“Modelos celulares para la confirmación de la patogenicidad de nuevas mutaciones en el mtDNA y

su aplicación al estudio de posibles compuestos terapéuticos. Terapia génica para las enfermedades

mitocondriales”.

Julio Montoya Departamento de Bioquímica, Biología Molecular y Celular

CIBER de Enfermedades Raras (CIBERER)

Universidad de Zaragoza

Enfermedades Genéticas Mitocondriales

Grupo de trastornos originados por defectos en el sistema de fosforilación oxidativa que

conlleva una deficiencia en la producción de ATP.

Oxidative phosphorylation system (OXPHOS)

2

14

C. V

13 3 1 - 7 Codified in mtDNA

> 85 13 11 4 > 43 Number of subunits

Total C. IV C. III C. II C. I

Herencia de las enfermedades genéticas

mitocondriales

•Mendeliana.-

Para genes mitocondriales codificados en el DNA nuclear

•Materna Para genes mitocondriales codificados en el DNA mitocondrial

Mapa genético del

mtDNA humano

16.569 pb

1.000-10.000 copias/cel.

37 genes

Información compacta

Genética Mitocondrial

• Herencia Materna

• Segregación mitótica

• Efecto Umbral

• Alta Velocidad de Mutación

•Carencia de recombinación

Mutaciones nuevas:

Secuenciación del mtDNA completo

MUTACIONES NUEVAS EN EL mtDNA

•Se conocen más de 150 mutaciones puntuales en el mtDNA asociadas a

enfermedades.

•A pesar de ello, se siguen encontrando mutaciones nuevas

•Para poder declararlas como mutaciones patológicas, éstas deben de

cumplir una serie de criterios

Criterios de Patogenicidad

5.1.- La mutación debe de estar presente en pacientes y ausente en individuos control. 5.2.- La mutación debe de encontrarse en fondos genéticos diferentes. 5.3.- Existencia de correlación entre el porcentaje de la mutación y el fenotipo. 5.4.- La mutación debe de ser la mejor candidata a ser patogénica. 5.5.- La mutación debe afectar a nucleótidos muy conservados evolutivamente. 5.6.- La mutación debe afectar a dominios funcionales importantes de las proteínas. 5.7.- La transferencia de un mtDNA con una mutación a líneas celulares sin mtDNA, debe de ir acompañada de una transferencia del defecto molecular y/o celular: Construcción de cibridos transmitocondriales.

A New Pathologic Mitochondrial DNA Mutation in

the Cytochrome Oxidase Subunit I (MT-CO1)

María D. Herrero-Martín, Mercedes Pineda, Paz Briones, Ester López-Gallardo,

Magdalena Carreras, Mercedes Benac, Miguel Angel Idoate, María A. Vilaseca,

Rafael Artuch, Manuel J. López-Pérez, Eduardo Ruiz-Pesini, and Julio Montoya

HUMAN MUTATION 29:E103-E111, 2008

mtDNA point mutations

More than 100 mtDNA point mutations in have been described associated to different

phenotypes

Only a few of then have been frequentlyly associated to specific phenotypes (3243-MELAS; 8344-MERRF; 8993-Leigh and NARP; 3460, 11778, 14484-LHON, etc)

16-18% of the have a mutation in their mtDNA

New mutations increases this number to 20%. The others remain without a clear

molecular diagnostic.

Do this patients have nuclear mutations in genes that codify for components of the

OXPHOS system?

Do they suffer a real mitochondrial disease?

Are we missing patients, mainly children, with a very mild phenotype?

13 years old girl

Personal clinical history

Non-consanguineous parents: high blood pressure and

hypercholesterolemia

Normal pregnancy

Normal development during first years

Retarded speech development and moderate mental retardation (5 yo)

Loss of appetite

Recurrent diarrhoea and abdominal pain

Hypercholesterolemia

High transaminase levels

Retarded weight and height

Weakness

Slower at running than the children of the same age

Moderate mental retardation: special program of integration.

