microbilogia e inmunologia

8/6/2019 microbilogia e inmunologia

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TP N1

A) MTODOS DE ESTERILIZACIN

OBJETIVO

Adquirir experiencia en el manejo de equipos de esterilizacin y aplicar mtodos de desinfeccin yesterilizacin empleando distintos agentes fsicos o qumicos.

Agentes fsicos

Calor hmedo (autoclave)El alumno se familiarizar con el uso del autoclave que incluye:1- Preparacin del material a autoclavar.2- Carga del autoclave con el material a esterilizar o decontaminar.3- Cierre del autoclave y encendido.4- Eliminacin del aire contenido en su interior (hasta emisin de chorro continuo de vapor por laespita o vlvula de descarga).5- Cierre de la vlvula de descarga y control hasta llegar a la presin de esterilizacin deseada.6- Control del tiempo de esterilizacin requerido.7- Apagado del autoclave.8- Apertura de la vlvula para igualar presiones.9- Retirado y secado del material autoclavado.

Se esterilizarn distintos materiales de vidrio y otros que resistan la temperatura, como as tambinsoluciones y medios de cultivo.Tambin se decontaminar material que contenga cultivos bacterianos (en especial cultivos demicroorganismos que forman esporas).Se harn controles de esterilidad despus del autoclavado para verificar que el proceso fue eficient

Calor seco (horno)1- Preparacin del material a hornear.2- Carga del horno.3- Control hasta llegar a la temperatura de esterilizacin.4- Control del tiempo de esterilizacin.5- Apagado, enfriado y apertura del horno.

Se esterilizarn materiales que no puedan ser autoclavados y/o que resistan altas temperaturas.

Incineracin por llamaEl alumno adquirir prctica en el flameado de la boca de botellas, frascos y tubos y en laesterilizacin y decontaminacin del ansa que se emplea para transferir cultivos bacterianos.

Radiacin ultravioletaSe emplear la radiacin ultravioleta como agente desinfectante o esterilizante.Se pondrn debajo de la luz U.V. objetos que no puedan autoclavarse ni hornearse ( Ej: tapasplsticas, membranas filtrantes, etc.).

FiltracinSe proceder a esterilizar lquidos que contienen componentes sensibles al calor como protenas,vitaminas, antibiticos y soluciones salinas definidas.


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Se emplearn filtros de celulosa utilizando vaco o presin positiva.

Agentes qumicos

Se emplearn distintos agentes germicidas y desinfectantes (soluciones de hipoclorito de sodio,cloroxilenol, formaldehdo, etc.) para desinfectar superficies.Se analizar la reduccin de la cantidad de microorganismos presentes en una mesada de trabajo,

pasando un hisopo con el que se sembrarn placas conteniendo agar nutritivo, antes y despus dehaber sido tratada con el desinfectante en cuestin.

Bibliografa:

Seeley, H.W.Jr.; Vandermark, P.J., Lee, J.J., Microbes in action. A laboratory manual of microbiology. Editores W. H. Freeman and Company, Cuarta Edicin, Captulo 5, 1991.

Tortora G.J., Funke B.R., Case C.L. Introduccin a la Microbiologa. Editorial Acribia SA,Zaragoza Espaa, 1993.

Vullo D.L., Wachsman M.B., Alch L.E. Microbiologa en Prctica. Editorial Atlante S.R.L.Buenos Aires, 2000.

B) MICROORGANISMOS DEL MEDIO AMBIENTE(OBSERVACIN MACROSCPICA)

OBJETIVOS

- Observar la gran variedad de microorganismos presentes en el medio ambiente (laboratorio dT.P.), determinando las diferentes morfologas de colonias que se obtienen.- Poner de manifiesto la necesidad de trabajar en estricta esterilidad en microbiologa debido a lgran facilidad con que se puede contaminar el material de trabajo.

DESARROLLO DEL PRCTICO

1- Exponer placas con agar nutritivo al medio ambiente durante distintos tiempos.2- Estriar con un hisopo previamente pasado por la mesada de trabajo sobre una placa con aganutritivo.3- Incubar las placas a temperatura ambiente hasta la clase siguiente.4- Observar las colonias obtenidas y describirlas teniendo en cuenta las siguientes caractersticas:.Forma: puntiforme, circular, rizoide, irregular, filamentosa..Tamao: grande (ms de 3 mm), mediana (2-3 mm), pequea (1-2 mm).Color.Borde: entero, ondulado, lobulado, filamentoso, ondeado.Elevacin: plano, elevado, convexo, pulvinado, umbonado.Superficie: suave, brillante, rugosa, plegada, seca, polvorienta


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C) TCNICAS MICROBIOLGICAS BSICAS

OBJETIVOS

- Adquirir experiencia en el manejo de los materiales y tcnicas bsicas que se utilizarn a lo largdel curso de trabajos prcticos.- Reforzar los conocimientos previos sobre el trabajo de laboratorio en condiciones de esterilidad.Coordinar la operativa de trabajo en el laboratorio y las normas de seguridad.

DESARROLLO DEL PRCTICO

- En todos los prcticos que se realicen en condiciones de esterilidad se debe, en primer lugarlimpiar el rea de trabajo de la mesada con alguna sustancia desinfectante y encender el mechero.- Preparar placas de Petri con agar nutritivo fundido y mantenido a 45 C.- Esperar que el medio solidifique y luego secar las placas invertidas en estufa a 37 C.-Preparar y rotular tubos de hemlisis para realizar diluciones seriadas al dcimo desde 10-1 hasta10-3.- Colocar en cada tubo 1,8 ml de solucin fisiolgica estril siguiendo las instrucciones del docenten cuanto al trabajo en esterilidad.- Agregar al tubo rotulado 10-1 0,2 ml de una solucin estril. Descartar la pipeta. Homogeneizar enagitador. Con una nueva pipeta tomar 0,3 ml del tubo anterior y descargar 0,2 ml de esta diluci

(10-1

) en el tubo rotulado 10-2

. Continuar haciendo las diluciones hasta 10-3

.- A partir de la dilucin 10-3sembrar:a) con ansa por estriado sobre agar nutritivob) con pipeta (0,1 ml) y posterior rastrillado sobre agar nutritivo

- Incubar las placas INVERTIDAS en cuarto estufa a 37C hasta la clase siguiente.


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Procedimiento para preparar una placa por volcado (aislamiento en profundidad).

A) Fundir el medio contenido en un tubo y luego enfriarlo hasta que se lo pueda tomar con la mansin quemarse.B) Flamear el ansaC) y D) Transferir microorganismos al medio con el ansa.E) Agitar rotando el tubo entre las manos para que se homogeinice bien.F) Volcar en una placa de Petri estril.G) Agitar con un movimiento rotatorio hasta asegurar una buena distribucin.H) Incubar boca abajo.Un mtodo alternativo muy usado es volcar en la placa vaca una suspensin bacteriana y luego coel medio fundido yenfriado segn A) volcarlo y efectuar los pasos G) y H).


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Procedimiento para obtener colonias aisladas estriando en placa:

A) Flamear el ansaB) Obtener un inculo con ella (en forma estril)C) Estriar con el ansa en medio estril contenido en una placa de Petri siguiendo uno de los modelomostrados en D.


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Siembra en agar inclinado (pico de flauta) por estra.

A) Flamear el ansaB) Obtener material a sembrarC) Apoyar el ansa sobre la superficie del agar y estriar con el diseo mostrado en D)


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Inoculacin por puncinA) Flamear un ansa rectaB) Sumergirla una vez fra, en una suspensin bacterianaC) Punzar cuidadosamente en el centro del tubo hasta el fondo y retirar el ansa cuidadosamenttratando de recorrer el mismo camino que para la inoculacin.D) Flamear el ansaE) Incubar el tubo


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T.P.N2

EVALUACIN DE LA DIVERSIDAD MICROBIANA EN UNA MUESTRA NATURAL

Columna de Winogradsky

Introduccin

A diferencia de los estudios realizados por Luis Pasteur y Roberto Koch sobre cultivos puros, dofamosos microbilogos: Sergei N. Winogradsky (1856-1953) y Martinus Willem Beijerinck (18511931), fueron los primeros en estudiar las relaciones entre diferentes tipos de microorganismos quconviven en un mismo habitat y cuyas poblaciones se mezclan.Una demostracin simple de laboratorio - la columna de Winogradsky- ilustra cmo diferentemicroorganismos interactan entre s, de forma tal que la actividad metablica de unmicroorganismo posibilita el crecimiento de otros y viceversa. Estas columnas, que llevan enombre del microbilogo ruso que las utiliz por primera vez, son sistemas completosautoreciclables, puestos en marcha solamente por energa lumnica.Inicialmente, todos los microorganismos estn presentes en muy baja proporcin, pero cuando lcolumna se incuba por 2 o 3 meses, los distintos tipos de microorganismos proliferan y ocupandistintas zonas en donde las condiciones ambientales favorecen sus actividades especficas.La columna de Winogradsky es una demostracin clsica de cmo los microorganismos ocupamicrositios altamente especficos de acuerdo a sus tolerancias ambientales y sus requerimientos dcarbono y energa. Adems, la columna permite ver cmo los elementos minerales son recicladotal como ocurre en los ambientes naturales.En este trabajo prctico, se enfoca principalmente la utilizacin del azufre por los distintosmicroorganismos, pero realizando pequeas modificaciones se pueden estudiar ciclos equivalentepara el nitrgeno, carbono y otros elementos.

OBJETIVOS

Los alumnos debern:1- Armar una columna de Winogradsky.2- Observar y describir la sucesin temporal de microorganismos en la columna.

Material de laboratorio

Muestra de barro de un arroyo, lago, pantano o costa de mar o ro (aproximadamente 100150gr de sedimento superficial o subsuperficial).

Recipiente alto de paredes trasparentes y rectas (botellas plsticas o probetas de vidrio. Tapn de goma o cobertura plstica. Pipetas de vidrio, portaobjetos, cubreobjetos, cajas de Petri.

Medios de cultivo de enriquecimiento, selectivos y diferenciales, colorantes, reactivos pararealizar pruebas bioqumicas. Papel de filtro o en su defecto papel de diario finamente cortado. 6 gr de cada una de las siguientes sales: CaCO3 , CaSO4 , CaHPO4.

Procedimiento

1- Colectar una cantidad de tierra o barro para llenar el recipiente hasta una altura aproximada d10 cm. Remover las piedras, ramas o partculas grandes del material en estudio. Mezclarlo colas sales y el papel finamente cortado.


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2- Colocar la mezcla en un recipiente adecuado (en nuestro caso una probeta de vidrio de 500 ml) aadir suficiente agua destilada hasta aproximadamente 3 5 cm del borde. Revolver la mezclpara eliminar burbujas de aire.

