandoactualmente son los fluoróforos de la serie Alexa que están dando buenos resultados en microarrays,y según la compañía Molecular Probes5,especializada en el área de la tecnología defluorescencia, tienen una mayor fotoestabilidad yproporcionan una señal más clara que otrosmarcadores, incluyendo Cy3 y Cy5.

2 Osborn J. (2000). A review of radioactive and non-radioactive-based techniques used in life science applications. Part I:Blotting techniques. Innovations Forum Life Science News 6, Amersham Pharmacia Biotech.1-4.

3 Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. Molecular Probes [Actualización: 11 Dic. 2001]:http://www.probes.com/handbook/print/0805.html

4 Call D. (2001). DNA microarrays: their mode of action and possible applications in molecular diagnostics. VeterinarySciences Tomorrow, Issue 3, August, 1-9.

5 Molecular Probes: http://www.probes.com

http://www.probes.com/handbook/print/0805.htmlhttp://www.probes.com

La técnica de detección de ácidos nucleicos noradiactiva más sensible hasta el momento es aquellaque utiliza sondas de ADN marcadas con biotina ydetectadas a través de conjugados enzimáticos deAvidina. Además, para amplificar aún más la señalse puede acoplar una segunda enzima a la moléculade avidina y estreptavidina2. Después del uso de laBiotina como marcador indirecto, la Digoxigenina esel marcador más utilizado en la actualidad.

Algunos expertos consultados para la realizaciónde este informe mencionan la enorme importanciaque puede tener la desaparición del marcaje

de las sondas para el desarrollo de nuevasplataformas de biochips. Según estos expertos,nuevos métodos de detección no basados en el marcaje de las sondas, tales como detecciónóptica, electroquímica, o espectrometría de masas MALDI-TOF6 serán determinantes a la hora de desarrollar biochips con nuevasaplicaciones. Estas técnicas permitirían una mayorsensibilidad y reducirían las cantidades demuestra necesarias, y en mayor grado deimportancia, simplificaría el proceso depreparación de la muestra al omitir pasos previosde amplificación (PCR).

13


Cuadro 2. Últimas tendencias en detección de la hibridación de ADN en Biochips (elaboración propia).

6 Matrix-assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry.

DETECCIÓN DE LA HIBRIDACIÓN SIN MARCAJE DE SONDAS:

Detección óptica: Resonancia de Plasmones en Superficie (SPR).

Técnica basada en fenómenos ópticos que tienen lugar sobre la superficie de un metal,permitiendo la detección de cambios en la concentración de masas del chip.Ejemplo: Biacore (http://www.biacore.com/technology/technology.lasso).

Detección óptica: Tecnologías Avanzadas de Resonancia de Espejos.

Miden pequeñas variaciones en el índice de refracción y grosor de la superficie del sensor.Ejemplo: IAsys®, propiedad de Thermo Labsystems

(http://www.affinity-sensors.com/technol.htm).

Detección por Métodos Electroquímicos.

La detección de la hibridación puede ser directa, por medio de fenómenos de oxidación del ADN através de electrodos, o indirectamente mediante indicadores redox activos que se unenfuertemente al ADN de cadena doble (N. Popovich, Mediated electrochemical detection of nucleicacids for drug discovery and clinical diagnostics. IVD Technology, 2001, 7, 36-42). Por medio demoléculas mediadoras se extraen electrones del ADN que amplifican la señal. Se consigue unaalta sensibilidad y requiere protocolos sencillos e instrumentos de detección relativamenteasequibles.Ejemplo: Xanthon Inc., NanoChip® de Nanogen, Codelink™ de Motorola.

Detección por Espectrometría de Masas MALDI-TOF.

Mediante un espectrómetro de masas se predice la secuencia de los fragmentos de ADNbasándose en su masa molecular.Ejemplo: SpectroCHIP™ de Sequenom.

http://www.biacore.com/technology/technology.lassohttp://www.affinity-sensors.com/technol.htm

Tradicionalmente los sustratos sólidos de los

biochips se dividen en porosos y no porosos.

Los chips “porosos” son chips en los que las

interacciones entre el material a inmovilizar y el

soporte sólido de inmovilización no tienen por lo

general carácter covalente7. Los soportes más

comúnmente empleados son pequeñas porciones de

geles, o membranas porosas de nylon o

nitrocelulosa presentes sobre portaobjetos de cristal.

El uso de superficies porosas como soporte para

inmovilizar ácidos nucleicos supone una gran

ventaja al ofrecer mayor superficie de unión que los

soportes lisos.

Los chips lisos o “no porosos” son aquellos en los

que el material se encuentra por lo general

inmovilizado covalentemente a la superficie sólida

que le sirve de soporte y que puede ser cristal o

cualquier otra superficie como silicio, plástico u oro.

Aunque las membranas de nylon y nitrocelulosa

siguen utilizándose en la actualidad, han sido

sustituidas en la mayoría de los casos por

alternativas que permiten mayor resolución de los

puntos, además del uso de la fluorescencia como

método de detección y el uso de dos fluorocromos

simultáneamente. Sin embargo, algunos biochips

utilizan membranas o sustancias porosas que

recubren la superficie de un cristal, mejorando la

resolución de los puntos. El uso de

micropartículas (sílice o agarosa) en la mayoría

de los casos es complementario al de

membranas.

Existe un buen número de alternativas a estos

soportes que están todavía en desarrollo, como la

inmovilización del ADN sobre geles de acrilamida

(http://www.motorola.com), o sobre matrices de

oro (http://www.interactiva.de). Además, Nanogen

(http://www.nanogen.com) ha desarrollado un tipo

de soporte totalmente diferente a las plataformas

que utilizan membranas o cristal como soporte.

Estos biochips consisten en un conjunto de

electrodos cubiertos por una fina capa de agarosa.

Los microelectrodos generan un campo eléctrico

que controla la deposición de las sondas y la

hibridación con las secuencias diana.

14

7 Hoheisel, J.D.; Diehl, F.; Scheideler, M.; Hauser, N.; Aign, V.; Matysiak, S.; Beier, M. (2001). Improving DNA-chipTechnology; Chemical Aspects.

8 Lee, G.; Chen, S.; Huang, G.; Sung, W.; Lin, Y. (2001). Microfabricated plastic chips by not embossing methods andtheir applications for DNA separation and detection. Sensors and Actuators B 75. 142-148.

CARACTERÍSTICAS DE LOS SOPORTES

Superficies Porosas Superficies Lisas

Membrana de NylonMembrana deNitrocelulosa

Cristal/CuarzoMicropartículas Plástico8

• Las interacciones entre el material ainmovilizar y el soporte sólido deinmovilización no tienen caráctercovalente.

• Suelen inmovilizarse fragmentos de cDNAo productos de PCR.

• El método de marcaje suele ser porradiactividad o enzimático.

• Amplio rango decaracterísticasfísico-químicas.

• Los ácidosnucleicos seadhieren apartículas que asu vez quedanatrapadas en laestructura de lamembrana.

• El material se encuentracovalentemente inmovilizadoa la superficie sólida que lesirve de soporte.

• Pueden inmovilizarseoligonucleótidos ofragmentos de cDNA.

• El método de marcaje sueleser por fluorescencia.

Alto ruido de fondoMenor ruido

de fondo

Tabla 4. Tipos de soportes utilizados en microarrays y biochips de ADN (elaboración propia).

2.3. Material de Soporte

http://www.motorola.comhttp://www.interactiva.dehttp://www.nanogen.com

Según los expertos consultados, a continuación se enumeran las ventajas y los inconvenientes de losdistintos soportes:

15


SOPORTES PARA MICROARRAYS Y BIOCHIPS

Tipo de soporte Ventajas Desventajas

Tabla 5. Ventajas y desventajas de soportes utilizados en microarrays y biochips de ADN (elaboración propia).

Membranas de Nylon y deNitrocelulosa

• Mayor capacidad de soportede ADN debido a susuperficie porosa.

• Reutilizables.

• Bajo coste.

• Mayor ruido de fondofluorescente.

• Capacidad de miniaturizaciónlimitada.

• Deformación de la membrana.

• Baja resolución.

Superficies porosas demicropartículas

• Mayor flexibilidad

Superficies lisas de cristal

• Mínimo volumen dehibridación.

• Mayor capacidad deminiaturización.

• Soporte inerte.

• Permite el uso de dosfluorocromos a la vez.

• Alta resolución.

• Capacidad para aguantaraltas temperaturas ylavados de elevada fuerzaiónica.

• En el caso del cuarzo,hidroxilado de formanatural.

• Restricción de la capacidad decarga.

• Limitación del número deexperimentos por surtido.