Examination at 13 yo

Normocephalia

Low weight

Growth retardation

Pes cavus

Moderate mental retardation

Anorexia

Generalized muscle atrophy

Weakness with fatigability to climb stairs

EMG: myopathic pattern

Mitochondrial disease?

Myopathic pattern

Pyruvate

Laboratory

parameters Haemogram

Organic

acids

Aminoacids

ECG

Hepatic

ultrasound

scan

Plasmatic

carnitine

EMG RMI-S

Audiometric

test

Hyperintensity

caudate nucleus

Cortex atrophy Lactate peak in

fronto-temporal-

occipital regions

CPK LDH

CSF

Blood

Lactate

Lactate

Hematoxiline-eosine staining Complex IV staining Subsarcolemmal acumulation of

mitochondria

Muscle biopsy

Morphological analysis

Subsarcolemmal accumulations of mitochondria

Atrophic type II fibers

Histochemical analysis

Most of the muscle fibers: COX-negative Some type I COX-positive fibers Absence of ragged- red fibers (RRF)

Specific activity

(nmol/min/mg prot)

mU/UCS

Patient Control

range

Patient Control

range

NADH:cyt c oxidoreductase

(Complex I+III)

12 (m) 12-56 (m) 41 (38.3%) (m) 107-560 (m)

Succinate:cyt c oxidoreductase

(Complex II+III)

6 (85.7%) (m)

6.5 (f)

7-24 (m)

2.4-17 (f)

21 (28.0%) (m)

0.24 (f)

75-149 (m)

0.14-1.0 (f)

Succinate:DCPIP oxidoreductase

(Complex II)

9 (m) 4-10 (m) 31 (93.9%) (m) 33-69 (m)

SDH (+PMS) 10 (m) 10-25 (m) 34 (59.6%) (m) 57-239 (m)

Decilubiquinol:cyt c oxidoreductase

(Complex III)

81 (m) 55-259 (m) 279 (45.7%) (m) 610-1760 (m)

Cytochrome oxidase

(Complex IV)

26 (44.1%) (m)

33 (f)

59-170 (m)

16-48 (f)

90 (15.3%) (m)

1.22 (84.1%) (f)

590-1300 (m)

1.45-3.13 (f)

Citrate synthase (CS) 290 (m)

27 (f)

71-200 (m)

11-29 (f)

Isolated C-IV deficiency Multienzymatic deficiency

Respiratory chain activity

Clinical symptoms: ETC disease

ETC:

-ETC: multienzymatic deficiency:

- mtDNA depletion, deletion

- Mitochondrial tRNA mutations

-CIV deficiency:

- Mutations of CIV genes encoded in mtDNA

- Mutations of CIV structural or assembly genes encoded in

nDNA

Muscle biopsy: No RRF and COX negative fibers:

- Mutations of CIV assembly genes encoded in nDNA

Where to check for mutations?

Sequencing of CIV genes encoded in mtDNA

CO I, COII , CO III subunits

G6955A

Molecular-genetic analysis Deletions, mtDNA Depletion

Gly351Asp Not found in more than 4,000 sequences from patients and controls of all around the world

CO I

Whole mtDNA sequence

Haplogroup H11

MT-GENE GENETIC VARIANTS

MT-RNR m.750A>G (MT-RNR1), m.961T>G (MT-RNR1), m.1438A>G (MT-RNR1)

MT-T rCRS

MT-ND m.4769A>G (S-p.MT-ND2), m.13759G>A (NS-p.MT-ND5:Ala475Thr)

MT-CYB m.15326A>G (NS-p.MT-CYB:Thr194Ala)

MT-CO m.6955G>A (NS-p.MT-CO1:Gly351Asp)

MT-ATP m.8448T>C (NS-p.MT-ATP8:Met28Thr), m.8860A>G (NS-p.MT-

ATP6:Thr112Ala)

