Modelo Proyecto Memoria de Título
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UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y PECUARIAS ESCUELA DE CIENCIAS VETERINARIAS EFECTO DE LA INMOVILIZACIÓN DE ANHIDRASA CARBÓNICA EN LA MEMBRANA DE LA CÁSCARA DE HUEVO DE GALLINA, SOBRE LA CRISTALIZACIÓN DE CARBONATO DE CALCIO Betzabé Yinaa Montt Riquelme Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario Departamento de Ciencias Biológicas PROFESOR GUÍA: MARIA SOLEDAD FERNANDÉZ G. Proyecto FONDECYT 1120172 y 1150681 Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile SANTIAGO, CHILE 2015
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UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y PECUARIAS
ESCUELA DE CIENCIAS VETERINARIAS
EFECTO DE LA INMOVILIZACIÓN DE ANHIDRASA CARBÓNICA EN LA MEMBRANA DE LA CÁSCARA DE HUEVO DE GALLINA, SOBRE
LA CRISTALIZACIÓN DE CARBONATO DE CALCIO
Betzabé Yinaa Montt Riquelme
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario Departamento de Ciencias Biológicas
PROFESOR GUÍA: MARIA SOLEDAD FERNANDÉZ G. Proyecto FONDECYT 1120172 y 1150681
Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile
SANTIAGO, CHILE 2015
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UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y PECUARIAS
ESCUELA DE CIENCIAS VETERINARIAS
EFECTO DE LA INMOVILIZACIÓN DE ANHIDRASA CARBÓNICA EN LA MEMBRANA DE LA CÁSCARA DE HUEVO DE GALLINA, SOBRE
LA CRISTALIZACIÓN DE CARBONATO DE CALCIO
Betzabé Yinaa Montt Riquelme
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario Departamento de Ciencias Biológicas
Nota Final: ………..…………………
Profesor Guía: M. Soledad Fernández. G Nota: Firma: Profesor Corrector: José Luis Arias Bautista Nota: Firma: Profesor Corrector: Héctor Adarmes Nota: Firma:
SANTIAGO, CHILE
2015
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AGRADECIMIENTOS
En esta etapa final de mi carrera como Médico Veterinario, quisiera agradecer en primer
lugar a mi madre, quien siempre estuvo ahí para apoyarme en estos años de estudio,
brindándome su amor, sustento y animo en situaciones en las que todo se veía oscuro.
A Carolina Beato, quien siempre me brindó su apoyo incondicional en todo momento, por
sus siempre acertados consejos que me ayudan cada día a ser una mejor persona y por
nunca dejar de creer en mi. Gracias por hacer cada día un día más feliz que el anterior.
A mis amigos por estar siempre ahí cuando el estrés sobrepasaba las ganas de seguir. Sobre
todo a Rúben Antileo, quien es mi amigo desde el primer día de universidad y que con el
tiempo se transformó en un hermano. A Karina Carrasco, Sofía Luna, Evelyn Vergara y
Rodrigo Alarcón por su hermosa compañía, quienes siempre lograban subirme el ánimo y
por siempre acompañarme y soportar mis momentos de estrés.
De igual forma, quiero dar las gracias a los docentes que me acompañaron en esta última
etapa. Especialmente a la Dra. María Soledad Fernández y Dr. José Luis Arias, por su
infinita paciencia, dedicación, compromiso y enorme calidad humana, en todo este proceso.
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ÍNDICE
I. CAPÍTULOS:
Introducción…………………………………………………………………….. 6
Revisión Bibliográfica…………………………………………………………. 7
Hipótesis, Objetivo General y Objetivos Específicos……………………… 11
Material y métodos…………………………………………………………….. 12
Resultados……………………………………………………………………….. 17
Análisis de los resultados……………………………………………………… 27
Discusión…………………………………………………………………………. 29
Conclusión………………………………………………………………………. 31
Bibliografía……………………………………………………………………... 32
II. FIGURAS: Nro. 1: Estructuras de la cascara del huevo de gallina………………….. 9
Nro.2: Cámara de cristalización……………………………………………... 13
Nro.3. Micropocillo control………………………………………………….. 13
Nro.4. Micropocillo N°2……………………………………………………….. 14
Nro.5. Micropocillo N°3………………………………………………………. 14
Nro.6. Micropocillo N°4………………………………………………………. 14
Nro.7 Membrana después de 24 hrs en ácido acético…………………….. 17
Nro.8 Micropocillo con depósito de cristales de calcita a las 4 hrs…….. 17
Nro.9 Cristales depositados en M2/MS,M2/AIM y M2/AS.……………….. 18
Nro.10 Cristales depositados en M3/MS,M3/AIM y M3/AS….………….. 19
Nro.11Cristales depositados en M4/MS, M4/AIM y M4/AS………………. 19
Nro.12 Cristales depositados en M2/MS, M2/AIM y M2/AS…..………… 21
Nro. 13 Cristales depositados en M3/MS, M3/AIM y M3/AS……………. 21
Nro.14 Cristales depositados en M4/MS, M4/AIM y M4/AS……………… 22
Nro.15 Cristales depositados en M2/MS,M2/AIM y M2/AS……………… 24
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Nro. 16 Cristales depositados en M3/MS, M3/AIM y M3/AS……………. 25
Nro. 17 Cristales depositados en M4/MS, M4/AIM y M4/AS…………….. 25
III. GRÁFICOS
N°1. Promedio del número de cristales en 2 hrs de incubación.………… 20
N°2. Promedio del tamaño de cristales en 2 hrs de incubación…………. 20
N°3. Promedio del número de cristales en 4 hrs de incubación…………. 23
N°4. Promedio del tamaño de cristales en 4 hrs de incubación………….. 23
N°5. Promedio del número de cristales en 24 hrs de incubación……….. 26
N°6. Promedio del tamaño de cristales en 24 hrs de incubación……….. 26
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IV. RESUMEN
La membrana de la cáscara de huevo (MCH) es una red de biopolímeros, esencialmente
formada por 2 capas de fibras entrecruzadas de proteínas (una externa y otra interna) que
tienen flexibilidad en solución acuosa y son permeables al agua y a los gases. En el
presente trabajo se utilizó MCH como una bioplataforma para la inmovilización de la
enzima Anhidrasa Carbónica (AC). La enzima AC se inmovilizó sobre la capa externa de la
membrana de cáscara de huevo a través de dos métodos: adsorción por atrapamiento y
reticulado, usando glutaraldehido como agente reticulador. Paralelamente se usó AC en
solución (1 mg de enzima anhidrasa carbónica de 2500 unidades/mg (SIGMA) en 1 mL de
agua desionizada). Se compararon estas dos variables junto a un control con MCH sin
tratamiento. Para evaluar el efecto de la inmovilización se ocupó SEM, para observar la
morfología, tamaño y número de los cristales depositados. De esta forma se pudo observar
que el depósito de cristales de calcita fue mayor en presencia de AC inmovilizada, versus
AC en solución. Al igual que el tamaño y la morfología de estos. En AC se observaron
calcitas con bordes lisos y regulares, en contraste con los cristales modificados encontrados
con AC en solución.
