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Seminario N° 2Microbiología General

Microscopia y Tinciones

Microscopía

Conceptos básicos: NA, resolución, partes del microscopio.

Microscopios: campo claro, campo oscuro, contraste defases fluorescencia confocal interferencia electrónico defases, fluorescencia, confocal, interferencia, electrónico debarrido, de transmisión, fuerza atómica, efecto tunel.

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Preparación de extendidos.

Tinciones: simples, diferenciales, especiales.

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Límite de resolución

Antony van Leeuwenhoek

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Descripción de Van Leeuwenhoek delos “pequeños animáculos“presentes en la placa dental. (Firstedition, Delft in Holland, 12 September1683, to Francois Aston, Pag.11).Dibujó bacilos, micrococos y espirilos.

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Máxima AN (teórica)

En objetivos secos:

n = 1 y alfa = 90° entonces

Apertura numérica

AN = 1

En la práctica AN = 0.95

(ángulo 72 °)

Índice de refracciónEn objetivos de inmersión:

n = 1.51 y alfa = 90° entonces AN = 1.51

En la práctica AN = 1.45

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Apertura numérica

Apertura Numérica (AN) = n . sen (alfa)n = índice de refracción del medio entre el objeto y el objetivo

(alfa) = mitad del ángulo descripto por el cono de luz que ingresa al objetivo.

Uso de un condensador

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Uso de Aceite de inmersión

•Máximo teórico de AN = 1: α = 90°, sin α = 1, naire = 1•Práctico: AN máx. = 0.95 ángulo de apertura ~ 72°•Máximo teórico AN = 1.51: α = 90°, sin α = 1, noil = 1.51

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Poder de Resolución

Distancia mínima entre dos puntos para que estos sean vistos como dos objetos individuales

R = λ / (NA objetivo + NA condensador)

Si luz verde λ = 550 nm , NA = 1.4 (para inmersión)

Entonces R = ?

R = λ /(2 NA)

Revolver

Ocular

Cabezal

Microscopio óptico

Objetivos

MacrométricoMicrométrico C d d

Platina

Ajuste de la platina

Brazo

Base

Micrométrico

Fuente de luz

Condensador

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Distancia de trabajo

Diafragma

Microscopía de campo claro

Campo claro Contraste de fases Campo Oscuro

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Microscopía de campo oscuroLa luz reflejada sobre el espécimen entra al

objetivo. Entonces observo el espécimen sobre unf dfondo oscuro.

Permite observar microorganismo vivos (sinteñir)

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Microscopía de contraste de fasesConvierte diferencias pequeñas en el n y la densidad

celular en variaciones de intensidad de luz fácilmentedetectadasdetectadas.

Permite observar microorganismo vivos (sin teñir) yseguir eventos dinámicos en células vivas (migración,división, etc.)

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Microscopía de Interferencia Diferencial (Nomarski)

Aprovecha los efectos de interferencia entre las ondas queatraviesan la célula, para crear una imagen de laestructura celular viva, nítida y tridimensional

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Célula epitelial de mejilla humana

Campo Claro Nomarski Campo Oscuro

Microscopía de fluorescencia

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Microscopía de fluorescencia

Sensibilidad: Mediantefluorocromos permite detectarla presencia de moléculas enbaja cantidad (DNA, proteínas)

Microscopía ConfocalCapacidad de obtener la imagen en secciones (planos)controlando la profundidad del espécimen.

Elimina el background !

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Microscopía Confocal vs

Microscopía de fluorescencia

FluorescenciaPierde detalle poralta señal de emisión

Confocal

Las secciones planopor plano permitenevidenciar diferenciasen estructuras

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MICROSCOPIODE LUZ

MICROSCOPIOELECTRONICO

Microscopía electrónica

Iluminación Haz de luz Haz de electrones

Longitud de onda 2000 Å - 7500 Å 370 nm

Lentes Vidrio Electromagnéticas

Medio Atmósfera Vacío

Resolución 0,2 um = 200 nm 0,0003 um = 0,3 nm

Magnificación 10 x - 2000 x 100 x - 450000 xMagnificación 10 x 2000 x 100 x 450000 x

Focalización Mecánica Eléctrica

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Microscopio electrónico de transmisión

Microscopio electrónico de barrido

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Microscopio de Fuerza Atómica

(AFM)

Microscopio de túnel de barrido

(Tunneling)

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PreparaciónPreparación de extendidos

y tinciones

Colorantes

Benzeno

+

Cromoforo

Solvente orgánico sin color

Grupo químico que imparteColor al solvente

Cromógeno

Colorante+

AuxocromoGrupo químico que permite la iniciacióndel cromóforo permitiendo la formaciónde sales y la unión a fibras y tejidos

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Tinción Simple Se utiliza para la visualización de lamorfología, el tamaño y la disposición

Tipos de

tinciones

Tinción Diferencial

g , y p

Separa entre grupos

Visualización de

Gram

Ácido alcohol resistentes

Flagelos

Cápsulaestructuras

Cápsula

Esporas

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Preparación de pun extendido

Tinción simple (procedimiento)

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Tinción negativa (procedimiento)

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Tinción de Gram

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Tinción de GramGram

Tinción de Ziehl-Neelsen

(BAAR)

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Tinción de Esporas (Schaeffer-Fulton)

Tinción de Esporas (Dorner)

Tinción de Cápsula

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Manipulación de cultivos