MT-DLOOP m.195T>C (MT-DLOOP), m.263A>G (MT-DLOOP), m.309Ci (MT-DLOOP),

m.315Ci (MT-DLOOP), m.16265A>C (MT-DLOOP), m.16293A>G (MT-

DLOOP), m.16311T>C (MT-DLOOP)

Molecular-genetic analysis

Heteroplasmy

Controls/Haplogroup

- 4020 mtDNA pusblished sequences

- Haplogrupo H11

Requirements to be pathologic…

% of mutation

Fibroblasts: Normal enzymatic activities

Muscle: Low complex IV activity

Conservation indexes of different aminoacid positions

Mutations Mammals

(227)

Aves

(125)

Reptils

(50)

Amphibia

(73)

Fishes

(322)

No

Vertebrates

(510)

Total

(1307)

%

(100)

S142F 227 125 50 73 322 411 1208 92.4

L196I

226 125 49 72 321 441 1234 94.4

M273T 227 125 50 73 321 493 1289 98.6

I280T

227 125 50 73 322 502 1299 99.4

G317S 227 124 50 73 322 494 1291 98.8

Media 96.7

G351D 227 125 50 73 322 505 1302 99.6

Requirements to be pathologic…

This change never has described in humans but it has been found in S. cerevisiae and

Rhodobacter spheroides and all of them are respiratory deficient mutants

G6955A: GGT GAT Gly351Asp (COI)

Gly351

His 378

His 376

Heme a

Heme a3

CuB

Asp351

CuB

Heme a3

His 378

Heme a

His 376

Gly351Asp Located in an important position involved in the catalitic function of CIV.

Both histidins are involved in hemes coordination. The distance between His 376 and the aspartic

acid decreases.

Binding of heme a3 is a prerequisite for assembly of the whole complex.

In yeast mutants this change affect the stability or assembly of complex IV.

Múscul

o

BN-PAGE and western-blot

Deficit of complex

IV assembly

OXPHOS complexes assembly

Ugalde, et.al. Eur. J. Biochem. 2002 SURF1

Oxa1

COX11

SCO1

COX17

SCO2

COX10

COXIV

COX17

SURF1

Complex IV assembly

Transmitochondrial cybrids

TK-

BrEt

Glc, Pir, Ur

TK+

rho0

PEG BrdU Ur - Glc, Pir

Producción de líneas celulares cíbridas transmitocondriales

-Crecimiento de las células y tratamiento con BrEt para la eliminación del

mtDNA: Formación de células rho cero.

- Obtención de una muestra de sangre del paciente y preparación de

plaquetas (éstas tienen mtDNA pero no núcleo).

- Fusión de líneas celulares rho cero y plaquetas.

- Selección de las células que llevan las mitocondrias del paciente.

- Realización de análisis bioquímicos y genéticos.

Transmitochondrial cybrids

TK-

BrEt

Glc, Pir, Ur

TK+

rho0

PEG BrdU Ur - Glc, Pir

The OXPHOS system as a therapeutic target in personalized medicine

Nutrients supply electrons that reduce coenzyme Q10 of the mitochondrial

respiratory chain of the oxidative phosphorylation system. Some coenzyme Q10-

binding sites from the electron transport chain are, in part, formed by polypeptides

encoded in the mtDNA. Mitochondrial DNA is highly polymorphic and many of these

polymorphisms, that modify amino acids of the coenzyme Q10-binding sites, define

mitochondrial DNA haplogroups. This fact suggests that alternative coenzyme Q10-

binding sites from diverse mitochondrial DNA haplogroups might differentially

interact with coenzyme Q10 or its analogs and modify the oxidative phosphorylation

phenotype. In this scenario, this molecular pathway could become a therapeutic

target for custom-made treatments.

Methods. We synthesized, modeled and tested several coenzyme Q10 analogs in a

collection of transmitochondrial cell lines harboring different mitochondrial DNA

haplogroups.

Results. These compounds bind the p.MT-CYB Qi-site and modify several

OXPHOS parameters without decreasing cell viability. The effect of one of these

compounds depends on the mtDNA genetic background.

