micropropagacion

1obtencin y multiplicacin de plantas de fresa libres de virus

2 obtencin y multiplicacin de plantas de fresa libres de virus

INTRODUCCIN

ETAPA I. SANEAMIENTO DE PLANTASPOR TCNICAS DE CULTIVO in vitro

ETAPA II. EVALUACIN SANITARIA

ETAPA III. EXPOSICIN DE PLANTAS ALUZ ARTIFICIAL PARA ESTIMULAR LAPRODUCCION DE ESTOLONES

ETAPA IV. MULTIPLICACIN DE PLANTASBAJO CUBIERTA

ESTABLECIMIENTO DE VIVERO

ANEXO 1.Composicin de sales inorgnicas delmedio MS

ANEXO 2.Composicin de medios de cultivo

ANEXO 3.Esquema para la obtencin de plantas defresa libres de virus por cultivo in vitro demeristemos

ANEXO 4.Esquema para la produccin de plantamadre de fresa libre de virus

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CONTENIDO


OBTENCION Y MULTIPLICACION DE PLANTAS

DE FRESA LIBRES DE VIRUS

INTRODUCCION

En Morelos, la fresa es un cultivo alternativo de nuevaintroduccin y su produccin comercial depende de laimportacin de la planta madre. Estas plantas no tienen garantade sanidad y la presencia de patgenos, entre ellos los llamadosvirus, afectan negativamente el rendimiento; por otra parte,su multiplicacin por ms de un ciclo bajo condicionesnaturales se dificulta, y la planta pierde calidad.

Mediante la aplicacin de tcnicas de cultivo in vitro, evaluacinsanitaria y mtodos adecuados para estimular la produccinde estolones, se puede producir planta madre nacional dealta calidad fitosanitaria para el establecimiento de viveroscomerciales.

El siguiente esquema para la obtencin y multiplicacin deplantas de fresa libres de virus consta de cuatro etapas y seaplic a las variedades Camarroza y Chandler, que son lasms importantes en la entidad.

I. Saneamiento de plantas por tcnicas de cultivo in vitro.

II. Evaluacin sanitaria.

Patricia Eugenia Lpez Gonzlez 1

Kunio Inoue 2

1 Investigador Titular del Programa de Biotecnologa. SAGARPA, INIFAP,CIRCE.

2 Experto de largo plazo. INIFAP, JICA, CIRCE.


III. Exposicin de plantas a luz artificial para estimular laproduccin de estolones.

IV. Multiplicacin de plantas bajo cubierta.

Las plantas producidas por este mtodo son apropiadas paraser utilizadas como planta madre para el establecimiento delos viveros comerciales.

ETAPA I. SANEAMIENTO DE PLANTAS POR TECNICAS DECULTIVO in vitro.

Aislamiento y cultivo de meristemos

a) Desinfectar superficialmente los estolonessumergindolos en una solucin de alcohol al 70% durante5 segundos y de cloro comercial al 10% por 10 minutos.Enjuagar tres veces con agua destilada esterilizada.

b) Aislar los meristemos de 0.2-0.5 mm en un ambienteasptico, con el auxilio de una campana de flujo laminar,instrumental de diseccin y un microscopio estereoscpico.Se debe prevenir la desecacin y evitar daos fsicos almeristemo.

c) Sembrar los meristemos en un medio de cultivo slidocomplementado con vitaminas, aminocidos, una fuentede carbohidratos y reguladores del crecimiento (Anexo 2).

d) Incubar a una temperatura de 26 2 C; humedad relativa> 50%; fotoperiodo 16/8 hr luz/oscuridad (mantener lasmismas condiciones fsicas controladas en cada una delas etapas del cultivo in vitro).

e) Al cabo de 70 a 90 das de incubacin, se observa unamasa de yemas axilares.