Superficies lisas de plástico

• Mínimo volumen dehibridación.

• Gran capacidad de soportede ADN.

• Mayor capacidad deminiaturización.

• Soporte inerte.

• Ruidos de fondo porfluorescencia.

Generalmente, para conseguir la inmovilizaciónespecífica de las sondas se requiere además unamodificación previa del oligonucleótido o cDNApor medio de la activación mediante gruposamino, tiol o biotina (en este caso es necesariocubrir la superficie del soporte conestreptavidina). No obstante, algunos expertosconsultados señalan la existencia de problemas depérdida de activación durante los procesos delavado, y la necesidad de desarrollar métodosmás estables.

La forma ideal de inmovilización de ácidosnucleicos a la superficie del soporte sería aquellaque controlase la distancia a la cual se une cada

ácido nucleico, de modo que cada una de lassondas tenga total libertad para interaccionar demanera específica e independiente con lamuestra. Para ello se debe incorporar a la sondauna molécula espaciadora que la ancle al soportey que a su vez permita su interacción con lamuestra.

Tanto la activación de la sonda como el soporterequieren tiempo y esfuerzo, lo que supone unproblema a la hora producir a gran escala. En estoscasos, existe la posibilidad de adquirircomercialmente soportes ya activados (Ej. CorningInc., Motorola), si bien esta opción puede resultarcostosa en laboratorios de investigación.

16

9 “Medical Device Link”. IVD Technology [Actualización: Oct. 2001]: http://www.devicelink.com/ivdt/archive/01/09/002.html

Pasiva Activa

Activación de la superficie • Electrónica.

• Grupos aldehído.

• Grupos amino.

• Estreptavidina.

Activación de la sonda

• Grupos amino.

• Grupos tiol.

• Biotina.

Tabla 6. Inmovilización de ADN (elaboración propia).

2.4. Inmovilización de ADN

En los últimos años se han desarrollado múltiples técnicas de inmovilización de sondas sobre la superficiede los microarrays. Estos procedimientos dependerán de la aplicación final del microarray y del tipo desoporte utilizado9.

Las técnicas de inmovilización no covalentes (adsorción física, irradiación ultravioleta) no sonrecomendadas en el uso de microarrays ya que se dan fenómenos de hibridación no específica. Noobstante, la inmovilización electrónica de sondas es una técnica no covalente que actualmente estádisponible comercialmente (Nanogen). Los métodos utilizados en la inmovilización de sondas sobre lasuperficie sólida de microarrays, se basan en la unión covalente de las mismas al sustrato por medio deprocedimientos químicos.

La preparación de los soportes de cristal o silicio generalmente implica un tratamiento previo con gruposreactivos amino o aldehído, de manera que formen una capa uniforme de grupos reactivos químicamenteestables, hidrofílicos, para evitar uniones no específicas de las sondas con el soporte.

http://www.devicelink.com/ivdt/archive/01/09/002.html

17


10 Schena, M. (2000). Microarray Biochip Technology. Chapter 2. Microfluidic Technologies and Instrumentation for PrintingDNA Microarrays. Telechem International. Eaton Publishing.

Existen dos técnicas10 para inmovilizar los fragmentos de ADN en el soporte del array, sintetizar losoligonucleótidos en el propio soporte, mediante ciclos sucesivos o depositar mediante un brazo robotizadoel fragmento presintetizado que corresponda.

2.5. Fabricación

Bases de datospúblicas

Análisis de lavariacióngénica

Análisis de laexpresión

génica

Síntesis deOligos

mediantefotolitografía

Bases de datospropias

Compra deproductos de

PCR

Síntesis deproductos de

PCR

Hibridación de lamuestra con ADNdiana marcado

Lavado, detecciónde la señal,

interpretación dedatos

Construcción de librerías de cDNA

Deposición de fragmentos de ADN

en el soporte mediante técnicas de espoteado

FABRICACIÓN DE MICROARRAYS Y BIOCHIPS

Fig. 2. Proceso de fabricación y utilización de un microarray o biochip de ADN (elaboración propia).

Los parámetros que definen las características de cada tecnología de fabricación de biochips vienendeterminados por la densidad y diseño del chip, composición bioquímica, versatilidad, reproducibilidad,eficacia, calidad, coste y facilidad de automatización.

Identificaciónde secuencias

de ADN deinterés

Chip comercial(Affymetrix)

18

Métodos para la fabricación de Microarrays y Biochips

Principios técnicos Empresas

Impresión sin contacto (Ink-Jet)

Impresión por contacto

Síntesis “in situ”

Otras técnicas

Inyectorespiezoeléctricos

Cristales piezoeléctricos (cerámicas) selocalizan en las cercanías del capilar devidrio que contiene la muestra. Se generaun pulso eléctrico mediante la aplicaciónde voltaje, lo que causa la deformacióndel cristal, presiona el capilar y expulsauna pequeña cantidad de fluido por laextremidad del capilar.

Esta tecnología combina una bomba yjeringa con una válvula microsolenoideque suministra cantidades de muestra delorden de los nanolitros.

Las agujas o pins se empapan en la soluciónque contiene la muestra, con lo que unapequeña cantidad de ésta se transfiere alextremo de la aguja. Cuando este extremotoca la superficie del chip, una gota de lamuestra queda impresa en ella.

Incyte PharmaCombion

Agilent

Roseta

ProtoGene

PerkinElmer

Cartesian Technologies

Affymetrix

Arrayit.com

GeneMachines

Genetix

Jeringa-Solenoide(Syringe-solenoid)

Pin printing oMicrospotting

Fotolitografía

Química directa

En el soporte sólido se une covalentementeuna molécula que tiene en un extremo unagente protector fotodegradable. La luz sedirige a través de una máscara, degradandoel agente químico protector, y permitiendola unión de los nucleótidos, cada uno con unnuevo agente protector, con el enlacecovalente del soporte. El proceso se repitecon distintos nucleótidos y distintasmáscaras, hasta conseguir el oligo con lasecuencia adecuada.

Cada punto de ensayo contiene unsegmento de ADN inmovilizado en unsoporte poroso. Por medio de unoselectrodos se activa una reacciónelectroquímica por la cual se incorporansucesivos nucleótidos nuevos.

Affymetrix

Combimatrix

Microarrays 3D

Micro impresión húmeda

“XNA on Gold”

Utilizan soportes tridimensionales.

Permite la síntesis “in situ” y está basadaen técnicas fotolitográficas.

Basada en técnicas fotolitográficas. La superficie de cristal está cubierta por unacapa de oro recubierta de un grupo tiol alque se le une una segunda capa demoléculas de biotina y estreptavidina. Lamáscara utilizada para su diseño consiste enuna capa hidrofóbica de teflón.

PamgeneAmersham plc

CLONDIAG®Technologies

Interactiva

Tabla 7. Métodos para la fabricación de microarrays y biochips (elaboración propia).

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Métodos para la fabricación de Microarrays y Biochips

Ventajas Desventajas

Impresión sin contacto (Ink-Jet)

Impresión por contacto

Síntesis “in situ”

Otras técnicas

Inyectorespiezoeléctricos

Jeringa-Solenoide(Syringe-solenoid)

Rapidez, sencillez, coste moderado, altasvelocidades de deposición (varios miles demuestras por segundo), buena capacidad de miniaturización de los puntos (20-80 µm) y densidad de integración (10.000 puntos/cm2). Se puedeninmovilizar oligos y cDNAs.

Método sencillo y fiable, bajo coste. Sepueden inmovilizar oligos y cDNAs.

Burbujas de aire quereducen la fiabilidad delsistema, necesidad deutilizar volúmenes demuestra relativamentegrandes.

Volumen de muestranecesario demasiadogrande, tan solo escapaz de dispensar unvolumen mínimo delorden de 4-8 nL, con que la capacidadde miniaturización (250-500 µm) ydensidad de integración(200-400 puntos/cm2)está limitada.

Pin printing oMicrospotting

La impresión mediante pins se puederealizar sobre placas multipocillo o biensobre portaobjetos. Alta densidad deintegración (10.000 puntos/cm2) ymoderada capacidad de miniaturización(100 µm). Se pueden inmovilizar oligos ycDNAs. Relativo bajo coste y flexibilidad.