Conclusions. Our results confirm that mtDNA polymorphisms can modify the

interaction with these compounds and alter bioenergetic parameters. Therefore,

personalized treatment using the OXPHOS system as a therapeutic target is

possible.

Cyt c

Matrix

Intermembrane space

Outer membrane

+

-

C.I C.III C.IV C.V

ETC

Inner membrane

e- H2O

ATP

NADH

H+

O2

NAD+

H+ H+

H+

ADP + Pi

DIFERENCIAS ENTRE ESPECIES EN LA ESTRUCTURA DEL CIII PERMITEN COMBATIR HONGOS QUE ATACAN COSECHAS O PARASITOS

QUE ATACAN HUMANOS. PARA ELLO SE UTILIZAN COMPUESTOS QUE SE UNEN AL CIII DE UNOS PERO NO AL DE LOS OTROS.

182

N

C

a

F1

F2

H1

H2

ab

cd1

cd2

ef

E A B C D G

239 294

120

15

..

.

..

.

.

.

. .

..

.H16R

F18L

A229T

250 G251S

G251D

S35P

G34S

A122T

S151P

G166E T158A

190

A193T

D171N

Y278C

G290D

L236I

40

.G339E

.R318P

.

DADO QUE LA MAYORÍA DE MUTACIONES PATOLÓGICAS EN EL CIII HUMANO SE ENCUENTRAN EN LOS LUGARES A LOS QUE PODRÍAN UNIRSE

ESTOS COMPUESTOS,PENSAMOS QUE DISTINTAS PERSONAS PODRÍAN RESPODER DE MANERA DIFERENTE A ESTOS COMPUESTOS

EL DOCTOR ALVAREZ BUILLA DE LA UNIVERSIDAD DE ALCALA DE HENARES

SINTETIZÓ UNOS COMPUESTOS SIMILARES AL SUSTRATO NORMAL DEL CIII

1 nM – 1 mM

IC50

μM

[Q]plasmática = 0.5 μM

PROBAMOS DIFERENTES CONCENTRACIONES PARA VER QUE TENÍAN EFECTO SOBRE LAS CÉLULAS (AFECTABAN LA

SUPERVIVENCIA) Y LIMITAMOS LA CONCENTRACIÓN A AQUELLAS QUE DEJABAN VIVAS LA MAYORÍA DE LAS CÉLULAS

ESTAS CONCENTRACIONES AFECTABAN DOS PARAMETROS DEPENDIENTES DEL SISTEMA DE FOSFORILACIÓN

OXIDATIVA

Qi-site

AA 3c

ENSAYOS DE COMPETICIÓN Y MODELOS CRISTALOGRÁFICOS DESARROLLADOS POR LA DRA DE PASCUAL

EN LA UNIVERSIDAD CEU DEMOSTRARON QUE ESTOS COMPUESTOS SE UNEN AL CIII

TK-

BrEt

Glc, Pir, Ur

TK+

rho0

PEG BrdU Ur -

Glc, Pir

TK-

BrEt

Glc, Pir, Ur

rho0

TK+ PEG

BrdU Ur -

Glc, Pir

HgH

HgJ2

Cybrids

CONSTRUIMOS CÍBRIDOS DE DISTINTOS HAPLOGRUPO

QUE DIFIEREN EN LA ESTRUCTURA DEL LUGAR DE UNIÓN DE

ESTOS COMPUESTOS

Phe18 Leu18

H J1c + Uk

LAS DIFERENCIAS ESTRUCTURALES DETERMINARON EL EFECTO DE ESTOS COMPUESTOS

In vitro oöcyte nuclear transplantation

Enucleate

Donor oöcyte

IVF

Normal embryo

MELAS oöcyte

Ester López Gallardo

Julio Montoya Eduardo Ruiz-Pesini

David Pacheu

Loli Herrero

Manuel J. López-Pérez

Sonia

Emperador

Sonia Emperador