3- Marcar el nivel de agua y cubrir la boca de la probeta con una envoltura plstica para reducir levaporacin. Puede ser necesario reponer agua para mantener el nivel original.

4- Incubar a temperatura ambiente cerca de una ventana para que reciba una adecuada cantidad dluz, pero no excesiva.

5- Observar la columna semanalmente, anotando cualquier cambio de aspecto (color, crecimientmicrobiano, etc.).

Gua para la interpretacin de la columna de Winogradsky

Una columna ideal de Winogradsky se podra representar con el siguiente esquema:


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Apndice

Medios de enriquecimiento y condiciones de cultivo para aislar las especies representativas de unoo ms grupos fotosintticos.

Organismos aser enriquecidos

Fuente de Corgnica

Salesinorgnicas

Atmsfera pH

Bacterias verdeazuladas ninguna ninguna aerobia oaerobia +5%CO2

6,0 - 8,0

Bacterias verdesdel azufre

ninguna NH4Cl: 1,0Na2S.9H2O: 2,0

NaHCO3: 5,0

ninguna 7,5

Bacteriasprpuras del

azufre

ninguna NH4Cl: 1,0Na2S.9H2O: 1,0

NaHCO3: 5,0

ninguna 8,0 - 8,5

Bacteriasprpuras

malato de sodio:5,0

extracto delevadura: 0,5

NH4Cl: 1,0 ninguna 7,0 - 7,5

El medio basal contiene:

MgSO4.7H2O................................... 0,2K2HPO4........................................... 1,0FeSO4.7H2O.................................... 0,01CaCl2................................................ 0,02MnCl2.4H2O.................................... 0,002NaMoO4.2H2O................................ 0,001NaCl................................................. 0,5

La concentracin de los componentes de los medios se expresa en gr/l.Medio ambiente: iluminacin constante y 25 - 30 C.

Las tcnicas de coloracin y las pruebas bioqumicas estn detalladas en las guas correspondientesa esos temas.

Bibliografia

Brock, T. D., Madigan, M. T. Microbiologa. Sexta edicin. Prentice Hall Hispanoamericana S.A1993.Seeley, H. W. Jr., VanDemark, P. J., Lee, J. J.: Microbes in action. A Laboratory Manual of

Microbiology. W. H. Freeman and Company New York. Fourth Edition. 1991.Tortora, G. J., Funke, B. R., Case, C. L.: Introduccin a la Microbiologa. Editorial Acribia, S.AZaragoza, Espaa. 1993.Vullo, D., Wachsman, M., Alche, L. Microbiologa en Prctica. Manual de tcnicas de laboratoripara la enseanza de Microbiologa bsica y aplicada. Primera edicin Editorial Atlante S.R.LBuenos Aires, 2000.


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T.P N3333

OBSERVACIN MICROSCPICA DE MICROORGANISMOS

OBJETIVOSEntrenamiento en preparacin de extendidos y realizacin de coloraciones.Observacin microscpica de morfologa y agrupamientos bacterianos.

Microorganismos a usar

Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Streptococcus faecalis

Micrococcus luteus Bacillus subtilis Bacillus cereus Bacillus sphaericus Mycobacterium phlei

1-Preparacin de extendidos y coloracin por el mtodo de Gram.

a-Rotular convenientemente cada uno de los portaobjetos.b-Preparar extendidos de los microorganismos indicados por el docente.Tomar material de la colonia elegida, con un ansa previamente esterilizada a la llama y suspendeeste material en una gota de agua colocada en la mitad del portaobjetos. Extender el material sobrtoda la superficie del portaobjeto.c-Dejar secar al aire junto a la llama del mechero.d-Fijar con calor pasando el preparado por sobre la llama SIN QUEMARLO.e-Cubrir el extendido con una solucin del colorantecristal violeta. Dejar en contacto 2 minutos.f-Volcar el colorante. Cubrir con solucin delugol. Dejar en contacto durante 2 minutos.g-Decolorar conalcohol-acetona(exhaustivamente). Lavar con agua.h-Cubrir consafranina (colorante de contraste). Dejar en contacto 1 minuto. Lavar con agua.i-Secar j-Observar al microscopio ptico con objetivo de inmersin.

Se debern reconocer las caractersticas morfolgicas y tintoriales de las distintas bacterias. Ealumno deber informar el agrupamiento, forma, coloracin, pudiendo utilizar como gua para dichdescripcin la siguiente clasificacin:

Forma: esfrica (COCOS)alargada (BACILOS)bacilos cortos (COCOBACILOS)

Agrupamiento: aislado (individual)diplostetradascadenasracimosempalizada


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2-Coloracin de cido resistencia

OBJETIVO:Deteccin en materiales biolgicos de especies de Mycobacterium y/o Nocardia que pueden serpatgenas. Se vincula a una peculiar composicin de las paredes en estas bacterias.

INSTRUCCIONES:

1-Preparar extendidos de los microorganismos a estudiar.2-Fijar con calor.3-Cubrir todo el porta confucsina bsica fenolada (carbolfucsina) 4-Calentar hasta emisin de vapores y seguir dicho calentamiento durante 3 minutos ms. Si se secalguna parte del porta, agregar colorante sobre el preexistente y no sobre la parte seca, hastcubrirlo nuevamente.5-Lavar con agua.6-Decolorar conalcohol-cidohasta que no se desprenda ms colorante.7-Lavar con agua.8-Cubrir el extendido conazul de metileno. Dejar en contacto durante 30 segundos.9-Lavar con agua. Secar.10-Observar con objetivo de inmersin.

Solucin de Ziehl (Fucsina fenicada)

1-Fucsina bsica 0.3 gAlcohol etlico 10 ml

2-Fenol 5 gAgua destilada 95 ml

Mezclar soluciones 1 y 2.

Alcohol cido

HCl (densidad 1.19) 3 mlAlcohol etlico 97 ml

Solucin de azul de metileno

Azul de metileno 1.4 gAgua destilada 100 ml

3-Coloracin de esporas.

OBJETIVO:Esta tcnica permite distinguir las esporas, del cuerpo vegetativo del microorganismo, como astambin ver su localizacin y forma.

INSTRUCCIONES:

1-Prepare un extendido del microorganismo.


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2-Fijar por calor y cubrir todo el portaobjeto con una solucin deverde de Malaquita.3-Calentar hasta emisin de vapores y seguir dicho calentamiento durante 3 minutos (no permitque se seque el colorante. Si esto ocurriera, agregar colorante, sobre el preexistente y no sobre lparte seca, hasta cubrirlo nuevamente.)4-Lavar con agua y cubrir con solucin deSafranina. Dejar actuar 1 minuto. Lavar con agua, secary observar con objetivo de inmersin.5-Informar: morfologa, color y tipo de espora.

Solucin de Verde de Malaquita.

Verde de Malaquita al 5 % en agua destilada.

Solucin de Safranina

Safranina 0.5 g en agua destilada.

4) Tincin negativa

INSTRUCCIONES

1-Colocar una pequea gota de tinta china en la parte central del portaobjetos.2-Utilizando el ansa, colocar una gota de la suspensin de microorganismos sobre la tinta china.3-Colocar sobre el preparado un cubreobjeto para que se forme un film (tinta-cultivo)4-Observar con objetivo de inmersin.

ACLARACIN: Los tiempos que aparecen en los protocolos de las tinciones en la gua de T.P. solos que figuran en los kits comerciales. Si se utilizan los colorantes en otra concentracin, puede sque dichos tiempos se modifiquen.

BIBLIOGRAFA

Brock, T.D.; Smith, D.W. & Madigan, M.T. Microbiologia, Prentice Hall Hispanoamericana S.ASexta Edicin, 1993


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T.P.N4

RECUENTO DE CLULAS VIABLES

OBJETIVO:Determinar las unidades formadoras de colonias de una muestra de bacterias por el mtodo drecuento en placa.

INTRODUCCIN TERICA

El mtodo de recuento en placa se utiliza a menudo para contar slo las clulas vivas (capaces ddividirse).En el mtodo de placa extendida, una muestra pequea (generalmente 0.1 ml) se extiende enesterilidad sobre la superficie de una caja de cultivo con agar que contiene medio adecuado y sincuba hasta que las colonias sean visibles a simple vista. Se infiere que cada colonia se origin duna sola clula, entonces contando el nmero de colonias se puede calcular la cantidad de clulaviables de la muestra.Para minimizar errores al calcular el tamao de la poblacin se ha determinado prcticamente qudebe haber entre 30 y 300 colonias por caja de cultivo, por eso para suspensiones densas esnecesario realizar diluciones del cultivo.El tamao de la poblacin se calcula usando la siguiente frmula:

ufc/ml = N / vol x dil

donde: ufc:unidades formadoras de coloniasN: nmero promedio de colonias obtenidas para una dilucin dada.vol: volumen de inculodil: dilucin

MATERIALES

-cultivo bacteriano-solucin fisiolgica-agar nutritivo-material de vidrio estril (tubos, pipetas, placas de Petri)

MTODO

1- Hacer diluciones seriadas al dcimo de las muestras a titular:dil.(-1) 0.1 ml muestra + 0.9 ml solucin fisiolgicadil.(-2) 0.1 ml dil(-1) + 0.9 ml solucin fisiolgicadil.(N) 0.1 ml dil.(N-1) + 0.9 ml dilucin fisiolgica

2- Sembrar por rastrillado 0.1 ml de cada dilucin en placas de Petri con agar nutritivo (cadadilucin se siembra por duplicado).

3- Las placas se incuban 24 - 48 horas en estufa a 37C.

4- Contar las colonias obtenidas en cada placa.


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5- Elegir la dilucin en la cual se hayan obtenido entre 30 y 300 colonias y calcular las unidadeformadoras de colonias (ufc) segn la frmula:

6- Tomar 1 ml de la muestra original (a partir de la cual se hicieron las diluciones) y medir ladensidad ptica en un espectrofotmetro a 600 nm.

7- Comparar los resultados obtenidos de ufc/ml y D.O., entre los distintos microorganismo

utilizados.

Bibliografa

1- Seeley, H.W.Jr.; Vandermark, P.J. , Lee, J.J., Microbes in action. A laboratory manual of microbiology. Editores W. H. Freeman and Company, Cuarta Edicin, Captulo 5, 1991.

2- Brock, T.D.; Smith, D.W. & Madigan, M.T. Microbiologia Prentice Hall HispanoamericanaS.A., Sexta Edicin, 1993


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T.P.N5

AISLAMIENTO DE DISTINTAS ESPECIES BACTERIANAS

Para aislar un microorganismo de la naturaleza, se debe conocer previamente los requerimientonutricionales y las condiciones ambientales ptimas para su crecimiento.Los alumnos debern buscar en la bibliografa, las caractersticas metablicas y el hbitat de lo

microorganismos que se van a utilizar.OBJETIVO: Aislamiento y posterior identificacin de distintas especies bacterianas a partir dediferentes muestras.