Alta densidad de integración (244.000puntos/cm2) y capacidad de miniaturización (

20

PRINCIPALES ARRAYERS DISPONIBLES EN EL MERCADO

Empresa Producto Enlace web

• Affymetrix • Affymetrix 417 Arrayer http://www.affymetrix.com

• Biomerieux http://www.biomerieux.com

• Biorobotics • MicroGrid II, Pro, TAS http://www.biorobotics.com

• Cartesian technologies• PixSys, ProSys, PegaSys

PA systems PixSys andProsys NQ systems

http://www.cartesiantech.com

• Clontech http://www.clontech.com

• DNAmicroarray http://www.dnamicroarray.com

• Genetix http://www.genetix.co.uk

• GeneMachines • OmniGrid microarrayer http://www.genemachines.com

• GenomeSystems http://www.genomesystems.com

• Genometrix http://www.genometrix.com

• GenomicSolution http://www.genomicsolutions.com

• Genpak• genpakARRAY 21

micro-arrayer systemhttp://www.genpakdna.com

• G Sim http://www.gesim.de

• Hitachi GeneticSystems

• SPBIO MicroarraySpotting Station

http://www.hitachi-soft.com/gs

• Labman AutomationLtd

http://www.labman.co.uk

• Molecular Dynamics • GEN III Array Spotter http://www.mdyn.com

• Packard • BioChip Arrayer http://www.packardinst.com

• TeleChem International • ChipMaker 2 and 3 http://arrayit.com

• Medway • ADVANCE-2000-I http://www.medway.ch

• Eurogentec • EuroGridder SDDChttp://www.eurogentec.be/catalog/dna_array/index.html

• RoboDesign • RoboArrayer http://www.robodesign.com

Tabla 8. Relación de las Empresas más relevantes dedicadas a la comercialización de Arrayers (elaboración propia).

Entre los componentes principales de un arrayer están los robots controlados por ordenadores, estacionesde lavado y de secado. Los robots están diseñados para recolectar automáticamente las muestraslocalizadas en placas multipocillo mediante distintas agujas simultáneamente.

http://www.affymetrix.comhttp://www.biomerieux.comhttp://www.biorobotics.comhttp://www.cartesiantech.comhttp://www.clontech.comhttp://www.dnamicroarray.comhttp://www.genetix.co.ukhttp://www.genemachines.comhttp://www.genomesystems.comhttp://www.genometrix.comhttp:://www.genomicsolutions.comhttp://www.genpakdna.comhttp:://www.gesim.dehttp://www.hitachi-soft.com/gsLtd http://www.labman.co.ukhttp:://www.mdyn.comhttp:://www.packardinst.comhttp:://arrayit.comhttp://www.medway.chhttp://www.eurogentec.be/catalog/dna_array/index.htmlhttp://www.robodesign.com

21


Mientras que la industria está continuamentebuscando la alternativa que le proporcionemayores beneficios, el mundo académiconecesita soluciones más baratas ya que susnecesidades de beneficio son menores. En unintento por atender ambas demandas, empresascomo Perkin-Elmer y Axon están trabajando enla elaboración de escáneres de alta tecnología y

a su vez desarrollando modelos de gama bajaque sean adecuados para su uso en pequeñascompañías o centros de investigación.

Por tanto, la diversidad en cuanto a lasdemandas está causando gran divergencia en losproductos desarrollados por los fabricantes deescáneres.

2.6. Escaneado y Software

Tabla 9. Relación de alguna de las Empresas más relevantes dedicadas a la comercialización de Escáneres con aplicaciónen Microarrays (elaboración propia).

PRINCIPALES ESCÁNERES DISPONIBLES EN EL MERCADO

Empresa Producto Enlace web

• Affymetrix Inc. • Affymetrix 428 scanner http://www.affymetrix.com

• Alpha Innotech • AlphaArray™ Reader http://www.alphainnotech.com

• Amersham/Pharmacia http://www.apbiotech.com/application/microarray

• Applied Precisión

• ArrayWoRx microarrayscanner

• ArrayWoRx microarrayreader

http://www.api.com/dvarrayworx.html

• Axon Instruments• GenePix 4000B

microarray scannerhttp://www.axon.com/GN_Genomics.html

• BiomedicalPhotometrics Inc.

• MACROscope, confocalmicroscope

http://www.confocal.com

• Curagen• GeneScape software

suite http://www.curagen.com

• Fuji Medical • BAS phosphorimagers http://www.fujimed.com

• GeneFocus • DNAscope scanner http://www.genefocus.com

• General Scanning • ScanArray 4000 http://www.gsilumonics.com

• Genomic Solutions• GeneTAC Biochip

Analyzershttp://www.genomicsolutions.com

• Molecular Dynamics Avalanche Microscanner http://www.mdyn.com

• MWG Biotech • GMS 418 array scanner http://www.mwgdna.com

• PerkinElmer LifeSciences

• ScanArray Lite, 4000,4000XL, 5000, 5000XL

http://lifesciences.perkinelmer.com/index.asp

• Virktek Vision Int. Inc.• ChipReader• ChipReader Extreme

http://www.virtek.ca

http://www.affymetrix.comhttp://www.alphainnotech.comhttp://www.apbiotech.com/application/microarrayhttp://www.api.com/dvarrayworx.htmlhttp://www.axon.com/GN_Genomics.htmlhttp://www.confocal.comhttp://www.curagen.comhttp://www.fujimed.comhttp://www.genefocus.comhttp://www.gsilumonics.comhttp://www.genomicsolutions.comhttp://www.mdyn.comhttp://www.mwgdna.comhttp://lifesciences.perkinelmer.com/index.asphttp://www.virtek.ca

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EMPRESAS QUE DESARROLLAN SOFTWARE PARA GENÓMICA

EmpresaInstitución

Aplicación Producto Enlace web

BioDiscoveryBases de datos; arraysde ADN

GeneDirector™ http://www.biodiscovery.com

Affymetrix Affymetrix LIMS,MicroDB http://www.affymetrix.com

BioDiscory

Media Cybernetics

Scanalytics, Inc.

Imaging Research, Inc.

Imaging Research, Inc.

BioDiscovery, Inc.

Rosetta Biosoftware

Silicon Genetics

Applied Maths

GeneData AG

LION Bioscience AG

OmniViz, Inc.

Affymetrix

Gene NetworkSciences

Informax, Inc.

AcadémicaFarmacéuticas

Otros

Partek, Inc.

Invitrogen ResGen

The WhiteheadInstitute for GenomeResearch

Stanford Univ.

TIGR

Berkeley University

Bioconductor

Universidad de Málaga

Eisen Labsoftware

Software tools

Dr. Terry Speed'sMicroarray DataAnalysis Group

Bioconductorproject

engene

http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm

http://www.tigr.org/softlab

http://www.stat.berkeley.edu/users/terry/zarray/Html/index.html

http://www.bioconductor.org

http://www.engene.cnb.uam.es

Pre-procesamiento dearrays de ADN

Análisis dedatos

ImaGen

Array-Pro

MicroArray Suite

ArrayVisionTMsystem

ArrayStat

GeneSight

Rosseta Resolver

GeneSpringTM

GenMaths

GeneDataExpressionist

arraySCOUT™-

Omniviz FunctionalGenomics

Data Mining Tool(DMT)

BioMine

Xpression NTI

Partek Pro

Pathway 4Software

GeneCluster

Calidadalta

Calidadmedia

Análisis de imagen dearrays de ADN

http://www.mediacy.com/arraypro.htm

http://www.scanalytics.com/product/hts/microarray.html

http://www.imagingresearch.com/products/ARV.asp

http://www.imagingresearch.com

http://www.biodiscovery.com/genesight.asp

http://www.rosettabio.com/products/resolver/default.htm

http://www.sigenetics.com/GeneSpring/index.html

http://www.applied-maths.com/ge/ge.htm

http://www.genedata.com/products/expressionist

http://www.lionbioscience.com/solutions/arrayscout

http://www.omniviz.com/products/index.htm

http://www.affymetrix.com

http://www.gnsbiotech.com/biomine.shtml

http://www.informaxinc.com/solutions/xpression/index.html

http://www.partek.com

http://pathways.resgen.com/tour/

http://www.genome.wi.mit.edu/cancer/software/genecluster2/gc2.html

Tabla 10. Relación de alguna de las Empresas más relevantes dedicadas a la comercialización de Software con aplicaciónen microarrays (Fuente: Dr. José María Carazo).

