MICROINJERTACION in vitro DE Erythrina edulis M. FAMILIA...
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MICROINJERTACION in vitro DE Erythrina edulis M. FAMILIA (FABACEAE) ADRIANA PAOLA BONILLA SÁNCHEZ Trabajo de grado presentado a la Facultad de Ciencias Básicas como requisito para optar al titulo de Bióloga Director NEFTALÍ MESA LÓPEZ Mg. en Dirección Universitaria UNIVERSIDAD DEL TOLIMA FACULTAD DE CIENCIAS PROGRAMA DE BIOLOGÍA IBAGUÉ - TOLIMA 2014
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MICROINJERTACION in vitro DE Erythrina edulis M. FAMILIA (FABACEAE)
ADRIANA PAOLA BONILLA SÁNCHEZ
Trabajo de grado presentado a la Facultad de Ciencias Básicas como requisito para optar al titulo de Bióloga
Director NEFTALÍ MESA LÓPEZ
Mg. en Dirección Universitaria
UNIVERSIDAD DEL TOLIMA FACULTAD DE CIENCIAS
PROGRAMA DE BIOLOGÍA IBAGUÉ - TOLIMA
2014
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AGRADECIMIENTOS
A Dios y mi Madre por ser los motores, fortaleza e inspiración de mi vida.
Al Grupo GEBIUT, porque más allá de hacer investigación, fomentan el desarrollo
humano e integral de los estudiantes.
Al profesor Neftalí Mesa, por su guía y acompañamiento en el desarrollo de este
trabajo.
A la profesora Martha Lily Ocampo Guerrero, Diana Carvajal, Diana Beltrán y Nataly
Ruiz, por su apoyo durante la ejecución de este trabajo.
A Gianina Rozo Rey, por ser una amiga y compañera de trabajo incondicional.
Al profesor Jairo Clavijo, por su colaboración en el análisis estadístico de resultados.
Al Comité Central de Investigaciones de la Universidad del Tolima, por la financiación
de este proyecto.
4
CONTENIDO
Pág INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 12
1. OBJETIVOS .................................................................................................. 14
1.1 OBJETIVO GENERAL .................................................................................... 14
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................... 14
2. MARCO TEORICO ........................................................................................ 15
2.1 GÉNERO ERYTHRINA. .................................................................................. 15
2.2 Erythrina edulis Micheli. .................................................................................. 15
2.2.1 Descripción Taxonómica. ............................................................................. 15
2.2.2 Descripción Morfológica. .............................................................................. 16
2.2.3 Distribución Geográfica Y Aspectos Ecológicos De La Especie. .................. 17
2.2.4 Uso E Importancia Económica De Erythrina edulis. ..................................... 18
2.2.5 Propagación De La Especie ......................................................................... 18
2.3. CULTIVO DE TEJIDOS O PROPAGACIÓN in vitro. ...................................... 19
2.3.1 Factores Que Intervienen En La Micropropagación 19
2.3.1.1 El Inoculo o Explante. .............................................................................. 19
2.3.1.2 Factores Físicos ....................................................................................... 19
2.3.1.3 Factores Químicos ................................................................................... 20
2.3.1.4 Principales Reguladores De Crecimiento. ................................................ 20
2.4 ETAPAS DE LA MICROPROPAGACIÓN in vitro. ........................................... 21
2.4.1 Etapa 0 ........................................................................................................ 21
5
2.4.2 Etapa I ......................................................................................................... 21
2.4.3 Etapa II. ....................................................................................................... 24
2.4.4 Etapa III ....................................................................................................... 25
2.4.5 Etapa IV ....................................................................................................... 25
2.5 TÉCNICAS DEL CULTIVO in vitro ................................................................. 25
2.5.1 Propagación A Través Del Rescate De Embriones in vitro.…………………26
2.5.2 Microinjertación. ........................................................................................... 27
2.5.3 Antecedentes En Cultivo in vitro De E. edulis............................................... 28
3. METODOLOGÍA ............................................................................................... 30
3.1 LUGAR DE TRABAJO .................................................................................... 30
3.2 SELECCIÓN DE SEMILLAS ........................................................................... 30
3.3 TRATAMIENTOS DE DESINFECCIÓN PARA SEMILLAS ............................. 31
3.4 EXTRACCIÓN DE EMBRIONES .................................................................... 32
3.5 ETAPA DE MULTIPLICACIÓN in vitro. ........................................................... 32
3.6 MANEJO DE PLANTAS EN INVERNADERO. ................................................ 32
3.7 PROCEDIMIENTO DE INJERTACION. .......................................................... 33
3.7.1 Preparación del injerto. ................................................................................ 33
3.7.2 Microinjertación. ........................................................................................... 33
3.7.2.1 Métodos de incisión .................................................................................. 33
3.7.2.2 Aproximación lateral .................................................................................. 33
3.7.2.3 Púa ........................................................................................................... 33
3.7.2.4 T. invertida ............................................................................................... 34
3.8 EFECTO DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO CON RESPECTO
AL CRECIMIENTO DEL MICROINJERTO. ........................................................... 34
6
3.9 MICROINJERTO A PARTIR DE EXPLANTES ex vitro. .................................. 34
3.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO. ............................................................................ 35
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................... 37
4.1 GERMINACIÓN DE EMBRIONES PARA PRODUCCIÓN DE PORTA-
INJERTOS Y YEMAS VEGETATIVAS ASÉPTICAS. ............................................ 37
4.1.1 Contaminación ............................................................................................. 38
4.1.2 Oxidación. .................................................................................................... 40
4.1.3 Germinación................................................................................................. 41
4.2 ESTABLECIMIENTO DEL MEDIO NUTRITIVO PARA EL RESCATE DE
EMBRIONES in vitro. ............................................................................................ 43
4.3 FASE DE MULTIPLICACIÓN. ......................................................................... 44
4.4 MICROINJERTACIÓN in vitro de Erythrina edulis. .......................................... 45
4.5 EFECTO DEL TIPO DE INCISIÓN EN EL PRENDIMIENTO DE LOS
MICROINJERTOS ................................................................................................ 48
4.6 MICROINJERTOS A PARTIR DE YEMAS AXILARES ex vitro. ..................... 50
5. CONCLUSIONES ............................................................................................. 52
6. RECOMENDACIONES ..................................................................................... 53
REFERENCIAS .................................................................................................... 54
ANEXOS .............................................................................................................. 58
7
LISTA DE FIGURAS
Pág Figura 1. Ilustración de las características morfológicas de E. edulis. .................. 17
Figura 2. Etapas de muestreo: A) árbol de Erythrina edulis en Villarrestrepo,
B) frutos de la especie. ......................................................................................... 30
Figura 3. Tipos de Incisión: A) Aprox. Lateral, B) Púa y C) T. invertida. ............... 34
Figura 4. Embriones extraídos a partir de semillas de chachafruto. ..................... 37
Figura 5. Estimación puntual de proporciones de contaminados en los
tratamientos de desinfección de E. edulis. ............................................................ 38
Figura 6. Estimación puntual de proporciones de oxidados en los tratamientos
de desinfección de E. edulis. ................................................................................ 40
Figura 7. Estimación puntual de proporciones de germinación en los
tratamientos de E. edulis....................................................................................... 41
Figura 8. Desarrollo de (Erythrina edulis) empleando HgCl2 al 0.2% por 20’.
A) embriones a las 3 semanas. B) plántula a las 6 semanas. ............................... 42
Figura 9. Desarrollo de embriones en: A) medio MS + ANA (2 mg/L) y B) MS
(nitratos a la mitad) + ANA (2 mg/L). ..................................................................... 43
Figura 10. Segmentos nodales de E. edulis en medio MS (nitratos a la mitad)
+ ANA + BAP (1:1). ............................................................................................... 44
Figura 11. Estimación puntual de las proporciones analizando la contaminación
y oxidación, en los tres métodos de injertación. .................................................... 46
Figura 12. Microinjerto. A) Contaminación fúngica de los microinjertos
B )procesos necróticos en la unión del injerto a través del método T. invertida..... 47
Figura 13. Estimaciones puntuales de prendimiento en injertos de E. edulis
para tres métodos de microinjertación. ................................................................. 48
Figura 14. Desarrollo del microinjerto: A) y B) formación de callo en la zona
de unión del injerto. C) consolidación de microinjertos a través del
método púa y D) Aprox. Lateral. ........................................................................... 49
Figura 15. Contaminación fúngica a partir de yemas ex vitro, en injertos in vitro. . 50
8
LISTA DE TABLA
Pág. Tabla 1. Tratamientos de desinfección aplicados a las semillas de E. edulis ....... 31
Tabla 2. Modificación de los tratamientos de desinfección empleados en
semillas de E. edulis. ............................................................................................ 31
Tabla 3. Reguladores empleados en la etapa de inducción de brotes de
E. edulis. ............................................................................................................... 32
9
LISTA DE ANEXOS
Pág Anexo A. Número de observaciones total, analizados en el estudio. ............. …..59
Anexo B. Análisis de Comparación de proporciones entre los tratamientos
de desinfección, analizando la variable contaminación. ........................................ 60
Anexo C. Tabla del análisis de comparación de proporciones entre los
tratamientos de desinfección, analizando la variable oxidación. ........................... 60
Anexo D. Análisis de Comparación de proporciones entre los tratamientos
de desinfección, analizando la variable germinación............................................. 61
Anexo E. Estimación del promedio de brotes y prueba de normalidad para
la construcción del intervalo de confianza. ............................................................ 61
Anexo F. Análisis de proporciones comparando los tres métodos de
microinjertación, analizando la variable contaminación. ........................................ 61
Anexo G. Análisis de proporciones comparando los tres métodos de
microinjertación, analizando la variable oxidación. ................................................ 62
Anexo H. Análisis de proporciones comparando los tres métodos de
microinjertación, analizando la variable prendimiento. .......................................... 62
Anexo I. Estimación del promedio de crecimiento y prueba de normalidad,
para la construcción del IC. ................................................................................... 62
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RESUMEN
Erythrina edulis, es considerada una especie promisoria en los sistemas de
alimentación, debido a los valores proteicos atribuidos a sus hojas y semillas. Por lo
que se ha propuesto que la técnica de la microinjertación aporte en la reducción del
periodo vegetativo y producción de la especie.