METODOLOGA:

Para el aislamiento de las distintas especies se va a seguir el siguiente esquema:- Inocular la muestra en un caldo de enriquecimiento (que puede o no ser selectivo al mismotiempo), para favorecer el crecimiento del microorganismo de inters.- Incubar a temperatura y tiempo adecuados.- Tomar una muestra del caldo ya crecido y estriar con un ansa en un medio slido que seaselectivo, para inhibir la flora acompaante del microorganismo que quiero aislar, y obtenercolonias del mismo. Este medio puede a la vez ser diferencial (se diferencian cepas o especiebacterianas en base a alguna caracterstica de las colonias).- Incubar a temperatura y tiempo adecuados.- Observar crecimiento de colonias aisladas.Luego del aislamiento se har un repique de alguna de las colonias obtenidas a un agar nutritivpara hacer una coloracin de Gram. Posteriormente se identificarn los microorganismos en base las pruebas bioqumicas y a las otras tcnicas de coloracin.

Aislamiento de Enterobacterias

1- Tomar 1ml de muestra de agua y sembrar en caldo Mac Conkey 1X en tubos con campanita dDurham.2- Incubar durante 48 hs. a 37C.3-Observar crecimiento (la formacin de gas y viraje del indicador Azul de Bromocresol a amarilindica probable presencia de E. coli ).4- Tomar una muestra con el ansa y estriar sobre placas con agar EMB.5- Incubar durante 24 hs. a 37C.6- Observar colonias con distinta morfologa y color.

Aislamiento de Pseudomonas sp.

1- Sembrar 1 ml. de agua en caldo M9.2- Incubar 48 hs. a 37C.3- Si se observa crecimiento, tomar una muestra con el ansa y estriar sobre una placa con agaCetrimida.4-Incubar 48 hs a 42C.5- Observar crecimiento de colonias con pigmento verde


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Aislamiento de Bacillus sp.

1- Agregar 10 g. de arroz (una cucharada) a 30 ml de solucin fisiolgica estril.2- Agitar durante 15 minutos.3- Calentar a 80C durante 5 minutos.4- Tomar 1 ml. del sobrenadante y pasarlo a un tubo con caldo nutritivo.5- Incubar 48 hs. a 37C.6- Estriar en agar Mossel (selectivo y diferencial)7- Incubar 48 hs. a 37C8- Observar el crecimiento de colonias con un halo rosa y precipitado de lecitina ( B. cereus, manitol-, lecitinasa +) y colonias con halo amarillo sin precipitado ( B. subtilis, manitol +, lecitinasa -).

Aislamiento de Lactobacillus sp

1- Realizar diluciones de yogur en solucin fisiolgica y sembrar 0,1 ml de cada dilucin en agaMRS2-Incubar 48 horas a 37C en anaerobiosis.3- Calcular el recuento de bacterias lcticas del yogur y observar los distintos fenotipos de colonicrecidos en el agar MRS.4- Seleccionar 2 fenotipos de colonias diferentes y a partir de ellas sembrar por estra con ansa eagar Rogosa.5- Incubar en condiciones de anaerobiosis a 37C.

Bibliografa

Brock, T.D.; Smith, D.W. & Madigan, M.T. Microbiologia Prentice Hall Hispanoamericana S.ASexta Edicin, 1993


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T.P.N6

PRUEBAS BIOQUIMICAS

Se trata de un conjunto de reacciones basadas en el metabolismo de los microorganismos. Entr

otros aspectos, se analiza la accin de la bacteria sobre los hidratos de carbono (qu fuente decarbono utiliza, en qu condiciones, cmo la utiliza, qu productos se obtienen), la liberacin dexoenzimas, metabolitos y toxinas al medio de cultivo, la motilidad, etc.A partir del conocimiento del metabolismo, las pruebas bioqumicas nos permiten determinar egnero y la especie de la bacteria en estudio.Esta identificacin debe hacerse a partir de un cultivo puro y fresco (18-24 horas). Hay que tener ecuenta, adems, que las caractersticas metablicas de los microorganismos pueden variar enfuncin de distintos factores de manera que para realizar una caracterizacin confiable es necesarirealizar las pruebas en condiciones estandarizadas (en cuanto al inculo, los reactivos, lascondiciones de incubacin y el tiempo de lectura) y utilizar ms de una prueba en cada caso. Leleccin de las mismas se har en base a la familia en estudio, lo cual se ir determinando en ecurso del aislamiento.Las pruebas ms comunmente utilizadas son:

1) Prueba de oxidasa

Esta prueba sirve para la determinacin de la presencia de la enzima citocromo oxidasa enpreparaciones de microorganismos.

Permite diferenciar enterobacterias, distintas especies deStreptococcus , Staphylococcus y Micrococcus (-) de algunas especies dePseudomonas u Aeromonas (+).

Materiales:- cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo.- tiras de papel de filtro impregnadas en reactivo de Kovacs (1 naftol + dimetilparafenilendiamina)- ansa.- Procedimiento:1.- Levantar con el ansa una colonia del cultivo puro.2.- Aplicar dicha colonia sobre la tira de papel de filtro embebida con el reactivo de Kovacsasegurndose de extender bien el material.3.- Esperar 5-10 segundos y observar la coloracin.

Interpretacin de resultados:* Prueba positiva: la tira de papel de filtro embebida en reactivo de Kovacs vira al color azul pooxidacin de dicho compuesto a azul de indofenol.* Prueba negativa: el color de la tira de papel de filtro embebida en reactivo de Kovacs no smodifica.

2) Prueba de catalasa

Esta prueba sirve para comprobar la presencia de la enzima catalasa en preparaciones demicroorganismos.Permite diferenciar:


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A) gneros:Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+); Bacillus (+) deClostridium (-) y Corynebacterium (+) de Erysipelothrix (-), siendo excepciones en este ltimocaso,Corynebacterium pyogenes (-) yCorynebacterium haemolyticum (-).B) especies: Moraxella bovis (variable) y Moraxella kingii (-) de otras especies de Moraxella (+).

Materiales:- Cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo.

- ansa.- portaobjetos limpios.- agua estril.- agua oxigenada fresca.- Procedimiento:1.- Colocar una gota de agua en un portaobjetos limpio.2.- Colocar dos ansadas del cultivo a probar sobre la gota de agua y hacer una suspensin espes(no dejar secar).3.- Agregar 2 o 3 gotas de agua oxigenada fresca.4.- Observar los resultados.

Interpretacin de resultados:* Prueba positiva: formacin inmediata de burbujas bien visibles (desprendimiento de O2).* Prueba negativa: no hay formacin de burbujas (no se forma O2).

3) Prueba de licuefaccin de la gelatina

Esta prueba sirve para determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas de tipproteoltico (gelatinasas) que licuan la gelatina.Permite diferenciar especies:Staphylococcus aureus (+) deStaphylococcus epidermidis (lento y +)y especies de Micrococcus (variables y lentas); Listeria monocytogenes (-) de Corynebacterium ulcerans (+),Corynebacterium haemolyticum (+) yCorynebacterium pyogenes (variable).Tambin ayuda a identificar:Serratia liquefaciens (+), Serratia marcescens (+), Pseudomona aeruginosa (+, rpida) y especies deFlavobacterium (+).

Materiales:- cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo.- ansa.- tubos de hemlisis con gelatina nutritiva.- Procedimiento:1.- Inocular por puncin los tubos conteniendo gelatina nutritiva. Dejar un tubo sin inocular comcontrol.2.- Incubar a 37oC durante 48 horas.3.- Colocar en heladera 2 horas y luego observar licuacin y crecimiento.

Interpretacin de resultados:* Prueba positiva:a) tubo inoculado: medio lquido.b) tubo control: medio se mantiene slido.* Prueba negativa:a) tubo inoculado: el medio se mantiene slido. Volver a incubar un tiempo adicional.b) Tubo control: el medio se mantiene slido.


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4) Prueba de reduccin de nitratos

Esta prueba permite determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos o enitrgeno libre.Sirve para identificar miembros de la familia Enterobacteriaceae (por lo general +) y diferenciar:

1.- Haemophilus ducreyi (-) y Haemophilus vaginalis (-) de otras especies de Haemophilus (+).2.- Branhanella catarrhalis (+) y Neisseria mucosa (+) de otras especies de Neisseria (-)

Materiales:- cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo.- tubos con caldo nitrato.- Reactivo A: solucin de dimetilnaftilamina 0,6%.- Reactivo B: solucin de cido sulfanlico 0,8%.- polvo o limaduras de cinc.- Procedimiento:1.- Inocular tubos de caldo nitrato con el microorganismo que se desea estudiar.2.- Incubar durante 18-24 horas a 37oC.3.- Determinar nitritos:

Fase I:- Agregar directamente al cultivo en caldo nitrato, 1 ml de reactivo A y 1 ml de reactivo B.- Agitar bien.- Esperar 30 segundos y observar coloracin.Si el resultado fuera positivo, la prueba se da por terminada.

Si el resultado fuera negativo, continuar con la fase II.Fase II:

- Agregar al tubo que ya contiene los reactivos A y B una pizca de polvo de cinc.- Agitar bien.- Esperar 30 segundos y observar coloracin.- Interpretacin de los resultados:A) Fase I:* Prueba positiva: color rosado a rojo intenso porque el nitrato ha sido reducido a nitrito por eorganismo.* Prueba negativa: no se observa cambio de color.B) Fase II (prueba de la reduccin del cinc):* Prueba positiva: no se observa cambio de color, por ausencia de nitrato en el medio, lo cual indicque el organismo redujo el nitrato en nitrito y luego redujo nuevamente el nitrito.* Prueba negativa: color rosado a rojo intenso, por presencia de nitrato que no ha sido reducido poel organismo. El cinc redujo el nitrato en nitrito.

5) Prueba del agar hierro de Kligler

Permite determinar la capacidad de un microorganismo de metabolizar un hidrato de carbonespecfico incorporado a un medio de crecimiento bsico as como la de producir gas y cidsulfhdrico.Se utiliza para identificar diferentes especies bacterianas pertenecientes a la familia

Enterobacteriaceae .


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Materiales:- cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo.- tubos en pico de flauta con agar hierro de Kligler, pH=7,4.- ansa.

Procedimineto:1.- Inocular cada uno de los microorganismos aislados por puncin y por estra en el mismo tubo d

medio agar hierro de Kligler.2.- Incubar a 37oC durante 18-24 horas.3.- Observar entre las 18 horas y las 24 horas de cultivo (ni antes ni despus).