El análisis de los datos y la interpretación de los mismos mediante herramientas software, es sin duda uno de losprincipales escollos en la utilización de la tecnología de microarrays y biochips. Los avances en la capacidad degestión y almacenamiento de las bases de datos son esenciales para mejorar la calidad de la información obtenidamediante técnicas de Minería de Datos o “Data Mining”, que permiten la elaboración de modelos de análisis comopor ejemplo aquellos que agrupan genes o experimentos en función de diferentes patrones (“clustering”).

http://www.biodiscovery.comhttp://www.affymetrix.comhttp://www.mediacy.com/arraypro.htmhttp://www.scanalytics.com/product/hts/microarray.htmlhttp://www.imagingresearch.com/products/ARV.asphttp://www.imagingresearch.comhttp://www.biodiscovery.com/genesight.asphttp://www.rosettabio.com/products/resolver/default.htmhttp://www.sigenetics.com/GeneSpring/index.htmlhttp://www.applied-maths.com/ge/ge.htmhttp://www.genedata.com/products/expressionisthttp://www.lionbioscience.com/solutions/arrayscouthttp://www.omniviz.com/products/index.htmhttp://www.affymetrix.comhttp://www.gnsbiotech.com/biomine.shtmlhttp://www.informaxinc.com/solutions/xpression/index.htmlhttp://www.partek.comhttp://pathways.resgen.com/tour/http://www.genome.wi.mit.edu/cancer/software/genecluster2/gc2.htmlhttp://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htmhttp://www.tigr.org/softlabhttp://www.stat.berkeley.edu/users/terry/zarray/Html/index.htmlhttp://www.bioconductor.orghttp://www.engene.cnb.uam.es

23


2.7. Breves cuestiones técnicas

Además de los gastos derivados de la adquisición directa del arrayer, hay que considerar otros costes notan obvios pero igualmente importantes. Imprimir un array de alta densidad requiere un gran número desondas, lo que resulta muy caro para un laboratorio de investigación. En algunos casos se recomiendarealizar previamente la secuenciación de las sondas para la verificación de sus secuencias, lo queencarece aún más su obtención. Algunas empresas como Clontech, Incyte y Operon proporcionan oligosya verificados u oligos de diseño. Otro factor a tener en cuenta es el uso necesario de la PCR en loslaboratorios que posean microarrays de ADN. Esta técnica es esencial para controles de calidad yverificaciones de las secuencias, y aunque en la actualidad la mayoría de los centros poseen lainstrumentación, hay que considerar los gastos derivados de su uso recurrente.

EMPRESAS QUE COMERCIALIZAN SONDAS PARA MICROARRAYS

Empresa Nombre del producto Enlace web

Operon technologies Array-Ready Oligo sets http://www.operon.com/arrays/arraysets.php

Lion Bioscience arrayTAGhttp://www.lionbioscience.com/eng/index_c_1_7.htm

ClontechAtlas Ready-to-print LongOligo

http://www.clontech.com/products/literature/pdf/brochures/AtlasReadytoPrint.pdf

Incyte Genomics Easy to spot products http://www.incyte.com/index.shtml

Research GeneticsGeneStorm® expression-ready full-length clones

http://www.resgen.com/full_length/index.php3

StratageneGeneConnection Discoveryclone collection QuikSpotPCR products

http://www2.stratagene.com/gc/discoveryclones.asp

I.M.A.G.E.Consortium cDNAlibraray

Biological resources fromUK Human GenomeMapping Project ResourceCentre

http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Biology/descriptions/image.html

Tabla 11. Relación de alguna de las Empresas más relevantes dedicadas a la comercialización de sondas con aplicación enmicroarrays (elaboración propia).

Además de los costes asociados a lasinfraestructuras y materiales, el diseño y manejode microarrays es laborioso y consume grancantidad de tiempo y recursos, por lo que esnecesaria la incorporación de personal dedicado atiempo completo. Según expertos consultados elnúmero de personas destinadas al mantenimientode la plataforma de microarrays es de una media

de 4, mientras que el tiempo medio necesariopara la puesta en marcha de las infraestructurasde microarrays es de 6 a 12 meses, pudiendo enocasiones necesitar de 1 a 2 años. Este periodose correspondería al tiempo que se requiere parala adquisición de datos experimentalessatisfactorios a partir de la adquisición delinstrumental.

http://www.operon.com/arrays/arraysets.phphttp://www.lionbioscience.com/eng/index_c_1_7.htmhttp://www.clontech.com/products/literature/pdf/brochures/AtlasReadytoPrint.pdfhttp://www.incyte.com/index.shtmlhttp://www.resgen.com/full_length/index.php3http://www2.stratagene.com/gc/discoveryclones.asphttp://www.hgmp.mrc.ac.uk/Biology/descriptions/image.html

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“Genechip®” de Affymetrix (http://www.affymetrix.com): biochips de ADN fabricados mediantetécnicas fotolitográficas. Pese a ser una denominación comercial en ocasiones es empleada parareferirse a los biochips de ADN en general.

“GEM arrays” de Incyte (http://www.incyte.com): biochips para el análisis de la expresión génica.

“Spectrochip” de Sequenom, (http://www.sequenom.com): son chips de silicio de 2 x 3 cmaproximadamente, con un surtido de puntos para al análisis de ADN mediante espectrometría demasas (MALDI-TOF). Se utilizan para el genotipado y secuenciación.

“Nanochip” de Nanogen (http://www.nanogen.com). Combinan la tecnología de microarrays con loslab-on–a chip, de los cuales hablaremos más adelante. Esta técnica utiliza la microelectrónica paramover y concentrar moléculas cargadas hacia los sitios diseñados en el microchip, por lo quetambién se denominan “matrices electrónicamente activas”.

Cuadro 3. Terminología de empresas que fabrican chips.

2.8. Últimas tendencias en nuevos desarrollos tecnológicos

Las tendencias hacia nuevos desarrollos tecnológicos se pueden clasificar en tres grupos según elobjetivo que persigan:

Tendencia 1 FIABILIDAD

Tecnología “Bioelectrochips”

DescripciónMétodo electrónico que mantiene las hebras de DNA unidas debido a lacarga negativa de éstas, y lo obliga a hibridar bajo condiciones controladas,moviendo y concentrando las muestras solo en los puntos deseados.

Ventajas

Permite al cliente diseñar el chip. Puede reutilizarse e incluso cambiar lassecuencias de las muestras. Rapidez (resultados en varios minutos) yprecisión (mayor que en los GeneChips de Affymetrix según expertosconsultados).

DesventajasTan solo está catalogado por el momento para su uso en investigación dedeterminadas enfermedades.

EjemploNanogen (http://www.nanogen.com) comercializa “Active MicroelectronicDevices” o “Matrices Electrónicamente Activas”.

http://www.affymetrix.comhttp://www.incyte.comhttp://www.sequenom.comhttp://www.nanogen.comhttp://www.nanogen.com

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Tendencia 2 SENSIBILIDAD

Tecnología PNAs (peptide nucleic acid)

DescripciónUnidades repetidas de N- (2-aminoetil)-glicina unidas por enlaces amino, ybases nucleotídicas unidas a la estructura.

VentajasMás estables frente a proteasas y nucleasas, y producen una mayor señal.

DesventajasSe ha observado una pérdida de especificidad en la hibridación (segúnexpertos consultados).

Ejemplo Radius BioSciences (Microarrays de ADN y PNA).

Tendencia 3 INTEGRACIÓN

Tecnología Dispositivos microfluídicos o LOAC* (Lab-on-a-chip)

Descripción

Dispositivos que emplean campos eléctricos para mover moléculas, células,partículas o líquidos a través de microcapilares construidos sobre chips decristal, plástico, silicio o cuarzo. Este tipo de chip contiene un conjunto demicrocanales y microcámaras donde tienen lugar las reacciones quepermiten el análisis de la muestra. El método predominante para laseparación de los productos de reacción es la electroforesis, ya que lacromatografía es muy complicada de miniaturizar.

Ventajas

El volumen de fluidos y de muestra que se necesita es mínimo,consiguiendo así que el ensayo se realice en menos tiempo, y que el preciodel dispositivo se reduzca debido al ahorro en reactivos. Eliminación de laetapa de inmovilización de sondas. Método de detección portátil, de usar ytirar, que además permita realizar tanto la preparación de la muestra, comoel análisis y la detección de los reactivos dentro de un mismo dispositivo defácil manejo.

Desventajas

El coste final del ensayo se encarece debido principalmente a laminiaturización, no obstante, la tecnología de microsistemas está avanzandode tal modo que en un futuro cercano se conseguirán sistemas máseficientes.

Ejemplo

Agilent (http://www.agilent.com), en colaboración con Caliper(http://www.caliper.com), ha desarrollado el LabChip11, un dispositivo quecombina materiales de cristal, cuarzo y plástico, y que contiene múltiplescapilares que permiten el acceso a las muestras. Las aplicaciones de estoschips se centran principalmente en ensayos enzimáticos y celulares, asícomo en ensayos de ARN y ADN. Agilent ofrece además un servicio deasesoramiento y de diseño del chip, principalmente orientado a la elecciónde las sondas más adecuadas para la detección de la diana en la queestemos interesados.

Tabla 12. Tendencias para futuros desarrollos tecnológicos (elaboración propia).