La asepsia de semillas y el establecimiento de embriones in vitro, consistió en la
inmersión de la semilla en alcohol 70%, durante 15’, seguida de Tween 80% por 15’,
Benlate 1 g/L durante 20’ y HgCl2 (0.2%) por 20’. Se tomaron epicótilos mayores a 3 cm
y como injertos yemas axilares, provenientes de embriones germinados in vitro en
medio MS con nitratos a la mitad + ANA (2 mg/L). Los microinjertos se realizaron a
través de los métodos (Aprox. Lateral, Púa y T. invertida). Estos se mantuvieron en
medio MS nitratos a la mitad + ANA (2 mg/L). Se utilizó un análisis de comparación de
proporciones evaluando la contaminación, oxidación y germinación y para la variable
crecimiento (cm) una estimación de promedio. El establecimiento de los microinjertos
se vio afectado por problemas de contaminación fúngica y microbiana, 8 días después
de la injertación. El método T. invertida presentó los mayores niveles de oxidación. El
prendimiento de los injertos no arrojó diferencias significativas, por lo que no fue
posible concluir si el prendimiento de los injertos estaba influenciado por el tipo de
incisión. Para los métodos (Aprox. Lateral y Púa) se observó un crecimiento promedio
de 2.58 cm, 45 días posteriores a la microinjertación.
Palabras clave: Erythrina edulis, dicloruro de mercurio, microinjerto, métodos de
injertación.
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ABSTRACT
Erythrina edulis, is considered a promising species in food systems because the protein
values attributed to their leaves and seeds. As the proposed technique micrografting
contribution in reducing the growing season and production of the species.
The aseptic seed and establishment of in vitro embryos, consisted of immersing the
seeds in alcohol 70% for 15’, followed by Tween 80 % for 15’, Benlate 1 g/L for 20’ and
HgCl2 (0.2%) for 20’. Epicotyls greater than 3 cm were taken and grafts as axillary buds,
embryos from in vitro germinated on MS medium with half nitrates + ANA (2 mg/L). The
micro grafts were performed by the methods (Approx. Lateral, Spike and T. reversed).
They were kept on MS half nitrates + ANA (2 mg/L). Analysis comparing proportions
evaluating contamination, oxidation and germination and for growth variable (cm) the
estimated average was used. Establishing micrografting was affected by problems of
fungal and microbial contamination, 8 days after grafting. The T. reversed method
showed the highest levels of oxidation. The Taking of the grafts showed no significant
differences, so it was not possible to conclude whether the take of grafts was influenced
by the type of incision. For methods (Approx. Lateral and Spike) an average growth of
2.58 cm, 45 days after the micrografting was observed.
Keywords: Erythrina edulis, mercury dichloride, micrografting, grafting methods.
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INTRODUCCIÓN
Eritrhina edulis o frijol de árbol, es una leguminosa arbórea originaria de América que
crece entre los 1.300 y 2.600 msnm; en Colombia se ha observado en la zona cafetera
en alturas hasta 2.200 y 2.500 msnm. Tradicionalmente el Chachafruto se ha utilizado
como especie de interés alimenticio por el destacado valor nutricional y el tamaño de
sus semillas, las cuales contienen un 25% de proteína.
En el ejercicio de la investigación, la irrupción de la biotecnología agrícola se considera
una herramienta que permite mejorar la calidad, seguridad y sanidad de los productos
agrícolas, genera rendimientos factibles, que propician la búsqueda de una agricultura
con un uso más racional de agroquímicos, así como ayudar de manera sostenible en la
creciente demanda de alimentos.
En la actualidad, el establecimiento y estandarización de protocolos in vitro en
especies alimenticias se considera fundamental para procesos de micropropagación
masiva y para facilitar las técnicas que se emplean en el campo de la biotecnología
vegetal.
En muchos países del mundo, el cultivo in vitro se utiliza para apoyar programas de
mejoramiento genético al mismo tiempo la biotecnología está generando un
extraordinario optimismo respecto a la capacidad del mundo para alimentar a futuras
poblaciones, ya que uno de los mayores logros de esta ciencia es poder obtener
plantas libres de enfermedades, mejora en la adaptación ambiental, entre otras
ventajas.
El objetivo de esta tesis se encaminó a estandarizar un protocolo de desinfección y
establecimiento de una metodología de propagación in vitro en la especie Erythrina
edulis, a través de la técnica de microinjertación in vitro, como alternativa a los métodos
de propagación convencional, con la finalidad de buscar nuevas tecnologías que por su
eficiencia permitan a futuro contribuir a la seguridad alimentaria de la humanidad,
gracias a su establecimiento en bancos de germoplasma.
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Se aplicaron algunos de los métodos de microinjertación propuestos por otros
investigadores, teniendo en cuenta la planta, el tipo de explante y los objetivos
planteados en el presente trabajo.
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1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL
Obtener plántulas de Erythrina edulis M. a través de la técnica de microinjertación in
vitro.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Definir un protocolo para el establecimiento aséptico del porta injerto y yemas
vegetativas a injertar de Erythrina edulis M. in vitro.
Evaluar la respuesta del microinjerto con respecto al uso de reguladores de
crecimiento en el medio de cultivo.
Determinar si el establecimiento del microinjerto está influenciado por el tipo de
incisión del injerto, considerados: métodos de Aproximación lateral, Púa y T invertida.
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2. MARCO TEORICO 2.1 GÉNERO ERYTHRINA.
El género Erythrina proviene del griego erythros (que significa rojo) por el color de sus
flores. Considerándose un género pantropical, muchas de sus especies son usadas en
diferentes países, donde crece bajo distintas condiciones de clima y suelo, llegando
hasta los 2.000 msnm (Krukoff, 1976).
Las especies de Erythrina generalmente son árboles o arbustos deciduos, con hojas
trifoliadas, alternas y con estipulas glanduliformes. Sus flores tienen cáliz acampanado,
oblicuamente trunco o bilabiado; con sus pétalos libres o adheridos por el dorso. El
fruto es una legumbre estipitada, bivalvada con semillas ovaladas o reniformes. Tienen
un rápido crecimiento y producción de abundante biomasa, aportan nutrientes al suelo,
enriqueciéndolo y protegiéndolo contra escorrentía (Jiménez, 1990).
2.2 Erythrina edulis Micheli.
2.2.1 Descripción Taxonómica. Clasificación taxonómica basada en el Sistema de
Información de Biodiversidad (SIB) y el Catálogo de la Biodiversidad de Colombia. Reino: Plantae División: Magnoliophyta Clase: Magnoliopsida Orden: Fabales Familia: Fabaceae Subfamilia: Faboideae Género: Erythrina Especie: Erythrina edulis Micheli Autor epíteto específico
Nombre común: Balú, Baluy, Calú, Chacha fruto, Chachafruto, Chaporuto, Fríjol nopaz,
Nopo, Nupo, Poroto, Poruto, Sachafruto.
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2.2.2 Descripción Morfológica. Erythrina edulis, es una leguminosa arbórea nativa de
los Andes Suramericanos, en la cual los arboles alcanzan una altura promedio de 8 a
12 m de altura, con un diámetro de copa de hasta 7 metros (Figura 1).
Su Tronco en árboles adultos mide 69 cm de diámetro, y en su etapa juvenil posee
aguijones cortos, copa redondeada y follaje verde oscuro. Factores como la falta de
dureza y susceptibilidad a la pudrición al hacer contacto con el suelo, hacen que su
madera no sea recomendada para construcción (Esquivel, 2009).
Las Hojas miden 30 cm de largo por 20 cm de ancho, son compuestas, alternas,
glabras, coriáceas, trifolioladas con forma triangular, están dispuestas en forma de
hélices, terminan en punta aguda, tienen glándulas en la base de sus pecíolos y su
borde es entero; presentan estípulas libres.
Las Flores son de color naranja, zigomorfas, y están conformadas por cuatro pétalos
que en conjunto parecen una mariposa o un pajarito con sus las abiertas y están
congregadas en inflorescencias en forma de racimos cónicos y densos.
El Fruto es una vaina alongada de color verde, que mide entre los 10 y los 30 cm de
largo, pendular y contiene numerosas semillas.
Las Semillas son de color café rojizo, miden 3.5 cm de largo, con forma de riñón y sus
cotiledones tienen consistencia carnosa.
El embrión de la semilla es pequeño, en relación con el gran tamaño de los
cotiledones. (Barrera, 1998).
Fenología: este árbol florece de noviembre a abril y fructifica de marzo a agoto,
perdiendo parcialmente su follaje al final de la floración (Esquivel, 2009).
18
2.2.4 Uso E Importancia Económica De Erythrina edulis. La producción de frutos en
árboles de chachafruto comienza a partir los 3 años de edad, estabilizando su
productividad a los seis años. Se conoce árboles de más de 20 años que producen un
promedio de 170 kg de frutos/árbol/año y es utilizado como fuente de alimento humano
y animal ya que sus frutos tienen un alto valor nutritivo (23% de proteína), superior al
de otras leguminosas como el frijol, la arveja y el haba. Además, sus semillas poseen
aminoácidos esenciales similares al huevo de gallina y se considera un alimento
completo cuando se mezcla con el maíz (Barrera, 1998; Barrera & Mejía, 1999).