Interpretacin de resultados:La utilizacin de un hidrato de carbono implica la liberacin al medio de productos cidos capacede ser detectados por un indicador de pH. Si el microorganismo es incapaz de utilizar el hidrato dcarbono, consume las peptonas del medio liberando productos que alcalinizan el medio.Cuando se interpretan los resultados de esta prueba deben analizarse los siguientes aspectos:A) Utilizacin del hidrato de carbono:* Si el microrganismo en estudio slo fermenta la glucosa:a) en superficie: reaccin alcalina, color rojo.b) en profundidad: reaccin cida, color amarillo.* Si el microorganismo en estudio es capaz de fermentar tanto la glucosa como la lactosa:a) en superficie: reaccin cida, color amarillo.b) en profundidad: reaccin cida, color amarillo.* Si el microorganismo en estudio no es capaz de fermentar la glucosa ni la lactosa (no entrico):a) en superficie: reaccin alcalina, color rojo.b) en profundidad: si el microorganismo es aerobio no se observa crecimiento ni cambio de color; el microorganismo es facultativo, reaccin alcalina, color rojo.* Si el microorganismo en estudio no es capaz de fermentar la glucosa pero si de oxidarla:a) en superficie: reaccin cida a tiempos cortos y luego alcalina, color rojo.b) en profundidad: no se observa crecimiento ni cambio de color.B) Produccin de gas:* Si el microorganismo en estudio es aerognico, la produccin de H2 y CO2 se manifiesta mediantela formacin de una o varias burbujas o el desprendimiento del medio del fondo del tubo dejando urea clara.* Si el microorganismo en estudio es anaerognico, no hay produccin de gases.C) Produccin de cido sulfhdrico (SH2):* Si el microorganismo en estudio produce este cido, se manifestar por la presencia de unprecipitado negro de sulfuro de hierro en la parte profunda del tubo.* Si el microorganismo en estudio no produce este cido, se manifestar por la ausencia de dichprecipitado.

6) Prueba de extraccin de pigmento con cloroformo

Esta prueba bioqumica permite investigar los pigmentos producido por cepas dePseudomonas .

Materiales:- cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo.- tubos con caldo nutritivo.- ansa.- cloroformo


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Procedimiento:1.- Sembrar el microorganismo en estudio en caldo nutritivo.2.- Incubar a 37oC.3.- Agregar 1 ml de cloroformo al contenido del tubo y agitar.4.- Observar los resultados.

Interpretacin de resultados:* Prueba positiva: la fase clorofrmica toma color azul verdoso por extraccin de piocianina.* Prueba negativa: la fase clorofrmica permanece amarilla (no se extrajo pigmento).

7) Prueba de hidrlisis de almidn

Permite investigar la presencia en el microorganismo en estudio de una enzima capaz de hidrolizael almidn. Esta enzima es muy comn en distintos miembros del gnero Bacillus .

Materiales:- cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo.- placas de Petri con agar almidn.- ansa.- lugol.- Procedimiento:1.- Sembrar el microorganismo en estudio por estra en una placa con agar almidn.2.- Incubar a 37oC hasta observar desarrollo.3.- Inundar la placa con lugol.4.- Dejar actuar 10 minutos.5.- Observar la coloracin.

Interpretacin de resultados:* Prueba positiva: halos de degradacin (marrones o transparentes) alrededor de las colonias sobrfondo azul.* Prueba negativa: ausencia de halos; coloracin azul alrededor de las colonias (presencia dcomplejo Iodo-almidn).

8) IMViC

Son cuatro pruebas que se utilizan para distinguir bacterias coliformes entre si.Las pruebas son: Indol, Rojo de Metilo, Voges Proskauer y Citrato.

Investigacin de la produccin de Indol. Con esta prueba bioqumica se mide la capacidad del microorganismo de producir indol a partir dla molcula de triptofano.Sirve para diferenciar Escherichia coli y distintas especies del gnero Edwarsiella (+) de especiesde los gnerosSalmonella , Klebsiella y Enterobacter (-).

Materiales:- cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo.- tubos con caldo triptona.- ansa.


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- reactivo de Kovacs: alcohol amlico + paradimetilbenzal- dehdo en medio cido.Procedimiento:1.- Inocular tubos conteniendo caldo triptona. Dejar un tubo sin inocular como control.2.- Incubar a 37oC durante 48 horas.3.- Determinar la presencia de indol utilizando el reactivo de Kovacs.Para ello, colocar en un tubo de ensayo 1 ml de medio, agregar 0,1 ml de reactivo y dejar reposahasta la formacin de un anillo.

6.- Observar coloracin.Interpretacin de los resultados* Prueba positiva: un anillo rojo en la superficie del medio en la capa alcohlica (corresponde a lformacin de un compuesto quinnico coloreado derivado del indol).* Prueba negativa: anillo amarillo en la superficie del medio en la capa alcohlica (ausencia dindol en medio de cultivo).

Investigacin de la produccin de acetil metil carbinol (Voges Proskahuer) y cidos (rojo demetilo).

Con estas dos pruebas se estudia qu tipo de fermentacin (butilengliclica o cido mixta) realiza microorganismo en estudio.La prueba de Voges-Proskauer sirve para comprobar la capacidad de algunos organismos deproducir un producto final neutro, el acetilmetilcarbinol (acetona) a partir de la fermentaci(butilengliclica) de la glucosa. Esta prueba permite diferenciarKlebsiella pneumoniae y

Enterobacter (+) de Escherichia coli y otras especies deKlebsiella (-).La prueba del rojo de metilo sirve para comprobar la capacidad de un organismo de producir ymantener estables los productos terminales cidos de la fermentacin (cido mixta) de la glucosaEsta prueba permite diferenciar Escherichia coli (+) de distintas especies pertenecientes a losgneros Enterobacter y Klebsiella (-).

Materiales:- cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo.- tubos con caldo glucosa fosfato.- ansa.- reactivos para la determinacin de acetil-metil-carbinol (solucin alcohlica de naftol al 5% KOH al 40%).- reactivos para la determinacin de cido (solucin de rojo de metilo 0,1%).

Procedimiento:1.- Inocular tubos conteniendo caldo glucosa fosfato. Dejar un tubo sin inocular como control.2.- Incubar a 37oC durante 48 horas.3.- Dividir el contenido de cada uno de los tubos en dos partes iguales. En una mitad, investigar lpresencia de acetil-metil-carbinol y en la otra la presencia de cidos.- Para determinar acetil-metil-Carbinol:a) Agregar 0.6 ml de solucin alcohlica de naftol al 5%.b) Agregar 0,2 ml de solucin de KOH al 40%.c) Agitar y dejar en reposo 5-10 minutos.d) Observar la coloracin resultado.- Para determinar cidos:a) Agregar al cultivo 10 gotas de solucin de rojo de metilo 0,1%.b) Observar la coloracin.


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SISTEMAS MULTIPRUEBAS PARA LA IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS

1) SISTEMA API 20E PARA ENTEROBACTERIAS

Descripcin general:Es un sistema miniaturizado de las pruebas convencionales que se emplean para la identificacin d

enterobacterias y otras bacterias Gram negativas. Se trata de microtubos con sustratos deshidratadoa los que se les agrega una suspensin bacteriana y se incuban durante 18 a 24 hs. a 37 C. En cadmicrotubo se halla incorporado un sistema indicador. Al cabo del tiempo de incubacin ese sistemes afectado por metabolitos de la bacteria o por reactivos agregados. Se registran los resultadoobtenidos en cada microtubo y en base a ellos se identifica la bacteria en cuestin.

Instrucciones para el uso del sistema:

a)- Agregar 5 ml. de agua en la base de la caja antes de sacar la tira. Esto sirve para mantener unatmsfera hmeda durante la incubacin.b)- Picar con el ansa una colonia y resuspender en un tubo con solucin fisiolgica estril. Agitacon vortex.c)- Ubicar la tira en la bandeja con agua.d)- Sembrar muy suavemente la suspensin bacteriana con pipeta Pasteur. Para ello se debe tener ecuenta lo siguiente: cada microtubo est compuesto por un tubo y una cpula y la cantidad dinculo a agregar a cada uno depende del tipo de prueba. Para el llenado se inclina la bandeja y sapoya la punta de la pipeta contra un costado de la cpula. Cada uno de los 20 microtubos se llenahasta el volumen del tubo. Los microtubos correspondientes a las pruebas CIT, VP y GEL se llenacompletamente (tubo + cpula). Aquellos correspondientes a las pruebas cuyos nombres estnsubrayados se llenan hasta el volumen del tubo y luego se completa el volumen de la cpula coaceite mineral.e)- Incubar entre 18 y 24 hs. a 37 C.f)- Luego de la incubacin, se anotan los resultados obtenidos en todas las pruebas que no requierael agregado de reactivos.Si el microtubo de glucosa es negativo (azul o verde), se debe contar el total de ensayos positivoPueden entonces presentarse las siguientes alternativas:

1)- Si dicho nmero es menor o igual a 2, se reincuba 18-24 hs. a 37 C.2)- Si el nmero es mayor que 2 se agregan los reactivos a las pruebas que

correspondan, se realiza la prueba de oxidasa (ver ms adelante) y se anotan todos los resultadoobtenidos.Si el ensayo de glucosa es positivo (amarillo) al cabo de las primeras 18-24 hs. de incubacin, sprocede de la misma forma que en el caso de la alternativa 2) del prrafo anterior.g)- Identificacin de la bacteria por comparacin de los resultados obtenidos con una tabla.

Caractersticas de las pruebas e interpretacin de resultados.

ONPG: determina la actividad de la enzima-galactosidasa.

-galactosidasaONPG---------------------------------------------ortonitrofenol(Orto-nitrofenil- (amarillo)-D-galactopiransido)

Reaccin positiva: amarillo.Reaccin negativa: incoloro.


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ADH: determina actividad de la enzima arginina dehidrolasa.ADH

arginina---------------------------ornitina + NH4 + CO2

El amonio produce un cambio en el pH y un viraje del indicador del amarillo al rojo.

Reaccin positiva: rojo.Reaccin negativa: amarillo.

LDC: determina actividad de la enzima lisina decarboxilasa.

LDClisina------------------------------cadaverina (amina)

La amina produce un cambio de pH y un viraje del indicador del amarillo al rojo.


ODC: determina actividad de la enzima ornitina decarboxilasa.

ODCornitina---------------------------putrescina (amina)

La amina produce un cambio de pH y un viraje del indicador del amarillo al rojo.


CIT: determina la capacidad de la bacteria de usar el citrato como nica fuente de carbono.

El consumo del citrato produce un aumento de pH y un viraje del indicador de verde a azul.Reaccin positiva: azul.Reaccin negativa: verde.

H2S: determina la capacidad de la bacteria de reducir el tiosulfato a H2S para reducir la tensin deoxgeno.El H2S se combina con sales de hierro y forma un precipitado negro.

Reaccin positiva: precipitado negro.Reaccin negativa: ausencia de precipitado.