ABSTRACT
The eggshell membrane (MCH) is a network of fibrous biopolymers, essentially formed by
two layers of protein fibers (an external and an internal one), flexible in aqueous solution
and showing water and gas permeability. MCH was used in the present work as a bio
platform for immobilizing carbonic anhydrase (CA) enzyme. The CA enzyme was
immobilized on the outer layer of the egg shell membrane using two methods: adsorption
by entrapment and crosslinked using glutaraldehyde as crosslinking agent. Parallel CA was
used in solution (1 mg of carbonic anhydrase enzyme 2500 units / mg (Sigma) in 1 mL of
deionized water). These two variables were compared with untrated MCH as control. To
evaluate the effect of immobilization SEM was used to observe the morphology, size and
number of deposited crystals. Thus it was observed that the deposit of calcite crystals was
higher in the presence of immobilized CA, compare with CA in solution. Same for size and
morphology of these. In MCH with CA immobilized. Calcite crystal were observed with
smooth and regular edges, in contrast whit the modified crystals found in CA in solution.
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INTRODUCCIÓN
La biomineralización es un proceso por el cual los organismos vivos precipitan minerales
inorgánicos en matrices orgánicas (Ehrlich y Skinner, 2014). Para ello, se llevan a cabo
procesos como la extracción y la absorción de los minerales inorgánicos presentes en el
medio local, para su posterior incorporación a estructuras funcionales, con el fin de formar
diferentes estructuras biomineralizadas (Song et al., 2014).
Uno de los principales minerales presente en los procesos de biomineralización, es el
carbonato de calcio (CaCO3) que tiene 6 formas estructurales distintas, siendo la calcita su
forma más estable. Sin embargo, la precipitación del CaCO3 es muy lenta, por lo que
necesita la presencia de un catalizador biológico, el cual en este caso, es la enzima
anhidrasa carbónica (AC). La AC es una metaloenzima que cataliza la hidratación rápida
reversible de dióxido de carbono a bicarbonato y un protón. Sin embargo, la utilización de
enzimas in vitro es difícil, debido a su inestabilidad y la complejidad de mantener su
función catalítica en las reacciones químicas (Lu et al., 2013). Es por este motivo, que la
inmovilización enzimática (confinamiento físico de una enzima en una determinada región
para que su actividad catalítica se retenga), aparece como solución para esta problemática
(Wanjari et al., 2013).
Para lograr la biomineralización in vitro es necesario, entre otras cosas, poseer
microambientes confinados específicos, es decir, un soporte inerte o marco estructural que
contenga el microambiente donde la mineralización se llevará a cabo (Arias et al., 2007).
Actualmente existen muchos soportes o superficies en donde se estudia la
biomineralización y la inmovilización enzimática, siendo la membrana de la cáscara de
huevo de gallina una de ellas y la razón por la cual se ocupó en el presente trabajo como
soporte para la inmovilización enzimática de AC. En estudios anteriores se observó que la
AC en solución aumenta la velocidad de crecimiento de los cristales de carbonato de calcio
y contribuye a la fusión de los agregados de cristales (Fernández et al., 2004). Por lo
anterior, es que se considera importante determinar la influencia de la enzima AC sobre la
cristalización de carbonato de calcio y para ello se inmovilizo dicha enzima sobre la
membrana de la cáscara de huevo de gallina, utilizando esta última como plantilla para la
cristalización.
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REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
La biomineralización es un proceso que ha sido ampliamente estudiado a lo largo de los
años, ya que es un fenómeno que se encuentra en la gran mayoría de organismos y formas
de vida, como los moluscos, crustáceos, conchas, dientes, huesos, cáscara de huevos entre
otros (Song et al, 2014).
Algunos de ellos producen minerales tales como sílice, apatita, y carbonato, los cuales son
usados por estos organismos para formar sus características estructurales, como conchas y
esqueletos. Dentro de los minerales, el carbonato de calcio (CaCO3) es el principal material
inorgánico en estos sistemas biomineralizados. El CaCO3 se puede presentar en seis formas
estructurales distintas o polimorfos: calcita, aragonita, vaterita, monohidrato de carbonato
de calcio, hexahidrato de carbonato de calcio y carbonato de calcio amorfo (Muller et al.,
2013). Cabe destacar que de todos estos polimorfos, la vaterita es la forma más inestable,
mientras que la calcita es la más estable a temperatura ambiente y presión atmosférica
encontrándose en esqueletos de foraminíferos, equinodermos, cocolitos, en los prismas de
ciertas conchas de moluscos o incluso en los cálculos biliares (Zhou et al., 2010). Sin
embargo, la precipitación o la biomineralización de CaCO3 es muy lenta. Se considera que
la reacción CO2 + H2O ↔ H + HCO3- es un paso limitante en la velocidad del proceso, es
por eso que es necesaria la presencia de un catalizador que acelere esta reacción. El
catalizador biológico para dicha reacción es la enzima AC (Li et al., 2013).
La enzima AC (CA, EC4.2.1.1) es clasificada como una metaloenzima, ya que en su
estructura química contiene un ion de zinc que está coordinado por los anillos de imidazol
de 3 residuos de histidina: His94, His 96 e His119. La enzima AC es la encargada de
catalizar la hidratación rápida reversible de dióxido de carbono a bicarbonato y un
protón CO2 + H2O ↔ HCO3− + H+. Además de lo anterior, permite un aumento de la
deposición de CaCO3 en el proceso de la biomineralización (Muller et al., 2013).