Las hojas y ramas tiernas se ofrecen como alimento forrajero a las cabras, caballos,
cerdos y conejos, pues contienen un 24% de proteína, 29% de fibra cruda (en peso
seco) y un 21% de hidratos de carbono. Además son ricas en potasio pero pobres en
calcio (Surco, 1987). Las vainas contienen 21% de proteína, 23% de fibra cruda (en
peso seco), 24% de hidratos de carbono y 91% de humedad. La semilla cocinada
puede reemplazar en un 60% el alimento concentrado para pollos y ganado vacuno
(Martín & Falla, 1991).
2.2.5 Propagación De La Especie. Erythrina edulis, posee una gran capacidad para
multiplicarse, tanto por semilla sexual como por estaca. Según Barrera (1989), el
porcentaje de germinación de las semillas sexuales es de un 90%, si se siembra en los
primeros 15 días, después de cosechadas las semillas.
Propagación por métodos convencionales de semillas y estacas: Por semilla: se recolectan las vainas que estén maduras. Se dejan secar a la sombra
de forma natural, las vainas se abren, y se dejan caer las semillas que tienen
coloración marrón. Se siembran de 2 a 3 semillas en siembra directa, a unos 3 cm de
profundidad. A los 10 días brota la plántula que alcanza unos 6 cm, y a los 6 meses su
altura llega a los 0.50 m.
Por estaca: deben cortarse luego de que el árbol ha producido frutos. Deben provenir
de árboles sanos y bien formados. Las estacas deben ser maduras y se cortan en la
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parte media de ramas color café-verdoso, teniendo al menos de 2-4 cm de diámetro por
2 cm de longitud. Con este sistema de propagación, la primera brotación aparece
aproximadamente a los 45 días de ser sembrado (Aguirre, 1996).
2.3. CULTIVO DE TEJIDOS O PROPAGACIÓN in vitro.
Consiste en la multiplicación masiva de un explante con potencial de diferenciarse en
condiciones favorables (balance hormonal apropiado y ambiente fisicoquímico
controlado). Los individuos descendientes de una planta madre propagada in vitro son
clones, es decir son copias genéticamente idénticas entre ellas e idénticas a la planta
madre, exceptuando las plantas propagadas por semillas (Abdelnour & Escalant, 1994).
2.3.1 Factores Que Intervienen En La Micropropagación según Abdelnour & Escalant,
(1994).
2.3.1.1 El Inoculo O Explante. Es el órgano, tejido o fragmento de tejido, células, etc.,
extraído del material parental para iniciar el cultivo in vitro. Elegir el explante
adecuadamente es el primer paso para el establecimiento de los cultivo, y varía según
el objetivo que se desee alcanzar. Es importante considerar factores como el genotipo,
edad de la planta y su estado fisiológico.
2.3.1.2 Factores Físicos.
pH: el grado de acidez o alcalinidad (pH) del medio de cultivo es importante y
específico para cada tipo de plantas, al igual que ocurre en el suelo, por lo que se debe
ajustar a los requerimientos de la especie en estudio.
La humedad: en condiciones in vitro la humedad dentro de los recipientes es casi
100%. Debido a esto la planta in vitro generalmente no desarrolla adecuados sistemas
de regulación hídrica tales como cera, estomas, cutículas, etc.
20
La luz: en condiciones in vitro clásicas, la calidad e intensidad de la luz es muy bajo (10
w/m2) ya que en condiciones naturales la luz puede llegar hasta los 900w/m2). Dos
fenómenos importantes dependientes de luz son: la fotosíntesis y la fotomorfogénesis.
3.3.1.3 Factores Químicos.
Medio de cultivo: conjunto de elementos abióticos que integran la sustancia nutritiva de
diversa consistencia (solida a liquida), suministrando anclaje, nutrición y la estimulación
del desarrollo al explante. Un medio de cultivo en forma general está compuesto de:
Sales minerales: sales encargadas de dar el soporte nutritivo de las plántulas. Las
sales contienen macronutrientes (N, K, P, Ca, Mg, S) y micronutrientes (Fe, Mn, Cu,
Zn, Mo, B), requeridos por la planta para su desarrollo normal.
Fuentes de energía: son sustancias orgánicas como los azucares que proveen tres de
los elementos mayores esenciales: hidrogeno (H), carbono (C) y oxigeno (O).
Agentes solidificantes: estas sustancias crean un medio de soporte de los tejidos u
órganos que vamos a sembrar, reemplazando el sustrato natural (suelo), las más
empleadas son los agares. Reguladores de crecimiento: la adición de estas fitohormonas al medio en diferentes
proporciones, estimula o detiene el crecimiento o diferenciación de algunos órganos en
la planta. Permiten manipular algunos procesos morfogenéticos de la misma.
2.3.1.4 Principales Reguladores De Crecimiento.
Auxinas: sustancias químicas que tienen en común la capacidad de regular el
crecimiento, la división celular y la diferenciación de raíces en los cultivos in vitro. Las
auxinas más utilizadas son el AIA (ácido indol-3-acético), el ANA (ácido α-
naftalenacético), el 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético), el AIB (ácido indolbutírico).
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Citoquininas: Son derivados de la adenina que promueven la división celular. Entre
ellas se destacan las siguientes: BA (bencil adenina), K (cinetina o 6-furfuril
aminopurina), Zea (zeatina) y 2-iP (N-isopentenil adenina). Las dos primeras son
citocininas sintéticas y las dos últimas naturales. La inclusión de citoquininas en el
medio de cultivo permite formar callos en varias especies vegetales, aunque
principalmente induce que regiones meristemáticas multicelulares se diferencien en
estructuras organizadas.
Giberelinas (GA3): regulan varios procesos del crecimiento y desarrollo como la
germinación de semillas, la elongación de tallos, el desarrollo de raíces y la floración.
Permiten superar la latencia de semillas y brotes, promueven la floración y retardan la
senescencia.
2.4 ETAPAS DE LA MICROPROPAGACIÓN in vitro.
Cuando se realiza la multiplicación de plantas, aplicando técnicas de cultivo aséptico es
fundamental considerar una serie de etapas, establecidas por (Murashige, 1974), las
cuales clasifico de la siguiente manera:
2.4.1 Etapa 0: Etapa inicial, que comprende la selección de la planta madre y la
selección de una modalidad de pretratamiento.
2.4.2 Etapa I: Es la etapa de iniciación, en la que se establece el cultivo primario.
Requiere que los explantes se transfieran al medio de cultivo de forma aséptica,
incluyendo la desinfección previa tanto del explante como del medio. Esta fase se
considerara superada si los inóculos (explantes) sobreviven sin contaminación fúngica,
ni bacteriana y se desarrollan adecuadamente (Sierra De Grado, 2003).
A continuación se describen algunas de los métodos de desinfección más utilizados en
el cultivo in vitro:
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Métodos de desinfección. La importancia de emplear métodos de desinfección
superficial de los explantes elegidos para micropropagar, además de los elementos de
trabajo como la cámara de flujo laminar, cuartos de procedimientos, la esterilización del
medio de cultivo, es fundamental en la propagación in vitro, teniendo en cuenta que el
medio de cultivo y el ambiente controlado genera también las condiciones ideales para
el crecimiento y proliferación de microorganismos contaminantes (Abdelnour &
Escalant, 1994).
Material vegetal: la desinfección superficial del explante debe eliminar los
microorganismos pero a la vez debe causarle el menor daño posible. Lizárraga et al.,
(1991), señala que dentro de los agentes desinfectantes más recomendados y usados
se encuentran:
El hipoclorito de sodio (Cloro comercial del 2 al 5%): estos productos
comerciales contienen normalmente 5,25% NaClO como producto activo. Al ser
diluido en agua la solución esterilizadora resultante deberá contener no menos
de 0.5 hipoclorito de sodio.
El Hipoclorito de Calcio (del 6 al 12%): la superficie de material vegetal puede
también ser esterilizada con soluciones acuosas a partir de (Ca [OCl]). Esta sal
es la más preferida por ser menos fitotóxica.
Etanol generalmente al (70%): el alcohol es una gente esterilizador común de
superficie para eliminar bacterias y hongos. Tiene una baja tensión superficial,
penetrando fácilmente en las pilosidades foliares mojando la superficie de la
planta.
Bicloruro de mercurio: el (HgCl2) ha sido utilizado como desinfectante pese a que
es altamente tóxico. La solución con bicloruro de mercurio es volátil a
temperatura ambiente, por lo cual es pertinente su uso en cámara de flujo
laminar, con la protección adecuada.
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En algunos casos resulta útil agregar algún agente tensoactivo o detergente (2 a 4
gotas de Tween-20) para romper la tensión superficial y permitir un mayor contacto del
explante con el químico. También se hace uso de antibióticos, aunque su empleo se
justifica en casos de excepción y en cultivos de corta duración ya que estos pueden
influir negativamente en procesos del cultivo (Roca & Mroginski, 1991). No se puede
garantizar sobre el tipo de desinfectante o la concentración de este a utilizar, ya que
cada especie y tipo de explante es un caso particular lo que resalta la importancia de
experimentar con diferentes métodos.
El medio de cultivo: generalmente los medios de cultivo se esterilizan en autoclave a
una presión de 115 lb. (121°C) durante 20 minutos o más, dependiendo del volumen de
medio.
La cristalería: su limpieza es de vital importancia en el trabajo de cultivo in vitro. Este
material debe lavarse con detergentes que se eliminen fácilmente con agua, y nunca se
debe utilizar jabón (Roca & Mroginski, 1991). También existen soluciones inorgánicas
para el lavado.
Instrumentos de trabajo: para esterilizar elementos metálicos como pinzas, bisturíes,
tijeras. etc. generalmente se utiliza la técnica de flameo previa inmersión en alcohol de
95°. Además cuando se utilicen cajas de Petri o papel, estos se esterilizaran haciendo
uso del autoclave.