11 Krishnan, M.; Namasivayam, V.; Lin, R.; Pal, R.; Burns, M.A. (2001). Microfabricated reaction & separation systems. Curr. Op. Biotech., 12, 92-98.

http://www.agilent.comhttp://www.caliper.com

Tras la secuenciación del genoma humano, la demanda de instrumentos tecnológicos que facilitarán labúsqueda de genes y sus patrones de expresión ha sido espectacular. Las aplicaciones de losmicroarrays en el sector de la salud humana se pueden resumir en la siguiente tabla:

26

3. Aplicaciones de los microarrays y biochips en Salud Humana

APLICACIONES DE MICROARRAYS Y BIOCHIPS

Objetivo Técnica Aplicación

Caracterizacióndel ADN

Cuantificacióndel ADN

Comparacióndel ADN

• Secuenciación por Hibridación(Sequencing by Hybridization o SBH).

• Identificación por hibridación.

• Análisis de la expresión génica.

• Descubrimiento de nuevosfármacos.

• Identificación de polimorfismos.

• Diagnóstico molecular.

• Farmacogenómica.

• Comparación de secuenciashomólogas.

• Genómica (funcionalidad degenes).

• Detección de mutaciones yvariaciones en el genoma.

• Diagnóstico molecular.

• Caracterización del perfil genéticode enfermedades.


• Validación de dianas terapéuticas.

• Caracterización de la acciónmolecular de compuestos activos.

Tabla 13. Aplicaciones de microarrays y biochips (elaboración propia).

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DIFERENCIAS ENTRE MICROARRAYS Y BIOCHIPS

Chip de ADNMicroarray de ADN

Tipo de impresión

Material genéticoinmovilizado

Densidad deintegración

Coste

Ventaja

Desventaja

• Impresión por deposición.

• Fragmentos de cDNA.

• 10.000-15.000 / microarray(aunque pueden alcanzarsedensidades mucho mayores).

• Bajo.

• Se pueden caracterizar genesnuevos al inmovilizarsecuencias anónimas.

• Necesita un paso previo de PCR.

• Impresión por síntesis.

• Oligonucleótidos.

• 200.000-300.000 / chip.

• Alto.

• Puede no necesitar PCR previa.• Sistema más utilizado para el análisis

del transcriptoma.

• Genes de interés y regiones nocodificantes deben ser identificadaspreviamente.

Tabla 14. Diferencias entre microarrays y biochips (elaboración propia).

Desde un inicio los microarrays y biochips seutilizaron para analizar patrones de expresión degenes con el fin de vislumbrar las bases molecularesde los procesos de la vida (ej. el ciclo celular). Sibien con posterioridad se han ido incrementando susaplicaciones hacía la comprensión del desarrollo detejidos y órganos e incluso la caracterización deenfermedades de base molecular como el cáncer.

El análisis de la expresión génica es útil en eldiagnóstico y tratamiento de enfermedades ligadas apatrones de expresión genética particulares. Losarrays de ADN son especialmente útiles para laclasificación de tumores y la identificación deparámetros (marcadores) que permitan estimar elpronóstico de la enfermedad. Se puede estudiar lafunción de los genes al facilitar la identificación deaquellos genes activados, inhibidos o mutados(polimorfismos) de forma diferencial cuando secomparan tejido sano y enfermo.

Sin embargo, los datos procedentes del análisis dela expresión génica tienen sus desventajas, ya quelos niveles de mRNA pueden no reflejar los niveles

de proteína, y la expresión de una proteína nosiempre tiene una consecuencia fisiológica. Así pues,sería necesario utilizar una técnica de análisis conindicadores más sofisticados como la localización delas proteínas y sus tasas de recambio, cambiosestructurales y modificaciones de proteínas.

Existen otras tecnologías que no están basadas enarrays de ADN, como por ejemplo TOGA12 (TotalGene Expresion Analysis), SAGE13 (Serial Analysisof Gene Expresion), READS (Restriction Analysisof Differentially Expressed Sequences), y RT-PCR(Real Time PCR), que permiten el análisis de laexpresión génica a media o baja densidad, esdecir, el número de genes que se pueden analizaren un solo experimento es de menor magnitudque en el caso de técnicas que permitenresultados a gran escala, como los microarrays deADN. El caso de TOGA es diferente, ya que pese ano estar basado en tecnologías de arrays, sípermite un análisis de la presencia yconcentración de mRNA por medio de un sistemaautomatizado y de alta resolución por el cual secuantifica el cDNA total.

3.1. Aplicación 1:Monitorización de la Expresión Génica

12 Digital Gene Technologies Inc.: http://www.dgt.com13 Genzyme Molecular Oncology: http://www.genzymemolecularoncology.com

http://www.dgt.comhttp://www.genzymemolecularoncology.com

La aproximación tradicional al proceso de descubrimiento de nuevos fármacos, su posterior desarrollo yanálisis toxicológico, está evolucionando en los últimos años debido al mayor conocimiento del genomahumano y a la utilización de técnicas de cribado a gran escala como son los microarrays de ADN.

28

Análisis de la expresión génica en células y tejidos normales

El patrón de expresión de un gen proporciona información indirecta acerca de su función. Si llegamosa caracterizar las secuencias homólogas de una familia génica, así como los procesos quedesencadenan la expresión selectiva de sus genes, podremos diseñar fármacos que activen dichaexpresión de manera específica, minimizando los efectos secundarios.

Análisis comparativo de la expresión génica en condiciones patológicas

La regulación negativa o positiva de la expresión de un gen puede ser la causa de la patología o bienel resultado de la misma. Aunque el principal objetivo sea actuar sobre el gen cuya expresión causala patología, también se busca modificar la actividad de alguno de los genes que se expresan comoconsecuencia de la enfermedad con el fin de aliviar sus síntomas. Por lo tanto, la posibilidad decomparar la expresión de miles de genes en tejidos o células enfermas y normales, permitirá laidentificación de múltiples dianas terapéuticas potenciales.

Análisis de la expresión génica en sistemas modelo

El uso de animales como modelos de enfermedades proporciona gran cantidad de información y laposibilidad de comparar sus patrones genéticos de expresión. Estos experimentos se suelen realizar conratones transgénicos que o bien sobre expresan genes específicos, o bien carecen de alguno de estosgenes (mutaciones puntuales, knockouts, etc). Otros modelos más sencillos que también se utilizan sonlas levaduras (Saccharomyces cerevisiae), o gusanos (Caenorhabditis elegans) y peces (Zebrafish).

Análisis de la expresión génica en patógenos

Una de las ventajas que presenta el trabajo con genomas procedentes de microorganismos es supequeño tamaño, lo que ha permitido la secuenciación de un gran número de ellos en poco tiempo.Entre sus genes se hallan los que codifican factores de virulencia que se encuentran regulados poragentes ambientales tales como la temperatura. Los microarrays pueden ser aplicados igualmente enel estudio de la expresión de los genes virales durante el curso de la infección y periodo de latencia,así como en el estudio de la respuesta del organismo hospedador frente al patógeno.

Cuadro 4. Aplicaciones derivadas del análisis de la expresión génica (elaboración propia).

Cuadro 5. Etapas en el descubrimiento de nuevos fármacos (elaboración propia).

Métodotradicional

Dianabiológica

Clonación Fármaco

GenómicaSecuencia

génicaDiana

terapéuticaFármacocandidato

Genómicareversa

Dianaterapéutica

GenFármacocandidato

3.2. Aplicación 2: Cribado de compuestos activos y validación de dianas terapéuticas

29


Las aplicaciones de microarrays y biochips en elámbito de la generación de fármacos sonespecialmente numerosas: contribuyen a laidentificación de dianas terapéuticas másefectivas; permiten conocer mejor el mecanismode acción de medicamentos, mejorando sueficacia y eficiencia; e incluso pueden determinarlos efectos secundarios de un fármaco endesarrollo, evitando la entrada en ensayos clínicosen caso de detectar toxicidad.

Los arrays de ADN son una herramienta potencial para la investigación de los mecanismospor los cuales actúan distintos fármacos, su implicación en rutas metabólicas, y posiblesefectos secundarios.

La monitorización de la expresión de genes conpotencial tóxico puede ser de especial interéspara las industrias farmaceúticas. La identificaciónde los productos expresados por estos genespueden ser usados para el seguimiento de untratamiento farmacológico y el efecto de distintasdosis del mismo, haciendo más fácil el desarrollode nuevos compuestos. El uso de arrays de ADNen este caso presenta grandes ventajas cuando elfármaco es difícil de rastrear por métodosconvencionales, o bien los efectos esperadosrequieren largos periodos de tiempo.