Las enzimas son proteínas que catalizan reacciones químicas a través de la disminución de
la energía de activación; esto es posible debido a la alta selectividad, especificidad y
actividad en condiciones controladas. No obstante, la mayoría de las enzimas o
catalizadores son inestables y es muy difícil de mantener la enzima activa, cuando se utiliza
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en solución, a partir de la mezcla de reacciones después de su uso (Lu et al., 2013). Para
abordar esta problemática, es que se ha estudiado en el último tiempo, el uso de la
inmovilización enzimática.
La inmovilización enzimática se refiere a el confinamiento físico de una enzima en una
determinada región del espacio (de un soporte o un sustrato), de manera que su actividad
catalítica se retenga y pueda ser reutilizada en varias ocasiones en forma continua (Wanjari
et al., 2013).
Es a través de este método que se intenta resolver problemas como los dichos
anteriormente al momento de utilizar biocatalizadores en una reacción, como lo son: la
solubilidad de la proteína, mejorar el control de la reacción, evitar la contaminación del
producto por la enzima, además de reducir la inhibición de la enzima y mejorar la
especificidad enzimática (García et al., 2011). Existen dos métodos de unión de la enzima
al sustrato: métodos reversibles y métodos irreversibles. El primero significa que una vez
que el biocatalizador está unido al soporte no se puede separar sin destruir la actividad
biológica de la enzima o su unión al sustrato. Los procedimientos más comunes de este tipo
de inmovilización son por acoplamiento covalente, atrapamiento o micro encapsulación y
reticulación. La segunda inmovilización de tipo irreversible, es particularmente importante
para la inmovilización de enzimas lábiles y para aplicaciones en sistemas bioanalíticos. Los
procedimientos más comunes son por adsorción con interacciones no covalentes (García et
al., 2011).
Existen diversas estructuras que sirven como fijador para un biocatalizador. Entre ellas
encontramos la membrana de la cáscara de huevo de gallina que, forma parte de la cáscara
de huevo, uno de los sistemas de biomineralización más estudiados en el último tiempo,
debido a sus características, entre las cuales destacan la naturaleza del depósito mineral, la
ausencia de células entremezcladas con la estructura mineralizada y la rapidez de la
mineralización (Arias et al., 2007).
La cáscara de huevo de gallina es un biocomposito compuesto de una fase orgánica y otra
inorgánica. Químicamente está compuesta de 1,6% de agua, 95,1% de minerales, de los
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cuales 93,6% corresponden a carbonato de calcio en forma de calcita, 0,8% de carbonato de
magnesio y 0,73% de fosfato tricálcico y finalmente 3,3% de materia orgánica. En ella
ocurre nucleación heterogénea primaria y secundaria a partir de las mamilas (Fernández,
2000). Estructuralmente está constituida por cuatro capas: a) membrana de la cáscara, b)
capa mamilar, c) capa en empalizada y d) cutícula (Fig. 1).
Figura 1: Representa las estructuras de la cáscara del huevo de gallina (Fernández, 2000).
Las membranas de la cáscara de huevo de gallina, se encuentran dispuestas en dos capas,
una interna de 20 μm de grosor que está en contacto con la albúmina y otra externa de 50
μm de grosor que está situada entre la zona mineralizada de la cáscara y la membrana
interna. Sobre esta membrana externa, se ubica la capa mamilar, que corresponde a menos
de 1/3 del grosor de la cáscara (100 μm) (Fernández, 2000). Esta capa mamilar se encuentra
constituida por las mamilas, que son pequeñas masas de material orgánico distribuidas en la
superficie externa de la membrana externa y es a partir de estas estructuras, que se inicia la
mineralización por el depósito de cristales de calcita (Arias et al., 1991). A su vez, cada
mamila contiene osteopontina y queratán sulfato, este último forma parte de un
proteoglicano llamado mamilán, que se ha implicado en la nucleación de los primeros
cristales de calcita (Arias et al., 2007). Es por esta razón que el uso de la membrana de
cáscara de huevo de gallina ha sido ampliamente estudiado en el último tiempo como
soporte para la biomineralización, y, sumado a las proteínas insolubles y estables que
componen los filamentos de las membranas, han dado paso a la realización de diversas
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aplicaciones, tales como material adsorbente y de inmovilización enzimática (Arias et al.,
2007). Entre las enzimas que han sido inmovilizadas en la membrana de la cáscara de
huevo de gallina encontramos: D-amino oxidasa, catalasa, tirosina, ureasa y glucosa
oxidasa, las que han tenido un rendimiento óptimo. La técnica que se utiliza
mayoritariamente para la inmovilización de la enzima en la membrana de cáscara de huevo
y que se utiliza también en este trabajo, es la de adsorción seguida por reticulación con
glutaraldehído (D`Souza et al., 2013).
Considerando el papel que juega la AC en la formación de la cascara de huevo, resulta
importante determinar el efecto de la enzima AC inmovilizada en la membrana de la
cáscara huevo de gallina, sobre la cristalización in vitro de carbonato de calcio.
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HIPÓTESIS
Si, la enzima anhidrasa carbónica en solución incrementa la disponibilidad de carbonato
para la cristalización in vitro, entonces al inmovilizarla sobre la membrana de la cáscara de
huevo de gallina ésta debería aumentar la eficiencia de la cristalización.
OBJETIVO GENERAL
Evaluar el efecto de la inmovilización de anhidrasa carbónica en la membrana de la cáscara
de huevo de gallina, sobre la cristalización de carbonato de calcio.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Evaluar el efecto de la enzima anhidrasa carbónica inmovilizada sobre la membrana de
cáscara de huevo de gallina, sobre la morfología, tamaño y polimorfismo, de los cristales
de carbonato de calcio depositados.
2. Comparar la morfología, tamaño y polimorfismo de los cristales depositados en
presencia de anhidrasa carbónica en solución.