El área de trabajo: la contaminación en estas áreas generalmente se da por esporas de
hongos y bacterias que habitan en el ambiente, por lo que se hace necesario limpiar las
paredes y mesas con desinfectantes y trabajar en lo posible durante períodos cortos de
tiempo (Roca & Mroginski, 1991). El investigador: suele ser una fuente primaria de contaminación, por lo que es
necesaria una adecuada limpieza de las manos y los brazos antes de iniciar la sesión
de trabajo. Para reducir la contaminación también se debe usar batas de laboratorio,
guantes limpios, y protección de cabello, boca y nariz.
24
Esterilización: La eficacia en el proceso de esterilización en cualquier preparación está
sujeta a factores como: la naturaleza de la sustancia que se esteriliza, el volumen
contenido en cada unidad, el tamaño del recipiente y el número de unidades que se
pueden manejar en una sola operación (Roca & Mroginski, 1991). Por lo cual no hay
una metodología especifica al momento de realizar la esterilización.
Sin embargo en los procesos de esterilización el calor es uno de los agentes que se
utiliza con más frecuencia. Empleándose de las siguientes maneras:
contacto directo con la llama. calor húmedo (vapor). calor seco (aire caliente). agua caliente (no hirviendo).
En la actualidad uno de los métodos más empleados en el laboratorio es el vapor bajo
presión o (autoclave). Es muy eficiente para esterilizar diferentes materiales incluyendo
los medios de cultivo (siempre y cuando no tenga componentes termolábiles), ya que
destruye todas las formas de bacterias, hongos y sus esporas. La autoclave más
utilizada es la contraparte de mayor tamaño de la olla de presión común. La
temperatura dentro de la autoclave se regula mediante la presión y es directamente
proporcional a ésta; la presión se observa en un manómetro que forma parte de la
autoclave. Con respecto al tiempo de exposición requerido dependerá tanto del tipo de
material que se va a usar como su cantidad.
Con respecto a la esterilización de material proveniente del cultivo de tejidos, se suele
manejar una presión de 15 lb durante 20 minutos (T° vapor aprox. 121°C) suficiente
para matar todas las formas de vida en cinco minutos. Si se desea que la esterilización
sea completa, el calor debe penetrar en cada porción del material; finalmente ninguna
sustancia es estéril si queda en ella un organismo viable.
25
2.4.3 Etapa II: Etapa de la multiplicación o proliferación. Se busca la multiplicación de
propágalos de gran número, que den lugar a nuevas plantas. La duración de esta etapa
depende de la especie (Sierra De Grado, 2003).
Subcultivo: a medida que el explante comienza a crecer y multiplicarse es
subdividido y cada nuevo propágulo es cultivado individualmente en un nuevo
medio de cultivo (Rojas et al., 2004), una vez se multiplique y crezca, será
subdividido nuevamente.
La regeneración del explante depende de muchos factores como el medio de
cultivo, el ambiente de incubación, el genotipo y su origen. Según Simón Martínez & Moysset Agustí (2006), en la etapa de multiplicación, las
citoquininas per se o reguladores de tipo auxínico inducen la formación y brotación de
yemas adventícias y axilares. Por lo que unan relación citoquininas/auxinas elevada
actuaría en la formación del brote y por el contrario una elevada relación
auxinas/citoquininas favorecería la diferenciación de raíces. Lo anterior no implica que
ambas hormonas deban encontrarse en el medio ya que los requerimientos exógenos
de estos reguladores, dependen de los niveles en endógenos de la planta; pues en
ciertos casos, la adición de citoquininas al medio nutritivo estimula la multiplicación
(brotación de yemas axilares y adventicias). A partir de 4 a 8 semanas, el explane
original generara numerosos brotes, los cuales pueden aislarse de forma individual o
en pequeños grupos y transferirse a un medio de multiplicación fresco. De esto modo
se iniciara otro ciclo de multiplicación y en un tiempo relativamente corto, podrá
obtenerse un número elevado de brotes.
26
2.4.4 Etapa III: se refiere al enraizamiento o etapa de pretransplante; su finalidad es
producir una planta autotrófica que sea capaz de sobrevivir en las condiciones de
trasplante al suelo (Roca & Mroginski, 1991).
2.4.5 Etapa IV: Transferencia final a la etapa de medio ambiente o aclimatización
2.5 TÉCNICAS DEL CULTIVO in vitro
El cultivo de tejidos vegetales in vitro comprende un grupo de técnicas heterogéneas,
que el operario debe conocer, con la finalidad de resolver numerosos problemas en la
multiplicación de las plantas, entre los cuales se cuentan la micropropagación masiva
de plantas elites, la limpieza de material libre de virus y otros patógenos, el rescate de
especies en peligro de extinción, la propagación de especies con problemas en la
viabilidad de las semillas, la conservación del germoplasma de plantas de interés
comercial y la posibilidad de establecer programas de mejoramiento genético más
rápidos que en los cultivos tradicionales, por técnicas biotecnológicas e ingeniería
genética (Alfaro, 2004).
3.5.1 Propagación a través del rescate de embriones in vitro. El cultivo de embriones
consiste en el aislamiento y crecimiento in vitro, en condiciones estériles de un embrión
inmaduro, con el objetivo de obtener una planta viable.
Pierik (1990), Señala dos tipos de cultivo de embriones:
1. Cultivo de embriones inmaduros: se origina en semillas no acabadas de
madurar. Este tipo de cultivo se emplea para evitar la muerte prematura del embrión,
con el fin de obtener una planta viable. El éxito en este tipo de cultivo depende en gran
parte del desarrollo del embrión en el momento de su extracción, por lo que se requiere
un medio de cultivo complejo y habilidades en el momento de la disección.
27
2. Cultivo de embriones maduros: aplica para semillas maduras, y se desarrolla
sobre todo para superar problemas de germinación de las semillas. En este caso suele
emplearse medios de cultivo simple, suplementados con agar, azúcar y minerales.
Las principales ventajas que se obtienen al cultivar embriones son:
- Prevención del aborto embrionario. - acorta el ciclo de germinación. - Elimina la inhibición de la germinación de las semillas. - Los embriones se utilizan como material inicial para la propagación vegetativa.
Sin embargo, se deben considerar factores adversos que disminuyen la viabilidad de
los embriones como:
- Pérdidas causadas por infección - Daños en los embriones - Interrupción del desarrollo embrionario.
2.5.2 Microinjertación. El método de la microinjertación tiene como finalidad el
acoplamiento de tejidos a partir de dos individuos, generando un crecimiento como
resultado de la unión. Así la planta mejorara problemas asociados con juvenilidad,
oxidación, perdida de estabilidad genética y resistencia a enfermedades con patrones
resistentes (Criollo, 2008).
El procedimiento estándar para la mayoría de los laboratorios consiste en los siguientes
pasos: 1.Preparación del portainjerto, 2. Preparación de la copa, 3. Injerto in vitro y 4.
Crecimiento de las plantas injertadas in vitro. Sin embargo Criollo (2008), considera
que el éxito de la injertación se refleja en el prendimiento o la unión que se produce
entre el ápice y el portainjerto, determinada por la compatibilidad dada entre las dos
partes. El parámetro de compatibilidad es decisivo pues si las dos especies no tienen
un parentesco genético, muy difícilmente puede ocurrir una unión y un crecimiento
normal del injerto.
El principal enfoque de esta técnica es el de obtener plantas limpias, eliminando la
contaminación causada por virus, así Navarro (1979), emplea la técnica de microinjerto
28
de ápices caulinares in vitro, a fin de obtener plantas de agrarios libres de virus. Una
variante de la microinjertación podría permitir la obtención de plantas injertadas en
mayor volumen, que con los métodos convencionales.
En Pinus radiata D., se ha empleado esta técnica injertando braquiblastos de seis años
de edad sobre portainjertos de la misma especie, con el objetivo de reactivar el
material adulto élite de pino (Materán et al., 2008). De igual manera, la microinjertación
ha sido realizada en cacao (Theoroma cacao L.) utilizando como patrones plántulas y
como injertos embriones somáticos. En este estudio, los resultados prueban la
confiabilidad de este método para regenerar plantas de cacao (Aguilar, 1990; Aguilar
et al., 1992).
Respecto a los factores que intervienen en la microinjertación, Criollo (2008) hace
referencia a Navarro et al., (1975), quien señala que el porcentaje de microinjertos
exitosos se ve influenciado por una serie de factores como lo son: el efecto de la luz en
la germinación de la semilla, la edad de la plántula al realizar el microinjerto y la
especie utilizada como patrón. De igual manera estos autores consideran fundamental
analizar el tamaño del ápice antes de injertar. Actualmente, para lograr la asepsia de
virus en cítricos, se recomienda injertar un ápice caulinar compuesto por un el
meristemo apical con tres primordios foliares (0,1 – 0,2 mm). Respecto a la posición del
injerto, Navarro et al., (1975) lograron mejores resultados al colocar el ápice sobre el
anillo vascular en la superficie del corte de epicótilo o en una incisión tipo T invertida,
en la zona decapitada del epicótilo.
2.5.3 Antecedentes En Cultivo in vitro De E. edulis. En las técnicas de cultivo in vitro, la
principal limitación que suele presentarse, es la contaminación de los cultivos por
microorganismos. Por lo anterior, Valdieri citado por Acosta & Zamora (2004), afirma
que la propagación de chachafruto a través de semillas, es imposible por el alto
porcentaje de contaminación bacteriana. Sin embargo actualmente se hace uso de un
gran número de desinfectantes de alto espectro bacteriano y fúngico, que permiten
alcanzar en la mayoría de los casos el éxito en la propagación in vitro.