PAPEL DE LOS MICROARRAYS DE ADN:DESCUBRIMIENTO DE NUEVOS FÁRMACOS

En este campo se persigue en primer lugar, la identificación de genes y mecanismosmoleculares nuevos14 que permitan el desarrollo de un abordaje terapéutico totalmente diferente alos ya existentes, o bien la mejora de los mismos.

La identificación de nuevas dianas terapéuticas mediante microarrays de ADN ha seguido dosestrategias durante los últimos 4 años, la mayoría relacionadas con el cáncer.

Estrategia 1: Identificación de compuestos con patrones de expresión de la actividad celular únicos,con el objetivo de que estos indiquen la presencia de un nuevo compuesto con alguna de lasactividades conocidas.

De esta forma, el Instituto Nacional de Cáncer de Estados Unidos ha analizado la actividad inhibitoria del crecimiento celular de aproximadamente 70.000 compuestos frente a un panel de 60células tumorales humanas15.

La estrategia a seguir en este tipo de estudios comprende la creación de bases de datos de análisisde expresión génica con el objetivo de realizar clusters que reúnan los genes según su implicaciónen determinados procesos relacionados con el proceso cancerígeno. Así, se elaboran microarrays conmarcadores genéticos específicos de proliferación celular, progresión del ciclo celular, regulación de lasíntesis proteica, metabolismo de fármacos, etc. La batería de compuestos disponibles se analizamediante este microarray, lo que dará lugar a un conjunto de datos relacionados con los cambios enla expresión génica inducidos por cada compuesto.

Nuevo Gen Nueva diana Nuevos fármacos

14 Debouck, C.; Goodfellow, P.N. (1999). DNA microarrays in drug discovery and development. Nature GeneticsSupplement. Vol 21, Jan. 48-50.

15 Scherf, U.; Ross, D.T.; Waltham, M.; Smith, L.H.; Lee, J.K.; Tanabe, L.; Kohn, K.W.; Reinhold, W.C.; Myers, T.G.;Andrews, D.T.; Scudiero, D.A.; Eisen, M.B.; Sausville, E.A.; Pommier, Y.; Botstein, D.; Brown, P.O.; Weinstein, J.N. (2000). A gene expression database for the molecular pharmacology of cancer. Nat Genet; 24:236–44.

30

Estrategia 2: Utilización del genoma de levaduras como modelo para el screening de dianasterapéuticas.

El genoma completo de S. Cerevisiae se conoce extensamente, y ha sido sujeto a numerosos análisisde mutaciones. La identificación de nuevos compuestos activos es posible mediante la comparaciónde la expresión génica en mutantes con alteraciones conocidas expuestos a baterías decompuestos16.

En segundo lugar la implementación de nuevas tecnologías que aumenten la eficiencia delproceso de descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos. El uso de los microarrays de ADNpodría reducir el tiempo empleado en realizar estas etapas, y disminuir el número de compuestos que sedescartan tras haber consumido tiempo y medios económicos en ensayos clínicos.

De esta forma, los microarrays de ADN se utilizan en el análisis de la expresión génica para lavalidación de dianas, el estudio del perfil de activación e inactivación de dianas durante el proceso deoptimización de agentes terapéuticos, mejor conocimiento de los mecanismos moleculares yrelaciones entre la actividad y la estructura, así como la predicción de efectos secundarios, ydescubrimiento de marcadores de diagnosis, prognosis, y otros marcadores moleculares17.Adicionalmente, el análisis de la expresión génica por medio de microarrays de ADN permite laobservación del modo de acción del fármaco, y la identificación de los factores responsables de lasensibilidad, toxicidad, y resistencia de los fármacos18.

Cuadro 6. Objetivos de la utilización de microarrays de ADN en el proceso de descubrimiento y desarrollo de nuevosfármacos (elaboración propia).

16 Gray, N.S.; Wodicka, L.; Thunnissen, A.-M.W.H.; Norman, T.C.; Kwon, S.; Espinoza, F.H.; Morgan, D.O.; Barnes, G.;LeClerc, S.; Meijer, L.; Kim, S.-H.; Lockhart, D.; Shultz, P.G. (1998). Exploiting chemical libraries, structure, andgenomics in the search for kinase inhibitors. Science; 281:533–8.Brachat, A.; Pierrat, B.; Brungger, A.; Heim, J. (2000). Comparative microarray analysis of gene expression duringapoptosis-induction by growth factor deprivation or protein kinase C inhibition. Oncogene; 19:5073-82.

17 Clarke, P.A.; Poele, R.; Wooster, R.; Workman, P. (2001). Gene expression microarray analysis in cancer biology,pharmacology, and drug development: progress and potential. Biochemical Pharmacology 62:1311-1336.

18 Workman, P. (2001). New drug targets for genomic cancer therapy: success, limitations, opportunities and futurechallenges. Curr Cancer Drug Targets; 1:33–47.Turton, N.J.; Judah, D.J.; Riley, J.; Davies, R.; Lipson, D.; Styles, J.A.; Smith, A.G.; Gant, T.W. (2001). Gene expressionand amplification in breast carcinoma cells with intrinsic and acquired doxorubicin resistance. Onco-gene.; 20:1300-6.Robert J (2001). Resistance to cytotoxic agents. Curr Opin Pharmacol; 1:353–7.

La presencia de formas génicas alternativas oexpresiones atípicas de genes implicados en laacción de un fármaco o el metabolismo, puedemanifestarse como una resistencia a la terapia obien una respuesta atípica a la misma. Losestudios farmacogenómicos correlacionan el perfilgenético de los individuos con la repuesta de cadauno de ellos a un fármaco determinado. Lainformación obtenida con estos resultados seutiliza para diseñar arrays de ADN que puedan serutilizados en la selección de fármacos a medida, ycon ello se consigan tratamientos más eficaces yatenuar posibles efectos secundarios en elpaciente.

La respuesta de cada paciente a un fármaco estáintrínsecamente ligada a las características genéticasdel paciente, moduladas por factores fisiológicos,patológicos y ambientales. Así, la particular dotacióngenética del paciente incide tanto en los factoresfarmacocinéticos, determinantes de la concentracióndel fármaco en su lugar de acción, como en losfactores farmacodinámicos (acción específica delfármaco) ligados a la manifestación propia de laenfermedad y a la reacción adversa. Lafarmacogenómica pretende realizar una terapéuticaindividualizada al determinar el fármaco de elecciónpara la manifestación específica de la enfermedaden el paciente, y la dosis apropiada para conseguirel efecto terapéutico minimizando el riesgo dereacciones adversas.

3.3. Aplicación 3:Farmacogenómica

31


Herramientas Tradicionales

• Desarrollo de un conocimientomás global de los cambios queconducen a los procesos demalignidad.

• Mejor conocimiento delmecanismo molecular durante losprocesos de identificación,optimización y ensayos clínicos.

• Identificación y validación de nuevas dianas terapéuticas.• Predicción de pacientes tratados con fármacos con mayor posibilidad de éxito.• Desarrollo de terapias a medida para cada paciente.

Microarrays y biochips

• Descubrimiento de indicadores dediagnóstico y pronóstico así comomarcadores de respuesta adistintas terapias.

• Identificación de genesimplicados en la resistencia afármacos.

INTEGRACIÓN DE MICROARRAYS EN LA LUCHA CONTRA EL CÁNCER: FÁRMACOS A MEDIDA

Fig. 3. Herramientas y estrategias utilizadas para el desarrollo de terapias contra el cáncer (elaboración propia).

La gran promesa que presentan los microarrays en la investigación del cáncer es la clasificación detumores en “clases” basadas en los patrones de expresión de los mismos. Estas clasificaciones se realizanpor medio de un “clustering” u organización de los genes en mapas de expresión génica a modo de árbolesfilogéneticos. Clases diferentes de tumores pueden presentar distintos comportamientos clínicos, y portanto deben abordarse mediante terapias diferentes, apropiadas para cada clase o subclase.

La obtención de información útil a través detécnicas genómicas tradicionales (ej. PCR) o bienmediante el uso de microarrays o bichips de ADN,tiene una clara explotación comercial, en elámbito del diagnóstico y prognosis deenfermedades. Los chips que se estándesarrollando en la actualidad con aplicaciones endiagnóstico molecular son de distinta naturaleza:

Chips para identificación de SNPs

La detección de mutaciones y polimorfismospermite el estudio de todas las variantes de unmismo gen, características de cada individuo, y ladetección de mutaciones en genes que participanen enfermedades complejas. Se pretendeconseguir la identificación de marcadoresespecíficos para determinadas enfermedades orepuestas a fármacos, mediante la identificaciónde SNPs19 (polimorfismos de un solo nucleótido).