URE: determina la actividad de la enzima ureasa.

ureasaurea---------------------------NH4

El amonio produce un cambio de pH y un viraje del indicador de amarillo a rojo si se observa entrelas 18 hs. y las 24 hs., o de naranja a rojo si se observa entre las 36 y 48 hs.


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Reaccin positiva: rojo o naranja.Reaccin negativa: amarillo.

TDA: determina la actividad de la enzima triptofano deaminasa.

TDAtriptofano-----------------------indolpirvico + NH4

Al final de la incubacin se agrega una gota de cloruro frrico al 10%. El cido indolpirvicoproduce un color rojo-amarronado en presencia del mismo.

Reaccin positiva: rojo-amarronado.Reaccin negativa: amarillo.

IND: determina la capacidad de la bacteria de metabolizar el triptofano.

triptofanasatriptofano------------------------indol

Al final de la incubacin se agrega una gota del reactivo de Kovacs. La reaccin debe ser ledadentro de los dos minutos de agregado el mismo. El indol se combina con el p-dimetilaminobenzaldehdo presente en el reactivo y se forma una quinona de color rojo violceo.

Reaccin positiva: color rojo. Reaccin negativa: amarillo.

VP: Determina la presencia de acetona como intermediario en el metabolismo de la glucosa.

Al final de la incubacin se agrega una gota de KOH al 40% y luego una gota de alfa-naftol. Seesperan 10 minutosantes de observar el resultado.

Reaccin positiva: rojoReaccin negativa: incoloro

Reduccin de nitratos:Determina la capacidad del microorganismo de reducir el nitrato a nitrito oa nitrgeno libre.

La prueba se lleva a cabo en el mismo microtubo que la de glucosa. Adems de anotar el resultadde dicha prueba, se observa si hay burbujas, lo cual indica que se redujeron los nitratos a nitrgengaseoso.Se agregan dos gotas de cido sulfanlico al 0.8% y dos gotas de N,N- dimetilnaftilamina. Seespran de 2-3 minutos. Si hay nitritos en el medio, los mismos forman un complejo de color rojcon los reactivos. Los resultados negativos se confirman agregando zinc al microtubo. Los nitratoson reducidos por el zinc dando un color rosa anaranjado. Si no hay un cambio de color, es porqulos nitratos fueron reducidos primeramente a nitritos y posteriormente a N2 o a alguna aminaaerognica.


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GEL: Determina la activiada de la enzima gelatinasa.La licuefaccin de la gelatina por esta enzima libera un pigmento negro que difunde al medio.

Reaccin positiva: difusin del pigmento negroReaccin negativa: no hay difusin.

GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA:Determinan la capacidad de un

organismo anaerbico de fermentar el carbohidrato o la de un organismo aerbico de oxidarlo.GLU: glucosa, MAN: manitol, INO: inositol, SOR: sorbitol, RHA: ramnosa, SAC: sacarosa, MELmelibiosa, AMY: amigdalina, ARA: arabinosa.Como consecuencia de la utilizacin del carbohidrato, se forman productos cidos. El descenso dpH produce un viraje del indicador de azul a amarillo.

MAN; INO; SOR: determina la actividad de la enzima catalasa.

2 H2O2 2 H2O + O2 (gas)

La reaccin se lleva a cabo en los mismos microtubos utilizados para MAN; INO y SOR. Despude leer los resultados de dichas reacciones, se agrega una gota de H2O2 al 1.5% a cada tubo. Seespera de 1-2 minutos y se observa si hay formacin de burbujas.

Reaccin positiva: formacin de burbujasReaccin negativa: no se forman burbujas

Prueba de oxidasa:Se embebe un papel de filtro con una suspensin bacteriana similar a lautilizada para inocular los microtubos. Se agrega una gota de clorhidrato de tetrametil-pfenildiamina al 1%. Si la reaccin es positiva, el rea del papel que contiene la suspensin dbacterias toma un color prpura dentro de los 30 segundos. Si la reaccin es negativa no se registrningn cambio de color.


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T.P.N7

RASTREO DE CEPAS PRODUCTORAS DE DE ENZIMAS INTERS BIOTECNOLGICO

Objetivos: Determinar la capacidad de los microorganismos aislados en el TP anterior de producirenzimas de inters industrial utilizando ensayos en placa y verificar actividad a distintastemperaturas de incubacin.

Introduccin: En el siguiente trabajo prctico se estudiar la capacidad de los microorganismosaislados de diversas fuentes de producir enzimas que se utilizan en la industria en generalPrincipalmente se seleccionarn aquellos que tengan una mayor actividad con respecto a locontroles empleados y a distintas temperaturas de incubacin. Adems cuando sea posible sutilizar dicha caracterstica para la identificacin de los mismos.Las enzimas se producen comercialmente desde fines del siglo pasado y a partir de la dcada del 6comienza la produccin masiva con microorganismos.Los microorganismos ofrecen grandes ventajas como sistemas de produccin de enzimas, dada salta velocidad de sntesis, alto rendimiento de conversin de sustrato en protena enzimtica, graversatilidad y mayor simplicidad en la manipulacin ambiental y gentica de su capacidadproductiva.Las enzimas de uso industrial, son mayoritariamente hidrolasas extracelulares de estructura simpleestables y sin requerimientos de cofactores disociables para su actividad. Estas enzimas sonproducidas por las bacterias como respuestas adaptativas de fase estacionaria que le sirven para laprovisin de nutrientes en condiciones de hambreado extremo como lo es la situacin en su hbitatnatural.Mientras que para las bacterias Gram positivas la exportacin al extracelular esta facilitada porcarecer de membrana externa, las Gram negativas presentan complejos sistemas de secrecin paraatravesar la capa externa de LPS. Adems existen diferentes niveles de control gentico de laexpresin de estas actividades, que han sido ampliamente estudiados. Uno de los problemas de lasenzimas es su inestabilidad, siendo particularmente sensibles a la temperatura; de manera que lavida media puede llegar a ser muy corta o su actividad baja en temperaturas ambiente.En la siguiente tabla se muestra las enzimas de produccin microbiana que sern rastreadas y sucampo de aplicacin industrial:

Nombre de la enzima yreaccin catalizada

Origen microbiano Campo de aplicacin industrial

-AmilasaHidrlisis de almidn

Bacillus , Aspergillus ,otros hongos

Obtencin de jarabe de glucosa;eliminacin del apresto del almidn

ProteasaHidrlisis de protenas

Bacillus y otrasbacterias, tambinhongos

Aditivos de productos de lavado;curtidos

LipasaHidrlisis de lpidos

Pseudomonas y Hongos

Curtidos, aditivos de productos delavado

Metodologa:Para todas las actividades que se evaluaran se empleara el sistema de deteccin en placa de halos ddegradacin. Esto se realiza en forma directa por inspeccin de la placa o por revelado especificque produce diferencias en la coloracin en las zonas degradadas respecto del fondo no hidrolizadoEn todos los casos se comparara la actividad con respecto a los controles empleados. Estascomparaciones requieren que exista un desarrollo microbiano similar para evaluar cuantitativamenlos resultados a distintas temperaturas de incubacin.


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1) Produccin de amilasas.

El almidn es un polisacrido de reserva complejo. Almidn es un polmero de glucosa en enlacglucosidico lineal (amilasa) -1,4 o ramificado (amilopectina) -1,6. Un test cualitativo para

determinar su presencia es la aparicin de un color azul luego de la adicin de una solucin dioduro de potasio/ I2. Luego de la hidrlisis del almidn, los productos de clivaje (dextrinas, maltosay glucosa) no dan este color. Este principio ser utilizado para testear la hidrlisis del almidn eeste trabajo.La capacidad de un microorganismo de hidrolizar el almidn esta asociada a la enzima alfa-amilasextracelular. Esta sirve como criterio de identificacin de aislamientos desconocidos.

1. Sembrar el microorganismo en estudio por estra en una placas de Agar Almidn. Inoculados placas con microorganismos control, Escherichia coli y Bacillus subtillis .

2. Incubar a 22, 30 y 42oC durante 48 hs o hasta observar desarrollo.3. Testear la hidrlisis del almidn por accin del microorganismo cubriendo la superficie de

la placa con una solucin de ioduro de potasio/ I2 (lugol)4. Dejar actuar 10 minutos.5. Observar la coloracin: halos de degradacin (marrones o transparentes) alrededor de las

colonias sobre fondo azul. Comparar con los controles ensayados y en cada temperatura.

2) Produccin de proteasas

Muchas bacterias pueden degradar diversas protenas y utilizar los pptidos y aminocidosresultantes como fuente de energa y para sintetizar sus propias protenas.Un ejemplo es la hidrlisis de la casena. La casena existe en la leche como una suspensincoloidal que da a la leche su aspecto opaco. Muchas bacterias producen enzimas que hidrolizan estaprotena dando derivados solubles y transparentes. La ruptura de protenas a veces llamadapeptonizacin, es til en la identificacin de especies microbianas.

1. Sembrar el microorganismo en estudio por estra en una placa de Agar Leche Inocular dosplacas control con Escherichia coli y Bacillus subtillis .

2. Incubar a 22, 30 y 42oC durante 48 hs o hasta observar desarrollo.3. Colocar las placas sobre una superficie negra y analizar la presencia o ausencia de zonas

claras (halos de degradacin) alrededor del rea de crecimiento de los microorganismostesteados. Comparar con los controles ensayados y en cada temperatura.


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3) Produccin de lipasas

Las lipasas tienen la capacidad de hidrolizar fosfolpidos, como los presentes en las lecitinas de lyema del huevo. El clivaje de las uniones fosfoester por accin de la Fosfolipasa C forma udiglicrido insoluble en agua. Esta actividad enzimtica puede ser detectada por una zona deopalescencia en el medio alrededor de la masa celular. Otra posible accin enzimtica es la de lFosfolipasa A, dando un producto soluble en agua (lisolecitina), que en cambio se observa com

una zona transparente alrededor de la masa celular. Los fosfolpidos son componentes mayoritarioy funcionales de las membranas celulares. La capacidad de hidrlisis de fosfolpidos de clulahuspedes es un factor importante de virulencia de las bacterias que la poseen y por lo tanto sdeterminacin es una herramienta utilizada para caracterizar e identificar miembros de los gneroPseudomonas, Staphylococcus, Bacillus y Clostridium .

1. Sembrar el microorganismo en estudio por estra en una placa de Agar Yema de huevo. Inoculaplacas control con Bacillus cereus, Steptomyces sp, Pseudomonas aeruginosa y Escherichiacoli .

2. Incubar a 22, 30 y 42oC durante 48 hs. o hasta observar desarrollo.3. Observar la presencia o ausencia de halos de precipitado insoluble o traslcido alrededor de

rea de crecimiento de los microorganismos testeados.


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ANLISIS MICROBIOLGICO DE AGUAS

INTRODUCCINUno de los principales requisitos para que el agua sea apta para consumo es que est libre dbacterias patgenas para el hombre.