29
En el año 1994, M. C. Vieites, Jaramillo, & Cancino, adaptaron los sistema de cultivo 'in
vitro' enfocados en micropropagar los tejidos vegetales de Erythrina edulis. Así,
formularon un protocolo general para la micropropagación y endurecimiento de plantas
obtenidas 'in vitro' a partir de material juvenil germinado en el invernadero. El
establecimiento de los cultivos a partir del explante yemas apicales, se logró
empleando el medio Murashige & Skoog (MS 1962) con los macro y micronutrientes
completos, sin adición de reguladores de crecimiento, agregando como suplemento
orgánico glicina (2mg/L), agar (6.5%) como agente solidificarte del medio y sacarosa al
3%. Una vez establecidas y elongadas las yemas apicales, se tomaron segmentos
nodales para iniciar la etapa de multiplicación.
Un nuevo ensayo realizado en el 2004, por M. Acosta, & Zamora establece un
protocolo de desinfección para Erythrina edulis Triana, usando Hipoclorito al 5.5%, y
Cloranfenicol 1250 mg/L en el explante embrión, obteniendo una germinación del 100%
en medio MS ½ enriquecido con vitaminas y ácido naftalenacético (ANA) 2.0 mg/L,
tomaron hojas de 2 cm retirando su epidermis, realizándoles cortes de 2 mm; aislando
los protoplastos con el uso de un protocolo de digestión enzimática de la pared celular
para evitar la plasmólisis.
30
3. METODOLOGÍA
3.1 LUGAR DE TRABAJO.
La presente investigación se desarrolló en las instalaciones del Laboratorio de
Protección de Plantas y Cultivo de Tejidos Vegetales de la Universidad del Tolima,
entre los meses de marzo y diciembre.
3.2 SELECCIÓN DE SEMILLAS.
Esquivel (2009), reporta un bajo número de ejemplares en Ibagué, confirmando su
presencia en solares de casas aledañas del Cañón del Rio Combeima. La recolecta de
semillas se realizó en dos puntos de muestreo (área poblada Pico de Oro y el
corregimiento de Villarestrepo), ubicados en la Zona rural del Cañón del Combeima a
una altura aproxima de 1600 msnm. De los árboles selectos, se tomaron las vainas o
legumbres cerradas, de coloración verde intensa con características fitosanitarias
idóneas, como ausencia de daños mecánicos o de insectos y sin afectación externa por
hongos o bacterias (Figura 2).
Figura 2. Etapas de muestreo: A) árbol de Erythrina edulis en Villarrestrepo, B) frutos de la especie.
Fuente: el Autor
A B
31
3.3 TRATAMIENTOS DE DESINFECCIÓN PARA SEMILLAS.
Las legumbres fueron llevadas al laboratorio de Protección de Plantas, donde se les
realizó un lavado con agua corriente para retirar cualquier partícula, seguido de una
limpieza superficial con Hipoclorito de Sodio al 5.25%. Luego de la desinfección de las
vainas se tomaron las semillas, las cuáles fueron sometidas a diferentes protocolos de
desinfección, como se registra en las Tablas (1 y 2) realizando tres lavados sucesivos
con agua destilada estéril, después de la inmersión en cada uno de los agentes
desinfectantes.
Tabla 1. Tratamientos de desinfección aplicados a las semillas de E. edulis
Tratamiento Benlate 1 g/L
Tween 80%
Etanol 70%
NaClO 5. 25%
Cloranfenicol 1.250 mg/L Tetraciclina
1 20’ 10’ 5’ 5’ 20’
2 20’ 10’ 5’ 10’ 20’ 3 20’ 10’ 5’ 15’ 20’ 4 20’ 10’ 5’ 20’ 20’ 5 20’ 10’ 5’ 30’ 20’ 6 20’ 10’ 5’ 20’ 20’ 7 20’ 10’ 5’ 20’ 20´ *
8 20’ 10’ 5’ 20’ 20´ ** 7) * Inmersión de embriones en Sol. 10% de Cloranfenicol. 8) ** Medio de cultivo suplementado con 50 mg de Cloranfenicol. Tabla 2. Modificación de los tratamientos de desinfección empleados en semillas de E. edulis.
Tratamientos Etanol 70%
Tween 80%
Benlate 1 g/L
HgCl2 PPM 0.2 % 0.2 % 0.3%
9
5’ 15’ 20’
10’
10 20’ 11 20’ 12 20’** 13 6 H 14 14 H
12) ** Medio de cultivo suplementado con PPM (2 ml/L)
32
3.4 EXTRACCIÓN DE EMBRIONES.
De las semillas desinfectadas se aislaron los embriones intactos, los cuales se
inocularon en dos medios de cultivo suplementados con vitaminas y reguladores de
crecimiento, con pH ajustado a 5.8 para la obtención de vitroplantas, así:
Medio básico Murashige & Skoog (MS) + ANA (2 mg/L). Medio básico (MS) con nitratos a la mitad + ANA (2 mg/L).
Los embriones fueron incubados en oscuridad por un periodo de 10 días,
posteriormente bajo fotoperiodo de 12 horas luz (lámparas fluorescentes de 1000 lux),
a una temperatura de 23-25°C.
3.5 ETAPA DE MULTIPLICACIÓN in vitro.
Se tomaron vitroplantas de 7 meses de edad, a partir de las cuales se aislaron
segmentos nodales (brote de tallo con una yema axilar), inoculándolos en un medio MS
(nitratos a la mitad), con reguladores de crecimiento vegetal (Tabla. 3) citoquinina: 6-
Bencilaminopurina (BAP), más auxina: Ácido naftalenacético (ANA).
Tabla 3. Reguladores empleados en la etapa de inducción de brotes de E edulis.
Tratamientos
ANA mg/l
BAP mg/l
Número de explantes
1 1 1 12 Fuente: el Autor 3.6 MANEJO DE PLANTAS EN INVERNADERO. Las plantas madre, donantes de yemas vegetativas ex vitro (explantes para la
microinjertación in vitro), fueron tratadas con riego manual tres veces por semana. Y
para el control de las condiciones fitosanitarias se efectuó una aspersión foliar con
(Benlate® 2 g/L) como fungicida sistémico y (Lorsban 2.5% DP), como insecticida de
contacto. Alternando el producto tanto en la fertilización como en el control fitosanitario,
33
así como la aplicación de un fungicida sistémico tres días antes de la colecta de los
explantes.
3.7 PROCEDIMIENTO DE INJERTACIÓN. 3.7.1 Preparación Del Injerto. Yemas axilares de aproximadamente 2 mm de longitud
fueron utilizadas como injerto. Estas fueron tomadas a partir de plantas madre
producidas in vitro de seis meses de edad. Con el fin de garantizar la asepsia en el
momento de realizar el injerto.
3.7.2 Microinjertación. En el procedimiento se usaron vitroplantas de 3 meses de edad,
las cuales se podaron en su parte apical dejando una porción del epicótilo de 3-4 cm;
eliminando sus yemas axilares y una porción del ápice de la raíz dejando un trozo de 2-
3 cm.
4.7.2.1 Métodos De Incisión:
3.7.2.2 Aproximación Lateral: a las yemas vegetativas asépticas “injerto”, se les realizó
un corte en forma de bisel en la parte basal, la cual entró en contacto con la zona
vascular de la plántula podada, la cual también presentaba una incisión en bisel (Figura
3.A).
3.7.2.3 Púa: a partir de plántulas in vitro, se tomaron yemas vegetativas de 2 a 3 cm de
longitud realizándoles un corte en forma de “v” invertida en la parte terminal; por otro
lado a los portainjertos se les eliminó las hojas y luego en la porción basal del mismo se
realizaron dos cortes en forma de “v” invertida para formar una cuña, que luego fue
insertada dentro de la hendidura del cubreinjerto (Figura 3.B).
En los dos métodos previamente descritos, el contacto entre el injerto y portainjerto, se
mantuvo utilizando anillos de silicona estériles.
34
3.7.2.4 T. Invertida: luego de extraer las yemas vegetativas, se le depositó dentro del
corte (1x2mm) hecho, como su nombre lo dice, en forma de t invertida en la parte
superior del patrón, abrazando las yemas con los tejidos al lado y lado de la incisión
(Figura 3.C).
Figura 3. Tipos de incisión: A) Aprox. Lateral, B) Púa y C) T. invertida.
Fuente: el Autor 3.8 EFECTO DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO CON RESPECTO AL
CRECIMIENTO DEL MICROINJERTO.
Los microinjertos fueron cultivados en medio Murashige y Skoog (MS) (nitratos a la
mitad) suplementado con 2 mg/L de ANA, con el fin de observar el desarrollo de las
yemas injertadas sobre el patrón. 3.9 MICROINJERTO A PARTIR DE EXPLANTES ex vitro.
A partir de plantas madres germinadas en invernadero, se tomaron ápices caulinares
con yemas axilares desarrolladas, se sometieron a un protocolo de antisepsia, que
consistió en un enjuague con agua destilada más Tween 80 por 15’, inmersión en
etanol 70% durante 10’, inmersión en una solución de Benlate 2 g/L durante 10’, y
posteriormente se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) al 2%
durante 10’. Finalmente los ápices se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril,
y se colectaron en un recipiente que también contenía agua destilad estéril.
A B C
35
Como portainjertos se utilizaron microtallos, mayores a 3 cm de longitud, provenientes
de vitroplantas de chachafruto. Todos los cultivos se colocaron en un cuarto de
crecimiento con un fotoperiodo de 12 horas luz oscuridad y temperatura de 23°C–24°C.
Una semana después se evaluó el porcentaje de contaminación, oxidación y
prendimiento; a las cuatro semanas el crecimiento de los microinjertos.
3.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
Se utilizaron 12 explantes por tratamiento, sin embargo en algunos ensayos se optó por
aumentar el número de observaciones (Anexo A). En los ensayos de desinfección,
control de oxidación y germinación evaluando variables de tipo categóricas como:
contaminación, oxidación y desarrollo, se realizó un análisis de estimación de
proporciones, para la comparación de los tratamientos.