3. Comparar la morfología, tamaño y polimorfismo de los cristales de carbonato de calcio
depositados sobre membrana de cáscara de huevo de gallina sin tratamiento.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Inmovilización de anhidrasa carbónica sobre membrana de cáscara de huevo de gallina:
Se realiza una apertura del huevo en su polo posterior, con el fin de descartar su contenido
y lavar el interior con agua desionizada. Posteriormente, se vierte ácido acético al 1% en el
interior del huevo sin su contenido y se incuba durante 25 minutos. Luego, se extrae
cuidadosamente la membrana del huevo y se deposita en una placa Petri, en donde se deja
nuevamente con ácido acético al 1% durante 48 horas a una temperatura de 4°C. Cumplido
el tiempo correspondiente, se efectúan 4 lavados de la membrana con agua desionizada, de
5 minutos cada uno (Tembe et al., 2008). Luego, de esta membrana se obtienen 3 trozos de
20 mm de largo y 15 mm de ancho.
Uno de estos trozos es utilizado para inmovilizar la enzima AC, de la siguiente manera: se
disuelven 1 mg de enzima anhidrasa carbónica de 2500 unidades/mg (SIGMA) en 1 mL de
agua desionizada (solución madre). A continuación se colocan 100 μL de la solución
madre, sobre la membrana externa de la cáscara de huevo (mamilas) y se deja actuar 1
hora. Después se agregan 20 μL de glutaraldehido al 2,5% y se deja actuar por 30 minutos
(Tembe et al., 2008). Posteriormente, se procede a lavar la membrana con TRIS a pH 9 y
se deja en esta misma solución durante 24 horas a 4°C.
Posteriormente, cada una de las membranas (una membrana con enzima AC inmovilizada y
dos membranas sin enzima AC inmovilizada) son cortadas en tres partes, una de 5 mm
ancho por 5 mm de largo y dos de 5 mm de ancho por 20 mm largo.
Ensayo de cristalización:
Para la cristalización se usa una solución cloruro de calcio 200 mM en TRIS 200 mM a pH
9 y una solución de bicarbonato de amonio 20 mM en agua desionizada (Fernández et al.,
2004).
Para la realización de los ensayos de cristalización in vitro, se utiliza el método de difusión
de gases (Dominguez-Vera et al., 2000).
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(NH4)HCO3 (l) CO2 (g) + 2NH3 (g) + H2O
2NH3 + CO2 + CaCl2 + H2O CaCO3 + 2(NH4Cl)
Figura 2. Cámara de cristalización. El bicarbonato de amonio ((NH4)HCO3) depositado en el recipiente
cilíndrico se descompone en amoniaco (NH3), agua (H2O) y dióxido de carbono (CO2), creando una
atmósfera en la cual este último interacciona con el cloruro de Calcio (CaCl2) presente en los micropocillos
formando carbonato de calcio (CaCO3).
La cámara de cristalización consiste en una cámara tapada compuesta de una placa Petri de
vidrio de 85 mm de diámetro, que tiene un orificio central de 18 mm en su base, que la
comunica con un recipiente cilíndrico de vidrio de 50 mm de diámetro y 30 mm de altura.
La base de la placa es dividida en 10 partes equidistantes donde son ubicados los
micropocillos de poliestireno (Hampton Res, Laguna Niguel, CA).
Las tres membranas previamente preparadas (una membrana con enzima AC inmovilizada
y dos membranas sin enzima AC inmovilizada) son colocadas en sus respectivos
micropocillos y posteriormente montadas en la cámara de cristalización, ocupando la
siguiente nomenclatura:
Micropocillo N°1 (M1): Control, que contiene 35 μL de la solución de CaCl2 200 mM en
TRIS 200 mM a pH 9. Figura 3.
Figura 3: Relleno de color plomo representa CaCl2.
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• Membrana de cáscara de huevo sin tratamiento (MS)
Micropocillo N°2 (M2/MS): Se depositan 35 μL de la solución de Cloruro de Calcio 200
mM en TRIS 200 mM a pH 9, sobre la membrana de 5 mm de ancho y 5 mm de largo, que
es colocada en el fondo del micropocillo con las mamilas hacia la solución. Figura 4.
Figura 4: Relleno color plomo representa CaCl2 y relleno de color rojo, representa
membrana de la cáscara de huevo
Micropocillo N°3 (M3/MS): Se depositan 35 μL de la solución de Cloruro de Calcio 200
mM en TRIS 200 mM a pH 9. La membrana de 5 mm de ancho y 20 mm de largo, es
pegada en la parte superior del micropocillo con las mamilas hacia la solución. Figura 5.
Figura 5: Relleno color plomo representa CaCl2 y relleno de color rojo, representa
membrana de la cáscara de huevo. Sector corrugado, representa las mamilas de la membrana de la cáscara de
huevo.
Micropocillo N°4 (M4/MS): Se depositan 35 μL de la solución de Cloruro de Calcio 200
mM en TRIS 200 mM a pH 9. La membrana de 5 mm de ancho y 20 mm de largo, es
pegada en la parte superior del micropocillo con las mamilas hacia el exterior. Figura 6.
Figura 6: Relleno color plomo representa CaCl2 y relleno de color rojo, representa
membrana de la cáscara de huevo. Sector corrugado, representa las mamilas de la membrana de la cáscara de
huevo.
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• Anhidrasa carbónica inmovilizada en membrana de huevo (AIM)
Micropocillo N°2 (M2/AIM): Se depositan 35 μL de la solución de CaCl2 200 mM en
TRIS 200 mM a pH 9, sobre la membrana de 5 mm de ancho por 5 mm de largo, que es
colocada en el fondo del micropocillo con las mamilas hacia la solución. Figura 4.
Micropocillo N°3 (M3/ AIM): Se depositan 35 μL de la solución de CaCl2 200 mM en
TRIS 200 mM a pH 9. La membrana de 5 mm de ancho y 20 mm de largo, es pegada en la
parte superior del micropocillo con las mamilas hacia la solución. Figura 5.
Micropocillo N°4 (M4/AIM): Se depositan 35 μL de la solución de Cloruro de Calcio 200
mM en TRIS 200 mM a pH 9. La membrana de 5 mm de ancho y 20 mm de largo, es
pegada en la parte superior del micropocillo con las mamilas hacia el exterior. Figura 6.
