TINCIN GRAMEl principal impedimento en la observacin de bacterias en microscopio ptico es la falta de contraste entre la clula en observacin y el medio que la rodea, la manera ms simple de facilitar el contraste es la utilizacin de colorantes, revelando la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Para bacterias, el proceso de fijacin por calor es lo ms habitual, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de esto se aade el colorante. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas parezcan mayores de lo que son realmente. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad por los materiales celulares.Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante. Una tcnica de coloracin y la ms conocida es la tincin de Gram, denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien desarrollo esta tcnica en 1844. Sobre la base de la tincin de gram, las bacterias se clasifican en dos grupos: gran positivos y gran negativos. En cuanto a la tincin de gram la secuencia es la siguiente: el frotis bacteriano se fija con calor se tie con cristal violeta por 1 min, se lava con agua, se la aplica un mordiente por 1 min y se lava nuevamente con agua, despus se decolora con una mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y cubrir con safranina (color de contraste) durante 1 min lavar y secar. Las bacterias Gram positiva y Gram negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para definir su tamao y su forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. La pared de la clulas Gram positivas es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano (cadenas lineales de un polisacrido formado por residuos alternativos de N-acetilglucosamina y N-acetilmurmico unidos mediante un enlace) y un poco de cido teicoico (forman parte de la gruesa capa de peptidoglicano que rodea a la membrana plasmtica y estn directamente unidos a l mediante un enlace fosfodister. De este modo pueden conectar varias capas de peptidoglicano), mientras que las bacterias gram negativas se componen de una capa delgada de peptidoglicano y est rodeada por una capa exterior de lipopolisacridos (forma parte de la pared de la pared celular de las bacterias Gram-negativas. Tienen carcter anfiptico, presentan carga negativa, y repelen molculas hidrofbicas. Son txicos para el hombre, y tambin se llaman endotoxinas) por lo cual estas dos tipos de bacterias se tien de diferente color y es posible identificarlas como Gram positiva o Gram negativa.

TCNICA DE LA COLORACION GRAM

1) El primer paso es preparar y fijar un frotis de la siguiente manera:

Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica y esperar que enfre un poco. Tomar el asa (previamente flameada) y con sta coger un poco de muestra. Una vez obtenida una pequea cantidad de la muestra (con el asa), hacer que sta tenga contacto con una lmina portaobjetos, la cual servir para depositar la muestra contenida en el asa. Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina portaobjetos, proceder a realizar la extensin de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lmina, de tal forma que al terminar la extensin, tengamos como producto un espiral en la parte media la lmina. Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.

2) Una vez obtenido el frotis con la muestra, se procede a teir la misma con violeta cristal o violeta de genciana, utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 grados.

3) Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, sta debe caer sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un centmetro de espesor. Tambin el enjuague se debe realizar poniendo la lmina en posicin inclinada hacia abajo.

4) Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 1 minuto ms.El mordiente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y determine su fijacin a las bacterias.

5) Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van aadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que ste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra ms lquido azul.

6) Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lmina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita.

7) Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto.

8) Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. VIOLETA DE METILO Comnmente denominadocristal violetaovioleta de genciana, es el nombre dado a un grupo de compuestos qumicos empleados como indicadores de pH y colorantes. Los violetas de metilo son mezclas de: N-tetra, N-penta y N-hexametil p-rosanilinas. Por la mezcla de diferentes versiones, el fabricante puede crear diferentes tonos de violeta en el colorante final. Cuanto ms metilado est el colorante, su color ser de un violeta ms oscuro: Tetrametilo (cuatro metilos) es conocido como Violeta de metilo 2B, y encuentra usos especficos en qumica y medicina. Pentametilo (cinco metilos) es conocido como Violeta de metilo 6B, y es ms oscuro como colorante que 2B. Hexametilo (seis metilos) es conocido como Violeta de metilo 10B, o especficamente violeta cristal. Es mucho ms oscura que la 2B, y an ms oscura que la 6Bk.