Este análisis se hace usualmente bajo el supuesto de que el tamaño de las muestras
permite utilizar aproximación normal en la prueba. Ya que el tamaño de la muestra es
pequeño, se hace necesario aplicar un método especial de estimación de proporciones
(Blyth & Hutchinson) para construir el Intervalo de confianza del 95% mediante la
siguiente formula:
Esta fórmula, no depende explícitamente del tamaño de muestra; siendo ejecutada
mediante el uso de la calculadora on line www.statpages.org y hojas de cálculo de
Microsoft Excel del paquete de office 2013.
36
La viabilidad de la microinjertación in vitro, a través de los tres métodos (púa, incisión
lateral y T invertida), se midió sobre las variables categóricas Contaminación,
Oxidación y Prendimiento (adhesión y formación de callo), a través de la comparación
de proporciones de éxito en cada uno de los tratamientos.
Las respuestas de tipo cuantitativas como: número de brotes y magnitud del
crecimiento (cm), se evaluaron mediante la estimación de los respectivos promedios,
con un nivel de confianza del 95%, y la construcción de los respectivos intervalos de
confianza haciendo uso del programa estadístico InFostat versión 2013.
37
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En esta investigación se evaluaron las condiciones de cultivo, la edad de los porta-
injertos, el tipo de injerto y la respuesta del injerto al medio de cultivo. Se observaron
los resultados utilizando, injertos de tres semanas de edad, con porta-injertos de dos
meses de cultivo.
4.1 GERMINACIÓN DE EMBRIONES PARA PRODUCCIÓN DE PORTA-INJERTOS Y YEMAS VEGETATIVAS ASÉPTICAS.
Los tratamientos de desinfección aplicados en este estudio se desarrollaron con el
explante semillas, de las cuales se extrajo el embrión (Figura 4), por lo que él % de
contaminación, oxidación y germinación se evaluó, teniendo en cuenta el desarrollo de
los embriones.
Figura 4. Embriones extraídos a partir de semillas de chachafruto.
Fuente: el Autor
38
4.1.1 Contaminación: En la evaluación de la contaminación, se observó que en el
explante embrión, los tratamientos de menor efectividad para controlar la
contaminación fueron aquellos en los que se empleó NaClO en concentración 5.25%,
generando la perdida de material entre un (75 y 100%), por contaminación de tipo
bacteriano. De igual modo, Acosta & Zamora (2004), describen la presencia de un
bacilo Gram - formador de colonias de color amarillo en embriones cultivados in vitro
de E. edulis.
Figura 5. Estimación puntual de proporciones de contaminados en los tratamientos de desinfección de E. edulis.
Fuente: el Autor
En la (Figura 5) las estimaciones puntuales para las proporciones de contaminados,
refleja que a partir del tratamiento 9 con una estimación puntual de 0.75 (o 75% de
contaminación), la desinfección de los embriones con Hipoclorito de Sodio resulto
negativa o en otras palabras “se contaminó”. De igual modo se descartan los
tratamientos con estimación puntual igual a 1 (100% contaminación) (T1, T6, T7 T13 y
T14) puesto que no presentaron significancia estadística, siendo poco efectivos para
impedir la acción bactericida.
De acuerdo con las pruebas estadísticas de comparación de proporciones entre todos
los tratamientos de desinfección evaluando la variable respuesta “contaminación”, con
un 95% de confiabilidad se observa que los tratamientos más efectivos son los
0,14
0,37
0,46
0,75 0,83 0,83
0,9 0,91 0,92 1 1 1 1 1
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
10 12 11 9 3 5 4 2 8 1 6 7 13 14
CO
NTA
MIN
AC
IÓN
TRATAMIENTOS
39
tratamientos 10, 11 y 12 ya que estos difieren significativamente de los demás (Anexo
B), demostrando la efectividad del dicloruro de mercurio, para controlar la
contaminación bacteriana. Ya que estos tratamientos no difieren entre sí, se considera
al T10 (HgCl2 0.2% por 20'), como el más sobresaliente, con una estimación puntual de
(0,14) (o 14% de contaminación). De igual forma Beltrán Pedroza (2011), menciona la
efectividad de este desinfectante, para controlar bacterias y hongos en yemas in vitro
de A. perutilis Hansley en igual concentración y tiempo de exposición.
Por otra parte la interacción de las semillas con el hipoclorito de sodio 5.25%, a
diferentes tiempos de exposición (T1 a T5), seguido del uso de Cloranfenicol (1250
mg/L) antibiótico bacteriostático de alto espectro (Mendoza, 2008), no mostró
significancia estadística respecto a los demás tratamientos (Anexo B), lo mismo que el
T6, en el cual se utilizó la tetraciclina como desinfectante, sin resultados positivos.
Concluyéndose que estos tratamientos son deficientes para el establecimiento de los
embriones in vitro. Este resultado difiere con lo reportado por Acosta & Zamora (2004),
quienes lograron eliminar la presencia de bacterias in vitro usando Cloranfenicol.
El tratamiento 7 fue el único ensayo en el que se realizó una desinfección directa a los
embriones, sumergiéndolos en una solución de cloranfenicol al 10% por 3’, retirando
con papel estéril el exceso de la solución antimicrobiana, desinfección recomendada
por Acosta & Zamora (2004), quienes lograron un éxito del 100% en el control de la
contaminación en embriones de chachafruto. Sin embargo, al seguir esta referencia, se
observó el crecimiento de hongos en el 100% de los casos.
Vargas y Abdelnour (2010), expresan la necesidad de adicionar antibiótico en el medio
de cultivo, cuando los microorganismos son un factor limitante para el establecimiento
de material in vitro, siguiendo este sugerencia en el T8 se agregó (50 mg/l) de
Cloranfenicol al medio de cultivo, sin embargo el alto valor de la estimación en la
proporción (0,92) revela que la contaminación persistió en un 92%. Sin embargo en
estudios desarrollados a partir de segmentos nodales de Mentha arvensis L, fue
posible establecer un 65%, de explantes sanos in vitro, al combinar la exposición previa
40
al cloranfenicol y su presencia como constituyente del medio de cultivo (Héctor et al,
2005).
4.1.2 Oxidación: La variable oxidación es determinante en la viabilidad del explante, en
la (Figura 6) se aprecia que los tratamientos (11, 12, 10, 8, 4, 9 y 1) sin equivalentes
desde el punto de vista estadístico, con una baja producción de sustancias fenólicas en
el explante “embrión”, (13%, 14%, 20%, 35%, 40% y 50% de oxidación,
respectivamente). Sin embargo la viabilidad de los embriones se vio comprometida al
emplear hipoclorito de sodio al 5.25% pues la etapa de contaminación no pudo ser
superada, por lo cual en este estudio se descartan los tratamientos (8, 4, 9, 1) dando
prioridad a los ensayos (11, 12 y 10), en los que se empleó dicloruro de mercurio en un
rango de concentración (0.2 y 0.3) porciento.
Figura 6. Estimación puntual de proporciones de oxidados en los tratamientos de desinfección de E. edulis.
Fuente: el Autor
Los Niveles de oxidación más altos (76% y 100%), se presentaron al emplear como
único agente desinfectante PPM (Plant Preservative Mixture) al 0.2%, siendo los
tratamientos (13 y 14), los más oxidativos al presentar significancia estadística respecto
a los demás tratamientos (Anexo C). Igualmente la acción biostática del PPM, se vio
inhibida por la presencia de bacterias en un 100% aun cuando los tiempos de
exposición fueron de 5 y 14 horas para cada tratamiento (figura 5), lo que indica que la
acción de este biocida químico al 0.2% no cubre el rango de efectividad para controlar
contaminantes bacterianos. Este resultado coincide con (Digonzelli et al., 2005) quien
0 0 0,13 0,14
0,2
0,35 0,4 0,4 0,5
0,66 0,67 0,76
0,83
1
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
6 7 11 12 10 8 4 9 1 3 5 13 2 14
Oxi
dac
ión
Tratamientos
41
expresa que concentraciones menores a 0.25 ml/L de PPM, no impide el crecimiento
de bacterias como Pseudomona. Así mismo (Lunghusen, 1998; Kalin, & Guri, 1999),
citado por (Digonzelli et al., 2005) recomiendan su uso en concentraciones de 0.5 a 2
ml/L.
4.1.3 Germinación: Los tratamientos que presentan una estimación puntual igual a (0),
corresponde a ensayos en los que no fue posible evaluar la variable germinación por
razones de contaminación y/o oxidación (figura 7). Hubo algunos tratamientos en los
que se evidenció significancia estadística pero que se descartaron por la misma razón
(T4 y T2).
Figura 7. Estimación puntual de proporciones de germinación en los tratamientos de E. edulis.
Fuente: el Autor
Por otra parte, los tratamiento (3, 9, 11, 12, 10 y 5), no presentaron diferencias
significativas entre ellos, lo que indica que estadísticamente son equivalentes y por
consiguiente, cualquiera de estos puede ser apropiado para el desarrollo de los
embriones cigóticos de chachafruto (Anexo D). Si se atiende a otras razones podemos
dar prioridad al tratamiento (T10) ya que fue el mejor en el control de la contaminación
(14%) y oxidación (20%), empleando dicloruro de mercurio en una concentración de
[0.2%] x 20 min, acompañado de la acción desinfectante del alcohol 70%, Tween 80%
y Benlate. Este tratamiento propició el desarrollo de los embriones en un 64%, al cabo
0 0 0 0 0 0 0,06 0,08
0,16
0,25
0,33
0,60 0,64
0,67
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
1 6 7 8 13 14 4 2 3 9 11 12 10 5
Ger
min
ació
n
Tratamientos
42
de 5 semanas se establecieron plántulas sanas sin daños por contaminación u
oxidación (Figura 8).