Generalmente, los anlisis de rutina no estn dirigidos a la bsqueda directa de microorganismocausantes de enfermedades que se transmiten a travs del agua (ej: fiebre tifoidea, clera, etc.). Polo general se busca detectar la presencia de microorganismos caractersticos del intestino dmamferos. La presencia de stos indicara contaminacin fecal en las fuentes de agua utilizadasAsimismo se utiliza como indicador de contaminacin el recuento de bacterias totales.

OBJETIVO- Determinacin de la presencia de bacterias coliformes en agua para establecer si es apta parconsumo humano.Para sto, se determinarn las bacterias coliformes totales, y entre stas se discriminarn las que sode procedencia fecal de las que no lo son.

MATERIALES Y MTODOS- Caldo Brila Fluorocult (Merck) (ver al final) de simple y doble concentracin- Caldo Citrato de Koser- Tubos de ensayo con campanitas de Durham- Baos o estufas a 37 C .- Luz U.V.

Fundamentos del mtodo En un primer ensayo se busca detectar la presencia de bacterias coliformes totales,

basndose en la capacidad de dichos organismos de fermentar lactosa con la produccin de cido gas. Se considera indicador positivo la produccin de gas, dado que otros microorganismos (ncoliformes) son capaces de producir acidez y no gas.

Un segundo paso consiste en la diferenciacin entre las bacterias coliformes de origen fecay no fecal. El primer grupo est representado por E. coli fecal cuyo hbitat es el intestino humano yel de otros animales. El segundo grupo, antiguamente llamado IAC, est representado por bacteriacuyo origen es el suelo y la vegetacin ( Escherichia sp., Enterobacter, Citrobacter y Klebsiella ).

Finalmente, la cuantificacin se hace por el mtodo del nmero ms probable, que es unmtodo estadstico basado en la teora de las probabilidades de Poisson. Para ello se tiene en cuentel nmero de porciones de la muestra que se siembra en el medio original de crecimiento y enmero de dichas porciones que contienen coliformes.

El volumen de las porciones a sembrar y el nmero de diluciones consecutivas a realizar, dependdel conocimiento que se tenga del grado de contaminacin del agua. De cualquier forma, lovolmenes debern ser tales que:1) Todos o la mayora de los tubos de la mayor dilucin hayan dado negativos a la produccin dgas en el Caldo Brila a 37 C.2) Todos o la mayora de los tubos de la menor dilucin hayan dado positivos a dicho ensayo

Para que el agua de una fuente dada pueda ser considerada potable desde el punto de vistamicrobiolgico, las bacterias presentes en la muestra no deben superar los siguientes valores:

Coliformes totales: < 2.2 coliformes/100 mlColiformes fecales: 0 coliformes/100 ml


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Prctica: A) Determinacin de coliformes totales: 1) Se siembran por triplicado en tubos de fermentacin que contienen 10 ml de Caldo Brila , 10, 1 0.1 ml de la muestra de agua. Las siembras que se hagan con un volumen de 10 ml, se harn en uvolumen igual de caldo de cultivo de doble concentracin. Las siembras que se hagan con uvolumen igual o menor a 1 ml, se harn directamente en 5 ml de caldo de cultivo de simple

concentracin.2) Se incuban los tubos sembrados a 37 C durante 48 hrs.3) Se observan los tubos a las 48 horas. Se considera resultado positivo la produccin de ga(debido a la fermentacin de la lactosa) que ocupe ms de 1/3 del volumen de la campanita dDurham.4) Se anota la cantidad de tubos positivos de cada dilucin. Se selecciona mediante un criterioadecuado la combinacin de tubos con la que se continuar el anlisis.

B) Diferenciacin de las bacterias coliformes de origen no fecal y fecal: Coliformes de origen no fecal:A partir de los tubos que dieron positivo (produccin de gas) se siembran, con ansa recta, tuboconteniendo caldo Citrato de Koser y se los incuba a 37 C por 48 horas. Solo los coliformes nofecales pueden crecer utilizando el Citrato como nica fuente de carbono a esa temperatura. Uresultado positivo en estos tubos se evidencia por la aparicin de turbidez.Coliformes de origen fecal:En los tubos positivos, la deteccin de la presencia de E. coli se efecta mediante fluorescencia aliluminar con luz U.V.. Para confirmar el ensayo se utilizan como indicadores la formacin de gas la prueba del indol utilizando el reactivo de Kovacs. Un resultado positivo ( presencia de gas, viradel reactivo de Kovacs al rojo y fluorescencia a la luz U.V.)), estara indicando la presencia de E.coli .Se observan y anotan los tubos positivos de cada dilucin.

Clculos e Informe: Con todos los resultados obtenidos, se buscan los datos en las tablas de nmeros ms probables y sconfecciona un informeMediante un simple clculo de proporcionalidad, se puede obtener a partir de los datos de la tabllas concentraciones de las coliformes fecales y no fecales:

Coliformes fecales = X. a/(a+b)Coliformes no fecales = X. b/(a+b)

Siendo:X: Nmero ms probable de coliformes segn las tablas de probabilidad.a: Nmero ms probable de coliformes fecalesb: Nmero ms probable de coliformes no fecales

X, a y b estn referidos a un volumen de 100ml, por lo tanto los resultados se informarn como eNmero ms probable de bacterias por 100ml de agua.Medio de cultivo para la demostracin rpida de E. coli mediante fluorescencia. FundamentoAl margen de ciertas especies deSalmonella y Shigella , la bacteria Escherichia coli , es la nicaespecie perteneciente al grupo de las Enterobacterias que posee la enzima-D-glucuronidasa. Estaenzima es capaz de escindir el sustrato 4-metilumbeliferil--D-glucurnido (MUG), formando 4-metilumbeliferona. Esta sustancia se caracteriza por ser fluorescente al iluminarse con luz U.V., l


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que permite su deteccin fcilmente. Este hecho es, al mismo tiempo, un indicador de la presencide E. coli.

Caldo Brila Fluorocult

Composicin (g/litro)Peptona ......................................................10,0

Lactosa........................................................10,0Verde Brillante.............................................0,0133L-Triptofano................................................1,0Bilis de buey desecada..................................20,0MUG............................................................0,1

Bibliografa: 1) Brock. T.D., Smith D.W. & Madigan M.T. " Microbiologa" 4ta. edicin . pp 637-647. 19842) Seeley H.W., Vandemark P.J & Lee J.J. " Microbes in action (A laboratory manual of microbiology)" 4th. edition chapter 12. 19913) Ferramola R." Examen bacteriolgico de aguas". Editorial el Ateneo. 1947.


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T.P. N 9

FORMACIN DE BIOFILMS BACTERIANOS

INTRODUCCIN

En los ltimos aos se ha demostrado que muchas bacterias en ambientes naturales, clnicose industriales no se encuentran como clulas planctnicas estudiadas tpicamente el laboratorio, sinque se unen a superficies formando estructuras denominadas biofilms. Los biofilms se definencomo poblaciones o comunidades microbianas unidas a una superficie que puede ser bitica oabitica.La formacin de los mismos depende de muchos factores de la superficie y ambientalestales como las caractersticas de sustrato, el inculo y la disponibilidad de nutrientes. Losmicroorganismos que habitan estas estructuras poseen una alta resistencia a diversos factoresincluyendo los bactericidas, por lo que algunos problemas derivados de los biofilms, en muchocasos, son difciles de solucionar.

Entre las ventajas que representa este modo de vida para los microorganismos se encuentranla mayor disponibilidad de nutrientes cerca del soporte o superficie, la capacidad de promover eintercambio gentico y, en el caso de los patgenos, el incremento de la proteccin frente a ladefensas del hospedador.Adems de las ventajas mencionadas, este modo de vida constituye unadefensa frente a la predacin en ambientes naturales y en el caso de suelos tambin frente a ldesecacin.

El conocimiento de las caractersticas de los biofilms resulta de utilidad en estudiosaplicados de biorremediacin y en algunos procesos como la biocatlisis. Por otra parte, lomicroorganismos formadores de biofilms provocan problemas en redes de distribucin de agua otras caeras como las del transporte de petrleo o combustibles, tienen importancia en fenmenode biocorrosin y desde el punto de vista clnico son frecuentemente responsables de lasinflamaciones asociadas a los catteres, etc.

OBJETIVOAnalizar la capacidad de formacin de biofilms enPseudomonas putida y Escherichia coli.

Existe una gran variedad de sistemas disponibles para evaluar la formacin de biofilms bacterianoComo un primer paso para estudiar la capacidad de formacin de los mismos se utilizarnmicroplacas de 96 pocillos fondo en U estriles para evaluar la unin de las bacterias a unasuperficie abitica. Est tcnica se emplea para analizar biofilms estticos.

PROCEDIMIENTO

Inocular 3-5 ml de caldo de cultivo con las bacterias de inters e incubar hasta fase estacionariaMedir la densidad ptica (DO).Diluir los cultivos en caldo nutritivo fresco hasta DO600nm=0,025 e inocular 5 pocillos con 150 de cada cultivo. Llenar 5 pocillos con el medio de cultivo utilizado. Tapar la microplaca.Incubar durante 24-48 h a 30C.Observar el crecimiento en los pocillos sembrados y ausencia en los controles.Retirar con pipeta cuidadosamente (sin tocar las paredes ni el fondo) el medio de cultivo pareliminar las clulas planctnicas. Lavar los pocillos con agua.Teir con 150 l de cristal violeta (0,1%), dejar en contacto con el colorante 20 min. Retirar ecolorante que no se haya unido a las clulas y observar el patrn de unin. Lavar el exceso dcolorante con agua.


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Solubilizar el colorante con 200 l de etanol (95%) a temperatura ambiente durante 10-15 minTransvasar el contenido de los pocillos a una placa de 96 pocillos fondo plano y cuantificarmidiendo la DO a 500-600 nm utilizando un lector de ELISA.Con esta metodologa se comparar la capacidad de formacin de biofilms enPseudomonas putida y Escherichia coli.

BIBLIOGRAFA

O`Toole, G.A. and R. Kolter. (1998). Initiation of biofilm formation inPseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis. Moleculamicrobiology, 28:449-461.Palmer J, Flint, S and J. Brooks, (2007) Bacterial cell attachment, the beginning of a biofilm.J Ind Microbiol Biotechnol (2007) 34:577588


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T.P. N 10

Parte A: PREPARACIN DE STOCKS Y TITULACIN DE BACTERIFAGOS

OBJETIVOS- Preparacin y determinacin del ttulo de stocks de bacterifagos a travs de la formacin de

placas de lisis.Microorganismos a utilizar: - Bacterifagos T4- Escherichia coli

Desarrollo experimental: Preparacin de stocks de los bacterifagos T4- Inocular dos cultivos en fase exponencial de Escherichia coli ccda uno con una suspensin delbacterifago T4 a una multiplicidad de infeccin de 0,1.- Incubar a 37 C con agitacin durante dos a cuatro horas.