• Membrana de cáscara de huevo con AC en solución (AS)
Micropocillo N°2 (M2/AS): Se depositan 35 μL de la solución de Cloruro de Calcio 200
mM en TRIS 200 mM a pH 9 más 10μ/mL de solución madre de AC, sobre la membrana
de 5 mm de ancho y 5 mm de largo, que es colocada en el fondo del micropocillo con las
mamilas hacia la solución. Figura 4.
Micropocillo N°3 (M3/AS): Se depositan 35 μl de la solución de Cloruro de Calcio 200
mM en TRIS 200 mM a pH 9 más 10μ/mL de solución madre de AC. La membrana de 5
mm de ancho y 20 mm de largo, es pegada en la parte superior del micropocillo con las
mamilas hacia la solución. Figura 5.
Micropocillo N°4 (M4/AS): Se depositan 35 μL de la solución de Cloruro de Calcio 200
mM en TRIS 200 mM a pH 9 más 10μ/mL de solución madre de AC. La membrana de 5
mm de ancho y 20 mm de largo, es pegada en la parte superior del micropocillo con las
mamilas hacia el exterior. Figura 6.
Finalmente se depositan 3 ml de la solución de (NH4) HCO3 en el recipiente cilíndrico que
forma parte de la cámara de cristalización. Posteriormente la placa se cubre con una tapa, se
sella con parafilm, para posteriormente dejar incubando las horas correspondientes
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(Fernández et al., 2004). Los ensayos se realizaron por: 2, 4 y 24 horas a temperatura
ambiente.
Pasadas las respectivas horas, se separan las membranas de los micropocillos y se colocan
en una placa Petri, en donde son lavadas con agua desionizada y posteriormente son
deshidratadas en alcohol de concentraciones crecientes. Luego, cada membrana son
sombreadas con oro utilizando un equipo sombreador Electron Microscopy Sciences EMS-
550 (Automated Sputter Coated), para finalmente observar las muestras en un microscopio
electrónico de barrido (TESLA BS-343A, Inspect F-50, PHENOM WORL, HITACHI TM
3000).
Análisis cualitativo de las preparaciones
Cada preparación fue observada utilizando el microscopio electrónico de barrido (TESLA
BS-343A, Inspect F-50, PHENOM WORDL, HITACHI TM 3000), con el objetivo de
evaluar el efecto de la enzima AC inmovilizada sobre la membrana de cáscara de huevo,
sobre la morfología, tamaño y polimorfismo, de los cristales de carbonato de calcio
depositados. A su vez, se compararon la morfología, tamaño y polimorfismo de los cristales
depositados en presencia de AC en solución y sobre membrana de cáscara de huevo sin
tratamiento. La evaluación del tamaño de los cristales, se realizó mediante las herramientas
de medición del programa del computador del microscopio electrónico.
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RESULTADOS
De acuerdo a los ensayos realizados, se determinó el tipo de polimorfo de CaCO3, la
morfología y tamaño de los cristales obtenidos, evaluando la influencia que tendría la
enzima AC inmovilizada en la membrana de la cáscara de huevo de gallina, en la formación
de los cristales anteriormente mencionados. Para esto se utilizaron 3 variables las cuales
fueron puestas en diferentes horas (2, 4, 24 horas).
• Membrana Control
Primero se evaluó la membrana que fue expuesta durante 24 horas a ácido acético, con el
fin de demostrar que no existe crecimiento de calcita previo a los experimentos en cada
membrana
Figura 7: Membrana después de 24 horas en ácido acético.
• Micropocillo Control
Paralelamente se evaluó el micropocillo expuesto a las 4 horas solo con CaCl2 en la
solución. Esto, con el fin de demostrar que existe un depósito real de cristales de calcita
en presencia de CaCl2.
Figura 8: Micropocillo con depósito de cristales de calcita a las 4 horas.
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•
• Membrana en el fondo del micropocillo:
Incubación de 2 horas:
Para el ensayo realizado a las dos horas de incubacion, se evaluó primero los micropocillos
que contenían la membrana de cáscara de huevo de gallina en el fondo de este mismo, en
sus tres variables: Membrana sin tratamiento (MS), Anhidrasa Carbónica inmovilizada
(AIM) y Anhidrasa Carbónica en solución (AS).
En M2/MS (micropocillo con MS) se observan sobre las membranas: escasas calcitas, que
se encuentran modificadas con bordes redondeados y calcitas fusionadas. En M2/AIM
(micropocillo con AIM) se apreció un gran número de cristales de calcita aislados, con
caras lisas y simétricas. En M2/AS (micropocillo con AS) se observó en su gran mayoría
cristales modificados con bordes redondeados y en menor cantidad, calcitas con bordes
lisos y simétricos.
Figura 9: Cristales depositados en M2/MS, M2/AIM y M2/AS, 500x.
• Membrana pegada en la parte superior con mamilas hacia la solución:
Dentro de las mismas dos horas de incubación, se evaluó los micropocillos que contenían la
membrana de la cáscara de huevo de gallina, pegadas en la parte superior del micropocillo
con las mamilas hacia la solución. En M3/MS (micropocillo con MS) no se observa un
depósito de calcita. En M3/AIM (micropocillo con AIM) se observan tanto cristales de
calcita con caras lisas y simétricas como calcitas fusionadas. En M3/AS encontramos
calcitas modificadas en su gran mayoría, con bordes romos y también calcitas con bordes
lisos y simétricos.
M2/AIM
M2/AS M2/MS
19
Figura 10: Cristales depositados en M3/MS, M3/AIM y M3/AS, 500x.
• Membrana pegada en la parte superior con mamilas hacia el exterior:
Continuando en las dos horas de incubación se evaluó los micropocillos que contenían la
membrana de la cáscara de huevo de gallina pegada en la parte superior del micropocillo
con las mamilas hacia el exterior. En cuanto a la morfología, encontramos en M4/MS
escasas calcitas modificadas con sus bordes redondeados. En M4/AIM se observan calcitas
con bordes lisos y simétricos. En M4/AS se observan calcitas modificadas.
Figura 11: Cristales depositados en M4/MS, M4/AIM 500x y M4/AS 485x.