Micropropagacin

a) Aislar los brotes axilares desarrollados a partir de losmeristemos, y subcultivarlos individualmente en el mismomedio fresco cada 4-6 semanas . Se sugiere no realizarms de 4 propagaciones in vitro.

b) Seleccionar los brotes ms grandes para elenraizamiento y los ms pequeos para continuar lamultiplicacin.

Enraizamiento

Aislar los brotes y transferirlos a un medio nutritivo sinreguladores del crecimiento (Anexo 2). El desarrollo deraces se presenta despus de los 30 das de incubacin.

Fig. 1. Aspecto de los brotes axilares de fresa durante lamicropropagacin.


Aclimatacin

a) Seleccionar plantas obtenidas in vitro mayores de 4cm y con races vigorosas. Lavar las races con aguacorriente hasta eliminar completamente los residuos de agar.

b) Utilizar un sustrato esterilizado preparado con peatmoss+vermiculita en proporcin 1:1. Se sugiere utilizar charolaspara almcigo de 50 cavidades . Fertilizar las plantas cadatercer da con una solucin de la frmula 6-6-19 NPK(1g/l).

c) Las plantas deben cubrirse con bolsas de plsticotransparente para conservar alta humedad relativa; estacubierta se retira gradualmente hasta su eliminacin total.

d) La aclimatacin de las plantas requiere aproximadamentede 20 das y se sugiere realizarla entre los meses dediciembre y enero.

Fig 2. Vitroplantas en aclimatacin


e) Para estimular la produccin de estolones estas plantasdeben ser expuestas a luz artificial 1 hr a la media nocheen todo el proceso se aclimatacin. Consultar la seccinEtapa III: Trasplante a maceta (c-f) y Tratamiento con luzartificial.

ETAPA II. EVALUACION SANITARIA

Se realiza mediante un injerto de hoja sobre plantas indicadorasde especies silvestres de fresa, y se aplica para comprobarla ausencia de virus en las plantas obtenidas en el laboratorio.Comprende los siguientes pasos:

a) Tomar hojas maduras de plantas indicadoras deFragaria vesca ( clones: EMC y UC-5) as como de lasplantas prueba obtenidas por cultivo in vitro.

b) Retirar el foliolo central de la planta prueba y prepararlaen forma de cua. Mantener esa porcin en agua para evitarla deshidratacin.

c) Eliminar el foliolo central de la planta indicadora y realizaruna incisin a lo largo y por el centro del peciolo, de longitudsimilar a la de la cua del foliolo preparado anteriormente.

d) Insertar el foliolo de la planta que se probar, en el cortedel peciolo de la planta indicadora. Atar con banda depolietileno.

e) Cubrir el injerto as preparado, con una bolsa de plsticotransparente la cual se retirar gradualmente. Al cabo de2 a 5 semanas observar si hay sntomas en las nuevashojas desarrolladas. La ausencia de sntomas seala lasanidad de los materiales evaluados.

f) Eliminar plantas con sntomas de mosaicos, moteado,deformaciones de hojas y tallos, amarillamiento,achaparramiento, anillos clorticos o necrticos.


g) Las plantas libres de virus se micropropagarn apartir de los cultivos rplica que permanecieron in vitro.

Fig. 3. Injerto de hoja sobre planta indicadora de fresa. Semuestran sntomas de virosis como mosaicos y ama-rillamiento en el clon EMC de F. vesca.

ETAPA III. EXPOSICION DE PLANTAS A LUZ ARTIFICIALPARA ESTIMULAR LA PRODUCCION DE ESTOLONES

Obtencin de planta madre para el primer ao

De las plantas libres de virus se puede emplear la primerao segunda generacin obtenida fuera del laboratorio.

Trasplante a maceta

a) Se recomienda utilizar plantas cosechadas en el mesde octubre.