- Centrfugar a 10.000 rpm durante aproximadamente 15 minutos a 4 C, para eliminar en el pellelos restos celulares y cosechar el sobrenadante en otro tubo.- Filtrar el sobrenadante por una membrana de nitrocelulosa de 0,45 de tamao de poro.- Controlar la ausencia total de bacterias en los stocks mediante plaqueo de una alcuota en agar LB

Titulacin de los stocks1- Se preparan 12 placas de Petri conteniendo agar LB. Se dejan solidificar y se secan en estufa.2- Se preparan diluciones seriadas decimales de los stocks de T4 y M13 en caldo LB(10-1 a 10-6).3- Se dispone de tubos de hemlisis conteniendo 3 ml de agar LB blando (0,7% de agar), los cualesson mantenidos en un bao termostatizado a una temperatura de 45-50 C, sin dejar quesolidifiquen.4- Se inoculan 6 tubos conteniendo agar blando con 0,1 ml de un cultivo de Escherichia coli encrecimiento exponencial, que se corresponda con el tubo 1 de la escala de Mc Farland.Seguidamente, cada tubo se inocula con 0,1 ml de las diluciones 10-4, 10-5 y 10-6 de los fagos T4 yM13, se agita vigorosamente y la mezcla correspondiente a cada dilucin se vierte (por duplicado)sobre una placa conteniendo agar LB, la cual se mueve en forma circular para esparcircompletamente el agar blando.5- Las placas se incuban durante 48 hs. a 37 C.6- Al cabo de dicho lapso, se observan las placas de lisis correspondientes a los bacteriofagos T4 ya M13. Se eligen aquellas placas en las cuales se puedan contar alrededor de 100 placas de lisis y scalcula el ttulo de cada stock como:

Ttulo viral = promedio del nmero de placas de lisis

(UFP/ml) volumen de inculo x dilucinBibliografa Adams, M. H. Bacteriophages. Editorial Interscience N Y, 1959


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ANTIBITICOS

A) PRODUCCION DE ANTIBIOTICOS A PARTIR DEStreptomyces sp. AISLADOS DE UNAMUESTRA DE SUELO

INTRODUCCINLa bsqueda de microorganismos productores de nuevos antibiticos utilizados en diversombitos (agricultura, veterinaria y la industria farmacutica) ha sido y contina siendo intensdebido, principalmente, al fenmeno de resistencia a los antibiticos. Una gran cantidad debacterias pertenecientes al Phylum Actinobacteria (actinomycetes) tienen la capacidad de sintetizardiferentes metabolitos secundarios biolgicamente activos: antibiticos, herbicidas, pesticidasantiparasitarios y enzimas que son utilizadas para el tratamiento de desechos. En particular, loantibiticos resultan de gran importancia teraputica y comercial.

Los actinomycetes constituyen un grupo ampliamente distribuido en la naturaleza.Semejantes a los hongos en su estructura filamentosa ramificada, estas bacterias son Grampositivas, aerbicas, mesfilas, morfolgicamente irregulares. Alrededor del 80% de losaislamientos del suelo pertenecen al GneroStreptomyces ; se encuentran en concentraciones viablesde 106-107 por gramo de tierra. Diversas especies deStreptomyces producen geosminasresponsables del olor caracterstico de la tierra frtil. Su aislamiento es relativamente sencillo pueson nutricionalmente muy verstiles: utilizan almidn, asparragina o malato clcico como fuente dcarbono y casena no digerida o nitrato potsico como fuente de nitrgeno. Producen esporasdenominadas conidios, por tabicacin. Se han obtenido ms de 50 antibiticos diferentes a partir despecies deStreptomyces , incluyendo la estreptomicina, la neomicina, el cloranfenicol y lastetraciclinas.

Objetivo: Obtener colonias deStreptomyces sp. productoras de antibiticos a partir de muestras desuelo.

Desarrollo experimental1) Preparar 3 placas de Petri con AS. Dejar solidificar y secar bien en estufa a 37 C.2) Mezclar 1 gr. de tierra en 100 ml de agua destilada en un frasco estril (un frasco por cada 4

alumnos). Agitar vigorosamente durante 5 min.. Tomar 0,2 ml de dicha suspensin y diluirla en1,8 ml de solucin fisiolgica estril en un tubo de hemlisis. Homogeneizar en agitador detubos. Repetir la dilucin

3) Sembrar 0,2 ml con rastrillo de cada dilucin en placas de Petri con un inculo proveniente de lsuspensin original y con otros dos inculos proveniente de la suspensin diluida.

4) Sembrar placas conS. aureofaciens y/o S. Venezuelae Estas bacterias son productoras declortetraciclina y cloranfenicol, respectivamente.

5) Incubar a temperatura ambiente durante 5 das.

2do. da1) Observar el desarrollo de colonias en las placas estriadas el 1er. da y describir su aspecto

macroscpico. Las colonias deStreptomyces son pequeas, de consistencia firme y adheridasfuertemente al sustrato solidificado, de aspecto granuloso y pulverulento, generalmentepigmentadas (blanco, amarillo, rojo). Identificar una colonia aislada, realizar una tincin dGram y observar al microscopio.

2) Preparar una suspensin de un microoganismo sensible ( E.coli ) colocando varias colonias en untubo de hemlisis conteniendo 1 ml de solucin fisiolgica estril. Homogeneizar en agitador dtubos. Agregar 4.ml de agar AS blando. Conservar a 40C.


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3) Volcar con cuidado la suspensin de agar blando con las bacterias sensibles sobre las placas dePetri que tienen las colonias provenientes de las muestras de tierra, y las que tienen colonias dS. aureofaciens y/oS. venezuelae .

4) Dejar secar las placas durante 5 min. e incubar durante 24 hs. a a 37 C .

3er. daObservar los halos de inhibicin del crecimiento de B. subtilis y E. coli en las placas con AN

controles debidos a la produccin de antibiticos deS. aureofaciens y/o S. venezuelae , ycompararlos con los obtenidos a partir de los aislamientos de tierra.

BibliografaMadigan M.T., Martinko J.M. and Parker J. Biologa de los microorganismos, 10 Edicin, pp415, 721-722, 2004.Seeley H.W., Vandemark P.J. and Lee J.J. Microbes in action (A laboratory manual of microbiology) 4th edition, pp. 173-176, 1991.http://www.accessexcelence.org/AE/AEC/AEF/1995/goudie_soil.htmlhttp://www-micro.msb.le.ac.uk/video/Streptomyces.htmlPurification and structure elucidation of antifungal and antibacterial activities of a newly isolateStreptomyces sp. Strain US80. Fourati-Ben Fguira L., Fotso S., Ben Ameur-Mehdi R., Mellouli Land Laatsch H. Research in Microbiology 156: 341-347, 2005.Plasticity of theStreptomyces genome-evolution and engineering of new antibiotics. Hranueli D.,Cullum J., Basrak B., Goldstein P. and Long P.F. Current Nedical Chemistry 12: 1697-1704, 2005.


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T.P. N 12

DETERMINACIN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBITICOS

INTRODUCCINEl uso y abuso de los antibiticos en las terapias contra infecciones de origen bacteriano, conlleva

la seleccin de cepas bacterianas resistente. La diseminacin de estas resistencias a otras cepas de misma o diferente especie se ve facilitada cuando los marcadores de resistencia (genes) seencuentran en elementos genticos mviles como son plsmidos y/o transposonesLa susceptibilidad de los microorganismos a los antibiticos se determina mediante tcnicabasadas en la dilucin o difusin del antibitico en un medio de cultivo donde desarrolla emicroorganismo en estudio.Las tcnicas de dilucin en caldo y agar son utilizadas para medir la actividad de un agentantimicrobiano frente a una cepa bacteriana y permiten determinar la concentracin inhibitorimnima (CIM) que es la menor concentracin de antimicrobiano capaz de inhibir el crecimientbacteriano.La CIM indica la concentracin de antimicrobiano que se necesita para matar o inhibir ecrecimiento del microorganismo analizado y permite valorar comparativamente la potencia de loantimicrobianos. La reproducibilidad de estas pruebas es de 1 dilucin y para evitar una granvariabilidad stas deben ser estandarizadas y controladas muy cuidadosamente. Los mtodoestandarizados se detallan ampliamente en el NCCLS (National Committee for Clinical LaboratorStandards)Para el caso de las tcnicas que se basan en la difusin del antibitico, el mtodo universalmentutilizado es el de Bauer y Kirby comnmente llamado antibiograma. Este mtodo consistebsicamente en un disco de papel embebido en el antibitico que es colocado sobre un medio dcultivo slido inoculado con el microorganismo a ensayar; luego de 18 a 24 horas de incubacin smide el halo de inhibicin del crecimiento bacteriano que produce el antibitico al difundir desde disco de papel que lo contiene, radialmente hacia el medio de cultivo donde esta creciendo emicroorganismo.El dimetro del halo de inhibicin del crecimiento en un antibiograma y el valor de la CIM para udeterminado antibitico son un criterio de referencia experimental para determinar si unmicroorganismo es resistente o sensible a ese antibitico.Otro novedoso mtodo es el EtestTM , que permite la determinacin de la (CIM) .El EtestTM es una tira plstica que contiene un gradiente continuo de un antibitico, la tcnicacombina el fenmeno de difusin con el de dilucin del antibitico para determinar la CIM para udado microorganismo. Este mtodo, como veremos en el trabajo prctico, es mucho ms certero quel antibiograma y ms rpido y preciso que la tcnica de dilucin para obtener la CIM, queusualmente se realiza en varios pasos de dilucin y cultivo lo cual requiere disponer de muchmaterial estril para una sola determinacin.

Materiales Cultivo exponencial de la cepa bacteriana a analizar.Agar Mller HintonCajas de Petri estrilesRastrillo (alcohol 70% para esterilizarlo)AnsaPipetas de 1 ml y 10 ml estrilesSolucin fisiolgica estrilSolucin de hipoclorito al 5% para descarte de material contaminado.Tubos de ensayo estrilesHispos estriles


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Escala de McFarlandDiscos de antibiogramaTiras de EtestTM para distintos antibiticosEstufa a 37 C

Desarrollo del trabajo prctico

Determinacin de la CIM por dilucin en caldo1. Se realizan diluciones al medio decrecientes del o los antibiticos en tubos conteniendo 1 ml dcaldo Mueller-Hinton2. Se siembra 1ml de una suspencin bacteriana de aproximadamente 105 bacterias por ml queequivale a una dilucin 1/500 del tubo 1 de la escala de Mc Farland.3. Se realiza un control de crecimiento inoculando un caldo sin antibitico y un control negativcon caldo sin inocular.4. Se incuban todos los tubos a 37 C durante 24 horas. Luego se observa turbidez indicativa dedesarrollo bacteriano.5. Se determina la CIM como aquella concentracin del antibitico contenida en el tubo que posela mayor dilucin del mismo en la que se detecta falta de turbidez. La mnima concentracin quinhibe el crecimiento bacteriano.