Analizando en conjunto las 3 condiciones (membrana en el fondo del micropocillo,
membrana pegada en la parte superior con las mamilas hacia el interior y membrana pegada
en la parte superior del micropocillo con mamilas hacia el exterior) en la incubación de 2
horas y con respecto específicamente al número de los cristales de calcita, se observó un
aumento en el número de los cristales en M3, tanto de AIM como de AS. Cabe mencionar
que el número de cristales fue mayor en todos los micropocillos que contenian AIM en
comparacion con MS y AS.
A continuación se muestran los gráficos que representan el número de los cristales de
calcita en MS, AIM y AS en 2 horas de incubación.
M3/AIM M3/AS
M4/MS M4/AIM M4/AS
M3/MS
20
Gráfico 1. El gráfico muestra el número de los cristales obtenidos en los micropocillos M2, M3 y M4 en sus
presentaciones: MS (azul), AIM (Rojo) y AS en solución (verde).
Con respecto al tamaño de los cristales obtenido Se observó que en M2 los cristales con AS
fueron de mayor tamaño que las otras variables. Sin embargo en M3 y M4 esta condición se
invirtió, siendo AIM la que presento un mayor tamaño en sus cristales.
Gráfico 2: El gráfico muestra el tamaño de los cristales obtenidos en los micropocillos M2, M3 y M4 en sus
presentaciones: MS, AIM y AS
Número de cristales
de calcita
Tamaño de cristales
de calcita (μm)
21
•
- Membrana en el fondo del micropocillo:
Incubación de 4 horas:
Al igual que en los experimentos realizados a las 2 horas incubación, se evaluó en primer
lugar los micropocillos que contenían la membrana de cáscara de huevo de gallina en el
fondo de este mismo. En cuanto a la morfología, observamos tanto en M2/MS como en
M2/AIM, calcitas con bordes lisos y simétricos. En cambio, en M2/AS se observan en
mayor cantidad calcitas modificadas, con bordes redondeados.
Figura 12: Cristales depositados en M2/MS, M2/AIM y M2/AS, 500x
- Membrana pegada en la parte superior con mamilas hacia la solución:
En los micropocillos que contenían la membrana de huevo de gallina pegadas en la parte
superior de estos con las mamilas hacia la solución, se observó morfológicamente en los 3
micropocillos (M3/MS, M3/AIM y M3/AS) la presencia de calcitas modificadas y
fusionadas.
Figura 13: Cristales depositados en M3/MS, M3/AIM 500x y M3/AS 485x
M2/MS M2/AIM M2/MS
M3/MS M3/AIM M3/AS
22
- Membrana pegada en la parte superior con mamilas hacia el exterior:
Continuando en las cuatro horas, se evaluó los micropocillos que contenían la membrana de
la cáscara de huevo pegada en la parte superior del micropocillo, con las mamilas hacia el
exterior. En cuanto a la morfología, observamos calcitas modificadas en M4/MS pero
mayoritariamente calcitas con bordes lisos y simétricos. En M4/AIM se encuentra un gran
número de calcitas con bordes lisos. En M4/AS se observan calcitas modificadas.
F
Con respecto al número de los cristales de calcita se observó un aumento en el número de
los cristales en M3 y M4 de AC en solución. Sin embargo, en M2 se observó un numero
mayor de cristales de calcitas en AC inmovilizada. Cabe mencionar que para MS se obtuvo
un bajo numero en los 3 micropocillos en comparacion con AIM y AS.
A continuación se muestran los gráficos que representan el número de los cristales de
calcita en MS, AIM y AS. Con 4 horas de incubación.
M4 M7 M10
M4/MS M4/AIM M4/AS
Figura 14: Cristales depositados en M4/MS, M4/AIM y M4/AS. 500x
23
Número de
cristales de
calcita
Gráfico 3: El gráfico muestra el número de los cristales obtenidos en los micropocillos M2, M3 y M4 en sus
presentaciones: MS, AIM y AS.
Con respecto al tamaño de los cristales de calcita, se observó que en los 3 micropocillos el
tamaño fue mayor en AIM, en comparación con las otras tres variables. Sin embargo, en el
micropocillo 3 se apreció un promedio parecido entre MS y AIM. En el micropocillo 4 el
tamaño de los cristales fue menor en comparación con los otros micropocillos.
Gráfico 4: El gráfico muestra el tamaño de los cristales obtenidos en los micropocillos M2, M3 y M4 en sus
presentaciones: MS, AIM y AS.
Tamaño de cristales
de calcita (μm)
24
•
- Membrana en el fondo del micropocillo:
Incubación de 24 horas:
Al igual que en los experimentos realizados a las 2 y 4 horas de incubación, se evaluó en
primer lugar los micropocillos que contenían la membrana de cáscara de huevo en el fondo
de este mismo. En cuanto a la morfología, observamos que en M2/MS se encuentran
calcitas modificadas con bordes cóncavos y un tamaño promedio de 14,85 µm. En
M2/AIM observamos calcitas con bordes lisos y simétricos, con un tamaño promedio de
30,1 µm. En M2/AS se observan calcitas modificadas con un tamaño de 20 µm.
Figura 15: Cristales depositados en M2/MS 500x, M2/AIM 1000x y M2/AS 1000x
- Membrana pegada en la parte superior con mamilas hacia la solución:
Dentro de las mismas 24 horas se evaluaron los micropocillos que contenían la membrana
de la cáscara de huevo, pegadas en la parte superior del micropocillo con las mamilas hacia
la solución. En cuanto a la morfología, observamos que en M3/MS se encuentran calcitas
modificadas con bordes cóncavos con un tamaño promedio de 29,58 µm. En M3/AIM se
encuentran abundantes calcitas con bordes lisos, simétricos y algunas calcitas con bordes
cóncavos, el tamaño promedio de los cristales es de 23,97 µm. En M3/AS observamos
abundantes calcitas modificadas con bordes cóncavos de un tamaño promedio de 21,49
µm.