En este tipo de chips de ADN, lo que se fija alsoporte son oligonucleótidos sintéticos de 7 a 30bases, pues con mayor número es difícilidentificar “mismatch”. Cada uno de ellosrepresenta un fragmento de un determinado gen,de modo que se puedan localizar variantes degenes conocidos, así como detectar mutacionespor deleción o inserción. Este tipo de análisis serealiza fijando a la matriz secuencias quecontengan mutaciones conocidas (por ejemplo,todas las de un determinado gen), para detectarcuál es la que tiene ese gen en la muestraproblema.

Chips de caracterización genética

Los análisis genéticos se emplean para encontrarla posible predisposición de una persona haciauna enfermedad basándose en el análisis demutaciones en un individuo o en una familia.

3.4. Aplicación 4: Diagnósticomolecular

19 Single Nucleotide Polymorfism (Polimorfismo de un solo nucleótido).

32

Para elaborar un chip de diagnóstico ycaracterización tumoral, se utilizan secuencias quecontienen distintas mutaciones en protooncogeneso en genes supresores de tumor, cuya presenciaen las células tumorales atribuye distintascaracterísticas al tumor en cuestión.

El Centro Nacional de Investigaciones OncológicasCarlos III, (CNIO), ha sido el primer centroespañol que fabrica y utiliza sus propios biochipspara su aplicación en cáncer. Los “oncochips” delCNIO contienen un total de 6.514 genes,seleccionados por su implicación en procesostumorales a partir de los 35.000 genesidentificados por el Proyecto Genoma Humano.Entre sus aplicaciones se encuentran la prediccióndel desarrollo clínico de un tumor y de su posiblerespuesta a distintos fármacos, así comoinformación fundamental para los investigadoresque trabajan en el campo de la oncología básica.

Chips de detección deenfermedades infecciosas

Actualmente existen varias líneas de desarrollo dechips para diagnóstico molecular de enfermedadesinfecciosas, como el SIDA o la hepatitis,convergiendo todas ellas hacia la integración yfacilidad de ensayo. Estos chips permiten elgenotipado de las cepas infecciosas a partir demuestras del paciente.

Si las herramientas de amplificación de ADN hansupuesto una primera revolución para eldiagnóstico molecular de enfermedadesinfecciosas (kits de PCR), al permitir un análisismás rápido y fiable que los ensayos tradicionalesmediante anticuerpos (ensayos serológicos), loschips de diagnóstico molecular de enfermedadesinfecciosas, que están actualmente en fase dedesarrollo, supondrán una segunda revolución deigual o mayor magnitud.

33


DESARROLLO DE CHIPS PARA APLICACIONES EN MICROBIOLOGÍA20

Virus Estatus en 2001 Soporte y sondas

Genotipado Virus de lahepatitis C

Resistencia al virus del VIH

• Disponiblecomercialmente

• En desarrolloindustrial



• En desarrolloacadémico

• Oligos en membrana de nitrocelulosaGenotipado Virus de lahepatitis B


• Oligos en membrana de nitrocelulosaGenotipado Papilomavirus


• Oligos en membrana de nylonIdentificación de mycobacterias


• Productos de PCR en membrana denylon

Identificación de Enterococcus


• Oligos en membrana de nitrocelulosaGenotipado de Helicobacterpylori



Patogénesis de E. Coli



Identificación de Streptococcus


• Oligos en membrana de nitrocelulosaIdentificación de especies deCampylobacter


• Oligos en membrana de nitrocelulosaDetección de Listeria


• Oligos en membrana de nitrocelulosaDetección de Brucella

• Oligos en membrana de nitrocelulosa

• Oligos en array microelectrónico

• Oligos en membrana de nitrocelulosa

• Síntesis in situ de oligos

Resistencia de mycobacterias a rifampicina



• Síntesis in situ de oligos

• Oligos en membrana de nylon

Tabla 15. Desarrollo de chips para aplicaciones en microbiología (elaboración propia).

20 Anthony, R.M.; Brown, J.T.; French, G.L. (2001). DNA array Technology and Diagnostic Microbiology. Expert. Rev. Mol.Diag. 1(1). 30-38.

34

Los microarrays de ADN o biochips que se comercializan actualmente se dividen en alta y baja densidad21,teniendo ambos aplicaciones distintas de acuerdo al usuario final.

Compañías farmacéuticas y biotecnológicas

Comunidad académica e investigadores

Tabla 16. Usuarios de las Tecnologías de Microarrays (elaboración propia).

4. Aspectos de mercado: aplicación de microarrays de ADN y biochips en salud humana

• Centran sus esfuerzos en acelerarlos niveles de producción.

Característicaprincipal

• Necesidades mucho menores encuanto a resultados a gran escala.

• Problemas de automatización yobtención de resultados a gran escala.

Debilidades • Medios económicos restringidos.

• Altos presupuestos.Fortalezas• Recursos humanos bien formados

y con bajo coste.

• Caracterización de la acciónmolecular de compuestos activos.

• Verificación y validación de dianasterapéuticas.


Arrays de media/alta densidad

• Identificación de genes de interés.

• Caracterización de mecanismospatológicos.

• Análisis de la expresión génica.

• Diagnóstico molecularArrays de baja

densidad

21 La densidad de un array hace referencia al número de puntos activos sobre una superficie en donde se depositan lassondas o oligos de ADN.

22 Gottlieb, S. (2001). The Coming Biochip Boom: Gene Chips Go Clinical. Gilder Biotech Report, Oct., Vol. 1, nº 1.

La empresa líder en arrays de alta densidad es

hasta el momento Affymetrix, con un 60% del

mercado total de chips de ADN, y que tiene a los

investigadores entre sus principales clientes. Este

tipo de arrays permite una gran densidad de

integración y la realización de un importante número

de ensayos de manera simultánea. El GeneChip de

Affymetrix se usa de manera relativamente

frecuente en laboratorios de investigación,

vendiéndose más de 100.000 unidades

anualmente22 a un precio que oscila entre los 50 € y

2.280 € dependiendo del chip. Entre los principales

productos que se comercializan están los chips VIH

que pueden detectar cepas resistentes a

determinados fármacos, los chips p53 que se utilizan

para la detección de mutaciones asociadas a una

mayor predisposición a desarrollar procesos

cancerosos, y el chip citocromo P450 que es capaz

de identificar aquellos individuos que tengan más

dificultades para metabolizar los fármacos de uso

común.

Las técnicas fotolitográficas utilizadas por

Affymetrix para la síntesis in situ de oligos,

permiten obtener hoy por hoy chips

comercializables con los tamaños de punto más

pequeños (390.000 puntos/cm2 según fuentes de

la propia compañía).

4.1. Arrays de alta densidad

35


Fig. 4. Comparación de las densidades de los arrays producidos por diferentes compañías en el año 2000.

100.000

10.000

1.000

100

10

Alta densidad

Media densidad

Baja densidad

Aff

ym

etr

ix

Vysi

s Clo

nte

ch

CM

S Mo

toro

la

Cep

heid

Nan

og

en

Ag

ilen

t

DENSIDAD DE ARRAYS COMERCIALES 23

Los arrays de media y baja densidad suelen utilizarse para trasladar a una escala más práctica, los resultados obtenidos (ej. secuencias de interés o mutaciones) con arrays de alta densidad. Las características de precisión y velocidad de análisis de los arrays de media y baja intensidad, permiten

que se posicionen en sectores de mercado conmayor margen de negocio, como por ejemplo elsector clínico. El punto fuerte de los chips deAffymetrix, la alta densidad de integración, tienemenor valor en estos sectores donde se buscafiabilidad, rapidez, simultaneidad y flexibilidad paraabordar los problemas concretos del cliente.

Proveedores de instrumental

GeneMachines, BioRobotics, Molecular Dynamics, Nanogen,Packard Biosciences.

Proveedores de chips

Stratagene, Clontech, Tahara, MWR, Perkin elmer/NEN.

Proveedores de soluciones integradas

Genomic Solutions.

Cuadro 7. Proveedores de arrays de baja y media densidad (elaboración propia).

4.2. Arrays de media y baja densidad

23 Nelson, T.R. (2000). Chip, Chip, Array! An Analysis of DNA Chip Technology. Equity Capital Markets, Dain RauscherWessels. Dec. 7.

Los expertos consultados para la realización de este

informe, corroboran los datos y tendencias

expuestos en los informes de mercado realizados

por importantes consultoras, si bien un número

importante de ellos piensa que se han subestimado

las posibilidades que presentan los microarrays de

baja densidad, sobre todo a la vista de los

importantes desarrollos que se están produciendo en

microfluídica, electrónica y microsistemas. Estos

desarrollos permitirían la integración de todas las

operaciones necesarias para llevar a cabo ensayos y

práctica clínica, de manera rápida y precisa

(ej. Tecnología Lab-on-a-chip).