Aunque el tratamiento 11, también mostró ser eficiente para establecer embriones
asépticos de chachafruto, Torres et al., (1998) citado por (García, 2013), consideran
que una desinfección eficaz es aquella en la que los explantes han sido expuestos a
una baja concentración desinfectante, presentando tasas reducidas de contaminación
microbiana y oxidación, razón por la cual se decidió no emplear (HgCl2 0.3%), ya que
la concentración del desinfectante es mayor a la del tratamiento 10.
Respecto al (T12), se podría decir que su efectividad obedeció principalmente, a la
adición de PPM (2 ml/l) en el medio de cultivo, que sumado a la metodología de
desinfección estándar, generó bajos niveles de contaminación (37%) y oxidación (14%)
con una germinación del (60%). Sin embargo, se debe considerar que el PPM, es una
sustancia antibacteriana que puede interferir en el crecimiento de las plántulas
(Digonzelli et al, 2005), por lo cual muchos autores recomiendan su uso con
moderación, ya que podrían modificar la composición del medio de cultivo y generar
problemas de fitotoxicidad. Dada esta razón y teniendo el alto costo del producto, en
este estudio se descarta su empleo.
Figura 8. Desarrollo de (Erythrina edulis) empleando HgCl2 al 0.2% por 20’. A) embriones a las 3 semanas. B) plántula a las 6 semanas.
Fuente: el Autor
A B
43
En general el dicloruro de mercurio (HgCl2), fue el agente desinfectante que resultó
menos permisible a la contaminación y permito el establecimiento aséptico de
embriones de chachafruto en cultivo in vitro, con altos niveles de germinación y bajos
porcentajes de oxidación (Figura 8). Si bien el dicloruro de mercurio, se clasifica dentro
de los desinfectantes de mayor toxicidad por la presencia de metales pesados, esto no
ha impedido su uso en el establecimiento de especies maderables como el pilón
(Hieronyma alchorneoides) usando (HgCl2) al 0,095% por 5 min (Abdelnour, 2011), y
en concentración de 0.005% por 10 min, efectivo para eliminar microorganismos
exófitos en tejidos de caña de azúcar in vitro (Niubó et al., 2002). Su efectividad a
bajas concentraciones, sumado a la actividad enzimática por acción de los grupos
sulfhidrilo (SF), lo hacen accesible en numerosas investigaciones (Roca & Mroginski,
1991).
4.2 ESTABLECIMIENTO DEL MEDIO NUTRITIVO PARA EL AISLAMIENTO DE EMBRIONES in vitro.
Al realizar la siembra de los embriones cigóticos al medio de cultivo, se evaluaron dos
tratamientos, los dos con medio MS e igual concentración de la Auxina (ANA), pero uno
de ellos con la concentración de nitratos a la mitad.
Figura 9. Desarrollo de embriones en: A) medio MS + ANA (2 mg/L) y B) MS (nitratos a la mitad) + ANA (2 mg/L).
Fuente: El Autor
A B
44
Los dos medios de cultivo propuestos en la fase de establecimiento para los
embriones de chachafruto, resultaron ser efectivos para obtener plántulas completas
en un 100%, por lo tanto desde el punto de vista estadístico, no hay diferencias, sin
embargo se optó por emplear el medio MS (concentración de nitratos a la mitad)
suplementado con ANA (2 mg/L), ya que se observó mayor elongación de la parte
apical, buen desarrollo en la parte radicular, así como un mayor número de entrenudos
por vitroplantula y una vigorosidad y coloración intensa (Figura 9). En relación con este
resultado, Abedini et al., (2000), citado por Acosta & Zamora (2004), afirma, que al usar
medios de cultivo con las concentraciones completas de nitratos en leguminosas como
Erythrina crista-galli, se disminuye, en forma sustancial, la expresión del material
vegetal en condiciones in vitro, debido, entre otras causas, al aumento de la oxidación y
desorden fisiológico como consecuencia de la hiperhidratación.
Estos autores también destacan la importancia de adicionar al medio de cultivo,
fitoreguladores de tipo auxínico, pues participan y aceleran el proceso de germinación,
de allí su importancia en ensayos donde se aísla el embrión de su endospermo, o se
aplican técnicas como el rescate de embriones.
4.3 FASE DE MULTIPLICACIÓN.
Una vez establecidos los embriones de E. edulis y obtenido un stock considerable de
vitroplantas, se realizó una etapa de multiplicación, subdividiendo la plántula según los
brotes y yemas formados, para tomar segmentos nodales, los cuales se sembraron en
medio nutritivo MS (nitratos a la mitad) + ANA + BAP (1:1) mg/L (Figura 10).
Figura 10. Segmentos nodales de E. edulis en medio MS (nitratos a la mitad) + ANA + BAP (1:1).
45
Fuente: al Autor La prueba de Shapiro-Wilks determinó la normalidad de los datos. El análisis de
estimación paramétrica, afirma que el promedio estimado de brotes a partir de
segmentos nodales de chachafruto, es igual a 2.58 en un periodo de 2 meses, con un
intervalo de confianza del 95% dado entre 1.80 y 3.37 (Anexo E), a partir de los dos
meses de subdivisión. Esto ratifica que la respuesta del explante “segmento nodal”, al
medio MS con nitratos a la mitad, más la combinación de los reguladores ANA y BAP
en igual proporción, estimuló la formación de múltiples brotes y permitió el crecimiento
de las ramas axilares y laterales (Figura 10).
De igual manera Montiel & Villalva (2007), lograron estimular la brotación de
meristemas en dos variedades de Piña con igual combinación de reguladores,
demostrando un efecto de sinergia al asociar auxinas y citoquininas a igual
concentración, expresado en la formación de brotes. Así mismo, en especies forestales
como el comino Aniba perutilis (Beltrán, 2011), confirma desarrollo caulinar por efecto
del BAP, pero inhibición en el proceso de enraizamiento, aun en presencia de ANA en
concentración 1mg/L. Esto coincide con lo observado en este estudio, ya que en la
(Figura 10), se aprecia la presencia de una masa tipo callosa, en la zona de caulinar.
4.4 MICROINJERTACIÓN in vitro de Erythrina edulis. La variable contaminación, no presentó diferencias significativas al comparar las
proporciones en los tres métodos de injertación (Anexo F). La viabilidad de los
46
microinjertos se vio afectada negativamente por una alta contaminación fúngica
posterior a los doce días de la microinjertación (Figura 12 A).
Figura 11. Estimación puntual de las proporciones analizando la contaminación y oxidación, en los tres métodos de injertación.
Fuente: el Autor
Cabe resaltar que en la consolidación del microinjerto, se emplearon explantes
asépticos producidos in vitro, lo que en este estudio no fue garantía de éxito en la
etapa de establecimiento de los mismos, pues los niveles de contaminación fueron del
(66%, 70% y 76%) empleando los métodos de incisión (T. invertida, Aprox. Lateral y
Púa), (Figura 11). Debido a que no se encontró reportes de microinjertos in vitro, en los
que la unión del injerto y portainjerto fuera de procedencia in vitro, no fue posible
justificar estos resultados en base a otros estudios.
Respecto a la variable oxidación, se encontró diferencia significativa entre los métodos
T. invertida y Púa (Anexo G), siendo el primero el que registró un mayor nivel de
oxidación (80%) (Figura 11), lo que impidió el prendimiento del injerto y por lo tanto su
evaluación como método de injertación.
0,7059 0,76 0,66
0,29 0,23
0,8
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
Aprox. Lateral Púa T. invertida
oxidación
contaminación
47
Figura 12. Microinjerto. A) Contaminación fúngica de los microinjertos B) procesos necróticos en la unión del injerto a través del método T. invertida.
Fuente: el Autor
Otra de las causas que posiblemente contribuyó a la contaminación y oxidación de los
injertos puede estar relacionada con una excesiva manipulación de los tejidos durante
la realización de los tres tipos de incisión (Rache et al., 2008; Materán et al., 2008), en
este punto es importante resaltar que los tallos que sirvieron como portainjerto,
presentaban un diámetro de 0.2 a 0.3 mm, lo que hizo más susceptibles los tejidos a
la deshidratación al momento en que se realizaban los cortes bajo el estereoscopio.
Razón por la cual se sugiere considerar lo expresado por Murashige et al., (1972),
quien plantea la posibilidad del microinjerto in vitro de ápices sobre plántulas obtenidas
a partir de semillas al lograrse un mayor diámetro del portainjerto. En el caso de
chachafruto se escogió el embrión dado el gran tamaño de la semilla.
4.5 EFECTO DEL TIPO DE INCISIÓN EN EL PRENDIMIENTO DE LOS
MICROINJERTOS
En los microinjertos que superaron la contaminación, y mostraron un desarrollo de las
yemas injertadas, se evaluó si el tipo de incisión favorecía el prendimiento del injerto,
así como su capacidad de adaptación.
A B
48
Figura 13. Estimaciones puntuales de prendimiento en injertos de E. edulis para tres
métodos de microinjertación.
Fuente: el Autor
La (Figura 13), refleja que a través de los métodos de injertación (Púa y Aprox. lateral)
se logró un prendimiento promedio del 23% y 29% respectivamente; a diferencia del
método de T. invertida, donde no fue posible observar la presencia de hojas, ni
desarrollo de las yemas injertadas debido fundamentalmente al efecto de la oxidación y
contaminación. Sin embargo, el análisis de comparación de proporciones evaluando el
prendimiento, no reflejó diferencias significativas entre los tres métodos (Anexo H),
Esta no significancia, se debe a que los tamaños de muestra estadísticamente no
permiten detectar las diferencias, en caso de que las haya. Aun así, en los métodos de
Aproximación lateral y Púa, se logró observar en los microinjertos que prosperaron, la
formación de un callo translucido a las tres semanas de ser realizada la
microinjertación, señal de que en la zona de injertación se favoreció la unión vascular
(Figura 14 A). Aguilar et al. (1990), citado por Juárez Gómez (2013), señala que al
injertarse dos especies, las partes afectadas inicialmente desarrollan un callo, producto
de la intensa actividad mitótica, que posibilita la unión (figura 14 B). Por lo cual este
49
estudio se limitará a seleccionar el método que obtuvo mayor prendimiento y su
facilidad para su implementación, como lo fue el de aproximación lateral.