M2/MS M2/AIM M2/AS
25
Figura 16: Cristales depositados en M3/MS 500x, M3/AIM 300x y M3/AS 500x
- Membrana pegada en la parte superior con mamilas hacia el exterior:
Finalmente se evaluaron los micropocillos que contenían la membrana de la cascara de
huevo de gallina pegada en la parte superior del micropocillo con las mamilas hacia el
exterior. En cuanto a la morfología, observamos que en M4/MS se encuentran calcitas
modificadas con un tamaño promedio de 30,28 µm. En M4/AIM observamos abundantes
calcitas con bordes lisos simétricos y algunos fusionados de un tamaño promedio de 21,57
µm. En M4/AS observamos abundantes calcitas modificadas de un tamaño promedio de
25,29 µm.
Figura 17: Cristales depositados en M4/MS, M4/AIM y M4/AS. 500x
En cuanto al número de cristales de calcita depositada a las 24 horas, se observó que para
los 3 micropocillos la variante AIM mostro un número superior en comparación a las otras
dos variantes.
M3/MS M3/AIM M3/AS
M4/AIM M4/MS M4/AS
26
Gráfico 5: El gráfico muestra el número de los cristales obtenidos en los micropocillos M2, M3 y M4 en sus
presentaciones: MS, AIM y AS.
Con respecto al tamaño de los cristales de calcita, se observó que en los 3 micropocillos el
tamaño fue mayor en AIM, en comparación con las otras tres variables. En cambio para las
variables MS y AS, el promedio en el tamaño fue similar tanto en el micropocillo 2 como
en el micropocillo 4.
Gráfico 6: El gráfico muestra el tamaño de los cristales obtenidos en los micropocillos M2, M3 y M4 en sus
presentaciones: MS, AIM y AS.
Número de
cristales de
calcita
Tamaño de cristales
de calcita (μm)
27
ANALISIS DE LOS RESULTADOS
Para el análisis cualitativo de los cristales obtenidos de cada solución preparada, se
consideraron cinco mediciones de tamaño de cristal por campo, y 6 campos por cada
micropocillo. Estos valores fueron analizados y se obtuvo la media y desviación estándar
para cada grupo.
Tabla 1: Número promedio y desviación estándar de los cristales de calcita obtenidos en
cada micropocillo.
Hora Micropocillos Promedio
MS
Desviación
Estándar
MS
Promedio
AIM
Desviación
estándar
AIM
Promedio
AS
Desviación
estándar
AS
2
M2 0,83 0,89 12 9,76 6,83 1,77
M3 0 0 23,5 2,92 15 3,51
M4 0,33 0,47 21 4,28 10,83 2,19
4
M2 5,83 2,03 12,66 2,86 6,66 2,56
M3 4 0,81 9,40 1,95 18,66 4,88
M4 3 1,29 9,33 1,79 22,66 10,15
24
M2 10,16 5,45 12,16 2,11 5,66 3,19
M3 8,16 1,67 25,83 3,13 16,16 3,97
M4 7,83 3,43 15,16 2,67 13,66 2,86
28
En los resultados obtenidos se pudo apreciar que el número de cristales de calcita
depositados en la membrana de la cascara de huevo que se encontraba sin tratamiento y con
AC en solución, aumentaba de acuerdo a las horas del experimento. En contraste con AIM
que mostro un crecimiento exponencial, pero con una descenso a las 4 horas
específicamente en M3.
Asimismo se observa que los promedios obtenidos en M3 para casi todas las variables y
horas, fue mayor en comparación con M2 y M4. Con la excepción de AS a las 4 horas que
mostro un mayor número de calcitas en M4.
También es importante recalcar que el promedio de número de cristales depositados en
AIM fue mayor en casi todos los casos en comparación con AS, con excepción de M3 y
M4 en el experimento realizado a las 4 horas.
Tabla 2: Tamaño promedio y desviación estándar de los cristales de calcita obtenidos en
cada micropocillo
Hora Micropocillos Promedio
MS
Desviación
Estándar
MS
Promedio
AIM
Desviación
estándar
AIM
Promedio
AS
Desviación
estándar
AS
2
M2 16,66 3,19 14,5 2,62 20,66 4,06
M3 0 0 29,5 3,45 21,33 1,69
M4 5,83 8,37 23,16 1,86 22,33 4,49
4
M2 9,16 1,34 21,83 4,66 17,83 2,91
M3 27,66 4,71 28 4,65 23,33 3,72
M4 11.16 1,95 14,16 3,62 10,33 1,69
29
24
M2 21,33 1,97 31 2,08 20,5 3,68
M3 22 1,91 35,83 3,53 27,83 2,47
M4 20,33 5,05 21,33 2,56 20,16 3,23
En los resultados obtenidos en el promedio del tamaño de los cristales de calcio
depositados, observamos que en las tres variables se observa un incremento en el tamaño a
medida que aumentan las horas.
Además se observa que el tamaño en AIM es mayor que en las otras variables en la
mayoría de los micropocillos y horas de experimento, con excepción de M2 a las 2 horas,
en donde AS tiene un promedio mayor en el tamaño de los cristales de calcita.
Cabe destacar que el tamaño de los cristales de calcita se condice con el promedio del
número de estas, vistas en la tabla 1, en donde en M3 y M4 a las 4 horas, se observa un
número menor de AIM en comparación con AS. Pero en esta misma situación el promedio
del tamaño de AIM es mayor que AS, es decir que, si bien el número de cristales de calcitas
depositados disminuye, aumenta el promedio del tamaño de estos mismos.
Observamos también que existe diferencia en el depósito de cristales, dependiendo de cómo
está dispuesta la MCH. Cuando la membrana se encuentra depositada en el fondo de la
membrana con la membrana externa hacia el exterior (M2) existe un depósito de cristales
de calcita en la superficie, en las tres variables (AIM, AS y MS). Esta misma situación se
observa en las membranas que se encuentran pegadas en la superficie pero con las mamilas
hacia el exterior (M4). Esta situación se puede explicar debido a que la membrana es
permeable, con lo cual la solución que se encuentra bajo la membrana, puede difundir o
bien la membrana en el proceso del experimento pudo sufrir un cierto curvamiento, lo que
hizo que la solución con AC quedara sobre ella y se depositaran cristales de calcita.