Bibliografa Bauer, A., Kirby, W., Sherris, J., Turk, M. American Journal of Clinical Pathology, 45: 493-4961986.Davis, D. B., Dulbecco, R., Eisen, H., Ginsberg, H., Tratado de Microbiologa. captulo 7 SalvatEditores, Tercera edicin, 1984.


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TCNICA DE INMUNODIFUSIN RADIAL PARA LA DETERMINACIN DEINMUNOGLOBULINAS Y OTRAS PROTENAS EN LQUIDOS BIOLGICOS

Introduccin La inmunodifusin radial en placa de agarosa conteniendo antisueros especficos constituye

un excelente recurso diagnstico para la determinacin cuantitativa de protenas de lquidobiolgicos.El procedimiento consiste en una inmunoprecipitacin en agarosa entre un antgeno a

cuantificar y su anticuerpo homlogo. Se realiza incorporando uniformemente uno de los doreactivos inmunes (generalmente el anticuerpo) en un gel de agarosa y luego introduciendo el otrreactivo en pocillos excavados en el mismo gel. El antgeno difunde radialmente en el gel qucontiene el anticuerpo y se forma un disco o anillo de precipitacin visible en un punto que dependde la relacin estequiomtrica antgeno-anticuerpo. A medida que el antgeno difunde desde epocillo hacia el gel, el anillo se redisuelve y reaparece a una distancia mayor del pocillo. Estaumento en el dimetro de precipitacin contina hasta que antgeno y anticuerpo reaccionancompletamente. Mientras que el precipitado se est expandiendo (16 a 20 horas) la relacin entre edimetro del anillo y el logaritmo de la concentracin de antgeno es aproximadamente lineal. Acompletarse la reaccin, la relacin entre el dimetro al cuadrado y la concentracin es lineal.Equipamiento necesario para el desarrollo de la tcnica * Inmunoplacas para 12 determinaciones* Micropipetas que permitan medir 5 l con precisin* Sueros testigos con 3 niveles de la protena a determinar* Regla de lectura que permita leer con una precisin de 0,1 mm

Desarrollo de la reaccin 1- Abrir la placa para permitir que se evapore el exceso de humedad, si lo hubiera2- Sembrar 5 l de muestra o control utilizando micropipetas de precisin.3- Incubar en posicin invertida en cmara hmeda el tiempo indicado en la tabla que acompacada placa (48 horas a temperatura ambiente)

Lectura de los resultados El punto final de la difusin esta indicado por la aparicin de un anillo de bordes netos. E

mismo se alcanza una vez cumplido el tiempo de incubacin. A partir de ese momento puedefectuarse la lectura, ya que el halo no aumentar de tamao.

El clculo de los resultados se realiza con alguno de los siguientes mtodos:A) Determinacin de rutina: Utilizando tabla de valores.a) Medir los halos con una precisin de 0,1 mm.b) Interpolar el dato anterior en la tabla de valores que acompaa a cada placa.

B) Determinacin de alta precisin: Trazando curva de calibracin.a) Las tres primeras posiciones de cada placa se utilizan para sembrar los sueros controles.b) Medir los dimetros de los halos con una precisin de 0,1 mm.c) Graficar las concentraciones de los sueros de referencia versus el dimetro al cuadrado de lohalos de precipitacin.d) Trazar la recta que mejor una los tres puntos.e) Interpolar el valor de la muestra desconocida.

C) Determinacin de rpida orientacin: Mtodo cintico de lectura rpida.


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a) Tomar la lectura entre 16 y 20 horas de incubacin con una diferencia mxima de 30 minutorespecto al suero de referencia. Medir los dimetros con una precisin de 0,1 mm.b) Graficar los dimetros de los sueros de referencia versus el logaritmo de sus respectivasconcentraciones.c) Trazar la recta que mejor una los tres puntos.d) Interpolar el valor de la muestra desconocida.e) No es necesario trazar una curva cada vez que se procesa una nueva muestra. Sin embargo, deb

efectuarse la lectura en el mismo tiempo en que se leyeron los sueros de referencia. Si se efectuna nueva siembra, con ms de una semana de diferencia respecto a la calibracin, es recomendabintroducir un testigo en cada corrida.NOTA: La tabla de valores se confecciona sobre un gran nmero de placas de cada lote utilizandun programa estadstico por computacin para trazar la mejor recta. Solo es vlida para el nmerde lote indicado. Variaciones en los parmetros del ensayo, como volumen de muestra, temperaturtiempo de incubacin y utilizacin de la placa una vez abierta por un lapso superior a 1 mes puedeproducir dimetros no concordantes con los especificados en la tabla. Es recomendable incluisueros controles para trazar una curva de calibracin.

Errores factibles en la utilizacin de la tcnica 1- Debe tenerse precaucin al sembrar, evitando derramar muestra fuera del pocillo, romper lobordes del mismo o introducir burbujas de aire. En caso que esto ocurra, sembrar un nuevo pocillo2- Si una vez abierta la placa se observan signos de deshidratacin o deterioro en el gel, debe sedesechada.3- Deben evitarse las variaciones brscas de temperatura, ya que afectan la velocidad de difusin ypor lo tanto, los dimetros de precipitacin.4- Las placas no deben ser congeladas. Si esto ocurriera, deben ser descartadas.

Evaluacin de los resultados Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. Los

rangos que aqu se dan corresponden a pacientes ambulatorios presuntamente sanos.

Inmunoglobulina G: Adultos: 600-1650 mg/dlNios: 560-1500 mg/dlInmunoglobulina A: Adultos: 90-400 mg/dlNios: 100-210 mg/dlInmunoglobulina M: Adultos: 75-300 mg/dlNios: 40-200 mg/dlInmunoglobulina D: 100 UI/mlC3: 80-160 mg/dlC4: 20-40 mg/dl

Bibliografa

Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology. Volume 1 Immunochemistry. BlackwellScientific Publications. Fourth Edition. 1986.Margni, R. A., Inmunologa e Inmunoqumica. Editorial Mdica Panamericana. Quinta Edicin1996T.P.N 13


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T.P. N 14

REACCIN DE AGLUTINACIN

Cuando un anticuerpo especfico es puesto en contacto con un antgeno, si ste esparticulado (por ejemplo un glbulo rojo, una bacteria o cualquier otra clula), las partculas saglutinan formando una malla visible. Esta reaccin se conoce con el nombre de aglutinacin.

Los principios que regulan la aglutinacin son los mismos que en la precipitacin. Laocurrencia de uno u otro fenmeno depende del tipo de antgeno involucrado (soluble oparticulado).

La reaccin de aglutinacin se usa para identificar un antgeno particulado, el cual va areaccionar con un inmunosuero especfico o para determinar el ttulo aglutinante de un suerinmune.

Para titular un antisuero se mezcla una cantidad constante de la suspensin antignica condiluciones crecientes del suero a examinar y se determina su ttulo como la inversa de la mximdilucin capaz de dar una aglutinacin positiva. El ttulo depende de la tcnica utilizada y debeestandarizarse distintos factores tales como concentracin de la suspensin antignica, temperaturconcentracin salina en el medio y tiempo de reaccin, para que los resultados sean comparables.

Objetivo: Titular anticuerpos en suero utilizando la tcnica de aglutinacin directa

Materiales:- PBS pH 7,2- microplacas de 96 pocillos con fondo en "U".- micropipetas y tips.- suspensiones homogneas deSalmonella newport y Salmonella oranienburg crecidas en caldonutritivo y diluidas hasta ajustar la concentracin tomando como referencia el tubo 1 de la escala dMac Farland (3 x 108 bacterias / ml aproximadamente). Estas suspensiones bacterianas representanel antgeno flagelar llamado antgeno H (Suspensin H).- suspensiones homogneas deSalmonella newport y Salmonella oranienburg crecidas en agarnutritivo y diluidas de igual forma que las crecidas en medio lquido. Estas suspensiones bacterianarepresentan el antgeno somtico llamado antgeno O o endotoxina de naturaleza glucolipdic(Suspensin O).S. oraniemburg (estructura antignica= 6,7:m,t) y S. newport (6,8:e.h:1,2) y los antisueros O6,8;He,h y Hm,t (antisuero anti O preparado en conejo inmunizado con antgeno O purificado).

Procedimiento:1.- Se colocan 50 l de PBS en cada uno de los 12 pocillos de una hilera de una microplaca de 9pocillos con fondo en "U".2.- Se colocan 50 l del suero anti H a titular en el primer pocillo de la hilera.3.- Se realizan diluciones seriadas al medio de dicho antisuero. Para ello se homogeniza econtenido del primer pocillo y se trasvasan 50 l de la mezcla al segundo pocillo. Se repite eprocedimiento a lo largo de toda la hilera.4.- Se trasvasan 25 l de cada pocillo al pocillo correspondiente de la siguiente hilera.5.- A cada pocillo de la primera hilera, se agregan 75 l de la suspensin antignica H.6.- A cada pocillo de la segunda hilera, se agregan 75 l de la suspensin antignica O.7.- Se repite idntico procedimiento con el suero anti O.8.- En todos los casos se homogeniza y se incuba a 37 C durante 2 hs.9.- Se realiza una primera lectura de los resultados, anotando la mayor dilucin del antisuero quproduce aglutinacin.


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10.- Se incuba durante toda la noche a 4 C y luego se realiza una segunda lectura, verificando ettulo definitivo.11.- Como controles se utilizan sueros normales de conejos obtenidos con anterioridad a lainoculacin de los distintos antgenos.

Bibliografa

Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology. Volume 1 Immunochemistry. BlackwellScientific Publications. Fourth Edition. 1986.Margni, R. A., Inmunologa e Inmunoqumica. Editorial Mdica Panamericana. Quinta Edicin1996


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Gua para la confeccin de informe

TURNO TP: ........ GRUPO N: ..........INTEGRANTES:................................

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INFORME TRABAJO PRACTICO N ....

TITULO: ..................................................................................................

OBJETIVOS:...............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

RESULTADOS OBTENIDOS: (se pueden utilizar tablas y/o grficos que expresen los resultadosen forma concreta, sin detalles de los mtodos utilizados que figuran en la gua de TP).

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CONCLUSIONES: (comente brevemente las conclusiones obtenidas a partir del anlisis de los

resultados)........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................


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APNDICE

MEDIOS DE CULTIVO

CALDO NUTRITIVO

Extracto de carne..................................... 3,0 g.Peptona de carne...................................... 5,0 g.Agua destilada c.s.p. ...........

microbilogia e inmunologia

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