Hasta la fecha, los microarrays de ADN más

utilizados según la encuesta realizada por ABRF

(Association of Biomolecular Resource Facilities) en

el 200125 son los de Affymetrix26. Esta compañía

sigue una estrategia de implantación en el

mercado parecida a la que mantuvo Microsoft con

sus programas informáticos, manteniendo

acuerdos con diversas compañías que se dedican

al mismo sector, con el fin de crear una plataforma

común y forzar al mercado a utilizar su modelo,

aunque este no sea tan flexible para el sector

clínico como otras plataformas. Para el mercado

sanitario, un sector de grandes márgenes y alto

valor añadido, la mejor plataforma sería aquella

que no solo fuese la más rápida y precisa, sino

también la que atrajera a la mayor colección de

sondas de ADN con aplicaciones en diagnóstico

molecular, es decir, la más flexible.

36

24 Electronics Journal. January/February (2002): http://www.electronicsjournal.com/content/backissues/0201/0201frame.html25 2000/2001 ABRF Microarray Research Group Study: A Current Profile of Microarray Laboratories. G. Grills, C.;

Griffin, A.; Massimi, K.; Lilley, K.; Knudtson, J. Van E.26 Affymetrix no solo se centra en aplicaciones farmacéuticas, sino que además está interesado en trasladar su plataforma

a otros sectores, como el de los análisis de calidad de agua. Por este motivo tiene un acuerdo con Lyonnaise des Eaux,una de las principales empresas que suministra agua a los países europeos, para el desarrollo de chips específicos queincluyan bacterias, virus y parásitos más frecuentes.

1999

86

86

79

912

2004

Microarrays

Otros Biochips

Microfluídica

Fig. 5. Estimación de la cuota de mercado de Microarrays y Biochips (Frost & Sullivan).

Productos Descripción Tendencias

GeneChips (síntesis in situ)Gene Array escáners

• Microarrays deoligonucleótidos yescáner.

• Fuerte crecimiento.

Arrays por deposición (spotted)Arrayer Ping & Ring y Escáner láser confocal

• Microarrayspersonalizados.

• Bajo crecimiento.

Tabla 17. Tendencias de implantación de microarrays en el Mercado. Adaptado de: Fronline Strategic Consulting, FunctionalGenomics Report, A Strategic Market Analysis (2002).

4.3. Mercados: Affymetrix

Según las estimaciones de la firma Frost &Sullivan del año 200124, el valor del mercado demicroarrays y biochips de ADN en el año 2000 fuede 531 millones de dólares, mientras que losanálisis financieros y pronósticos de mercado deesta consultora señalan que la tasa decrecimiento para los próximos años será del 65%anual. Del total de este mercado, el 60%corresponde a microarrays de alta densidad cuyafinalidad principal es la investigación encaminadaa la búsqueda de nuevos fármacos y la minería dedatos genómicos.

http://www.electronicsjournal.com/content/backissues/0201/0201frame.html

37


27 “Affymetrix”: http://www.affymetrix.com/products/index.affx

Producto

Arrays catalogados

Arrays personalizados

Instrumental

• Arabidopsis Genome Array. • Drosophila Genome Array. • E. Coli Genome Array. • Human Genome Focus Array.• Human Genome U133 Set. • Human Genome U95 Set. • Murine Genome U74 Set. • Rat Genome U34 Set. • Rat Neurobiology U34 Array. • Rat Toxicology U34 Array. • Test3 Array. • Yeast Genome S98 Array.

• El GeneChip® permite el análisiscuantitativo y cualitativo de los niveles deexpresión génica de organismos biológicosrelevantes.

• Los chips son redundantes, el materialinmovilizado consiste en oligos deaproximadamente 25 nucleótidos, y sólopueden ser analizados medianteinstrumentos de Affymetrix.

• Custom Arrays.• Permite la posibilidad de usar GeneChips

con los parámetros y secuencias que sedeseen.

• CustomExpress™ Arrays. • Permite el diseño del chip usando el

catálogo de sondas disponibles.

• Made-to-Order Arrays.

• Cartridge Carriers.

• CYP450 Assay.

• HuSNP™ Mapping Assay p53 Assay.

• GenFlex™ Tag Array.

Arrays deanálisis de ADN

• Arrays no disponibles en catálogos.

• Cartucho.

• Fluidics Station 400. • Cámaras de hibridación.

• Hybridization Oven 640. • Horno de hibridación.

• Scanner System with Workstation. • Escáner.

• Complete GeneChip® InstrumentSystem.

• Contiene el set completo con la cámara,horno de hibridación, escáner y soporteinformático.

• Data Mining Tool (DMT).

• Laboratory InformationManagement System (LIMS).

• Microarray Suite Software.

• MicroDB™ Software.

• NetAffx™ Analysis Center.

• Software and Computer Packages.

• Soporte informático para el análisis yorganización de los datos.

Software

Componentesadicionales

• Genotipado (detección de SNPs), análisisdel gen p53, análisis de CYP450.

• Permite el diseño de arrays personalizados.

Análisis de laexpresión

génica

Aplicación Descripción

TECNOLOGÍAS DE AFFYMETRIX27

Tabla 18. Catálogo de productos y tecnologías de Affymetrix (elaboración propia).

http://www.affymetrix.com/products/index.affx

38

28 “Trilateral Project B3b. Comparative study on biotechnology patent practices. Patentability of DNA fragments”:http://biotech.about.com/cs/patentdebate/

29 “Japan Patent Office”: http://www.jpo.go.jp/30 “European Patent Office”: http://www.european-patent-office.org31 “U.S. Patent and Trademark Office”: http://www.uspto.gov/32 “DeCode Genetics”: http://www.decodegenetics.com33 “Agilent Technologies”: http://www.agilent.com34 “Incyte Genomics”: http://www.incyte.com/index.shtml35 “Motorola Life Sciences”: http://www.motorola.com/lifesciences36 http://www.motorola.com/lifesciences/news

El uso de fragmentos de ADN como sondas generaun gran número de dudas acerca de la propiedadintelectual de las mismas. Según un estudioconjunto28 publicado por la Oficina de PatentesJaponesa (JPO29), Europea (EPO30), yEstadounidense (USPTO31), un fragmento de ADNcon una utilidad determinada, por ejemplo, unasonda para el diagnóstico de una enfermedadespecífica, es potencialmente patentable siempreque cumpla los tres criterios fundamentales de unapatente: novedad, invención y aplicación industrial.De esta forma, no basta con caracterizar unfragmento de ADN basándose en su homología conuna proteína de función conocida, y suponiendo quela secuencia formará parte de un gen estructural.Por tanto, el diseño de un kit de diagnóstico conmúltiples sondas debe tener en cuenta la propiedadintelectual de estas, y las licencias de uso necesariaspara su comercialización.

Dentro de este contexto, Affymetrix tiene unacuerdo con DeCode Genetics32 para teneracceso a la base de datos genómica que estosúltimos poseen y Agilent Technologies33

también tiene un proyecto de colaboración conIncyte Genomics34, por el cual esta compañíapermite la disponibilidad de su base de datos degenes patentada denominada Life-Seq.

Por último remarcar que actualmente Affymetrixestá interesado en fabricar unos biochips con losque se pueda analizar cómo responden lospacientes a distintos tratamientos frente aenfermedades como la depresión, asma,hipertensión, cáncer de mama, migrañas,hipercolesterolemia y otros.

4.4. Mercados: empresas quecompiten con Affymetrix

Varias compañías de tamaños muy diversos se estánposicionando paulatinamente en el mercado de losmicroarrays y biochips haciendo competencia aAffymetrix por el liderazgo del sector de la

genómica. Estas compañías son principalmenteMotorola, Corning, Agilent Technologies (spin-off deHewlett-Packard), Incyte y Nanogen, que tienen encomún pertenecer al sector de los semiconductores,y que están extendiendo sus actividades al sector delos biochips:

Motorola35 está utilizando su experiencia ensensores y circuitos para producir biochips quecontengan microelectrodos conectados afragmentos de ADN. Esta plataforma consiste enla fabricación de chips de baja densidad quepueden canalizar 36 dianas de ADN o ARNsimultáneamente. El sistema usa moléculasorgánicas que forman circuitos electrónicos,proceso que se conoce como bioelectrónica, y quepermite detectar la hibridación de las moléculasde ADN. De esta manera, no es necesario el usode fluorescencia y por tanto no precisanescáneres. Esta compañía tiene acuerdos conPackard Ins

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