(Foto: K. Ohkoshi)


b) Podar las hojas ms grandes de la plantas y protegerlas races de la deshidratacin antes del trasplante.

c) Trasplantar en macetas de 10 cm de dimetro con sueloagrcola esterilizado, cuidando que las races no quedendobladas.

d) Evitar que el cogollo de la planta quede bajo el nivel delsuelo.

e) Fertilizar a los 30 das del trasplante, aplicando 3 gr detriple 17, mateado en cada planta. El fertilizante debe taparsey se evitar dejarlo en contacto con la planta. Repetir laaplicacin cada mes hasta el trasplante a piso (Cuadro 1).

f) Colocar las macetas bajo cubierta de malla contrainsectos, y evitar su contacto directo con el piso.

Tratamiento con luz artificial

a) Mantener las plantas en iluminacin 1 hr a la media nochea partir del mes de noviembre, hasta la fecha de trasplantea piso (Cuadro 1).

b) Se sugiere utilizar un foco de 60 w para una superficiede 4 m en la que se colocan 304 macetas. Ubicar losfocos 1.5 m arriba de las macetas.

c) La aparicin de estolones se presenta despus de los40 das de iniciar la exposicin con luz artificial. Cortar losbotones florales.

d) Las plantas tratadas pueden utilizarse para la produccinde planta madre para el segundo ao o como planta madrepara el vivero comercial.


ETAPA IV. MULTIPLICACION DE PLANTAS BAJOCUBIERTA

Todas las multiplicaciones de las plantas libres de virus fueradel laboratorio y antes de establecer los viveros comerciales,deben realizarse bajo cubierta de malla contra insectos y conun estricto control de plagas y enfermedades.

Produccin de planta madre para el segundo ao

a) Plantas tratadas con luz artificial se trasplantan acamas con suelo previamente desinfectado.

b) En cuanto a la preparacin de suelo, poca de trasplante,densidad, fertilizacin, plagas y enfermedades sedescriben en la seccin de establecimiento de vivero.

c) Cada planta tratada con luz artificial produce de 90-150plantas hijas.

Fig. 4. Desarrollo de estolones en plantas expuestas al tratamien-to de luz artificial


d) Las plantas se cosechan en octubre y antes delestablecimiento del vivero, los materiales se sometennuevamente al tratamiento con luz artificial para estimularla produccin de estolones.

Fig 5. Produccin de planta madre bajo cubierta de malla contrainsectos

ESTABLECIMIENTO DE VIVERO

Obtencin de la planta madre

Los viveros deben utilizar plantas que no estn separadasms de tres generaciones de una planta libre de virusobtenida en el laboratorio.

Seleccin del terreno

a) Utilizar terrenos sin problemas de salinidad y drenaje.


b) Evitar establecer el vivero en donde se haya cultivadofresa, papa, jitomate, pepino, meln y ornamentales durantelos tres aos anteriores.

c) El vivero debe estar alejado de la plantacin comercialpara reducir la presencia de plagas y enfermedades.

Preparacin del terreno

a) El suelo debe prepararse mediante un barbecho a 30cm de profundidad, una cruza y varios pasos de rastra, hastadejar el suelo mullido, a continuacin se debe nivelar.

b) Preparar camas de 1.10 m de separacin y de 15 a 20cm de altura.

Forma de trasplante

a) A las plantas tratadas con luz artificial se les retiranlas macetas, y sin eliminar el suelo que cubre las racesse trasplantan cuidando que el cuello de la raz quede alnivel del suelo.

b) Los estolones que estn presentes deben mantenerseen contacto con el suelo para su enraizamiento.

Variedad Localidad msnm Epoca de trasplanteChandler Zacatepec 900 15 feb-30 marzo

Camaroza 15-30 marzo

Chandler Oacalco 1 300 20-30 marzo

Tepoztln 1 700

Cuadro 1. Epoca del trasplante


Fig. 6 Trasplante a 1 hilera en camas de 1.10 m de separacin

Densidad de plantas por hectrea

Trasplantar a una hilera y con una distancia entre planta de1 m , lo que dar un total de 9 090 plantas /ha. (Fig. 6)

Fertilizacin y control de maleza

a) Se recomienda la frmula de N-P-K 120 -60-60 la cualse obtiene con 585 kg de sulfato de amonio, 308 kg desuperfosfato de calcio simple y 120 kg de sulfato de potasio.

b) Realizar dos aplicaciones: la primera a los 30 das deltrasplante aplicando la mitad de nitrgeno y todo el fsforoy potasio; la segunda a los 60 das de la primera aplicacin,con el resto del nitrgeno.

c) Aplicar el fertilizante mateado a cada planta madre,tapndolo, y evitando que quede en contacto directo con laplanta.


d) Mantener el vivero libre de malas hierbas mediantedeshierbes continuos.