30
Sin embargo cuando la MCH se encuentra puesta en la superficie del micropocillo con las
mamilas hacia el interior de esta (M3), existe no tan solo un depósito de cristales de calcita,
sino también un crecimiento desde la membrana, manifestado en el fusionamiento de los
cristales de calcita. Esta situación solo ocurre en las membranas que contienen la enzima
AC inmovilizada, ya que cuando la membrana se encuentra sin tratamiento o con AC en
solución, solo existe un depósito de cristales. Esta situación se debe a que al estar la parte
de la membrana externa con las mamilas hacia la solución, estas contribuyen a una
agregación y posterior crecimiento de calcita desde estas mamilas. Es por eso que en el
caso de M3 se observan cristales fusionados y aglomerados.
31
DISCUSIÓN
Desde el año 1971 que existen publicaciones en las cuales se mencionan experimentos
utilizando la membrana de la cascara de huevo. Desde éste año hasta la fecha, son muchas
las investigaciones que se han hecho en torno a esta membrana, debido a sus propiedades
únicas, que son resultado de su compleja estructura. Dentro de estas características
encontramos su excelente capacidad como sustrato tanto para la cristalización, como para
la inmovilización (Matej, 2014).
Como se mencionó anteriormente, la MCH es uno de los sustratos utilizados como soporte,
debido a su composición de fibras proteicas (biopolímeros fibrosos) que forman una
membrana semipermeable, similar a una red. Igualmente, posee una red intrincada de fibras
estables e insolubles en agua y tiene un área de alta superficie (Arias et al., 2007).
Se han descrito diferentes técnicas para lograr la inmovilización enzimática, dentro de ellas
se encuentra, la adsorción física (por atrapamiento o inclusión a membrana) y la unión
química (por unión a soportes y reticulado), no obstante, el más utilizado es la unión
química por reticulado (Dussan, 2008). Estos dos enfoques son los que se utilizaron en el
presente trabajo. La adsorción física, añadiendo la enzima sobre la MCH y la unión química
por reticulado usando como reactivo bifuncional el glutaraldehido al 2,5% (Poletto et al.,
2011), añadiendo la enzima más glutaraldehído sobre la MCH.
En relación a la presente memoria, se comprobó el efecto que tiene la enzima Anhidrasa
carbónica (AC) que se encuentra inmovilizada sobre MCH versus AC en solución.
Recordemos que la enzima AC es la enzima encargada de catalizar la ionización del
dióxido de carbono (CO2) para formar el ácido carbónico (H2CO3) (Espinosa y Sierra,
2010). Además de lo anterior, permite un aumento de la deposición de CaCO3 en el proceso
de la biomineralización (Muller et al., 2013).
La enzima AC, está presente en el proceso de mineralización en la cáscara de huevo de
gallina en forma natural. Se ha descrito que en este proceso de mineralización se presentan
32
tres etapas: 1° la etapa inicial cuando los primeros cristales de calcita se depositan. 2° la
fase de crecimiento activo cuando hay una deposición mineral rápida, durante la formación
de la capa empalizada y 3° la fase terminal, donde ocurre una detención de la calcificación
y deposición de la capa más externa, la cutícula (Gómez et al, 2015).
En la primera fase, los cristales de calcita se depositan sobre la superficie de las mamillas,
es importante recordar que la base de las mamilas contiene osteopontina pero en su
superficie contiene queratan sulfato el cual forma parte de un proteoglicáno llamado
mamilan. A partir de estas mamilas se inicia la mineralización por depósito de calcita
(Fernández, 2000). Luego, comienzan un crecimiento en altura y verticalmente hasta las
membranas de la cáscara (Fernández et al, 2004). Esta situación es la que observamos en
los micropocillos que contenían membrana de huevo sin tratamiento, en los cuales existe un
crecimiento debido a los componentes naturales de dicha membrana. De esta misma forma
los micropocillos que contenían la MCH en la parte inferior del micropocillo, para
cualquiera de las variables y a distintas horas, se observa que existe un depósito de cristales
de calcita, pero no así un crecimiento desde la membrana.
Sin embargo, los micropocillos que contenían AC en solución, presentaron un depósito de
cristales modificados en MCH, debido a que la enzima actuaba antes de que los cristales se
depositaran en MCH. Esta situación también fue expuesta por Fernández et al, 2004.
Ahora bien, en los experimentos que contenían AC inmovilizada y AC en solución, se
observó que hubo un crecimiento desde estos cuerpos mamilares. Sobre todo cuando los
experimentos fueron realizados con la MCH colocada en la parte superior del micropocillo
con la membrana externa hacia la solución de CaCl2. Esta situación se condice con lo
ocurrido en la cáscara de huevo in vivo, en donde durante las etapas iniciales de la
formación de cáscara de huevo, los cuerpos mamilares calcificados se pueden visualizar.
Sin embargo cuando avanza la calcificación se pierden y finalmente toda la superficie de la
cáscara de huevo está organizada como una capa continua de carbonato de calcio, excepto
en los sitios de poros (Fernández et al, 2004).
33
CONCLUSIÓN
El método de difusión de gases constituyó una excelente forma de generar cristales de
CaCO3. Debido a esto, se obtuvieron numerosos cristales que sirvieron para analizar el
efecto de la enzima AC inmovilizada en la membrana de la cáscara de huevo de gallina,
versus AC en solución. Para la presente tesis, se consideró un análisis de los cristales
mediante SEM constituyó un buen método para el análisis morfológico de las distintas
formas, mostrando ampliamente los efectos de AC en los cristales obtenidos.
Así también, la membrana de cáscara de huevo (MCH) resultó ser un excelente soporte
para la inmovilización de la enzima AC. Este efecto se demostró mayoritariamente en los
micropocillos que contenían la MCH pegada en la superficie de este, pero con las mamilas
hacia la solución de CaCl2 (M3). Ya que en estos casos y en las diferentes horas que se
analizó en este trabajo (2, 4 y 24 horas), se presentó un crecimiento de cristales de calcita
desde la membrana.
No obstante, no es posible estimar cuantos gramos de la enzima AC están efectivamente
inmovilizados en la membrana de la cáscara de huevo, por lo cual se necesitaría hacer una
investigación en paralelo para medir este efecto.
En conclusión, la presencia de la enzima AC inmovilizada presento una mayor eficiencia al
momento de ayudar en el depósito de cristales de calcio en comparación con AC en
solución.
34
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