Respecto a la poca viabilidad presentada en el método T. invertida, Navarro (1979),
señala que el método de colocación del ápice en el patrón influye significativamente en
el grado de prendimiento. Igualmente este autor reporta que al colocar el ápice dentro
de la incisión tipo T. invertida, pero con su superficie basal de corte en contacto con el
tejido de la médula, dio un bajo porcentaje de prendimiento. Esto se debe a que el
injerto no queda realmente en contacto directo con el tejido vascular sino con tejido
medular.
Figura 14. Desarrollo del microinjerto: A) y B) formación de callo en la zona de unión del injerto. C) consolidación de microinjertos a través del método púa y D) Aprox. Lateral.
Fuente: el Autor
El medio básico MS (con nitratos a la mitad), suplementado con ANA (2 mg/L), permitió
el desarrollo las plantas microinjertadas, logrando estimular el crecimiento de las yemas
vegetativas del injerto, 45 días después de realizada la incisión (Figuras 14 C y D). Este
comportamiento, puede estar influenciado por la acción hormonal del ácido
naftalenacético (ANA). Chinchilla (2008), citado por Ayala (2011), considera que su
presencia promueve la organogénesis, e induce la generación de callo como parte del
rejuvenecimiento o en respuesta a heridas por cortes y manipulación.
A
B C D
50
Por otra parte, el análisis estadístico permite inferir que en un lapso de 45 días, el
crecimiento promedio de las yemas injertadas es de 1.58 cm, con un intervalo de
confianza del 95% dado entre 0.89 y 2.22. Se comprobó la normalidad de los datos
(Anexo I). Este crecimiento se considera un indicador morfológico que ratifica la unión
de los tejidos en el microinjerto.
Criollo (2008), señala que el medio ideal para cualquier microinjerto es el que permite
un desarrollo del portainjerto en su estructura y en su sistema radical, lo que garantiza
la vitalidad del mismo. Por lo anterior, se considera el medio MS (nitratos a la mitad) +
ANA (2mg/L) cumple con estos criterios. Sin embargo no se debe descartar el efecto de
otros reguladores de crecimiento y su influencia en el desarrollo de los microinjertos, en
estudios futuros.
4.6 MICROINJERTOS A PARTIR DE YEMAS AXILARES ex vitro.
En los ensayos generados a partir de yemas provenientes de plantas establecidas en
invernadero (nueve meses de edad), injertadas sobre portainjertos in vitro, se observó
presencia de hongos en todos los casos.
Figura 15. Contaminación fúngica a partir de yemas ex vitro, en injertos in vitro.
Fuente: el Autor
51
Aun cuando la planta madre fue sometida a un pretratamiento con Benlate y Lorsban,
previo a la aplicación del protocolo de desinfección con el hipoclorito de sodio, se
observó un alto nivel de contaminación de las yemas, lo que mostró que la desinfección
con NaClO no resultó efectiva para el control de microorganismos contaminantes. Por
lo anterior, se hace necesario implementar nuevos protocolos de desinfección para
materiales provenientes de vivero, ya que toda la literatura encontrada sobre técnicas
de microinjertación se ha realizado introduciendo al cultivo in vitro ápices caulinares
tomados de árboles adultos mantenidos en invernadero o campo, con la finalidad de
sanear, reactivar y juvenilizar material adulto de diferentes especies (Soto, 2003; Rache
et al., 2008 y Materán et al., 2007).
52
5. CONCLUSIONES
El Protocolo de desinfección más efectivo para controlar la contaminación de los
embriones a partir de semillas de Erythrina edulis, es: alcohol 70%, durante 15
min, seguida de Tween 80% por 15 minutos, Benlate 1 g/L, durante 20 minutos y
dicloruro de mercurio (0.2%) por 20 min.
La reducción de la concentración de nitratos a la mitad en el medio de cultivo MS
con la adición de ANA 2mg/L, permitió la obtención de plántulas completas de
chachafruto; de igual manera fue el medio de cultivo seleccionado para el
prendimiento del injerto.
Se selecciona el método de aproximación lateral para la microinjertación por ser
el de mayor prendimiento y facilidad de ejecución. La microinjertación in vitro con
los métodos de Púa y T. invertida, deben excluirse hasta tanto no se logre
controlar la contaminación y oxidación.
Las yemas axilares tomadas de plantas ex vitro, microinjertadas sobre patrones
in vitro, no fueron viables por presentar altos niveles de contaminación fúngica.
Es posible lograr la microinjertación de Erythrina edulis, utilizando explantes
provenientes de plántulas producidas in vitro ya que se garantiza la asepsia del
material.
53
6. RECOMENDACIONES
Se sugiere ampliar la investigación en la fase de microinjertación, evaluando el efecto
de las diferentes concentraciones y reguladores de crecimiento (auxinas, citoquininas)
en el desarrollo de los injertos y elongación del tallo.
Evaluar si la imbibición de la parte decapitada del patrón y los brotes a injertar en
distintos reguladores de crecimiento influye en el prendimiento de los microinjertos.
Continuar los estudios para introducir material ex vitro a in vitro libres de
contaminación.
54
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58
ANEXOS
59
Anexo A. Número de observaciones total, analizados en el estudio.
Tabla 1. Número de individuos empleados en la fase de desinfección.
Tratamientos
Número total de
individuos n:
Contaminados Oxidados Germinados
1 12 12 6 0
2 12 11 10 1
3 12 10 8 2
4 30 27 12 2
5 12 10 8 2
6 20 20 0 0
7 20 20 0 0
8 40 37 14 0
9 20 15 8 5
10 34 5 7 22
11 15 7 2 5
12 35 13 5 21
13 26 26 20 0
14 27 27 27 0 Fuente: el Autor Tabla 2. Número de individuos empleados en la fase de Microinjertación. Fuente: el Autor De acuerdo con la teoría estadística, dos proporciones difieren si y solamente si sus
correspondientes intervalos de confianza tienen “intersección vacía”, y esto se aplica
haciendo las comparaciones de todos los pares de tratamientos como se expresa en
las siguientes tablas.
N° individuos Prendimiento Contaminados Oxidados
Aprox. lateral 17 5 12 5
Púa 17 4 13 4
T. invertida 15 0 10 12
60
Anexo B. Análisis de Comparación de proporciones entre los tratamientos de desinfección, analizando la variable contaminación.
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14
T1 - - - - - - - - * ? * - -
T2 - - - - - - - - * - * - -
T3 - - - - - - - - * - - - -
T4 - - - - - - - - * ? * - -
T5 - - - - - - - - * - - - -
T6 - - - - - - - - * * * - -
T7 - - - - - - - - * * * - -
T8 - - - - - - - - * * * - -
T9 - - - - - - - - * - - - -
T10 * * * * * * * * * - - * *
T11 ? - - ? - * * * - - - * *
T12 * * - * - * * * - - - * *
T13 - - - - - - - - - * * * -
T14 - - - - - - - - - * * * - Fuente: el Autor *: Indica diferencia significativa. ?: Indica casos dudosos. -: indica la no significancia. Anexo C. Tabla del análisis de comparación de proporciones entre los tratamientos de desinfección, analizando la variable oxidación.
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14
T1 - - - - * * - - - - - - *
T2 - - - - * * ? - * * * - -
T3 - - - - * * - - - - * - -
T4 - - - - * * - - - - - - *
T5 - - - - * * - - - - * - -
T6 * * * * * - * * - - - * *
T7 * * * * * - * * - - - * *
T8 - - - - - * * - - - - * *
T9 - - - - - * * - - - - - *
T10 - * - - - - - - - - - * *
T11 - * - - - - - - - - - * *
T12 - * * - * - - - - - - * *
T13 - - - - - * * * * * * -
T14 * - - * - * * * * * * * - Fuente: el Autor
61
*: Indica diferencia significativa. -: indica que no hay diferencia. Anexo D. Análisis de Comparación de proporciones entre los tratamientos de desinfección, analizando la variable germinación.
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14
T1 - - - * - - - - * - * - -
T2 - - - - - - - - * - * - -
T3 - - - - - - - - - - - - -
T4 - - - * - - - - * - * - -
T5 * - - * * * * - - - - * *
T6 - - - - * - - - * - * - -
T7 - - - - * - - - * - * - -
T8 - - - - * - - - * * * - -
T9 - - - - - - - - - - - - -
T10 * * - * - * * * - - - * *
T11 - - - - - - - * - - - - -
T12 * * - * - * * * - - - * *
T13 - - - - * - - - - * - * -
T14 - - - - * - - - - * - * - Fuente: el Autor *: Indica diferencia significativa. -: indica no significancia. Anexo E. Estimación del promedio de brotes y prueba de normalidad para la construcción del intervalo de confianza.
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Anexo F. Análisis de proporciones comparando los tres métodos de microinjertación, analizando la variable contaminación.
aprox. Lateral Púa T invertida
aprox. Lateral - -
Púa - -
T invertida - - Fuente: el Autor *: Indica diferencia significativa. -: indica no significancia.
Anexo G. Análisis de proporciones comparando los tres métodos de microinjertación, analizando la variable oxidación.
aprox. Lateral Púa T invertida
aprox. Lateral - -
Púa - *
T invertida - * Fuente: el Autor *: Indica diferencia significativa. -: indica no significancia.
Anexo H. Análisis de proporciones comparando los tres métodos de microinjertación, analizando la variable prendimiento.
aprox. Lateral Púa T invertida
aprox. Lateral - -
Púa - -
T invertida - - Fuente: el Autor *: Indica diferencia significativa. -: indica no significancia. Anexo I. Estimación del promedio de crecimiento y prueba de normalidad, para la construcción del IC.
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