Riegos

a) Regar el terreno antes y despus del trasplante de talmanera que el suelo quede bien hmedo.

b) Despus del trasplante los riegos deben ser ligeros yfrecuentes con agua de buena calidad y sin exceso desales.

Plagas

Las principales plagas son araa roja, trips, pulgones ygallina ciega; las tres primeras se controlan utilizando2 lt/ha de Thiodan 35%; Malation 1000 E 1 lt/ha; para latercera, aplicar 12 kg/ha de Furadan 10G.

Enfermedades

Se presentan principalmente antracnosis y mancha o pecade la hoja; para la primera aplicar Folpan 80 PH 1 a 2 kg/ha;para la segunda aplicar Direne 50% PH 2-4 kg/ha.

Cosecha

La cosecha se realiza entre el 15 de agosto y el 30 deseptiembre y debe efectuarse en terreno hmedo (Fig. 7).

Clasificacin de la planta

Clasificar las plantas por dimetro de la coronaseleccionando las de ms de 5 cm porque son las de mayorrendimiento. Las plantas se deben proteger de ladeshidratacin mantenindolas en contacto con el suelohmedo y sombreado hasta su trasplante definitivo en ellote de produccin frutcola (Fig. 8).


Fig. 8. Clasificacin de planta por el dimetro de la corona

Fig. 7 Cosecha de planta


Anexo 1. Composicin de sales inorgnicas del medio MS

Compuesto Concentracin ( mg/litro)

1650.001900.00440.00170.00370.0022.306.208.600.250.83

0.0250.02537.2527.85

NH4 NO

3KNO

3CaCl.2H

2O

KH2PO

4MgSO

4.7H

2O

MnSO4.4H

2O

H3BO

3ZnSO

4.4H

20

Na2MoO

4.2H

2O

KICoCl.6H

2O

CuSO4.5H

2O

Na2EDTA

FeSO4.7H

2O

MS= Murashige y Skoog, 1962

BAP = 6-benzil-aminopurinaAIB = cido 3- indolbutricoGA3 = cido giberlico

Anexo 2. Composicin de medios de cultivo

Concentracin (mg/litro )

EnraizamientoCultivo de meristemos y micropropagacinConstituyentes

MS100.0

0.10.50.52.0

30, 000.08, 000.0

0.50.10.1

Sales inorgnicasInositolTiamina-HClPiridoxina-HClAcido nicotnicoGlicinaSacarosaAgarBAPAIBGA3

MS100.0

0.10.50.52.0

30, 000.0 8, 000.0

0.00.00.0


Anexo 3. Esquema para la obtencin de plantas de fresalibres de virus a partir del cultivo in vitro demeristemos

Saneamiento porcultivo in vitro de meristemos

Luzartificial

Evaluacinsanitaria

Aclimatacin

Micropropagacin

Lab

ora

tori

oB

ajo

cu

bie

rta

Anexo 4. Esquema para la produccin de planta madre defresa libre de virus

Plantas libresde virus

Laboratorio

Bajo cubierta

Pla

nta

mad

rese

gund

o a

o

Cielo abierto

Propagacin en piso

(16 plantas / 32 m2)

Vitroplantasen maceta

con luz artificial(16 plantas delaboratorio)

Cultivo comercialde produccin

frutcola( 100 mil plantas / ha)

Vivero(1000 plantas x 100)

Plantas en macetacon luz artificial

(1 200 plantas/32m2)

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