El violeta de metilo se obtiene por reaccin de condensacin de la cetona de Michler (4,4'-Bis-dimetilamino-benzofenona) con N,N-dimetilanilina en presencia de clorato de fosforilo. LUGOLEllugolodisolucin de Lugoles una disolucin de yodo molecularI2 y yoduro potsicoKIen agua destilada. Se prepar por primera vez en1829y recibe su nombre en honor al mdicofrancsJ.G.A. Lugol. El Lugol consiste en 20 gramos de yodo metlico y 40 gramos de yoduro potsico, disueltos en 1 litro de agua destilada. El yoduro potsico facilita la disolucin del yodo diatmico, debido a la formacin de ionestriyoduro I3-.No debe confundirse el lugol con latintura de yodo, que consiste en yodo diatmico y sales de yodo disueltos en una mezcla de agua yalcoholetlico (etanol). La disolucin de Lugol no contiene alcohol.Enmicrobiologase emplea en latincin de Grampara retener el colorantecristal violeta. El I2entra en las clulas y forma con el colorante cristal violeta un complejo insoluble en agua. ALCOHOL ACETONASu composicin es: Metanol: 75% Acetona: 25%La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen. La funcin del alcohol-acetona es la quitar el colorante de las bacterias, as si la bacteria conserva el tinte, es Gram positiva y si el tinte no se mantiene es Gram negativa.

FUCSINA BSICAEs una mezcla de rosaniline y paraosanilina y tambin puede contener Magenta II y neofucsina. Acta como colorante de contraste para la tincin de bacterias (pared celular). SAFRANINALa safranina (tambin llamada Safranina O o rojo bsico 2), es un colorante biolgico, de contraste que se utiliza en la Tincin de Gram para proporcionar un color violeta ms intenso a las bacterias Gram+ y tie de rosa a las bacterias G- ; en histologa y en citologa. La safranina se usa como lquido de contraste en algunos protocolos de tincin, coloreando el ncleo celular de rojo. Tambin para detectar cartlago, mucina y grnulos de mastocitos.La safranina es una dimetil safranina. Hay tambin una trimetil safranina, que tiene un grupo metil agregado en la posicin orto- del anillo ms bajo. Ambos compuestos se comportan de forma esencialmente idntica en usos biolgicos de tincin, y muchos fabricantes de safranina no distinguen entre los dos. Los preparados comerciales de safranina frecuentemente tienen una mezcla de ambos. La safranina tambin se usa como indicador redox en qumica analtica.Cules son las fuentes de error ms comunes en la Tincin de Gram?Los peores obstculos de la Tincin, que impiden conseguir el resultado perseguido, son los errores del tcnico. Para evitarlos hay que elegir bien los reactivos y ser muy cuidadosos al ejecutar la tcnica. A continuacin se especifican algunas de las fuentes de error: Impurezas en los reactivos de Tincin. Concentracin inadecuada de los reactivos de tincin. pH inadecuado. El colorante se fija a la clula por mecanismos fsico-qumicos, que se alteran si el PH no es el apropiado. Los colorantes pueden ser cidos, bsicos o neutros. Tiempo de Tincin incorrecto. Temperatura suficiente.A qu se debe el distinto comportamiento de las bacterias Gram+ o Gram- al tratamiento con la coloracin de Gram?La coloracin de gran es de gran importancia en Microbiologa porque permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), segn se comporten ante esta tincin. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano ms fina y una capa lipopolisacardica externa, por este motivo a las bacterias Gram+ se les fija el primer colorante usado en la mezcla, mientras que las Gram- despus del lavado se desprende el colorante y se fija el colorante de contraste de la tincin.Explique como la tincin de Gram permite realizar identificacin bacteriana.La tincin de Gram ofrece la coloracin de las bacterias dependiendo sus caractersticas presentes en la pared celular, en las cuales si es Gram positiva estas se tien del primer colorante (cristal violeta) y al utilizar el mordiente (lugol), se fija a la pared celular, por lo cual al aplicar el decolorante no se pierde el color como sucede en las Gram negativas se tien del colorante de contraste (fucsina), por lo cual al observar en el microscopio se logra definir la morfologa de las bacterias, es decir el tamaa y la forma por lo cual se logra identificar los tipos de bacterias.Para qu se utiliza el aceite de inmersin?El aceite de inmersin para microscopio tiene aproximadamente el mismo ndice de refraccin que el vidrio. Mediante el aceite de inmersin se elimina casi completamente la desviacin de los rayos de luz y se aumenta considerablemente la eficacia de los objetivos de los microscopios.